Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клональный анализ некоторых трансплантируемых опухолей по злокачественности и радиационной чувствительности

£8' 0 6 9 2

КАЗАХСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ онкологии И РАДИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 816—000 + 033.2:615.049—012—092.9

НУРГАЛИЕВА Каламкас Жумашевна

КЛОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ТРАНСПЛАНТИРУЕМЫХ ОПУХОЛЕЙ ПО ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ Н РАДИАЦИОННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

14.00.14 — онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

■у

/

Алма-Ата — 1992 г.

Диссертационная работа , выполнена и лаборатории медико-Оиологп-ческих моделей и генетики опухолей Казахского научно-исследовательского института онкологии и радиологии Министерства здравоохранения Республики Казахстан.

Научные руководители: — доктор медицинских наук

Б. И. ИСЛМИЛОВ

— доктор медицинских паук, профессор А. Б. УТЕШЕВ

Официальные оппоненты: — доктор медицинских наук, профессор

С. А. БАИШЕВА

— доктор медицинских наук Б. К. КАЗЫМБЕТОВ

Ведущее научное учреждение — Научно-исследовательский институт онкологии и радиологии Республики Кыргызстан (г, Бишкек).

Защита состоится « »_ 1992 года в « » часов

на заседании специализированного Совета К-079.01.01 в Казахском научно-исследовательском институте онкологии и радиологии по адресу: 480072, г. Алма-Ата, проспект Абая, 91.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « Ю92 р.

Ученый секретарь специализированного совета, профессор

Л. Л. ШАФРАНСКИЙ

д.;клон шьной выживаемости.

ртдций

—-45. Корреляционный анализ зависимости между показателями влока-чественности и радиационной чувствительности.

6. Определение соотносительной роли наследственных и средовых факторов в проявлении некоторых ивученных признаков.

Научная новизна Получены дополнительные сведения о биологических свойствах длительно селектируемых аффинитетных опухолевых штаммов, их индивидуальных легочных клонов, популяции клонов, которые расширяют диапазон их использования в решении различных вадач экспериментально-теоретической онкологии. Сравнительное изучение гетерогенности и характера фенотипического проявления таких фундаментальных признаков, как "злокачественность" и "радиочувствительность" на равных уровнях структурной организации опухолей проводится впервые. Впервые неучено количественное соотношение между признаками "радиочувствительность" и "нестабильность генома" (по показателю частоты клеток с микроядрами) и определен коэффициент наследуемости этих привнаков.

Практическая ценность работы. Углубленное изучение биологических характеристик новых отселектированных опухолевых субштаммов позволяет более широко их использовать в различных радиобиологических, химиотерапевтических исследованиях, в Частности, для отбора антиметастатиков и препаратов с другими механизмами действия. Полученные результаты по ивучению закономерностей фенотипического проявления указанных признаков позволят рационально их использовать в прогнозировании индивидуальной чувствительности опухолей челокека к терапевтическим воздействиям в клинической практике.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на У Всесоюзном симпозиуме "Управление радиочувствительностью опухоли и нормальных тканей" (Алма-Ата, 1987), на I! РоопуСликлнсксм стенда снкологов, ронтг«нологов и радиологов (Альп- Агэ,

1988), на конференции молодых ученых и специалистов КаеГУ им. Аль-Фараби, посвящэнной 70-летию ВЛКСМ (Алма-Ата, 1988), на I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), на Республиканской конференции "Проблемы теоретической и прикладной генетики в Казахстане" (Алма-Ата, 1990), диссертация апробирована на научной конференции лабораторий: медико-биологических моделей и генетики опухолей, радиобиологии опухолей, иммунологии, биохимии, канцерогенных агентов внешней среды, экспериментальной химиотерапии опухолей, медицинской биофизики КавНИИОиР (Алма-Ата, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит ив общей характеристики работы с формулировкой вадач исследования; пяти глав, первая из которых посвящэна обзору литературных данных, вторая - описанию материала и методов исследования; остальные главы посвящены изложению результатов собственных исследований, их анали-ву и обсуждению. Работа включает 8 выводов.

Диссертация изложена на /// страницах машинописного текста. Шлючает 22 рисунка и 14 таблиц. Библиографический указатель представлен //У- работами отечественных и /32. зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Работа проводилась на трансплантируемых опухолях крьгс: карцн-носаркоме Уокер (КСУ) (Dunham, Steward, 1953; Е. Е. Погосянц, 1957), еэ аффинитетном варианте - карциномаркоме КИО (Б. И. Исмаилов и др., 1983) аффинитетной рабдомиосаркоме РА-2 крыо (JL И. Степаньян. Ю. Б. Бахтин, 1980). Последние два ва это время прошли, соответствен но, 110 и 204 циклов отбора. В оштах использовали белых беспород ных крыс, крыс породы Вистар и новую инбредную линию "черноголовых"

крыс (В. К. Красноштанов, 1990) обоего пола, массой 100-120 г.

Клоны опухолевых клеток получали методом легочных колоний путем внутривенного введения суспензии одиночных клеток (Hill, Bush, 1969).

Эффективность клонирования (КОЕ - колониеобразующая единица) оценивали как число выросших в легких клонов к числу внутривенно введенных опухолевых клеток и выражали на 100 ООО клеток.

Радиочувствительность опухолей, клонов и их подкожных трансплантатов определяли по проценту тормоиэния роста (Л. Ф. Ларионов, 1962) и методом легочных колоний.

Для оценки радиочувстительности популяции клонов была использована модификация метода легочных колоний, включашзя клонирование in vivo, облучения клеток клонов и дальнейшую их трансплантацию животным-реципиентам. to доеным кривым выживаемости трансплантатов-клоков определяли параметры Др. Д^ и п. Для прививки испольвова-„чи одинаковое число клеток клонов находящихся в экспоненциальной фазе роста.

Опухолевые клетки облучали in vitro на аппарате РУ1М7. Массовое облучение клонов проводилось в стерильных иммунологических планшетках.

Оценка интенсивности синтеза ДНК (ИСД) проводилась по мечению з

клеток Н-тимидином. Радиоактивность измеряли с помощьп жидкостного сцинтилляционного счетчика "Beta-I" (СССР). Величина фона при всех измерениях не . превышала 80 имп/мин. Результаты рассчитывали как сроднее число импульсов за 1 мин на 1 млн клеток (Я Е Добрынин и др., 1974).

Параметры клеточной пролиферации - фракция роста (ФР) и индекс метки (ИМ) определялись методом аяторадиографии (О. И. Епифанова а íp. , 1969). Количество меченых клеток подсчитывали па ЭОО клоток и рнратали в X,

Частоту клеток с микроядрами (ЧКМ) оценивали микроядерным тестом (ERИльинских и др., 1986) в мавках, окрашенных по Романовско-му-Гимва в расчете на 200 клеток и выражали в X.

При изучении активности дегидрогена8 цикла Кребса (ИДГ, .¿-КДГ, МДГ с НАД, СДГ) в тканях подкожных опухолей и клонов-трансплантатов был испольвован метод Кип, Abood (1949) в модификации Oda, Okazakl (1958) и Ю, В. Наточина (1962).

г

Коэффициент наследуемости (h ) изучаемых признаков определяли путем вычисления коэффициентов корреляции между признаками клонов и происходящих от них трансплантатов (IHR Бахтин, 1980), а в случае признака "ЧКМ" с ассиметричным характером распределения L по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни методом ранговых корреляций по Спирмену (Г. Ф. Лакин, 1990).

Статистическая обработка результатов проведена методом вариационной статистики с использованием критерия Стыодента. Часть результатов обрабатывалась при использовании пакета статистических программ на "Искре-226".

Всего в опытах испольвовано крыс. Иэучено клонов

и их подкожных трансплантатов.

■ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Гетерогенность и характер фенотипического проявления признака "злокачественность"

В данном разделе приводятся результаты сопоставления признака "злокачественность" на разных уровнях структурной организации опухолей, оцениваемой различными показателями.

Ростовые параметры (РП). Сравнительные исследования злокачественности трансплантируемых новообразований одного и разного гистогенеза (КСУ, КИО, РА-2) по РП (латентный период появления опухоли после подкожной траноплантацк;!, оредняя масса опухолей на 14-е сут-

ки поело прививки, сроки 50Х гибели животных о опухолями) показало более высокую степень злокачественности аффинитетной КИО. КСУ и РА-2 по втш показателям, соответственно, оказались менее влокачес-твенными. Более выраженной злокачественностью КИО характеризовалась и при оравнении популяции клонов новообразований.

Распределения подкожных опухолей, их клонов и клонов-трансплантатов по кассе в экспоненциальной фазе роста во всех случаях носят непрерывный одновершинный характер (рис.1).

При атом более высокой степени елокачественнооти соответствовала более выраженная гетерогенность РЕ

Таким образом, феномен соответствия более высокого темпа роста и большей степени гетерогенности по РП высокой елокачественности отмечался как при'анализе роста клонов в легких, так и при анализе их роста в условиях подкожной трансплантации. Эти ревультаты согласуются с данными ростовых (масса клонов и трансплантатов) и кинетических (фактор самоускорения) параметров, полученными на субштаммах КИО и РА-2 на ранних циклах отбора (Н. Т. Имангалиева и др., 1983), что указывает на наследственную гетерогенность популяций клонов по РП.

Клойогенная способность (КС). Изучение вависимости между прив-паком "КО" (КОЕ на 10 клеток) и массой опухолей повволило установить наличие недостоверной олабоотрицательной коррелятивной свяви (р> 0.05). Иэдду величиной КОЕ и массой индивидуальных клонов, а . также их подкожных трансплантатов каких-либо зависимостей обнаружить не удалось. Данные литературы по ивучению зависимости КО от массы опухоли противоречивы (Чан-Тик Кань и др., 1978; ЕЕ Лэтов и др., 1989;Baumann et al., 1990). Вместе о тем установлена.четкая обратная зависимость выживаемости больных от КО (Hug et al., 1965). Необходимо отметить, что КС в наша исследованиях представляет со-

к о л и ч е о т в

О,

- 9 -клоны КСУ

л=г<*

клоны КИО

п.- /0£

клоны-трансплантаты КСУ

I

хОСЬ

XI

клоны-трансплангаты КИО

клош клоны-трансплантаты РА-2 РА-2 /и» /05" ___п. = Ц

(2? >0,51 </,О ¿¿и

к л а с о ы по м в о о е , г

Рио. I Распределение подкожных опухолей, клонов и клонов-траноплангатов по массе в экспоненциальной фазе роста

бой привнак о нивкой наоледуемоотью, в реализации которого основную роль играют не . столько наследственные, сколько внешние средовые {акторы. Распределение клонов и их трансплантатов по данному привнаку имело одновершинный и непрерывный характер о ассиметрией влево (рио. 2).

к о л и ч б с т в

- 10 -

клоны

1 = 48

50

30

20

Ю О

40

ЗО 0> »

%

<0 о

¿50 ¿Х> жо

классы по КОВ на Ю5 клетон;

Рис. 2 Распределение легочных клонов РА-2 крыс к их подкожных трансплантатов по признаку "клоногенная способность"

клоны-транспла нтаты л = 39

Продиферативная активность (ПА) изучалась на штамме РА-2 крыс на 204 цикле отбора на аффинитет.

Радиометрически установлена значительная вариабельность ИСД в подкожных опухолях в зависимости от их массы и от воны взятия проб п пределах опухоли (табл.1). Показатели ИОД в опухолях массой 2-5 г были в 2-3 раэа выше, чем в опухолях массой 6-14 г . о чем свидетельствует и вычисленный коэффициент корреляции (г«-0,69 + 0,17). Обнаружена зональная гетерогенность опухолей по данному признаку. Так, в периферических зонах (ПЗ) показатели радиоактивности были пыш9, чем в центральных (ЦЗ) и промежуточных (ПРЗ). При атом наиболее резко зональная гетерогенность выражена в опухолях о бол.пей мчсссй. Метау роптовыми параметрами и показателем степени гягто-"

Таблица 1

Про лиферативная активность (ИОД, иып/мин) в подкожных опухолях РА-2 крыс с различной массой

Ыасса 1 опухоли, 1 Зоны г 1 1 интенсивность синтева ДНК, имп/ыин 1

1на 1 млн кл. 1 НАМ 1 '

1,97 ПЗ ПРЗ цз 1841,1 1971,1 1695,6 1835,9 * 64,9 112,5

2,8 ПЗ ПРЗ ЦЗ 1172,2 590,6 760,3 841,0 ± 140,9 244,2 0

3,1 ПЗ ПРЗ ЦЗ , 1781,3 1512,1 1850,6 1714,7 ± 84,3 146,0

3,5 ПЗ ПРЗ ЦЗ 1901,3 2140,0 990,2 1677,5 ± 286,2 495,7

4,6 ГО ПРЗ ЦЗ 2304,0 802,9 1417,3 1508,1 ± 355,7 616,2

6,0 го ПРЗ ЦЗ 1356,3 889,9 598,3 . 948,2 ±180,2 312,2

7,0 го ПРЗ ЦЗ 464,1 1780,2 458,5 900,9 ± 359,0 621,7

8,9 го ПРЗ 03 957.1 441.2 522,0 640,1 ± 130,8 226,6

11,3 го ПРЗ ЦЗ 1380,4 710,3 522,0 860,4 ± 218,5 • 378,5

14,1 ПЗ ПРЗ ЦЗ 1025,2 973,6 461,8 820,2 1 146,6 254,3

генности признака "ПА" в опухолях каких-либо зависимостей обнаружено не было.

Авторадиографическое изучение ФР и ИМ также выявило их колебания в клонах о равной массой. В среднем, величина ФР в крупных клонах была на 18 и 23% вине, чем в мелких и средних (р>0. С®) (табл. 2). Можно предположить, что РП клонов отражают пролифератив-ные потенции давших им начало клоногенных клеток.

Таблица 2

Фракция роста и индекс метки в клонах РА-2 крыс с различной массой

Масса кло- 1 нов, мг 1 1 Фракция роста I ! Индекс метки

5-10 20-50 60-100 52,9 ± 7,4 49,8 ± 8,7 64,6 ± 5, 9 24, Б ± 2,0 26,4 ± 13 30,9 ± 1,8

В динамике роста клонов (11,15,17. сутки после внутривенной прививки) в" повднив сроки отмечается снижение величины ФР на 372 (р<0.05), что может быть связано с переходом клонов в терминальную фазу роста и увеличением доли покоящихся клеток. Ш независимо от массы клонов и сроков их развития оставался относительно стабильным (г=0,3+0,2, р>0.05) (табл.3).

Таблица 3

фракция роста (ФР) и индекс метки (ИМ) в динамике роста клонов РА-2 крыс Дниростаклонов 11 сут I ГБ сут ! 17 сут

~ТСР-'I Ш-1—-1-Ш-1-$Р-!-Ш-

I..... I_! _I 1 _

б1:, 4±2, 3 Ш7ШГ5— 55, Ш, 5 27,3±1,9--50, 1 ^ШГГ

Зональная гетерогенность, обнаруженная по ПА в случае исходник

- 13 -

опухолей, выявлена и при иэучении легочных клонов (табл. 4)

Таблица 4

Пролиферативная активность (ФР, Ш) в различных вонах клонов РА-2 крыс

Масса I периферическая вона! промежуточная вона! центральная вона

клонов,I ______

мг »—ФР-1-ИИ-1-Я?-1-ИВ—I-$Р-1-Ш-

_I_I_» - 1_Г_!_

5-10 56, б±7,2 23,5*1,4—61,6*7.3 22.1±1,2 61,7±В,Э 26,7±2, О 20-50 48,1±7, Б 24,1±1,7 50,0±7,6 23,5±0,9 43, 5±8, 8 24,6±1,6 60-100 43, 6±6, 6 26,1±3,0 69, 0±6,2 27,0±1,8 63, 3±4, 8 27, 9±3, 4

ТБм БО, 2±4, Б 24,7±0, б 60, 2±5,б 24, ¿±1,4 Б6,2±6,4 26,4±0,9

По величине ФР различные воны мелких и средних клонов почти не различались. В клонах с большей массой различие по ФР мешу ГО и ЦЗ, о одной стороны, и ПЗ и ПРЗ, о другой, составило, соответстве-но, 32 и 36% (рс0,05). Но Ш межклональные различия не обнаруживались.

Распределения популяции клонов по различным показателям ПА были почти идентичными (рис.3) и напоминали аналогичные распределения по ростовым, кинетическим параметрам роста (а Т. Имангалиева и др. ,1983; -Б. И. Исмаилов, 1983) и клоногенной способности: носили одновершинный ассиметричный характер с ревким сдвигом влево.

Чзс.^га клеток о микроядрами (ЧКМ). В качестве показателя признака "злокачественнсть" нами изучалась.нестабильность генома по критерию ЧКМ. Обнаружена широкая вариабельность популяции клонов но признаку "ЧКМ" в динамике их роста с тенденцией к ее нарастанию п более поздние сроки (рис.4). При зтом распределение клонов носило двухвершинный характер с обособлением фракции клонов с большей выраженностью данного признака. Доля клонов с высоким значением ЧКМ на 28-е сутки составила ЗОХ. Вариабельность изучаемого признака в популяциях клонов значительно сужалась при их подкожной транспланта

- -

классы по величине изучаемых показателе!

Рис» 3 Распределение легочных клонов РА-2 крыс по различным показателям пролиферативной активности

к о л в

ч е

к. л о'

ао

к> 35 30 25 20 /£ Ю

го /5 *0

20

*5

/О

18® сутки л а 35

¿ъ

24® сутки л » 30

П.

л

-ГШ-

Л

28е сутки ' 36

п

л * £ 6

частота клеток о минроядрами, %

Рис. 4 Распределение клонов РА-2 крыс по чаототе встречаемости клеток с микроядрами

ции (рис.Б), ревко уменьшалась доля клонов-трансплантатов (до 2Х) о высокими значенияш ЧКМ.

Интересно, что клоны о величиной ЧКМ в пределах 7-1ОХ не дали начало росту подкожным опухолям. Все это свидетельствует о нивкой живнеспосоОности клеток и их клонов с микроядрами (Е КХ Кравцов и

о

к *

0

л 6

и * •

ч г

в 0

0

т в / •

0» 6 ■ *

% е ' 0

[Л

клопы п. Ж 32

Н Чп П

пл.

и

клоны-трансплантаты л. = 25

т

у / л * * $ * 4 юна

частота клеток с микроядрами, %

Рис. 5 Распределение легочных клонов и их подкожных трансплантатов РА-2 крыс по чао-тоте встречаемости клеток о микроядрами

др.,1990). Коэффициент наследуемости признака "ЧКМ" в ряду трансп-

г

лантат-трансплантат укааывеат на умеренную его наследуемость СЬ -0,47; р<0,05).

При изучении активности дегидрогеназ С ИДГ.^-КДГ. ИНГ (с НАЛА СДГ )• цикла Кребса в исходных опухолях и их клонах-трансплантатах обнаружены значительные их колебания. Наибольшие вариации были характерны для ключевого энвима - СДГ (в 2-63 раза). Последние могут быть обусловлены как индивидуальными особенностями метаболизма ор-ганивма животных-реципиентов, так и соотношением опухоль-органивм. Изучение зависимости мевду параметрами 'роста и активностью в них

дегидрогенав выявило в ряду трансплантатов до 6 г слабо- и умеренно-отрицательные коррелятивные овяви для «¿-КДГ (г--0,21), СДГ (Г--0.22) и ЦДГ с НАД (г--0,35). В ряду клонов-трансплантатов масоой более б г установлены положительные коррелятивные зависимости, что должно быть учтено при прогнозировании злокачественных опухолей по активности атих ферментов.

Распределения исходных опухолей и клонов-трансплантатов по активности изученных ан8имов цикла Кребса носят (ва исключением СДГ) одновершинный и непрерывный характер о определенной ассимет-рией.

Таким образом, изучение закономерностей проявления признака "злокачественность" на равных уровнях структурной организации опухолей позволило обнаружить различную степень гетерогенности и идентичный характер распределения атого привнака. Отмечается тенденция соответствия бблывей степени елокачественности опухолей более выраженной ее неоднородности по данному признаку.

Гетерогенность и характер фенотипического проявления признака "радиационная чувствительность" Оценка радиочувствительности (РЧ) опухолей. Сравнительное изучение РЧ исходной КСУ и аффинитетных штаммов - КИО и РД-2 по проценту торможения роста при подкожной трансплантации покаэало большую РЧ КИО, нежели КСУ и РА-2 при догах облучения 10 и 20 Гр (при довах 30-50 Гр вти различия сглаживались). Величины Д08 ТДупо про-биту) для этих новообразований составили: 16,5 Гр (КИО), 20 Гр (КСУ), 25 Гр (РА-2). Можно полагать, что в ходе длительной селекции, несмотря на повышение КС в 10-100 и более рае имеет место лишь незначительная тенденция к повышению РЧ опухоли. По-видимому, в РЧ новообразований играет роль не столько общая доля клоногенных клеток, сколько соотношение ее радиоревистентной фракции (А.Г. Коноп-

данников и др. ,1988). Аналога РЧ трех субштаммов по дозным кривым выживаемости клеток (по методу легочных колоний) показал некоторую вариабельность параметров клеточной РЧ от опыта к опыту (табл.Б).

Таблица 5

Показатели клеточной радиочувствительности исходной и аффинитетных опухолевых штаммов по данным кривых доза-эффект

Штаммы 1 NN I 10ПЫТ0В1 Д0 ,ГР | Д9 ,гр 1 П 1

1 КСУ 2 3 1.8 2.5 2.6 3,4 0,9 1.8 1.7 1.2 1.2

1 КИО 2 3 2,4 3,7 4,1 2,3 1.8 0,5 1.7 1.2 1,2

1 РА-2 2 3 3,2 4,2 3,2 0,6 2,0 1.8 1.2 1.2 1.2

Ц)и этом более вариабельными оказались параметры ^и Д^(в 1,6 -2.0 рава). Это по-видимому, обусловлено соотношением различных по РЧ субпопуляций (клонов) в пределах опухолей и вариабельностью ио-польеуемых в опытах животных по противоопухолевой ревистентности. Кроме того, субштамм КИО характеризуется относительно большей радиоустойчивостью (в 1,5-2.0 рава), нежели исходная КСУ. Различие между КИО и РА-2 по величине ТД^тканевая РЧ по проценту торможения роста) при определении клеточной РЧ вовсе не выявлялось.

. Оценка РЧ клонов и популяции клонов. Аналогично оценке РЧ по клеточной выживаемости РЧ опухолей определялась также по величине фракции выживших клонов. При этом учитывалось количество выживших и _ не выживших клонов при облучении in vitro в разных дозах при последующей подкожной трансплантации. Результаты обрабатывались методом накопления частот (по Боренсу) и выражались графически. По пробиту

определялись ТД., .ТД_и ТД ,а по кривым доза-эффект - значения доз /6 50 а7

- 19 - •

Д^, Др и экстраполяционное число п ( табл.6).

Таблица 6

Параметры радиочувствительности опухолей по данным клональ-ной выживаемости: по пробиту и по кривым доза-аффект

Парш втры 1 ! ш КСУ т а м м ы 1 КИО 1 РА-2

ТЯ» ,Гр 22,5 1в,0 28,0

До ,гр 13,0 19,6 26,0

Д» .ГР 14,8 16.8 18,6

пг 3,7 2,4 1,0

Обнаружены вариации РЧ новообразований как по величине ТД^ так и по величине дов■^, Д^. При этом кривые выживаемости клонов напоиинали доеные кривые выживаемости клеток, т. е, характеризовались наличием плеча и экспоненциального участка. Кроме того, по величине дов Л^ клональной выживаемости субштамм КИО в 1,5 раза радиоустойчивее КСУ, что соответствует их различиям по величине ^клеточной выживаемости.

Оценка РЧ клонов РА-2 крыс по проценту торможения синтеза ДНК погволило обнаружить почти'те же закономерности их распределения, что были ранее установлены при определении РЧ клонов по проценту торможения их роста (Б. И. Исмаилов,1983) (рис.6).

РЧ и ЧКМ в популяциях клонов. Изучение признака "ЧКМ" в популяциях клонов РА-2 крыс до и после облучения показало широкую вариабельность по данному признаку и умеренно-положительную корреляции иежду признаками "ЧКМ" и "РЧ" (г«0,3+0.2). Распределение популяции клонов по проценту торможения роста в отличие от признака "ЧКМ" носит непрерывно-одновершинный характер со сдвигом модального класса влево. Влияния облучения на исходный уровень ЧКЫ в легочных клонах в условиях нашего эксперимента выявить не удалось по той причине, что при трансплантации облученных клонов селеотирукгся клетки и

дг

к 30

0

л

и аз

ч №

е ю

0

т 0

в л

0

к 0

л м

0 . 05

в

0 /г

V ю

% в

41* п. = 29

Чп,

6

л « 30

8 1* л * 28

10 Гр Л Ш 16

ги

4Ю М 4Л>

классы по проценту торможения роста

>91

исд.

Рио. 6 Распределение легочных клонов РА-2 крыс по проценту торможения интенсивности оивтеза ДНК ( ИСД, имп/мин) при облучении в разных дозах

¡слоны о оольаей жизнеспособностью, т. е. меньшим уровнем ЧКЫ.

РЧ и активность некоторых деглдрогенав цикла Кребса. Изучение активности энзимов цикла Кребса в связи с. различной РЧ популяции клонов-трансплантатов КИО (табл.7) выявило различную степень выра-явнности корреляционных зависимостей в группах с более и менее вы-

Таблица 7

Активность дегидрогенаэ цикла Кребса в группах клонов-трансплантатов с различной радиочувствительностью

! ВДГ .!' ¿.-т. i СДГ f ВДГ (с НАД»

Активность, нмоль/г-ч

I Lim ! M±m 1

РЧ по Z ! торможе -t

ния роста!---------------------------

!Illm t M±m I Lim f M±m t

Lim I Mim

# 70 Z !6-30!17,3±l,3!l, ,l-50tl7,0±2,l 11-60 114,2±3,5t0,6-4018,4±2,0

г ! 0,20 ± 0,20 1 - -0,26 ± 0,10 ! -0,17 ± 0,20 ! 0,03 ± 0,20

} 71 X 14-16 8,3±1,8t 4, ,8 41,B±li,910,5-40 11,5±6,6t0,8-50 21,9*8,5

г 1 0,49 i. 0,301 -0,20 ± 0,39 ! 0,08 ± 0,40 1 -0,68 ± 0,21

i

(Vi

раженной РЧ. Следовательно, при испольвовании окислительно-восста новительных ферментов в целях прогнозирования индивидуальной РЧ требуется более дифференцированный подход в зависимости от степени РЧ изучаемых новообразований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты наших исследований, проведенных на исходном штамме - КСУ и аффинитетны* субштаммах - КИО и РА-2, прошедших, соответственно, 116 и 204 циклов отбора на повышение клоно генности и тропности к легочной ткани, дополняют и подтверждают положение о том, что прогрессия опухолей никогда не приводит к фено-типической и наследственной однородности их клеточных популяций по большинству цитокинетических, цитогенетических и биохимических признаков (Б. И. Исмаилов, 1983; КХ Б. Бахтин и др. ,1987).

Продолжительный и целенаправленный отбор лишь по двум признакам не вызвал каких-либо вакономерных сдвигов в их РЧ по показателям клональной и клеточной выживаемости. При этом несомненный интерес представляет возможность определения РЧ клОнов по проценту торможения их роста (ТД^), с одной стороны, когда учитываются промежуточные эффекты радиации (этим они напоминают исходные клонируемые опухоли) й , с другой стороны, по величине фракции выживших клонов (Д^), когда учитываются крайние радиационные эффекты ( этим они сближаются с родоначальными клоногенными клетками). При этом форма кривых доэа-эффект клональной выживаемости имеет аналогичную форму доэных кривых клеточной выживаемости и состоит иэ плеча и'экспоненциального участка, что позволяет определить параметры и п.

О том, что клональный уровень является как бы промежуточным шжду клеточным и тканевым уровнями организации опухолей (Б. И. Исмаилов, 1986) свидетельствует также следующие' наши данные. Так, клоны подобно исходным опухолям характеризуются наличием зональной гетерогенности по ПА, а по фенотипическому проявлению ростовые и пито-

- 23 - '

кинетические (ФР и ЮО параметры пролиферации популяций клонов и опухолей нооят почти идентичный характер.

Научение кдеточно-популяционных показателей (КС, ПА, ЧКМ. активность некоторых энзимов цикла Кребса), отепени их гетерогенности и наследуемости показало, что исходный уровень широко варьирует в . популяциях клонов и характеризуется довольно нивкой наследуемостью. О РЧ эти показатели слабо или вовсе не коррелируют. Поэтому их исходный уровень, по-видимому, менее информативен в плЬне прогноза индивидуальной РЧ опухолей, и больший интерес предотавляет их изменение пооле терапевтических вовдействий (Р. К. Каракулов,198б; А.Е Деденков и др., 1987).

Определенную ценность в плаве использования в прогностических целях, судя по данным наших исследований, предотавляет ЧКМ как по- . кааатель живнеопоообнооти клеток и их потомков -клоков.

ВЫВОДЫ

1. Аффинитетные опухолевые оубштаммы - карциносаркома ЮЮ и рабдомиооаркома РА-2 край, прошедшие длительную селекцию (116 и 204 циклов отбора, соответственно)1 на повышение клоногенности и троп-кости к легким, сохраняют свои основные биологические свойства: гетерогенность по воем наученным признакам и способность их клеток пролифирировать как при подкопной (в виде солидных опухолей), так и при внутрибрюшинной (в асцитной форме) трансплантациях в случае

КИО. Неомотря на повышение злокачественности в 10-100 и более рае

г

(судя по величине КОЕ на 10 клеток), среднепопуляционные показатели РЧ (^и цу этих оуботаммэв варьируют незначительно.

Е. Более высокая злокачественность ЮЮ по сравнению с КСУ проявлялась на всех уровнях Ърганивации опухолей, в то время как при сравнении опухолей равного типа (КИО и РА-2 крыс) между ростовыми параметрами и продолжительностью жизни животных, с одной стороны, и

ююногенной способностью, с другой, в оценке их злокачественности , подобных соответствий не обнаружено.

3. Покааана возможность оценки РЧ популяций клонов традиционным методом - по проценту торможения их роста, по Т^ как в случае исходных опухолей) и по величине фракции выживших клонов - по ^(как в случае популяций клоногенных опухолевых клеток).

4. Изученные признаки: "ростовые параметры", "клоногенная способность", "пролиферативная активность","активность некоторых энзимов цикла Кребса" в популяциях клонов всех исследованных перевивных опухолей имеют непрерывный одновершинный характер распределения с некоторой ассиметрией влево.

5. Некоторое исключение составил признак "частота меток о микроядрами", распределение клонов по которому имело двухвершинный характер с наличием фракций клонов с высокими значениями данного при-энака. Вычисление коэффициента его наследуемости показало, что вариабельность популяций клонов по данному признаку на 47X обусловлена наследственными факторами и на 53% факторами среды.

6. Изучение признака "частота клеток о микроядрами" в клонах до и после облучения, а также при их подкожной трансплантации показало, что I «галогенные опухолевые клетки, клоны и трансплантаты с более высокими значениями ЧКМ- являются менее жизнеспособными и обладают нивкой опухолеобразующей способностью.

7. Коррелятивные связи изученных энзимов цикла Кребса С ИДГ.оС-

■ КДГ, МДГ (с НАД)(СДГ) с массой подкожных опухолей и клонов - трансплантатов, а также с РЧ последних были неоднозначными и разнонаправленными в зависимости от ростовых параметров и от степени выраженности РЧ опухолей и трансплантатов - клонов.

8. тональный анализ, позволяющий определить степень гетерогенности клонируемых опухолей по тому или иному признаку, а таг.**

- g5 - ■

их наследуемость могэт служить весьма информативным ретроспективном тестом прогнозирования индивидуальной РЧ опухолей.

Пэ материалам диссертации опубликованы следующие работы-.

1. Клоногеиная способность и радиочувствительность рабдомиосар-комы РА-2 крыс в динамике отбора на аффинитет // В сб. : Управление радиочувствительностью опухоли к нормальных тканей. Алма-Ата, 1987, с. 30-32 ( в соавт. о А. К. Едыгеновой, Р. П. Ауганбаевой, IL Т. Имангали-евой, К. А. Аймамбетовой).

2. Показатели продиферативной активности легочных клоков рабдо-миосаркомы РА-2 крью // Материалы II Республиканского съезда онкологов, рентгенологов и радиологов Казахстана. Алма-Ата, 1988, с. 308-310.

3. Соотношение ме«ду клеточными популяциями и популяциями клот нов in vivo на примере экспериментальных опухолей //Тезисы конференции молодых ученых и специалистов КазГУ им. Аль-Фараби, посвященной 70-летию ВЛКСМ. Алма-Ата, 1988, с. 137 ( в соавт. с Р. IÍ Ауганбаевой).

4. Частота клеток с хжкроядрами в клеточных популяциях рабдоми-осаркомы РА-2 крыс в отдаленные сроки после облучения //Тезисы докладов I ' Всесоюзного радиобиологического съезда. Пуш-но, 1989.т.II,с.342 ( в соавт. с Б.И.Исмакловым, Ю. В. Кравцовым, H. Н. Ильинских. КХБ. Бахтиным ).

5. Радиочувствительность и пролиферативная активность клонов рабдомиосаркомы РА-2 крью // Там же, о. 344 ( в соавт. с В. И. Исмаило-

вым, R Т. Имангеишевой).

6. Модели и методы изучения наследственного полиморфизма популяции опухолевых клеток // Материалы Республиканской конференции "Проблемы теоретической и прикладной генетики в Казахстане". Ал-ма-Ата,199о. с. 182-183 ( в соавт. о Б. И. Исмаиловым, В. К. Красношта-новым, Л Т. Тобэгабыловой. Р. П. Ауганбаевой).

7. Изменчивость пролиферативной активности в"популяциях клонов и оценка клеточной радиочувствительности // Деп. в КаеНИИНТИ га. 01.91 N208 Ка, 9с. ( в соавт. с Б. И. Измайловым, & Т. Имангалиевой)

8. Клональная гетерогенность опухолей по радйочувствителыюсти/ Деп. в КаеНИИНТИ 09.01.91., Н 209 Ка, Юс ( в соавт.. с а И. Исмаиловым) .

Актуальность проблемы. Многолетними исследованиями показано, что реакция опухолей на лучевое воздействие обусловлена многими факторами и подвержена большим колебаниям даже среди новообразований одного гистогенеза , стадии и размеров. В свяви о этим одним ив перспективных подходов к повышению эффективности терапии опухолей является индивидуализация тактики лечения. Последнее делает весьма актуальной проблему разработки способов прогновирования индивидуальной. чувствительности злокачественных новообразований в каждом конкретном случае.

По мнению многих исследователей решение указанной проблемы должно основываться на достижениях фундаментальных исследований биологии злокачественных новообразований последних лет (Salmon, 1980, 1984; Б. И. Ис май лов, 1983; Р. К. Каракулов, 1985; И. К Пелевина, А. С. Саенко, 1986; Hanauske et al., 1987; А. Н. Деденков и др., 1987; Ю. Б. Бахтин и др., 1987; Sutherland et al., 1988; Brock et al., 1989; 0. Л. Дарьялова И др., 1991).

О этих позиций заслуживают внимания два основных, тесно взаимосвязанных теоретических положения - концепция клоногенных опухолевых клеток и клонально-селекционная концепция опухолевого роста. Согласно первой - носителем всех весьма важных проявлений влокачео-твенных новообразований, таких как прогрессивный нерегулируемый рост, инваэивность, метастазирование и рецидивирование' после терапевтических во&действий, является небольшая доля клоногенных кло-ток, обладающих неограниченными про лифе ративньми потенциями (И. И. Пелевина и др., 1978). Согласно второй - опухоль представляет собой сложную гетерогенную систему клеточных популяций, специфика которой воспроизводится в потомстве одной яивнеспособной, входящей в ее состав опухолевой клетки (Ю. Б. Бахтин и др., 1967).

На наш взгляд именно вти два положения должны послужить теоре-

тической и методической предпосылкой при разработке способов прог-нова и индивидуаливации тактики лечения.

Использование многочисленных, уже отработанных тестов прогно-вирования индивидуальной чувтовительности (А. К Деденков и др., 1987; С. Л. Дарьялова и др., 1990) в отношении опухолей человека ват-руднено рядом причин, в частности, невозможностью частого проведения биопсий или пункций, небевопасности некоторых методов для человека. В результате, информация, полученная иэ одного ограниченного участка опухоли, недостаточно адекватно отражает ее свойства

В данном аспекте клональный анализ как метод, позволяющий оценивать поведение опухолей по совокупности составляющих ée клонов, обладает большой информативностью (Б. И. Исмаилов, 1983). В связи с этим изучение проявления весьма важных признаков опухолей на кло-нальном и клеточном уровнях представляет большой интерес. Тем более, что для проведения подобного рода исследований имеются специально отселектированные опухолевые оубштаммы с высокой эффективностью клонообравования (ЛИ-Степаньян, КХ Е Бахтин, 1980; Б. Я Исмаилов и др., 1980).

Рель работы. Ивучение гетерогенности и характера фенотипичес-кого проявления признаков "алокачественнооть" и "радиочувствительность" на различных уровнях структурной организации опухолей.

Задачи исследования: '

1. Сравнительное ивучение биологической характеристики длительно селектируемых опухолевых субштаымов по привязкам "злокачественность" и "радиационная чувствительность".

2. Оценка радиочувствительности опухолей традиционным методом - по проценту торможения роста при подкожной трансплантации.

3. Оценка радио чувствительности опухолей по клеточной выживаемости.

4. Оценка радиочувотвительнооти сравниваемых субштаммов по