Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Клинико-генетические особенности рака молочных желез у мужчин.

На правах рукописи

Быкова Анастасия Владимировна

Клинико-генетические особенности рака молочных желез у мужчин.

14.01.12 — онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

г 4 ЯНВ 2013

Москва—2012

005048544

005048544

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учрежденш «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина> Российской академии медицинских наук.

Директор:

академик РАН и РАМН Давыдов Михаил Иванович

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Воротников Игорь Константинович

доктор медицинских наук Любченко Людмила Николаевна

Официальные оппоненты:

Комов Дмитрий Владимирович доктор медицинских наук, профессор,

«РОНЦ им.Н.Н. Блохина» РАМН, заведующий отделением диагностики опухолей

Стрельников Владимир Викторович доктор биологических наук,

ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, ведущий научный сотрудник лаборатории эпигенетики

Ведущее учреждение:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «^ » 2013 года в часов на

заседании диссертационного совета (Д 001.017.02) при ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 23)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

Автореферат разослан ^ 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор / -^ "Барсуков Юрий Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы исследования

Рак молочной железы у мужчин - редкое заболевание: на его долю приходится около 1% всех диагностируемых в мире случаев рака молочной железы. По оценкам Американского Ракового Общества в США РМЖ у мужчин составляет 0,7% всех случаев рака молочной железы. В 2008 году в России на 52 469 новых случая рака молочной железы выявлено примерно 500 заболеваний у мужчин [Е.М. Аксель, М.И. Давыдов. 2011].

По оценкам популяционных исследований около 15-30% мужчин имеют отягощенный семейный анамнез в отношении рака молочной железы или яичников. Терминальные мутации в генах BRCA являются определяющими в развитии высокого риска РМЖ у мужчин - в 80 раз выше по сравнению с общепопуляционными оценками. Частота носительства колеблется по данным разных авторов от 4 до 40%. У мужчин-носителей мутации в гене BRCA2, риск развития РМЖ на протяжении жизни составляет 6%, что в 150-200 раз выше, чем в общей популяции. [Brose MS et all 2002].

Исследования, посвященные клинико-генотипическим корреляциям АЛСЛ-ассоциированного РМЖ у мужчин, малочисленны. В работах Basham et al. и Ottini L. et al. показано, что частота BRCA1 мутаций составляет от 0 до 16%, BRCA2 - от 8 до 14% [Basham et al., 2002; Ottini et al., 2003]. Средний возраст постановки диагноза А/?СЛ-ассоциировашгого РМЖ - 5860 лет (53-64), что на 9 лет раньше по сравнению с общей популяцией. Отягощенный семейный анамнез прослеживали в 42,8%-45% случаев. Высокая степень злокачественности отмечена в 100% случаев. При изучении РМЖ у мужчин в выборках, не учитывающих онкологически отягощенный анамнез, частота мутаций колебалась в различных популяционных исследованиях. Friedman et al. выявили только 2 из 54

• 3

мутации гена BRCA2 [Friedman et al., 1997]. Тогда как Thorlacious et al. продемонстрировал очень высокую частоту - 40% носительства основополагающих BRCA2 мутаций исландской популяции среди мужчин, страдающих РМЖ [Thorlacious et al., 1997]. Одно из последних многоцентровых исследований, выполненных в Италии, основано на изучении взаимосвязи клинических и патоморфологических характеристик РМЖ у мужчин в зависимости от носительтсва мутаций в генах BRCA1 и/или BRCA 2. [Ottini L, Silvestri V, Rizzolo Р et al. 2012]

На сегодняшний день одними из наиболее важных морфологических факторов при РМЖ у мужчин является наличие экспрессии онкопротеина Her2/neu и показателя пролиферативной активности Ki-67.

Несмотря на схожие характеристики с РМЖ у женщин, в изучении данного заболевания у мужчин остается еще много открытых вопросов. Трудно прийти к заключению относительно влияния факторов экспрессии протоонкогена с-егЪВ-2 (Her2/neu) и показателя пролиферативной активности Ki-67 в виду их недостаточной изученности при РМЖ у мужчин. Все это дает возможность для дальнейшего исследования этого научного направления.

Данные о взаимосвязи генетической предрасположенности и клинического течения заболевания противоречивы, в отечественных источниках эти вопросы не освящены. Оценка взаимосвязи клинических и генетических аспектов РМЖ у мужчин представляет научный и практический интерес.

Цель исследования

Улучшение диагностики и результатов лечения у мужчин больных раком молочных желез на основе изучения взаимосвязи клинико-морфологических факторов прогноза с мутациями в генах BRCA 1, BRCA 2, ТР53.

Задачи исследования

1. Изучить прогностическую значимость клинических факторов (возраст, стадия болезни), наличие семейного анамнеза, морфологических и биологических факторов (рецепторный статус, экспрессия Her-2/neu и Ki-67) у мужчин, больных РМЖ.

2. Определить частоту терминальных мутаций генов BRCA 1 и BRCA2, ТР53 у мужчин, страдающих раком молочной железы.

3. Проанализировать взаимосвязь мутаций в генах BRCA 1 и BRCA2 и семейного анамнеза при раке молочных желез у мужчин.

4. Выявить взаимосвязь между наличием мутаций в генах BRCA 1, BRCA2, ТР53 и клиническими, морфологическими особенностями РМЖ у мужчин.

5. Изучить продолжительность и качество жизни больных в зависимости от клинико-генетических факторов и проведенного лечения.

Научная новизна Впервые на материале, собранном в ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН с 1985 по 2009г. и представленном 38 случаями РМЖ у мужчин определена частота терминальных мутаций в генах BRCA J (мутация 185delAG), BRCA2 (мутация 6174delT), ТР53 (Int3dupl6), СНЕК2 (llOOdelC), с использованием комбинации молекулярно-генетических методов и последующим секвенированием фрагментов ДНК, идентифицированных в качестве мутантных.

Подтверждено, что онкологически отягощенный семейный анамнез в 12,6% обусловлен наследованием терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ТР53, СНЕК2.

У мужчин, больных РМЖ проведена оценка клинико-морфологической картины, статуса рецепторов стероидных гормонов, экспрессии Her2/neu, уровня Ki-67.

При анализе взаимосвязи между изменениями на генетическом уровне с клиническим течением и основными морфологическими характеристиками заболевания показано, что основным прогностическим фактором РМЖ у мужчин является степень злокачественности опухоли.

Практическая значимость

Результаты проведенной работы могут быть использованы в профессиональной деятельности специалистов — онкологов при обследовании мужчин с подозрением на злокачественное образование в молочной железе.

Молекулярно - генетическое исследование генов ВКСА1, ВЯСА2, СНЕК2, МЬН1, ТР53 позволяет прогнозировать течение данного заболевания.

Результаты проведенного исследования планируется использовать в практической деятельности клинических учреждений онкологического профиля, при медико-генетическом консультировании, а так же для разработки методических рекомендаций.

Внедрение результатов исследования Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделения опухолей молочных желез и лаборатории онкогенетики ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась 18 сентября 2012 года на совместной научной конференции с участием хирургических отделений: диагностики опухолей, опухолей молочных желез, опухолей женской репродуктивной системы, реконструктивной и сосудистой хирургии, радиохирургии, патологоанатомического отделения, лаборатории клинической онкогенетики, кафедры онкологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Первого Московского

государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы в журналах рекомендованных ВАК РФ, 2 тезиса и 1 статья в журнале.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 26 источников отечественной и 85 источников зарубежной литературы. Диссертация иллюстрирована 33 таблицами и 32 рисунками.

Материалы и методы исследования В основу диссертационной работы положен ретроспективный анализ 70 историй болезни мужчин получивших лечение и наблюдающихся по поводу рака молочных желез в ФБГУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН за период с 1985 по 2009 годы включительно. Из них 38 (54,3%) пациентам было проведено медико-генетическое консультирование и молекулярно-генетическая диагностика.

Основным критерием включения являлось гистологическое заключение, подтверждающее диагноз РМЖ у мужчин. Методом случайной выборки были сформированы группы: 1) для проведения молекулярно-генетического исследования мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и TP 53 - 38 (54,3%) пациентов; 2) определения РЭ и РП - 60 (85,7%) пациентов; 3) Her2/neu - 46 (65,7%); 4) Ki-67 - 40 случаев (57,1%).

Возрастной диапазон пациентов составил 35-82 года. РМЖ у мужчин в нашем исследовании наиболее часто встречался среди категории больных'от 51 до 70 лет - 43 (61,4%) (рис 1).

¡S 20

51-60 61-70

Возраст(лет)

81 и старше

Рис. 1. Распределение больных по возрасту.

В нашем исследовании наибольшее количество больных имели II - 29 (41,5%) и III - 26 (37%) стадии заболевания. Вероятнее всего, это связано с более поздней обращаемостью мужчин и отсутствием скрининга у данной категории (таблица 1).

Таблица 1

Распределение больных по стадиям заболевания

Стадия заболевания Классификация TNM Количество больных

Абс. %

I T1N0M0 11 15,7

11-29 (41,5%)

Па T1N1M0 9 13

T2N0M0 15 21,4

ПЬ T2N1M0 4 5,7

T3N0M0 1 1,4

III-26 (37%)

Ша T1N2M0 1 1,4

IHb T4N0M0 8 11,4

T4N1M0 12 17,1

T4N2M0 4 5,7

lile T1N3M0 1 1,4

IV T4N2M1 4 5,7

Всего: 70 100

Метастатическое поражение лимфатических узлов наблюдалось у 34 пациентов (48,5%). При этом поражение более 4 лимфатических узлов составило 14,4% (рис.2).

/

■ Отсутствие пораженных лимфатических узлов ¿И От 1 до 3

От 4 до 9

«<9

Рис.2. Распределение больных по количеству пораженных лимфатических узлов.

В общей выборке пациентов наиболее часто встречался инфильтративный протоковый тип РМЖ в 78,6% случаев.

Опухоли имели преимущественно 2 степень злокачественности (70%), при этом в нашем исследовании 1 степень злокачественности не отмечена ни у одного больного.

Иммуногистохимическое исследование гистологического материала на наличие рецепторов эстрогена и прогестерона проводилось у 60 (85,7%) пациентов, уровня экспрессии Нег2/пеи - у 46 (65,7%) больных и уровня индекса пролиферации Кл-67 — у 40 (57,1%) пациентов.

Опухоли положительные по обоим видам рецепторов встречались у 76,6% (46 больных), у 2 (3,4%) пациентов опухоли были рецептор-отрицательные (рис.3).

■ рецепторы прогестерона

76,6% (46)

Ш рецепторы эстрогенов

□ рецепторы эстрогенов и прогестерона

□ отсутствие рецепторов эстрогенов и прогестерона

Рис.3. Распределение больных по наличию уровня рецепторов эстрогенов и прогестерона.

У 21 больного отмечалась низкая пролиферативная активность в

опухоли, у 19 пациентов - высокий уровень показателя Кл67 (рис.4).

|

Рис.4. Распределение больных по показателю индекса пролиферации Ю-67.

У 40 пациентов (86,9%) экспрессия гена Нег2/пеи отсутствовала (равна «0» или «+1») у 6 пациентов (13,1%) экспрессия гена была равна «+2», что требовало проведение Р18Н-реакции (реакции гибридизации гена), по результатам реакции гибридизации в одном случае (2,2%) была обнаружена гиперэкспрессия гена Нег2/пеи (рис.5).

86,9%(40)

13,1%(6)

2,2%(1)

Ю,+1

Н +2(нет

амплификации)

□ +2(есть амплификация гена)

Рис.5 Распределение больных в зависимости от наличия экспрессии Нег2/пеи

Всем 70 пациентам проведено хирургическое лечение. Комплексное лечение, включающее сочетание более 3 методов лечения (химио-, лучевая терапия, эндокринотерапия) проводилось в 59% случаях (33 пациента). Комбинированное лечение проведено в 41% случаев (23 пациента). Только хирургическое лечение выполнено у 14 больных (20%).

Хирургическое лечение в объеме радикальной мастэктомии с сохранением грудных мышц выполнено 68 пациентам (97,1%), радикальная мастэктомия по Пейти - 2 пациента (2,8%).

Неоадъювантное лечение было проведено в 14,2% (10 больных): в 60% случаев проводилась химиотерапия (в объеме 4-6 курсов по схеме САР или АС), в 10% - лучевая терапия (на область молочной железы 60 Гр и регионарные зоны 46 Гр) сочеталась с гормонотерапией (Тамоксифен 20 мг/сут), у 1 пациента (10%) на фоне химиотерапии (Метоксантрон + 5-фторурацил) проводилась горномонотерапии Тамоксифеном, только лучевая терапия - у 2 (20%) больных.

Адъювантное лечение было проведено 56 больным (78,6%) и включало полихимиотерапию, лучевую терапию, эндокринотерапию или их сочетание (рис.6).

Ы Химиотерапия

■ Эндокринотеряпия

В Химиотерапия + гормонотерапия

ОХнмиотерапия + лучевая терапия

□ Лучевая терапия + гормонотерапия

□ Сочетание всех видов лечения

Рис. 6 Распределение больных в соответствии с проведенным методом послеоперационного лечения.

Молекулярно-генетическая часть исследования была выполнена на образцах ДНК, выделенных:

1-из лимфоцитов периферической крови у 15/38 (39,5%) пациентов.

2-из срезов с парафиновых блоков нормальной ткани послеоперационного материала у 38 (100%) пациентов.

Наличие мутаций в ДНК, выделенной из нормальной ткани, может рассматриваться как носительство терминальных мутаций генов ВЯСА1, ВЯСА2, ТР53, СНЕК2 характеризуя наследственную предрасположенность к РМЖ у мужчин, и используется в проспективных исследованиях.

В исследуемой группе больных выявлено 10/38 (26,3%) мутаций в генах ВЯСА!, ВЯСА2, ТР53, СНЕК2, в 2/10 (20 %) случаях сочетание 2 мутаций в генах ВЯСА1 и ТР53, СНЕК2 и ТР53.

Определение структурных вариантов генов проводили в несколько этапов, с использованием нескольких молекулярно-генетических методик с целью расширения диагностической панели генетического поиска и оценки чувствительности и специфичности используемых методик (рис 7).

Рис.7. Дизайн молекулярно-генетического исследования при РМЖ у мужчин.

На первом этапе проводилось МГК и ДНК-диагностика с использованием метода конформационно-чувствительного гель- электрофореза с последующим секвенированием фрагментов ДНК идентифицированных как мутантные (таб. 2, рис 8).

Таблица 2.

Анализ мутаций в генах ВЯСА1/2, ТР53 и МШ1 с использованием КЧГЭ

(п=38)

BRCA1 В RCA 2 TP53 MLH1

185delAG 6174delT Int3dupl6 618del3

160 ! С С A KG II G j A 170 <. A T С С С N 11 1 m Ж G G A IT i' 1 i 1! 1 tUr 1 I » Wv¥\ 180 И G iil 4 A A M VrV.V a G •if л л Д i i ^ j i f

Рис.8. Секвенирование мутации 185delAG.

В ходе проведенного этапа выявлено:

Ген мутация Генотип Количество пациентов

BRCA1 185 AG/del AG AG/AG 5

BRCA2 6174T/delT T/T 2

MLH1 618del3 1

TP53 Dupl6 3

На втором этапе проводился анализ полиморфизма в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 методом аллель-специфичной гибридизации, (таб. 3, рис. 9)

Таблица 3

Анализ мутаций в генах ВЯСА 1/2, СНЕК2 с использованием метода биочипов.

Ген Мутация BRCA1 185AG/ delAG BRCA1 300T/G BRCA1 4153 АУ delA BRCA1 4158A/G BRCA1 5382С/ Ins С BRCA2 6174/ delT Chek2 1100С/ deIC

Генотип тя А/А А/А С/С Т/Т С/С

Полученные мутации 5 2

Рис.9. Пример метода диагностики с использованием гибридизационных биочипов.

Мутации, выявленные на этапе КЧГЭ, подтверждены при использовании метода биочипов, что говорит о высокой чувствительности и специфичности используемой методики.

Заключительный этап ДНК-диагностики проводился с использованием метода Real-Time PCR (ПЦР в реальном времени), с целью расширения диагностической панели данных. При проведении данного этапа выявлена только одна мутация в гене СНЕК2{ 1 lOOdeIC) (рис. 10).

Тнлммугмо« BRCAI BRCA2

5382msO 185delAG 4154delA <S174d«lT, 1328djl4 9318del4

2963dell0 3875dsl4 3819del3 C610 208M«1A

CHEK2 1 lOOdeIC 470T>C IVS2+10>A

ESg.— БЯ>-

• dß «ш г.

f

Рис.10. Анализ мутаций в генах BRCA1/2, СНЕК2 с использованием Real-Time ПЦР (п=38)

Таким образом, в ходе проведенной ДНК-диагностики частота выявленных мутаций у мужчин, больных РМЖ составила 26,3% (10/38).

Статистический анализ

Информация заносилась в специально созданную базу данных. Статистическая обработка показателей проводилась с использованием описательной статистики, а также с помощью методов медико-биологической статистики. Различия считались значимыми, если значение «р» было менее 0,05. Выживаемость анализировалась по методу Каплана-Мейера (1958) и сравнивалась по лог-ранг тесту.

Для сравнения качественных признаков использовался у^-тест с поправкой Йетса на непрерывность при таблицах сопряжения 2x2 или точный критерий Фишера при малых выборках. Во всех случаях применялся 95% доверительный интервал и двусторонний Р.

Статистическая обработка данных производилась с использованием программы GraphPad Prism v.4.0, пакета программ Statistical Package for the Social Sciences software program (version 15.0; SPSS Inc.Chicago, IL).

Результаты исследования и их обсуждение

По результатам проведенного исследования выявлены следующие особенности рака молочных желез у мужчин.

Средний возраст изучаемой когорты больных составил 60±1,3 лет, медиана возраста в исследовании - 65,5 лет. При оценке зависимости возраста и стадии заболевания, отмечается тенденция к выявлению у мужчин ранних стадий в более молодом возрасте, до 60 лет (р=0,14).

При анализе общей выживаемости в зависимости от стадии заболевания можно отметить следующее - при ранних стадиях заболевания показатели как общей, так и безрецидивной выживаемости превышают показатели при местно-распространенных стадиях. При III-IV стадиях общая 3-летняя выживаемость равна 100%, при ранних стадиях составляет 92±4,5%. Показатели общей 10-летней выживаемости снижаются как при ранних стадиях, так и при местно-распространенных и составляют 80±3,5% и

41±5,5% соответственно. При 1-П стадиях общая выживаемость 5- и 10-летняя выше, чем при ПНУ стадиях. Однако значения являются статистически не значимыми (р>0,05) (рис.11).

от стадии заболевания.

Анализируя данные безрецидивной выживаемости в зависимости от стадии заболевания: при начальных стадиях заболевания показатели как 3-,5-и 10-летней безрецидивной выживаемости превышают показатели при местно-распространенных стадиях (р>0,05) (рис.12). Показатели выживаемости не несут различий в интервале до 3 лет и проявляются после 5-летнего временного промежутка.

При оценке продолжительности и качества жизни показатели как общей (рис.12), так и безрецидивной выживаемости были статистически значимо выше при 2 степени злокачественности (3-летняя - 97±2,4%, 5-летняя -92±3,9% и 10-летняя - 83±5,3%; безрецидивная 3-летняя - 92±3,8%, 5-

I

летняя-81±5,6%, 10-летняя - 74±6,2%. В то время как эти же показатели при 3 степени злокачественности составили для общей - 70±17,3%, 53±18,8%, 18±14,5% и безрецедивной - 57±18,7%, . 39±18,4%, 19±14,8% (соответственно) (для общей р=0,0009, для безрецидивной р=0,004).

Рис.12. Общая и безрецидивная выживаемость в зависимости от степени

злокачественности

При изучении рецепторов гормонов в опухоли молочной железы у мужчин в 76,6% (46 пациентов) случаев в проведенном исследовании опухоли были позитивны по двум видам рецепторов. Нами не было установлено какой-либо зависимости уровня рецепторов от возраста и стадии заболевания. Показатель пролиферации Ki-67 в 52,5% (21 пациент) случаях был менее 19%, т.е. наблюдалась низкая пролиферативная активность опухоли. Уровень экспрессии гена Her2/neu у 40 (86,9%) больных был равен «0» или «+1», в 10,9% (6 пациентов) случаях потребовалось проведение FISH-реакции, при которой гиперэкспрессия проявилась лишь в одном случае, однако ввиду малого количества случаев показатели нельзя считать значимыми.

Имунногистохимические характеристики опухоли, такие как РЭ, РП, Her2/neu и индекс пролиферации Ki-67, в нашем исследовании не влияли на продолжительность и качество жизни пациентов.

Нами был проведен анализ различных вариантов лечебных тактик, которые использовались при лечении мужчин, страдающих раком молочной железы.

Неоадъювантное лечение в различном объеме было проведено 14,2% (10) пациентов с местно-распространенным РМЖ. Данные общей и

безрецидивной выживаемости в зависимости от наличия или отсутствия предоперационного лечения не являются значимыми, но обращает внимание тот факт, что показатели общей выживаемости были выше на 3-м интервале в группе больных, которым проводилось неоадъювантная терапия (рис.13).

Рис.13 Общая и безрецидивная выживаемость в зависимости от наличия или отсутствия неоадъювантного лечения.

Адъювантное лечение проведено у 56 больных (78,6%) и включало полихимиотерапию, лучевую терапию и эндокринотерапию.

Таблица 3.

Общая выживаемость в зависимости от вида адъювантного лечения.

Лечение Общая выживаемость

3-летняя 5-летняя 10-летняя

Отсутствие лечения (только хирургическое) 92,1±7,2 67,2±12,5 57,8±13,2

Один вид лечения 100 88,2±6,7 68,9±9,6

Два и более вида лечения 92,9±4,4 82,1±6,6 66,9±8,1

р>0,05

Общая выживаемость при 2 и более видах адъювантного лечения выше, чем при хирургическом лечении, 3-летняя - 92,9±4,4%,-5-летняя - 82,1±6,6%, 66,9±8,1%, но снижена в сравнении с одним видом лечения. При этом значимых различий при сравнении показателей выживаемости не выявлено, р>0,05.

Таблица 4.

Безрецидивная выживаемость в зависимости от вида адъюваитного лечения.

Лечение Безрецидивная выживаемость

3-летняя 5-летняя 10-летняя

Отсутствие лечения (только хирургическое) 71,2±12,1 54,2±13,3 45,1±13,3

Один вид лечения 75,9±8,9 69,9±9,5 70,2±9,5

Два и более вида лечения 86,9±5,8 75,1±7,5 63,1±8,4

р>0,05 р=0,15 (сравнение хирургического и комплексного)

отмечены у пациентов при хирургическом лечении, по сравнению с двумя и более видами адъювантного лечения: 3-летняя - 71,2±12,1%, 5-летняя-54,2±13,3% и 10-летняя-45,1±13,3% (р=0,15).

Произведен анализ общей и безрецидивной выживаемости общего лечения, проведенного всем больным (как неоадъювантого, так и адъювантного и хирургического).

При сравнении показателей продолжительности жизни, в зависимости от вида лечения, в группе больных получивших комбинированное лечение 3-летняя и 5-летняя общая выживаемость составляет 100%, снижаясь к 10-летнему интервалу до 74,1±9,1%. Показатели выживаемости при комплексном и хирургическом лечении - 3-летняя - 93,1±4.4% и 90,9±7,6%, 5-летняя -73,2±7,7% и 63,9±12,8% соответственно. Показатели 10-летней выживаемости аналогичны: 64,1±12,8% - хирургическом, 58,9±8,5% - комплексном (р>0,05) (рис.14).

о 50 ° 40

-хирургическое -комбинированно • комплексное

} 48 60 72 84 96108120132144 месяцы

- »руртмесхое

- коМ5широва+се комплексное

О 12 24364860 72 8496 108120132144 Меся1#>1

Рис.14 Общая и безрецидивная выживаемость в зависимости от общего проведенного лечения.

Показатели качества жизни не имели значимых различий (р>0,05) и при комбинированном лечении данные 3-летней выживаемости составили 86,2±7,2%, 5-летней - 78,9±8,4%, 10-летней - 73,2±9,6%, при хирургическом и комплексном - 67,8±12,4% и 80,2±6,9, 50,8±13,3% и 68,1±8,1%, 50,9±13,3% и 57,1±8,6% соответственно.

Таким образом, наши данные подтверждают исследования ряда отечественных и зарубежных авторов, которые указывают на то, что использование чисто хирургического лечения рака молочной железы у мужчин является недостаточным вне зависимости от стадии опухолевого процесса.

При анализе отдаленных результатов лечения прогрессирование заболевания отмечалось у 19 (27,2%) пациентов. Местный рецидив наблюдался в 7 случаях (10%), из них в 1 случае он сочетался с наличием отдаленных метастазов в другие органы. Метастатическое поражение других органов зарегистрировано у 12 пациентов (17,1%): в большинстве случаев 58,3% (7 пациентов) это костная система.

Медико-генетическое консультирование и молекулярно-генетическое исследование с целью определения значимых мутаций в генах ВЯСА1/2, ТР53,СНЕК2, было проведено у 38/70 (54,2%) пациентов.

В ходе проведения тестирования результаты и методы диагностики были валидизированы. Чувствительность и специфичность выявленной частоты мутаций во всех методиках составили 100%.

В результате было выявлено 10 различных мутаций, что составило 26,3%. (10/38). Из них:

1. мутация в гене ВКСА1 (мутация 185с1е1А) составила 50% (5/10) среди пациентов с мутациями и 13,1% (5/38) в общей выборке;

2. в гене ВЯСА2 (мутация 6174ёе1Т) - 20% (2/10) среди носителей мутантного генотипа и 5,2 % (2/38) в общей выборке;

3. в гене ТР53 (1тЗс1ир16) составила 30% (3/10) среди пациентов с мутациями и 7,9 % (3/38) в общей группе;

4. в гене СНЕК2 (мутация 1100с1е1С) - 10% (1/10) у больных с мутантным генотипом и 2,6 % (1/38) среди всей группы;

5. у одного пациента проведена ДНК-диагностика всей кодирующей части гена, в результате выявлена мутация в гене МЬН1(>618(1е13).

У 2 пациентов в нашем исследовании встречалось сочетание мутаций в гене СНЕК2 и в гене ТР53, в гене ВПСА1 и в гене ТР53.

В результате выполненного молекулярно-генетического исследования пациенты были разделены на 2 группы: 1) с мутациями в генах ВЯСА1/2, ТР53, СНЕК2, МЬН1 (п=10) (учитывая малое количество больных, мы сочли целесообразным объединить пациентов-носителей мутаций генов ВЯСА1/2, ТР53, СНЕК2, МШ1 ввиду их роли в канцерогенезе РМЖ); 2) больные без мутаций (п=28) (рис.15).

Рис.15. Распределение больных в зависимости от генотипа

Средний возраст среди больных-носителей патологического генотипа составил 60,2±3,7 лет, медиана возраста 59,5 лет. Возраст больных с мутантным генотипом и отсутствием мутаций находится в одном возрастном интервале.

В 70% случаев отмечается тенденция к более распространенной стадии заболевания, ассоциированного с мутациями в генах. Анализируя зависимость стадии заболевания от мутаций в генах, показано что различия, как и в случае возраста, не являются статистически значимыми.

В нашем исследовании у 60% (42/70) пациентов присутствуют случаи злокачественных новообразований в семейном анамнезе у родственников I линии родства.

Первично-множественные злокачественные новообразования являются важной составляющей наследственной предрасположенности к развитию РМЖ. Наиболее чаще в нашем исследовании второй злокачественной опухолью являлся рак предстательной железы. Известно, что мутация в гене В11СА2 ассоциирована не только с РМЖ у мужчин, но и в случае рака предстательной железы. У 3/38 пациентов выявлены ПМЗН, во всех случаях вторым заболеванием являлся рак предстательной железы (рис.16).

/ W 60 РМЖ

6Б РПЖ 66 РМЖ * BRCA2 / 6174delT 73

37

Рис.16. Родословная пациента с мутацией гена BRCA2 и присутствием первично-множественного заболевания.

У 1 пациента диагностирован метахронный рак: сочетание новообразований предстательной железы, слепой кишки, меланомы кожи, ободочной кишки. В этом случае ДНК-диагностика генов BRCA Уг не подтвердила наличие мутаций, а при выполнении дифференциального молекулярно-генетического поиска была выявлена наследуемая мутация гена MLH1, что подтвердило наследственную форму РМЖ у пациента. Аналогичный случай (сочетания РМЖ и рака толстой кишки у мужчины) был описан Boyd J в 1999 г.

Несмотря на небольшое количество случаев, можно сделать предположение, что в 25,3% (2/3) ПМЗН ассоциированы с терминальными мутациями генов при РМЖ у мужчин. 22

РМЖ у мужчин носителей мутантного генотипа принадлежит инфильтративному протоковому типу рака. Среди пациентов изучаемой группы данный вид опухоли наблюдался как в общей группе пациентов, так и у больных с мутациями (90%).

В изучаемой группе пациентов (п=38) опухоли чаще были представлены 2 степенью злокачественности и ассоциированы с наличием мутаций в 90% случаев. Однако значения не имеют статистических различий (р>0,05).

В нашем исследовании в 80% опухоли являются положительными по РЭ и РП как в общей группе больных, так и в группе пациентов с мутациями. У пациентов с мутантным генотипом экспрессия фактора Нег2/пеи не выявлена, тогда как среди общей группы пациентов (п=70) гиперэкспрессия выявлена лишь у одного пациента (1,4%). Анализ зависимости морфологических факторов: наличие рецепторов эстрогена и прогестерона, экспрессия гена Нег2/пеи, индекса пролиферации Кь67 в группах сравнения не выявил значимых различий (р>0,05).

Учитывая ретроспективный анализ проведенного нами исследования, мы имели возможность оценить данные 3-, 5- и 10-летней общей и безрецидивной выживаемости, как среди всей выборки пациентов, так и в группе с мутантным генотипом.

Отдельно проанализированы показатели общей и безрецидивной выживаемости в группе пациентов с отсутствием мутаций в зависимости от общего объема проведенного лечения. Показатели 3-летней - 74,1±21,9%, 5-летней - 50,2±25% и 10-летней - 49,9±25% общей выживаемости при хирургическом лечении достоверно ниже (р=0,03) чем при комбинированном лечении 3-летняя - 100%, 5-летняя - 87,9±10,8%, 10-летняя - 88,3±10,8%. При комплексном лечении 3-летняя - 95,1±5,6%, 5-летняя 94,9±5,6% выше, чем при хирургическом, но снижается в сравнении при комбинированным лечением (рис.17).

Рис.17. Общая и безрецидивная выживаемость больных в зависимости от проведенного лечения в группе без мутаций.

Безрецидивная выживаемость при хирургическом лечении 3-летняя -53,2±24,9%, 5-летняя - 25,8±21,9%, 10-летняя - 26,1±21,9% значимо снижается (р=0,02) по сравнению как с комбинированным 3-летняя -92,2±9,0%, 5-летняя - 91,8±9,1%, 10-летняя - 92,3±9,0%, так и комплексным лечением 3-летняя - 90,1±7,7%, 5-летняя - 84,2±9,4%. При сравнении комплексного и комбинированного лечения значимых различий не выявлено (р=0,4) (рис.17).

В группе больных с мутациями показатели общей выживаемости выше, по сравнению с таковыми в группе без мутаций: 3-летняя и 5-летняя 100%, 10-летняя - 83,1±11,9% и 3-летняя - 92,1±5,1%, 5-летняя - 87,8±6,1%, 10-летняя - 77,2±7,9% соответственно (рис.18).

; о

а з>

-чтч"

-нет (упцм

о иаэввюпыягааизгш иввш

Рис 18. Общая и безрецидивная выживаемость в зависимости от мутаций в исследуемых генах

Результаты более высокой выживаемости у пациентов-носителей мутаций, по сравнению с группой пациентов без мутаций, является своего рода закономерностью ввиду особенностей молекулярного патогенеза, а именно снижения или отсутствия репарации двухнитевых разрывов ДНК, что в свою очередь способствует наилучшему эффекту от проводимого лечения.

Выводы

1. Впервые на клиническом материале ФБГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН определен вклад наследственных факторов в развитии РМЖ у мужчин - 26,3% (10/38): частота мутации гена ВЯСА1 (мутация 185с1е1А) составила 13,1% (5/38) случаев, частота мутации гена ВИСА2 (мутация 6174с1е1Т) - 5,2% (2/38), мутации в гене СНЕК2 (мутация ПООсЗЫС) - 2,6% (1/38) и в гене ТР53 (1ШЗ(1ир16) - 7,9% (3/38) случаев. Мутация в гене МШ1 выявлена в одном случае - 2,6% (1/38).

2. Онкологически отягощенный семейный анамнез отмечен у 47,4% пациентов и в 12,6% случаев определяется взаимосвязь семейного анамнеза с терминальными мутациями в генах ВЯСА1/2, ТР53, СНЕК.

3. У пациентов с первично-множественными злокачественными новообразованиями в 66,6% выявлены терминальные мутации в генах ВЯСА2 и МЬН1, что позволяет утверждать, что ПМЗН являются генетически детерминированными опухолями.

4. Показатели общей (р=0,0009) и безрецедивной (р=0,004) выживаемости достоверно снижаются в группе больных, характеризующейся 3 степенью злокачественности: 3-летней - 69,8±17,3%, 5-летней -53,2±18,8%, 10-летней - 17,9±14,5% и безрецедивной 3-летней -. 57,2±18,7%, 5-летней - 38,9±18,4%, 10-летней - 19,1±14,8%. Степень злокачественности является основным прогностическим фактором РМЖ у мужчин.

5. Инфильтративный протоковый тип рака, ассоциированный с мутациями в генах ВРСА1/2, ТР53, СНЕК2, характерен для 90% случаев РМЖ у мужчин.

6. В группе больных с мутациями показатели общей выживаемости выше, чем в группе без мутаций: 3-летняя и 5-летняя 100%, 10-летняя -83Д±11,9% и 3-летняя - 92,1±5,1%, 5-летняя - 87,8±б,1%, 10-летняя -77,2±7,9% соответственно.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в журналах рекомендованных ВАК РФ:

1. Денчик, Д.А. Особенности листовидных опухолей / Д.А. Денчик, И.К. Воротников, JI.H. Любченко, O.A. Анурова, A.B. Быкова // Опухоли женской репродуктивной системы 2010г.- №3 с.21-24.

2. Быкова, A.B. Рак молочных желез у мужчин: некоторые генетические аспекты / A.B. Быкова, И.К. Воротников, Л.Н. Любченко, Е.М. Погодина, Е.А. Ким, Д.А. Денчик // Материалы VI съезда онкологов и радиологов стран СНГ- Душанбе, 2010г.-с.141

3. Быкова, A.B. Роль мутаций генов BRCA1 и BRCA 2 в возникновении рака молочных желез у мужчин / A.B. Быкова, И.К. Воротников, Л.Н. Любченко, Я.В. Вишневская, Д.А. Денчик // Опухоли женской репродуктивной системы 2011г.- №1 с.29-32.

4. Быкова, A.B. Проблема рака молочной железы у мужчин / А.В.Быкова, И.К. Воротников, Я.В. Вишневская, Д.А. Денчик, Л.Н. Любченко // Сибирский онкологический журнал- 2011г.- №4. Г.Томск с.64-68.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

5. Быкова, A.B. Рак молочных желез у мужчин: генетические аспекты / A.B. Быкова, И.К. Воротников, Л.Н. Любченко, Д.А. Денчик // Материалы научно-практической конференции «Достижения современной онкологии» Барнаул 2010г.-с.15.

6. Денчик, Д.А. Листовидные опухоли молочных желез / Д.А. Денчик, И.К. Воротников, A.B. Быкова, O.A. Анурова, Л.Н. Любченко // Научно-практический рецензируемый медицинский журнал «Справочник акушера-гинеколога»- 2011г.-№ 5-6 с.15-17.

Подписано в печать 05.12.12 Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеюСору». Тираж 100 экз. Заказ № И8Э Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Актуальность темы исследования.

Рак молочной железы (РМЖ) во всем мире лидирует среди онкологической патологии наружных локализаций и занимает III место среди всех злокачественных новообразований, уступая лишь раку легких и раку желудка. В 2009 г. в России зарегистрированы 54 315 новых больных раком молочной железы. По сравнению с 2004 г. прирост составил 10,3%[1].

Рак молочной железы у мужчин - редкое заболевание: на его долю приходится около 1% всех диагностируемых в мире случаев рака молочной железы. В 2008 году в России на 52 469 новых случая рака молочной железы выявлено примерно 500 заболеваний у мужчин [1]. Согласно данным реестра Surveillance, Epidemiology and End Results(SEER), за период с 1973 по 2005г. зарегистрировано 5494 случая рака молочной железы у мужчин и 835 000- у женщин [73].

По сравнению с РМЖ у женщин, РМЖ у мужчин чаще имеет клинические признаки, характерные для поздних стадий заболевания. Приблизительно в 20% наблюдений диагноз рака молочной железы у мужчин при первичном обращении не устанавливается, а в 46,8% при первичном обращении имеется значительное местное распространение процесса [16].

Около 15-30 % мужчин имеет отягощенный семейный анамнез в отношении рака молочной железы или яичников. У мужчин-носителей мутации в гене BRCA2, риск развития РМЖ на протяжении жизни составляет 6%, что в 150-200 раз выше, чем в общей популяции. [35, 40-41, 60, 97,100, 106]. Тогда как у женщин с патологическим BRСА1-генотипом риск развития РМЖ на протяжении жизни составляет 50-80%, риск развития рака контрлатеральной молочной железы - 40-60%. В клинико-генетических исследованиях, проведенных в семьях с накоплением рака молочной железы, структурные перестройки в гене BRCA2 были найдены у мужчин в 76 % случаев, мутации гена BRCA1 в этих семьях были найдены в 16 % случаев [17].

По данным различных зарубежных литературных источников [83] частота мутаций генов BRCA1 и BRCA2 также значительно различается. В исследовании, проведенном в Северной Калифорнии, Friedman et al идентифицировали только 2 мутации гена BRCA2 при молекулярно-генетическом исследовании 54 случаев рака молочной железы у мужчин. Thorlacius et al обнаружили мутации гена BRCA2 в 40% случаев рака молочной железы у мужчин, диагностированных в Исландии в течение 40 последних лет [76]. Мутации гена BRCA1 в этих исследованиях не обнаружено. Частотные оценки носительства BRCA1-мутаций не превышали 11%, тогда как высокие показатели наследственно-обусловленного рака молочных желез у мужчин были характерны для закрытых популяций с «эффектом родоначальника» [17]. Схожие частотные оценки были получены в исследовании, проведенном Frank et al.: мутации в гене BRCA1 обнаружены в 11% случаев, BRCA2- в 18% [54]. Brose et al. рассчитали, что кумулятивный зависимый риск развития РМЖ у мужчин-носителей BRCA- мутаций составляет 5,8% по сравнению с 0,1% в общей популяции [35]. В работах Basham et al. и Ottini L. et al. показано, что частота BRCA1 мутаций колеблется от 0 до 16%, BRCA2 — от 8 до 14% [77, 80].

Таким образом, пациенты мужского пола, чьи матери, сестры или дочери получили положительные результаты теста в отношении генетической предрасположенности к развитию рака, также находятся в группе риска развития злокачественных новообразований.

Различия в молекулярном патогенезе между ÄKC4-ассоциированными и ненаследственными опухолями молочной железы предполагают, что эти опухоли могут кардинальным образом различаться по фенотипическим и прогностическим признакам, а терминальные мутации BRCA можно рассматривать как молекулярно-генетические маркеры, имеющие прогностическое значение.

В настоящее время ведется активный поиск факторов, которые позволяли бы прогнозировать течение рака молочной железы у мужчин. Одними из наиболее важных прогностических факторов при РМЖ у мужчин является наличие экспрессии онкопротеина с-егЬВ-2 и показателя пролиферативной активности Ki-67. Сведения относительно экспрессии Her2/neu клетками РМЖ у мужчин весьма противоречивы. По сведениям Европейского института онкологии (European Institute of Oncology, IEO), частота экспрессии гена Her2/neu составляет 15 % [43]. Маркер пролиферативной активности Ki-67 играет важную роль при раке молочной железы у женщин, однако его значимость в прогнозе рака у мужчин до конца не выяснена и требует дальнейшего изучения.

Несмотря на схожие черты с раком молочной железы у женщин, в изучении данного заболевания у мужчин остается еще много открытых вопросов. Трудно прийти к заключению относительно влияния факторов экспрессии протоонкогена c-erbB-2 (Her2/neu) и показателя пролиферативной активности Ki-67 в виду их недостаточной изученности относительно РМЖ у мужчин. Остается открытым вопрос и о распространенности молекулярно-биологических подтипов данной патологии. Все это дает возможность для дальнейшего изучения этого научного направления.

Наиболее актуальным представляется наличие клинической составляющей в совокупности с генетическими особенностями заболевания у мужчин. В отечественной литературе этот вопрос изложен не достаточно подробно, а исследований, посвященных генетической предрасположенности в России не проводилось. Работы, связанные с клинико-генотипическими корреляциями BRCA-ассоциированного РМЖ у мужчин единичны. В зарубежной литературе данные о генетической предрасположенности значительно разнятся. В связи с этим чрезвычайно интересно определить генетическую предрасположенность у мужчин больных раком молочных желез, а также оценить взаимосвязь клинических и генетических аспектов данного заболевания.

Цель исследования: улучшение диагностики и результатов лечения РМЖ у мужчин на основе изучения взаимосвязи клинико-морфологических факторов прогноза с мутациями в генах BRCA1, BRCA 2, ТР53.

Задачи исследования:

1. Изучить прогностическую значимость клинических факторов (возраст, стадия болезни), наличие семейного анамнеза, морфологических и биологических факторов (рецепторный статус, экспрессия Her-2/neu и Ki-67) у мужчин, больных раком молочной железы.

2. Определить частоту терминальных мутаций генов BRCA 1 и BRCA2, ТР53 у мужчин, страдающих раком молочной железы.

3. Проанализировать взаимосвязь мутаций в генах BRCA 1 и BRCA2, TP53 и семейного анамнеза при раке молочных желез у мужчин.

4. Выявить взаимосвязь между наличием мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ТР53 и клиническими, морфологическими особенностями рака молочных желез у мужчин.

5. Изучить продолжительность и качество жизни больных в зависимости от клинико-генетических факторов и проведенного лечения.

Научная новизна: впервые на материале РМЖ у мужчин, накопленном в ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН с 1985 по 2009г., определена частота терминальных мутаций в генах BRCA1 (мутация 185delAG), BRCA2 (мутация 6174delT), ТР53 (Int3dupl6), СНЕК2 (llOOdelC), с использованием комбинации молекулярно-генетических методов и последующего секвенирования фрагментов ДНК, идентифицированных в качестве мутантных.

Подтверждено, что онкологически отягощенный семейный анамнез в 33,3% обусловлен наследованием терминальных мутаций в генах ВЯСА1 , ВЯСА2, ТР53, СНЕК2.

У мужчин, больных РМЖ проведена оценка клинико-морфологической картины, статуса рецепторов стероидных гормонов, экспрессии Нег2/пеи, уровня Кл-67.

При анализе взаимосвязи между изменениями на генетическом уровне с клиническим течением и основными морфологическими характеристиками заболевания показано, что основным прогностическим фактором РМЖ у мужчин является степень злокачественности опухоли.

Практическая значимость работы: Результаты проведенной работы могут быть использованы в профессиональной деятельности специалистов -онкологов при обследовании мужчин с подозрением на злокачественное образование в молочной железе.

Молекулярно - генетическое исследование генов ВКСА1, ВЯСА2, СНЕК2, МЬН1, ТР53 позволяет прогнозировать течение данного заболевания.

Результаты проведенного исследования планируется использовать в практической деятельности клинических учреждений онкологического профиля, при медико-генетическом консультировании, а так же для разработки методических рекомендаций.

ВЫВОДЫ

1. Впервые на клиническом материале ФБГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН определен вклад наследственных факторов в развитии РМЖ у мужчин, который составил 26,3%: частота мутации гена ВЯСА1 (мутация 185ёе1А) составила 13,1 % случаев, частота мутации гена ВЯСА2 (мутация 6174ёе1Т)- 5,2 %, мутации в гене СНЕК2 (мутация 1100ёе1С)- 2,6% и в гене ТР53 (М3ёир16)- 7,9 % случаев. Мутация в гене МЬН1 выявлена в одном случае.

2. Онкологически отягощенный семейный анамнез отмечен у 47,4% пациентов и в 33,3% случаев ассоциирован с терминальными мутациями в генах ВЯСА1/2, ТР53, СНЕК2.

3. У пациентов с первично-множественными злокачественными новообразованиями в 66,6% выявлены терминальные мутации в генах ВЯСА2 и МЬН1, что позволяет утверждать, что ПМЗН являются генетически детерминированными опухолями.

4. Показатели общей (р=0,0009) и безрецедивной (р=0,004) выживаемости достоверно снижаются в группе больных, характеризующейся 3 степенью злокачественности: 3-летней- 69,8±17,3%, 5-летней-53,2±18,8%, 10-летней- 17,9±14,5% и безрецедивной 3-летней-57,2±18,7%, 5-летней- 38,9±18,4%, 10-летней- 19,1±14,8%. Степень злокачественности является основным прогностическим фактором РМЖ у мужчин.

5. Инфильтративный протоковый тип рака, ассоциированный с мутациями в генах ВЯСА1 и ВЯСА2 , ТР53, СНЕК2 , характерен для 90%) случаев РМЖ у мужчин.

6. В группе больных с мутациями показатели общей выживаемости выше, чем в группе без мутаций: 3-летняя и 5-летняя 100%), 10- летняя-83,1±11,9% и 3-летняя- 92,1±5,1%, 5-летняя- 87,8±6,1%, 10-летняя-77,2±7,9% соответственно.

Практические рекомендации

Результаты проведенного исследования могут быть использованы в профессиональной деятельности специалистов онкологов, генетиков, а также среди врачей общей практики при обследовании мужчин с подозрением на злокачественное образование молочных желез.

Молекулярно-генетическая диагностика с целью определения мутаций в генах ВЯСА1, ВЯСА2, ТР53, СНЕК2, МЬН1 при раке молочных желез у мужчин может являться дополнительным диагностическим методом с целью определения прогноза заболевания.

Полученные данные планируется внедрить в практическую деятельность клинических отделений и медико-генетического консультирования учреждений здравоохранения, а также для методических пособий в медицинских ВУЗах и кафедрах последипломного образования.