Автореферат и диссертация по медицине (14.01.18) на тему:Коррекция повреждений головного мозга мезенхимальными стромальными клетками в модели нарушений венозного кровотока

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

04201457353

Васильев Игорь Анатольевич

КОРРЕКЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ В МОДЕЛИ НАРУШЕНИЙ ВЕНОЗНОГО КРОВОТОКА

14.01.18.- нейрохирургия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

д.м.н., проф. Ступак Вячеслав Владимирович

Научный консультант: чл.-корр. РАМН,

д.м.н., проф. Черных Елена Рэмовна

Новосибирск - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................4

ГЛАВА 1. КЛИНИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА: ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И НОВЫЕ СТРАТЕГИИ ЛЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)...............................................................................................11

1.1. Патогенез нарушений церебрального кровообращения.............................11

1.2. Нарушение венозного кровотока при удалении менингиом в области средней трети верхнего сагиттального синуса..................................20

1.3. Экспериментальные модели сосудистых поражений головного

мозга...........................................................................................................................26

1.4. МСК в лечении очаговых повреждений головного мозга у экспериментальных животных..............................................................................29

1.4.1. Регенеративный ответ в ЦНС как новая мишень в лечении повреждений головного мозга...............................................................................29

1.4.2. МСК как перспективные кандидаты для клеточной терапии повреждений головного мозга...............................................................................30

1.4.3. Влияние МСК на неврологическое восстановление в моделях ишемического инсульта.........................................................................................33

1.4.4. Механизмы, лежащие в основе эффекта МСК.........................................34

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................37

2.1. Объект исследования........................................................................................37

2.2. Методика моделирования очагового нарушения венозного кровообращения головного мозга у экспериментальных животных............39

2.3. Характеристика сформированных групп......................................................41

2.4. Оценка повреждений головного мозга, индуцированных нарушением венозного кровотока........................................................................45

2.4.1. Оценка неврологического статуса животных.........................................46

2.4.2. Электрофизиологическая активность головного мозга крыс.................48

2.4.3. Магнитно-резонансная томография головного мозга крыс....................49

2.4.4. Морфологическое исследование головного мозга......................................50

2.5. Генерация мезенхимальных стромальных клеток.....................................51

2.6. Статистическая обработка полученных результатов................................52

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................53

3.1. Морфо-функциональная характеристика созданной

экспериментальной модели очага нарушения венозного

кровообращения головного мозга........................................................................53

3.1.1. Характеристика общего состояния и неврологических выпадений при самопроизвольном восстановлении функции головного мозга животных................................................................................................................53

3.1.2. Характеристика морфологических изменений головного мозга при моделировании нарушения венозного кровотока................................................60

3.2. Влияние МСК на восстановление неврологических выпадений крыс при экспериментальном очаговом повреждении головного

мозга, вызванном нарушением венозного кровотока......................................76

3.3. Влияние МСК на электрофизиологическую активность головного

мозга в модели очагового нарушения венозного кровообращения..............83

3.4. Влияние МСК на характер морфологических изменений в модели очагового повреждения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока........................................................................89

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................................98

ВЫВОДЫ......................................................................................................................103

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.....................................................................103

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.........................................................................................106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................107

ВВЕДЕНИЕ

Поражение головного мозга (ПГМ) в результате нарушения мозгового кровообращения представляет серьезную медико-социальную проблему и наносит огромный экономический ущерб обществу, поскольку является причиной экстренной госпитализации, длительной инвалидизации и в развитых странах занимает третье место среди причин смертности взрослого населения после онкологических заболеваний и сердечной патологии [19, 24, 49, 70, 119].

Лидирующая позиция в структуре сосудистых заболеваний головного мозга принадлежит ишемическим инсультам, которые встречаются в 70-80% случаев, 20-30% приходится на долю геморрагических инсультов и 5 % в структуре цереброваскулярных патологий занимают субарахноидальные кровоизлияния [23].

Наряду с нарушениями артериального кровообращения, серьезную проблему - в связи со сложностью диагностики, недостаточной изученностью патогенеза и отсутствием эффективных методов лечения - представляют нарушения венозного кровотока, обусловленные венозными кровоизлияниями, тромбозами мозговых вен и тромбозами синусов. В последнее время этой патологии было посвящено немало работ [22, 32, 41, 57, 61, 79, 98, 121, 122, 145, 146, 196,215,221].

Вместе с этим, развитие очаговых церебрально-васкулярных нарушений может быть следствием осложнений хирургического лечения парасагиттальных менингиом, локализованных в средней и задней трети верхнего сагиттального синуса (ВСС) [15, 22, 45]. Это связано с тем, что удаление парасагиттальных менингиом данной локализации нередко ведет к травматизации впадающих в синус крупных венозных коллекторов и развитию обширного венозного инфаркта мозга. Все это нередко приводит у больного к развитию нового или к углублению уже имеющегося неврологического дефицита. Развитие парезов и параличей в конечностях приводит к значительному снижению качества жизни. Об этом свидетельствует тот факт, что после удаления менингиом, растущих из верхнего

сагиттального синуса, большое число больных остаются инвалидами. Так, по данным Габибова [15], только 50% больных через 5 лет после операции были практически здоровы и трудоспособны, 15% являлись инвалидами, но могли обслуживать себя, а остальные оставались глубокими инвалидами. Согласно исследованиям [15, 33] до 50% (28,8-47,5%) больных после операции имеют неврологические нарушения, а 18,6% - остаются глубокими инвалидами [7, 45, 78].

Отсутствие эффективных методов лечения при данных поражениях головного мозга побуждает искать новые терапевтические подходы, направленные на стимуляцию процессов репарации нервной ткани. Особая роль в этом направлении отводится клеточным технологиям. Долгое время считалось, что центральная нервная система (ЦНС) не способна к репарации. Однако экспериментальные исследования последних лет показали, что процессы репарации могут наблюдаться в поврежденной ткани ЦНС, причем эти процессы во многом обусловлены образованием новых сосудов, генерацией новых нервных клеток и в значительной степени - реорганизацией нейронной сети (нейропластичность) [224]. Более того, многочисленные экспериментальные исследования показали эффективность клеточной терапии при коррекции неврологических нарушений в моделях повреждения головного мозга сосудистого генеза [1, 85, 113,206].

Среди различных типов клеток наибольшее внимание в последнее время привлекают мезенхимальные стромальные клетки (МСК), способные стимулировать ангиогенез, активировать нейральные стволовые клетки, оказывать нейротрофическую поддержку и модулировать процессы воспаления [14, 144,211,228, 229, 232].

Однако ограниченность моделей ПГМ мозга сосудистого генеза, среди которых основной является окклюзия среднемозговой артерии, а также отсутствие ясности в отношении оптимальных сроков и путей введения клеток, существенно тормозят развитие клеточных технологий и их трансляцию в клиническую практику.

Исходя из вышесказанного, была сформулирована цель настоящего исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Разработать экспериментальную модель очагового церебрального поражения, индуцированного нарушением венозного кровотока, и на основании комплексных исследований оценить влияние мезенхимальных стромальных клеток на морфо-функциональное восстановление головного мозга.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Разработать модель очагового поражения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока, и оценить характер повреждений головного мозга, тяжесть неврологических расстройств и эффективность их спонтанного восстановления.

2. В разработанной модели исследовать влияние мезенхимальных стромальных клеток на восстановление неврологического дефицита в зависимости от путей и сроков проведения клеточной терапии.

3. Провести сравнительную оценку электрофизиологических параметров головного мозга путем регистрации сомато-сенсорных вызванных потенциалов до и после оперативного вмешательства в группах животных с самопроизвольным восстановлением неврологического дефицита и с трансплантацией мезенхимальных стромальных клеток.

4. В рамках разработанной модели провести сравнительную характеристику патогистологических изменений головного мозга у экспериментальных животных после трансплантации мезенхимальных стромальных клеток и в группах с самопроизвольным восстановлением.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые показано, что облитерация верхнего сагиттального синуса в средней трети путем его полной биполярной коагуляции с одновременной коагуляцией корковых вен в теменно-височной области у крыс моделирует выраженное ПГМ, которое характеризуется тяжелым неврологическим дефицитом с доминированием очаговых расстройств, сочетающихся в остром

периоде с общемозговой симптоматикой, и низким уровнем спонтанного восстановления.

Установлено, что морфологическим субстратом церебрального повреждения является зона омертвения (некроза) головного мозга, который развивается на фоне выраженного отека и нарушения микроциркуляции в венозном русле по смешанному типу (стазы, тромбозы, кровоизлияния), и впоследствии подвергается рубцовому замещению с кистозной дегенерацией. Формирование очага отека на фоне выключения венозного кровотока при сохранении артериального кровообращения с последующим образованием в зоне повреждения кистозной полости подтверждается также данными магнитно-резонансной томографии (МРТ).

На основе полученных экспериментальных данных разработан новый способ очагового повреждения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровообращения «Способ моделирования ишемического поражения головного мозга» Патент № 2 432 619 РФ. Авторы Ступак В.В., Васильев И.А., Самохин А.Г.

В разработанной оригинальной модели очагового нарушения церебрального венозного кровотока продемонстрирована безопасность и эффективность трансплантации МСК с целью коррекции неврологического дефицита.

Установлено, что трансплантация животным МСК в разработанной модели не вызывает локальных или системных осложнений и приводит к достоверному улучшению неврологических функций. Положительный эффект трансплантации МСК проявляется при внутривенном и локальном их введении, как в остром, так и в подостром периодах. При этом наиболее эффективным режимом является внутривенное введение клеток и проведение терапии в остром периоде, начиная с 1-х суток с момента формирования очага венозной ишемии.

Клиническая эффективность трансплантации МСК подтверждается данными электрофизиологического обследования. У животных контрольной группы снижение амплитуды сомато-сенсорных вызванных потенциалов (ССВП) в послеоперационном периоде носит выраженный и стойкий характер. У крыс с

трансплантацией МСК с 14-х суток наблюдается возрастание амплитуды ССВП, а к 21 -м суткам - восстановление электрофизиологической активности практически до исходного уровня.

На основании исследований морфологических изменений головного мозга животных после трансплантации МСК установлено, что позитивный эффект внутривенного введения клеток ассоциирован с активацией ангиогенеза, подавлением деструктивного отека, дистрофических изменений и воспаления и более эффективной организацией поврежденной ткани (образование компактного глиомезодермального рубца с меньшей кистозной дегенерацией).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработанная модель тяжелых очаговых ПГМ позволяет оценить безопасность и эффективность различных фармакологических и клеточных воздействий. Данный способ приближен к патогенезу повреждений, связанных с развитием венозного инфаркта, возникающих после травматизации крупных венозных коллекторов и венозных синусов после удаления парасагиттальных менингиом.

Выявленный позитивный эффект трансплантации МСК на восстановление неврологического дефицита у экспериментальных животных в разработанной модели очагового ишемического поражения головного мозга является обоснованием для дальнейшего продвижения клеточных технологий в клиническую практику.

Морфо-функциональные данные в виде ССВП и МРТ-исследования головного мозга свидетельствуют о целесообразности их использования в клинической практике для объективизации эффектов клеточной терапии при очаговых повреждениях головного мозга.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Моделирование поражений головного мозга венозного характера путем биполярной коагуляции верхнего сагиттального синуса с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области приводит к

развитию тяжелого неврологического дефицита с доминированием очаговых расстройств и низким уровнем спонтанного восстановления.

2. Морфологическим субстратом в разработанной модели является очаг некроза головного мозга с последующим замещением зоны повреждения рубцовой тканью с кистозной дегенерацией.

3. Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток в разработанной модели является эффективным методом восстановления неврологического дефицита с наилучшим клиническим эффектом при использовании внутривенного режима введения и проведения терапии в ранние сроки, что подтверждается данными клинических, электрофизиологических и морфологических исследований.

Основные положения работы доложены на: Всероссийской научной школе-конференции МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва, 2010 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Цивьяновские чтения», НИИТО, Новосибирск, 2010 г.; Заседании ассоциации нейрохирургов г. Новосибирска. 2011 г.; VII Сибирском физиологическом съезде, г. Красноярск, 2012 г.; VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Цивьяновские чтения», НИИТО, Новосибирск 2013 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21-а научная работа, в том числе 4 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 страницах, содержит 32 рисунка, 10 таблиц, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка использованной литературы, содержащего 241 источник, из них 85 на русском и 156 на иностранных языках.

Личный вклад автора

Автор лично провел все 100% оперативных вмешательств на животных по моделированию очагового поражения головного мозга венозного характера и

отработал методику забора клеточного материала. Все 100% клинического материала, полученные в эксперименте, проанализированы и статистически обработан автором самостоятельно.

Глава 1. КЛИНИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА: ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И НОВЫЕ СТРАТЕГИИ ЛЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Патогенез нарушений церебрального кровообращения

Нарушения венозного кровообращения в головном мозге, вызванные преимущественно тромбозом или сдавлением церебральных венозных синусов, крайне трудны для диагностики в связи с небольшой распространенностью и отсутствием характерной симптоматики поражения. И поэтому механизмы нарушений венозной гемоциркуляции остаются во многом неизученными.

Единственным крупным исследованием тромбоза церебрального венозного синуса является завершенное в 2004 году исследование (International Studyon Cerebral Veinand Dural Sinus Thrombosis) [212], охватившее 624 пациента в 89 центрах Европы.

Анализируя патологические факторы, вызывающие наруш�