Автореферат и диссертация по медицине (14.00.48) на тему:Клиническое значение ДНК-топоизомераз в оценке активности и прогноза нефритов

На правах рукописи

РГБ ОД

11 АПР 2002

ИВАНОВА ЛИЛИЯ ВИКТОРОВНА

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗ В ОЦЕНКЕ АКТИВНОСТИ И ПРОГНОЗА НЕФРИТОВ

14.00.48 - нефрология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М. Сечено

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Е.М. Шилов доктор медицинских наук, профессор А.А. Иванов

Официальные оппоненты:

на заседании диссертационного совета Д 208.040.05 при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: 119992, Москва, Б. Пироговская ул., д. 6, стр.3.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: Москва, Зубовская площадь, д. 1.

Автореферат разослан «_»_2002 года

доктор медицинских наук, профессор Л. В. Козловская доктор медицинских наук, профессор В.М. Ермоленко

Ведущее учреждение:

Учебно-научный Центр Медицинского Центра Управления делами Президента Российской Федерации

Защита состоится «_»

2002 года в_часов

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Е.В. Волчкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Гломерулонефрит (ГН) - одна из наиболее частых причин хронической почечной недостаточности. Лечение ГН остается сложной проблемой, и основу лечения, направленного на отдаление терминальной почечной недостаточности, составляет патогенетическая терапия, базирующаяся на современных представлениях об иммунных и неиммунных механизмах происхождения и прогрессирования ГН [И.Е. Тареева 1995]. Несмотря на достигнутый за последнее десятилетие прогресс в иммунодепрессивной терапии ГН, лечение прогрессирующих форм нефрита требует дальнейшей разработки [И.Е. Тареева с соавт. 1989; H.A. Мухин с соавт. 1989; Е.М. Шилов 1994; Т.Н. Краснова 1998; G.G. Illei & J.H. Klippel 1998; С.С. Geddes & D.C. Cattran 2000; P. Passerini & С. Ponticelli 2001]. Кроме того, большинство иммунодепрессантов (ИД) вызывают ряд тяжёлых осложнений и обладают непосредственным нефротоксическим эффектом [J.L. Ader 1998; С. Ponticelli 1999; W.F. Finn 1999]. Поэтому остаётся актуальным дальнейшее углублённое изучение патогенеза ГН с целью поиска новых маркёров для оценки активности и прогноза ГН и, возможно, точек приложения действию новых классов ИД с принципиально другими механизмами действия, обладающих более высокой терапевтической эффективностью и меньшей токсичностью.

Известно, что важную роль в возникновении и прогрессировании патологических процессов в почках играют иммунные комплексы и антитела (AT), а также реакции клеточного иммунитета [W. G. Couser 1999]. Наиболее чётко это продемонстрировано при волчаночном нефрите (ВН) [J.S. Cameron 1999; М.Н. Foster et al. 1999]. Хотя AT к ДНК и являются основным патогенетическим фактором [N. Suzuki et al. 1997; D.A. Isenberg et al. 1997], y пациентов с ВН были найдены другие аутоантитела [J.C. Kootstra et al. 1996], среди которых описаны AT к топоизомеразам I и На [A. Hoffmann et al. 1989; L. Stojanov et al. 1995; R.; Kameda et al. 1997; Katsumi et al. 2000; Gussin et al. 2001].

Топоизомеразы - это ДНК-связанные ферменты, контролирующие топологическое состояние ДНК посредством участия в процессах транскрипции, репликации и сегрегации делящихся хромосом [М. Geliert 1981; К. Drlica 1984; J.C. Wang 1997]. Поскольку топоизомеразы тесно связаны с ДНК [J.C. Wang 1985; W.C. Earnshaw 1985] то, следовательно, включены в процесс, ведущий к образованию AT к ДНК, на что указывает наличие антигистоновых AT при ВН [R. Suenaga 1996]. Приведенные данные свидетельствуют о возможной роли топоизомераз в аутоиммунном процессе.

Участвуя в процессах транскрипции и репликации, топоизомеразы могут служить индикаторами метаболической и пролиферативной активности клеток [U. Kellner et al. 2000], что успешно используется для оценки прогноза у пациентов со злокачественными заболеваниями [Р. Rudolph 1999; L. Nakopoulou 2001]. В клинической онкологии также широко применяют ингибиторы ТОП, которые при ряде злокачественных заболеваниях

имеют достаточно хороший терапевтический эффект и многие из них (топотекан, иринотекан) обладают незначительным нефротоксическим действием по сравнению с современными ИД [S. O'Reilly et al. 1996; D. Abigerges 1996; P. Canal 1996; С Kollmannsberger 1999].

Однако опубликованных работ по исследованию экспрессии этих ферментов е почечных биоптатах больных нефритами и в нормальной почечной ткани к настоящему времени нет. Изучение этого аспекта является важным, так как уровень экспрессии эти> ферментов может отражать клиническое течение нефритов и, таким образом, быть новым маркёром в оценке активности и прогноза нефритов. Также важно изучение патогенетических связей между экспрессией топоизомераз и другими маркёрами активности нефрита, в том числе моноцитарной инфильтрацией. Кроме того, доказательство экспрессии топоизомераз в клетках почечных клубочков и канальцев при развитии и прогрессировании нефрита может послужить обоснованием применения ингибиторов топоизомераз как нового метода лечения прогрессирующих форм нефрита.

Цепь исследования: поиск новых маркёров активности и прогноза нефритов для повышения эффективности их терапии. Задачи исследования

1. Оценить уровень экспрессии топоизомераз I, На и степень моноцитарной инфильтрации в почечных биоптатах больных нефритами и в почечной ткани без патологических изменений.

2. Оценить связь уровня экспрессии топоизомераз !, На и выраженности моноцитарной инфильтрации с клиническими и морфологическими параметрами активности и прогрессирования почечного процесса.

3. Оценить влияние уровня экспрессии топоизомераз I, На и степени моноцитарной инфильтрации на прогноз больных ВН и мезангиокапиллярным гломерулонефритом (МКГН) и их ответ на лечение.

Научная новизна

1. Впервые продемонстрирована экспрессия топоизомераз I и На в почечных биоптатах больных с различными формами нефрита и в почечной ткани без патологических изменений.

2. Впервые описано наличие сильной корреляционной связи между уровнем экспрессии топоизомераз I, На и выраженностью моноцитарной инфильтрации (одним из маркёров активности почечного процесса), указывающее на патогенетическую роль топоизомераз в развитии нефрита.

3. Впервые показана возможность использования уровня экспрессии топоизомераз I и На в качестве маркёра морфологической и клинической активности почечного процесса.

. Впервые продемонстрирована роль уровня экспрессии топоизомераз I и На в качестве предиктора ответа на иммунодепрессивную терапию (ИД-терапию) у больных ВН и МКГН.

. Впервые в мире уровень экспрессии топоизомераз I и На использован для оценки скорости прогрессирования почечной недостаточности у больных ВН и МКГН. Впервые продемонстрировано новое звено патогенетической цепи развития ГН, которое может стать мишенью селективного терапевтического воздействия, способного кардинально изменить прогноз прогрессирующих форм нефрита, резистентных к современным иммунодепрессивным препаратам, рактическая значимость

, Уровень экспрессии топоизомераз I и На предложен как новый молекулярно-биологический маркёр активности почечного процесса у больных различными морфологическими вариантами нефрита. . Определена прогностическая роль уровня экспрессии топоизомераз I, На и выраженности моноцитарной инфильтрации в предсказании развития почечной недостаточности у больных ВН, МКГН и их ответа на иммунодепрессивную терапию. . Создана теоретическая основа для проведения исследований по практическому применению нового класса препаратов - ингибиторов топоизомераз - в лечении прогрессирующих форм нефрита, резистентных к современным иммунодепрессивным препаратам, недрение результатов исследования

Результаты настоящего исследования используются при обследовании и лечении ольных Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний ММА им. М Сеченова, включены в материалы лекционных курсов для курсантов кафедры ефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образования 1МАим. И.М. Сеченова, убликации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, которые отражают зложенные результаты, положения и выводы, пробация работы

Апробация работы проведена 3 сентября 2001 года на совместном заседании афедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального бразования и отдела нефрологии Научно-исследовательского центра ММА им. И.М. еченова. Материалы работы представлены на научной конференции кафедры ефрологии и гемодиализа ФППО ММА им. И.М. Сеченова (сентябрь 1999 г.), на 180-м зседании Общества патологов Великобритании и Ирландии (январь 2000 г., Лондон), на онгрессе немецкого общества нефрологов (сентябрь 2000 г., Вена), на XXXVII Конгрессе вропейской ассоциации по диализу и трансплантации (сентябрь 2000 г., Ницца), на

Конференции молодых учёных России с международным участием (апрель 2001 г., Москва), на втором Международном Конгрессе «Иммунология в нефрологии» (май 2001 г. Сардиния), на XXXVIII Конгрессе Европейской ассоциации по диализу и трансплантацт (июнь 2001 г., Вена). Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 2 схемы 24 таблицы, 28 рисунков, 5 микрофотографий и состоит из введения, обзора литературы материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 2( отечественных и 156 зарубежных источников. База проведения исследования

Основной базой проведения исследования являлись кафедра нефрологии \ гемодиализа ФППО и отдел нефрологии НИЦ ММА им. И.М. Сеченова (зав. - чп.-корр

РАМН, профессор) U.E. Тареева ), Клиника нефрологии, внутренних и профессиональны: болезней ММА им. И.М. Сеченова (дир. - академик РАМН, профессор H.A. Мухин) кафедра патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова и НИИ молекулярноь медицины ММА им. И.М. Сеченова (дир. - академик РАМН и РАН, профессор М.А Пальцев), Клиника нефрологии Christian-Albrechts University, Kiel, Germany (дир. - приват доцент D. Proppe), Институт общей патологии Christian-Albrechts University, Kiel, Germany (дир. - профессор G. Klöppel). Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научныи руководителям - профессору Е.М. Шилову и профессору A.A. Иванову, а также академию РАМН, профессору H.A. Мухину, профессору Л.В. Козловской, профессору В.А Варшавскому, к.м.н. Е.П. Проскурневой, к.м.н. Т.Н. Красновой, к.м.н. М.Ю Швецову зг неоценимую помощь в работе. Особую благодарность автор выражает чл.-корр. РАМН профессору |И.Е. Тареевой], приват-доценту D. Proppe, профессору G. Klöppel и приват доценту Р. Rudolph за возможность участия в международном проекте «ДНК топоизомеразы» и постоянную помощь в самых различных организационных вопросах.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования 1. Больные

Для выполнения основных этапов работы использовались 2 независимые группь больных, включавшие в целом 177 больных нефритом, и 12 контрольных пациентов бе; патологических изменений в почечной ткани (табл. 1). Контрольные образцы почечно! ткани получены из неизменённых участков почек, удалённых по поводу локальны;

пухолей. Нормальная почечная структура была подтверждена при гистологическом сследовании.

1-ю группу составили 132 больных различными морфологическими вариантами ефрита, наблюдавшихся в Клинике нефрологии Christian-Albrechts University, Germany и в оспитале Lund University, Sweden. Основные критерии отбора больных 1-й группы: ачество почечного биоптата, требуемое для проведения полноценного морфологического сследования; отсутствие ИД-терапии в момент проведения биопсии почки и желание эздать морфологические группы, одинаковые ло числу входящих в них больных.

2-ю группу составили 45 больных (ВН. п=22 и МКГН, п=23), наблюдавшихся в пинике нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний ММА им. И.М. еченова. Эти две нозологические формы были выбраны, исходя из результатов первого rana работы, продемонстрировавшего наибольшую экспрессию топоизомераз I и Па менно при ВН, БПГН и МКГН. Критерием отбора больных 2-й группы, помимо требований качеству почечного биоптата, служило достаточно длительное прослеживание больных, еобходимое для оценки эффективности ИД-терапии и почечной выживаемости больных, аблица 1. Морфологические варианты нефрита у 177 больных

,, . , Количество больных Морфологические варианты нефрита --

_1 группа_2 группа

VIH (п = 15) 15 (10)*

ФСГС (л = 9) 9 (6)

WH (п = 19) 19 (10)

vinrn (л = 20) 20 (11)

МКГН (п = 32) 9 (7) 23

БПГН (п = 18)

гранулематоз Вегенера 6 (3)

микроскопический полиангиит 3 (3)

синдром Гудпасчера 4 (1)

постинфекционный 2 (2)

первичный 3 (3)

ЗН (п = 45)

МН 2

мпгн 5

оп/дпвн 23 (15) 13

нефросклероз 2

ГИН (п = 19) 19 „(10)_____

Общее количество больных (п = 177) 132 (81) 45

1римечание. «*» в скобках указано число больных 1-й группы, участвующих во 2-ом этапе аботы.

. Первый этап работы - оценка уровня экспрессии топоизомераз I, На и степени моноцитарной инфильтрации в почечных биоптатах больных нефритами и в почечной ткани без патологических изменений - проведен с использованием почечных биоптатов 132 больных 1-й группы и 12 пациентов, не имевших патологических изменений в почечной ткани (нормальный контроль).

2. Второй этап работы - оценка связи уровня экспрессии топоизомераз |, Па и выраженности моноцитарной инфильтрации с клиническими и морфологическим! параметрами активности и прогрессирования почечного процесса - выполнен i использованием информации, которая имелась только для 81 из 132 больных 1-¡ группы.

3. Третий этап работы - оценка прогностической роли уровня экспрессии топоизомераз I Па и степени моноцитарной инфильтрации - проведен во 2-й группе больных ВН t МКГН (п = 45).

Для части больных 1-ой группы (81 из 132), а также для всех больных 2-й группь имелись данные общеклинического обследования, включавшего данные анамнеза физического обследования; клинического анализа крови и мочи; определения скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина; суточной экскреции белка мочевой кислоты и электролитов; биохимического исследования уровня сывороточны> белков, креатинина, мочевой кислоты; определения показателей иммунного статуса -иммуноглобулинов классов А, М, G, общего комплемента СН50, ЦИК, а также данные рентгенографии органов грудной клетки, внутривенной урографии, УЗИ почек.

В 1-й группе (п = 132) было 66 мужчин и 66 женщин, средний возраст которы> составил 42 ± 16,6 (13 - 84) года. Среди 81 больного 1-й группы, данные которых использовали для второго этапа работы, было 40 мужчин и 41 женщина, в возрасте от 12 до 84, в среднем 42 ± 17,5 лет. Клиническая характеристика больных этой подгруппы представлена в таблице 2.

Таблица 2. Клиническая характеристика 81 больного 1-й группы на момент биопсии почки

Пол Возраст Время до АГ НС ПУ ГУ Кр сыв.

(М/ (годы) биопсии* (+/-) (+/-) (г/сут.) (в п/з) (мг/дл.)

Ж) (мес.)

п Средняя Медиана п л Средняя Средняя Средняя

± с + а ± о ±о

МИ (п= 10) 8/2 39 ±16,1 1 (1-197) 7/3 10/0 10,9 ±5,6 8 ± 6 1,2 ±0,4

ФСГС (п = 6) 3/3 42 ±21,2 25(10-92) 6/0 2/4 4,8 + 4,1 8 ±5 1,5 ±0,8

МН (п= 10) 4/6 43 ±17,6 2,5 (1-25) 7/3 10/0 8,9 + 4,1 13+13 1,0+0,0

МПГН (п= 11) 3/8 34 ±10,2 1 (0,5-144) 5/6 0/11 1,7 + 1,3 32 + 26 1,4 ±0,5

МКГН (п = 7) 4/3 49 ±17,2 4(1-11) 6/1 5/2 5,0 ±4,0 14 + 9 3,0 ±2,2

БПГН (п = 12) 6/6 56 ± 12,8 1,5 (0,5-81) 11/1 1/11 1,8 ±1,3 40 + 29 5,6 ± 3,4

ВН (п = 15) 5/10 35 + 19,7 10(3-168) 5/2 5/5 2,9 + 2,1 42 + 41 1,7 ±0,9

ТИН (п = 10) 7/3 46+16,9 1 (3-168) 5/5 0/10 0,8 ±1,0 16 + 17 4,3 ±4,5

Р 1,0 0,017 0,0007 1,0 0,001 < 0,0001 0,008 < 0,0001

В контрольную группу из 12 пациентов вошло 8 мужчин и 4 женщины в возрасте от 34 до 79, в среднем 60 ± 12,5 лет. Во 2-й группе (п = 45) в целом было 15 мужчин и 30

сенщин, в возрасте от 15 до 42, в среднем 29 + 10,8 лет. Клиническая характеристика юльных этой группы представлена в таблице 3.

аблица 3. Клиническая характеристика больных 2-й группы на момент биопсии почки

Пол Возраст Время до АГ НС ПУ ГУ Кр сыв.

(М/ (годы) биопсии* (+!) (+/-) (г/сут.) (в п/з) (мг/дл.)

Ж) (мес.)

п Средняя Медиана п п Средняя Средняя Средняя

i СУ ±ст ± а ±сг

У1КГН (п = 23) 12/11 30 ± 11,6 5,5(2-123) 18/4 16/6 7,0 + 4,0 57 + 53 1,3 + 0,5

ЗН (п = 22) 3/19 27 ±9,8 25 (1,5-93) 15/7 11/11 3,9 ±2,9 45 + 61 1,3 ±0,7

э 0,015 0,256 0,385 0,486 0,216 0,006 0,036 0,604

1римечание к таблицам 2 и 3. Обозначения: АГ - артериальная гипертензия, НС -ефротический синдром, ПУ - протеинурия, ГУ - гематурия, Кр сыв. - креатинин сыворотки рови. Для сравнения качественных показателей применялся медианный тест, оличественных - непараметрический дисперсионный анализ Кги5ка1ЛЛ/аШе. Обозначения: *» время от начала нефрита до биопсии почки (мес.).

)ффективность ИД-терапии оценивались по следующим критериям:

. Ремиссия для больных с НС - исчезновение признаков НС (протеинурия менее 3,5

г/сут., альбумин более 3,5 г%) с полным восстановлением или сохранением

нормальной функции почек; для больных с активным ГН без НС - снижение

протеинурии менее 1 г/сут. при сохранной функции почек.

!. Улучшение (неполная ремиссия) - частичное уменьшение признаков НС с полным

восстановлением функции почек или исчезновение НС при отсутствии дальнейшего

прогрессирования почечной недостаточности; для больных с активным ГН без НС -

восстановление функции почек при уровне протеинурии от 1 до 3 г/сут.

I. Без изменения - стабильный уровень протеинурии, альбумина и креатинина.

I. Ухудшение - персистирование НС с появлением или прогрессированием почечной

недостаточности; для больных с активным ГН без НС - развитие НС и/или почечной

недостаточности.

¡. Уремия - повышение уровня сывороточного креатинина до 5,0 мг% или выше;

гемодиализ или трансплантация почки. !. Смерть больного от почечных и внепочечных причин.

Три 1 и 2 исходах ответ больных на терапию считался положительным; при 3, 4, 5 и 6 ->трицательным.

!. Морфологические исследования Ц Биоптаты

Почечные биоптаты (п = 189) получены за период с 1991 г. по 2000 г. в Клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева ММА им. И.М. Сеченова (п = 45); Клиниках нефрологии (п = 120) и урологии (п = 16) СЬпБйап-А1ЬгесМз

University, Germany; Госпитале Lund University, Sweden (n = 8). Морфологическое исследование почечных биоптатов проводилось проф. A.A. Ивановым, проф. В.А Варшавским, проф. G. Klöppel, проф. Per Alm и приват-доц. Р. Rudolph. Диагноз ставило! при помощи световой микроскопии парафиновых срезов, окрашенных гематоксилин эозином, иммунолюминесцентной микроскопии криостатных срезов с антисывороткой иммуноглобулинам человека А, М, G и СЗ фракции комплемента, электронное микроскопии.

Б) Определение индексов активности и склероза

Всем больным произведен полуколичественный подсчет индексов активности (ИА) i склероза (ИС) по Austin et al. [1983] в модификации A.A. Иванова. ИА оценивался нг основании 5 показателей: пролиферация эндотелиальных клеток, пролиферацю мезангиальных клеток, клеточные полулуния, инфильтрация интерстиция, инфильтраци? клубочков. ИС включал в себя 8 показателей: перигломерулярный склероз, спадение капиллярных петель, синехии, склероз интерстиция, увеличение мезангиального матрикса атрофия почечных канальцев, утолщение базапьной мембраны клубочков, склеро; почечных клубочков (гиалиноз). Каждый из признаков оценивался по шкале от 0 до i баллов. Индексы рассчитывались как сумма баллов соответствующих признаков. В) Иммуногистохимическое исследование

Иммуногистохимическое исследование проводили стандартным стрептавидин-биотин-пероксидазным методом с использованием первичных AT: С 21 - моноклональные AT (моАТ) к топоизомеразе I, предоставленные Y. - С. Cheng, Yale University, New Haven, CT; Ki-S4 - моАТ к топоизомеразе На и Ki-M1p - моАТ к CD68 (маркер моноцитарной клеточной линии), предоставленные лабораторией Института общей патологии ChristianAlbrechts University, Germany. В качестве вторичных AT использованы биотин-связанные кроличьи anti-mouse IgM. Только ядерная метка признана специфичной для топоизомераз. Позитивные клетки оценены полуколичественным методом для мезангиальных клеток (МК) почечных клубочков и клеток эпителия почечных канальцев. В клубочках позитивная реакция считалась как + (1 балл), если среднее число меченых клеток колебалось в пределах между 1 и 10%; как ++ (2 балла) для среднего числа между 10 и 25%; и как +++ (3 балла) для любого среднего значения большего, чем 25%. Негативная реакция регистрировалась при отсутствии какой-либо цветной реакции. Вследствие более высокой общей реактивности в почечных канальцах и интерстиции три категории (+, ++ и +++) определены на основании 1-10%, 10-50% и >50% позитивных клеток. 3. Статистический анализ

Сопоставление медиан вариационных рядов проводилось с помощью непараметрических методов: монофакторного дисперсионного анализа (метод Kruskal-Wallis) с последующим попарным сравнением методом Mann-Whitney с поправкой Bonferroni. Связь между параметрами оценивалась с помощью непараметрического

арреляционного анализа Spearman и моно- и многофакторного линейного егрессионного анализа, прогнозирование ответа на лечение - с помощью божественной логистической регрессии. Анализ почечной выживаемости проводился с омощью регрессионной модели Сох'а («критерий исхода» - уровень креатинина ыворотки 2 1,5 мг/дл) и метода Kaplan-Meier'a (достоверность различия между кривыми почечной выживаемости» оценивалась методом log-rank).

езультаты исследований и их обсуждение

. Уровень экспрессии топоизомераз и степень моноцитарной инфильтрации в очечных биоптатах больных нефритами и в почечной ткани без патологических зменений

Экспрессия топоизомеразы I выявлена во всех типах клеток, включая мезангиальные, ндотелиальные и эпителиальные клетки почечных клубочков, эпителий почечных знальцев, интерстициальные фибробласты и сосудистый эндотелий. В отличие от эпоизомеразы IIa, распределение позитивных клеток было, как правило, диффузно. сходя из необходимости сравнения экспрессии топоизомеразы I с экспрессией эпоизомеразы IIa в одних и тех же клетках, экспрессия топоизомеразы I оценивалась элько в мезангиальных клетках (МК) почечных клубочков и в эпителии почечных анальцев. Экспрессия топоизомеразы Па выявлена почти исключительно в МК почечных тубочков и в эпителии почечных канальцев. В отличие от топоизомеразы I, давшей ариабельное окрашивание в пределах одного образца, интенсивность иммунного крашивания на топоизоыеразу IIa была гомогенной. Экспрессия топоизомеразы IIa ценивалась в МК почечных клубочков и в эпителии почечных канальцев. Ki-M1p-оложительные клетки встречались в почечных клубочках и в интерстиции. Они были редставлены моноцитами крови или оседлыми макрофагами. В дальнейшем для ростоты изложения количество клеток, экспрессирующих топоизомеразы обозначалось зк уровень экспрессии топоизомераз, а количество Ki-Mlp-позитивных клеток - как гепень (выраженность) моноцитарной инфильтрации.

Для сравнения средних уровней экспрессии топоизомераз I, IIa и степени моноцитарной нфильтрации в различных морфологических группах использовался следующий подход, ровень показателя (в баллах), соответствующий медиане, рассчитанной для каждой эпоизомеразы I, IIa и для степени моноцитарной инфильтрации отдельно в объединенной зупле, включавшей в себя одновременно все морфологические варианты ГН и норму, бозначался как «—». Уровень показателя в диапазоне от медианы до верхнего квартиля Г5%-представитель вариационного ряда) - как повышенный (Т), от верхнего квартиля до ерхнего предела (100%-представитель) - как высокий (TT), а равный верхнему пределу -ак максимальный (ÎÎT). Соответственно, уровень показателя от медианы до нижнего вартиля (25%-представитель) обозначался как сниженный (1).

Руководствуясь этим подходом, выявлено (табл. 5), что уровень экспрессии

топоизомеразы I в МК почечных клубочков был высоким при БПГН и ВН, повышенным П|

МКГН, равным медиане при ФСГС, МПГН, ТИН и в почечной ткани без патологическ!

изменений, и сниженным при МИ и МН. В эпителии почечных канальцев урове>

экспрессии топоизомеразы I был максимальным при ВН, высоким при БПГН и ТИ1

повышен при МКГН и равным медиане при МИ, ФСГС, МН, МПГН и в почечной ткани б(

патологических изменений. Уровень экспрессии топоизомеразы На в МК почечнь

клубочков был максимальным при БПГН, высоким при МПГН, МКГН и ВН, повышенным пр

МИ, ФСГС и ТИН, и равным медиане при МН и в почечной ткани без патологичеси

изменений. В эпителии почечных канальцев уровень экспрессии топоизомеразы Па бь

максимальным при БПГН и ВН, повышенным при МИ, ФСГС, МН, МПГН, МКГН и ТИН,

равным медиане в почечной ткани без патологических изменений. В почечных кпубочкг

количество К1-М1р-позитивных клеток было максимальным при БПГН, высоким пр

МКГН, ВН и ТИН, повышенным при ФСГС, равным медиане при МПГН и в почечной ткаь

без патологических изменений, и сниженным при МИ и МН. В интерстиции повышение

число Ю-М1р-позитивных клеток выявлено при ФСГС, МКГН, БПГН, ВН и ТИН, и равне

медиане при МИ, МН, МПГН и в почечной ткани без патологических изменений.

Таблица 5. Уровень экспрессии топоизомераз и степень моноцитарной инфильтрации при нефритах и в почечной ткани без патологических изменений

Клубочки Канальцы Интерс

ТОП I ТОП IIa MOH ТОП! ТОП IIa MOH

МИ (п=15) 0,50 4- 0,50 t 0,00 i 1,00 — 1,00 t 1,00 —

ФСГС (п=9) 1,00 — 0,50 T 1,50 t 1,00 — 1,00 t 2,00 t

МН (п=18) 0,00 i 0,00 — 0,00 i 1,00 — 0,75 t 1,00 —

МПГН (л=20) 1,00 — 1,00 tt 1,00 — 1,00 — 1,00 t 1,00 —

МКГН (п=10) 1,50 t 0,75 tt 2,00 tt 1,50 t 1,00 t 2,00 t

БПГН (п=18) 2,00 tt 2,00 ttt 3,00 ttt 1,75 tt 2,00 ttt 2,00 t

ВН (п=24) 2,00 tt 1,25 tt 2,00 tt 2,00 ttt 2,00 ttt 2,00 t

ТИН (п=18) 1,00 — 0,50 t 2,50 tt 1,75 tt 1,00 t 2,00 t

НОРМА (л=12) 1,00 — 0,00 — 1,00 — 1,00 — 0,00 — 1,00 —

Примечание. Обозначения: ТОП - топоизомераза, МОН - моноцитарная инфильтраци» НОРМА - почечная ткань без патологических изменений, «—» уровень показателя ( баллах), соответствующей медиане; «4-» сниженный, «t» повышенный, «Tt» высокий «ttt» максимальный уровень.

Далее исследовались различия в уровне экспрессии топоизомераз и степен моноцитарной инфильтрации при нефритах в сравнении с почечной тканью бе патологических изменений (метод Mann-Whitney с поправкой Bonferroni). По сравнению почечной тканью без патологических изменений уровень экспрессии топоизомеразы II

s МК почечных клубочков был достоверно повышен только при БПГН (р = 0,009), а в тителии почечных канальцев - при ВН (р < 0,0001) и БПГН (р = 0,018); уровень экспрессии попоизомеразы I в МК почечных клубочков и в эпителии почечных канальцев оказался 50стоверно повышенным только при ВН (р = 0,048 и 0,007 соответственно); количество К/-\/11р-позитивных клеток в почечных клубочках увеличено при БПГН (р = 0,014) и уменьшено при МИ (р = 0,019), а в интерстиции повышено только при ВН (р = 0,019).

Наконец, был проведен попарный корреляционный анализ между уровнем экспрессии гопоизомераз I, Па и степенью моноцитарной инфильтрации, выявивший существенную ззаимосвязь между этими показателями (табл. 7).

Таблица 7. Корреляция меэеду уровнем экспрессии топоизомераз и степенью моноцитарной инфильтрации в почечной ткани

ТОП

Па клубочки На канальцы I клубочки I канальцы

МОН клубочки

ТОП На канальцы ТОП I клубочки ТОП I канальцы МОН клубочки МОН интерстиций

г =0,746

р < 0,0001

г =0,399 г =0,378

р < 0,0001 р< 0,0001

г= 0,326 г =0,224 г =0,659

р< 0,0001 р = 0,009 р < 0,0001

г= 0,414 г =0,359 г =0,423 г = 0,302

р < 0,0001 р < 0,0001 р < 0,0001 р <0,0001

г =0,217 г= 0,263 г= 0,128 г- 0,256

р = 0,009 р = 0,002 р = 0,136 р = 0,002

г= 0,359 р < 0,0001

Примечание. Корреляционный анализ с использованием непараметрического показателя :вязи г- коэффициента корреляции рангов Spearman.

Таким образом, обращает на себя внимание различие в уровне экспрессии топоизомераз и степени моноцитарной инфильтрации у больных с так называемыми тролиферативными (ВН, БПГН, МКГН и МПГН) и непролиферативными (МИ, ФСГС и МН) зариантами нефрита. Высокий уровень экспрессии топоизомераз I и На в МК почечных шубочков и эпителии почечных канальцев отмечался при пролиферативных вариантах нефрита, что, возможно, отражало метаболическую и пролиферативную активность этих клеток в рамках общей активности воспалительного процесса в почечной ткани. В противоположность этому при таких непролиферативных вариантах как МИ и МН уровень экспрессии топоизомераз I и IIa был сниженным, нормальным или незначительно повышенным, а моноцитарная инфильтрация в почечных клубочках отсутствовала. Интересные закономерности обнаружены при ФСГС, которые выделяли его из группы непролиферативных вариантов нефрита: наличие моноцитарного инфильтрата в почечной ткани и повышенный уровень экспрессии топоизомеразы IIa в МК почечных клубочков и эпителии почечных канальцев. Это ещё раз подчёркивает наличие воспалительной реакции при этой форме нефрита, что уже отмечено другими авторами. Моноцитарная

инфильтрация в почечных клубочках и интерстиции выявлена преимущественно при прояиферативных вариантах нефрита и при ТИН. Выраженность моноцитарно! инфильтрации в почечных клубочках прямо коррелировала с высоким уровнем экспресса топоизомеразы На в МК почечных клубочков (указывающим на пролиферативнук активность МК), возможно вызванным цитокинами и факторами роста, продуцируемым! клетками инфильтрата. Тесные взаимные корреляционные связи, выявленные межд) экспрессией топоизомераз и степенью моноцитарной инфильтрации (см. табл. 7) позволяют предположить тесные патогенетические связи между этими участниками патологического процесса.

2. Связь уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации с клиническими и морфологическими параметрами активности f прогрессирования почечного процесса

В группе, включавшей 81 больного с различными морфологическими вариантами нефрита, проведен монофакторный линейный регрессионный анализ, позволяющие выявить связь уровня экспрессии топоизомераз I, lia и степени МОН инфильтрации (независимые переменные) с величиной индекса активности (ИА), индекса склероза (ИС) сывороточного креатинина, протеинурии, гематурии и наличием артериальной гипертензии (зависимые переменные) (табл. 8).

Таблица 8. Связь уровня экспрессии топоизомераз и степени моноцитарной инфильтрации с параметрами активности и прогрессирования почечного процесса у 81 больного нефритом

Независимые _Зависимые переменные

переменные ИА ИС Кр сыв. ПУ ГУ АГ

. ТОП I в клубочках ß Р 0,460 < 0,0001 0,341 0,004 -0,214 0,056

ТОП I в канальцах Р Р 0,321 0,008

ТОП IIa в клубочках Р Р 0,326 0,007 0,381 0,001

ТОП IIa в канальцах Р Р 0,418 < 0,0001 0,373 0,002 0,398 < 0,0001 -0,232 0,037 0,228 0,041

МОН в клубочках ß Р 0,270 0,026 0,370 0,002 0,281 0,011 -0,285 0,010 0,202 0,070 0,216 0,052

МОН в интерстиции Р Р 0,428 <0,0001 0,453 < 0,0001 0,383 < 0,0001 -0,355 0,002 0,286 0,010

Примечание. Монофакторный линейный регрессионный анализ. Представлены достоверные связи (р < 0,05) и связи, имеющие пограничный уровень значимости.

Выявлена достоверная прямая связь уровня экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков с величиной ИА и ИС и обратная связь с величиной ПУ. Уровень экспрессии топоизомеразы I в эпителии почечных канальцев положительно коррелировал с величиной ИА. Уровень экспрессии топоизомеразы На в МК почечных клубочков и

эпителии почечных канальцев был прямо связан с величинами ИА и ИС, помимо того уровень экспрессии топоизомеразы Па в эпителии почечных канальцев был прямо связан с зеличиной Кр сыв. и АГ, и обратно - с выраженностью ПУ. Степень моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках и интерстиции коррелировала с абсолютным [большинством морфологических и клинических параметров: прямо - с величиной ИА, ИС, Кр сыв. и АГ; и обратно - с уровнем ПУ. Прямая связь выраженности моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках со степенью ГУ имела пограничный уровень значимости (р = 0,070).

Учитывая выявленную ранее сильную корреляционную взаимосвязь между уровнем экспрессии топоизомераз и степенью моноцитарной инфильтрации (см. табл. 7), для выявления наиболее сильных из этих факторов, влияющих на морфологические и клинические параметры активности и прогрессирования почечного процесса, проведён многофакторный линейный регрессионный анализ. Для этого построено несколько многофакторных моделей - отдельно для каждой зависимой переменной (ИА, ИС, Кр сыв., ПУ, ГУ и АГ). В качестве независимых переменных в эти модели вводился один и тоже набор факторов (уровень экспрессии топоизомераз I, На в почечных клубочках и канальцах, степень моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках и интерстиции). При построении многофакторной модели признак оставался в модели при р < 0,1 и удалялся из модели при р > 0,1. В результате получено шесть окончательных моделей, в которых остались комбинации наиболее сильных прогностических факторов, наилучшим образом связанных с зависимой переменной (табл. 9).

Таблица 9. Связь уровня экспрессии топоизомераз и степени моноцитарной инфильтрации с параметрами активности и прогрессирования почечного процесса у 81 больного нефритом

Независимые ___Зависимые переменные

переменные ИА ИС Кр сыв. ПУ ГУ АГ

Модель № 1а 16 1в 1г 1д 1е

ТОП I в клубочках ТОП I в канальцах ТОП Па в клубочках ТОП На в канальцах МОН в клубочках МОН в интерстиции ß P ß Р ß Р ß Р ß P ß P 0,228 0,053 0,355 0,003 0,227 0,044 0,406 < 0,0001 0,281 0,023 0,223 0,070 -0,397 0,025 0,329 0,054 -0,272 0,015 0,202 0,070 0,286 0,010

Примечание. Многофакторный линейный регрессионный анализ. Представлены только достоверные связи (р < 0,1).

Для ИА это были выраженность экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков и моноцитарной инфильтрации в интерстиции (модель 1а), для ИС выраженность экспрессии топоизомеразы IIa в МК почечных клубочков и моноцитарно инфильтрации в интерстиции (модель 16). Величина Кр сыв. была прямо связана уровнем экспрессии топоизомеразы IIa в эпителии почечных канальцев и со стелены моноцитарной инфильтрации в интерстиции (модель 1в). В свою очередь выраженност ПУ была прямо связана с уровнем экспрессии топоизомеразы I в эпителии почечны канальцев и обратно - с уровнем экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков выраженностью моноцитарной инфильтрации в интерстиции {модель 1г). Уровень Г коррелировал только с выраженностью моноцитарной инфильтрации в почечны клубочках (модель 1д), а уровень АГ - со степенью моноцитарной инфильтрации интерстиции (модель 1е).

Таким образом, в данном разделе работы подтверждена связь межд • молекулярными механизмами клеточной активации, метаболизма (топоизомеразой I) i пролиферации (топоизомеразой IIa) и их реализацией на клеточно-тканевом уровне i процессе развития иммунного воспаления в почечных клубочках, канальцах и интерстици! (ИА и ИС), а также связь с клиническими проявлениями активности и прогрессировани; почечного иммунопатологического процесса (Кр сыв., ПУ, ГУ и АГ).

Важно подчеркнуть, что изученные молекулярные маркёры активации i пролиферации клеток и непосредственные индукторы воспалительного процесса (клети мононуклеарного инфильтрата) тесно коррелировали с ИА - интегральным показателен воспапительной активности в клубочках, канальцах и интерстиции, они же были связаны i с интегральным показателем выраженности склеротических процессов в почечной ткани -ИС, что косвенно (методом монофакторного корреляционного анализа) подтверждав" фундаментальную роль активного воспаления в последующем развитии прогрессирующе склеротических процессов в почечной ткани. Множественная линейная регрессив позволила выделить среди всех показателей (уровня экспрессии топоизомераз I, IIa i выраженности моноцитарной инфильтрации) те, которые наиболее сильно связаны < каждым из морфологических и клинических проявлений активности нефрита (табл. 9) Поэтому этот набор показателей может рассматриваться в качестве причин индуцирующих иммунное воспаление и прогрессирование почечного процесса. Важнс отметить, что моноцитарная инфильтрация в интерстиции была неизменно связана как < морфологическими проявлениями активности и прогрессирования нефрита, так и с и> клиническими эквивалентами, что хорошо согласуется с обсуждаемой в настоящее врем; в литературе ролью мононуклеарных клеток в повреждении и развитии иммунногс воспапения, а также в инициации и контроле за развитием склеротических процессов.

Парадоксальная отрицательная связь между уровнем экспрессии топоизомеразы I е МК почечных клубочков и степенью ПУ объясняется характером анализируемого

«атериала. Как уже установлено, высокий уровень экспрессии топоизомеразы I в МК ючечных клубочков выявлен при пролиферативных вариантах и низкий при юпролиферативных вариантах нефрита, в то время как для уровня ПУ имелась обратная акономерность: менее выраженная ПУ была при пролиферативных вариантах (в среднем 1,1 г/сут.) и высокая (в среднем 8,7 г/сут.) при непролиферативных вариантах нефрита. Те ке закономерности объясняли отрицательную связь уровня ПУ со степенью /юнонуклеарной инфильтрации в интерстиции: выраженная мононуклеарная шфильтрация при пролиферативных вариантах нефрита сопровождалась менее сраженной ПУ, наоборот меньшая степень моноцитарной инфильтрации при гепролиферативных вариантах нефрита сопровождалась высокой ПУ.

Существенная роль тубулоинтерстициального повреждения в развитии почечной юдостаточности хорошо подтверждается выявленной прямой связью между степенью ючечной недостаточности (величиной сывороточного креатинина) и уровнем экспрессии "опоизомеразы Па в эпителии почечных канальцев и выраженностью моноцитарной 1нфильтрации в интерстиции, а также между тяжестью АГ и выраженностью моноцитарной 1нфильтрации в интерстиции (табл. 9).

!. Влияние уровня экспрессии топоизомераз и степени моноцитарной инфильтрации <а прогноз больных ВН и МКГН

Влияние ИД-тералии, проводимой до биопсии почки, на уровень экспрессии попоизомераз I, IIa и степень моноцитарной инфильтрации

Прогностическая роль уровня экспрессии топоизомераз I, На и степени ионоцитарной инфильтрации изучена в группе из 45 больных нефритами (ВН, п = 22 и МКГН, п = 23). 19 больным биопсия почки проводилась до начала ИД-терапии, остальным 26 - на фоне ИД-терапии. Биопсия проводилась в среднем через 1,8 (0,0 - 11,0) месяцев эт начала ИД-терапии.

Поскольку возможность влияния проведённой к моменту биопсии почки ИД-терапии -и уровень экспрессии топоизомераз и степень моноцитарной инфильтрации полностью не исключалась, то был проведён многофакторный линейный регрессионный анализ, проанализировавший зависимость уровня экспрессии топоизомераз и степени моноцитарной инфильтрации от интенсивности ИД-терапии до биопсии почки. В качестве параметров интенсивности иммунодепрессии использовались: длительность, тип ИД-терапии (кортикостероиды; кортикостероиды + цитостатики; цитостатики) и кумулятивные цозы преднизолона (ПЗ) и циклофосфана (ЦФА). Установлено, что время, тип лечения и кумулятивные дозы ПЗ и ЦФА до биопсии почки не были связаны с уровнем экспрессии топоизомераз и степенью моноцитарной инфильтрации на момент биопсии почки. Это позволило использовать уровень экспрессии топоизомераз и степень моноцитарной инфильтрации для предсказания ответа на ИД-терапию и «почечной выживаемости» больных ВН и МКГН.

3.1. Прогностическая роль уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации в ответе на лечение больных ВН и МКГН

Различные виды ИД-терапии получали все 22 больных ВН и 17 из 23 больны МКГН. Абсолютное большинство больных ВН (91%, п = 20) получали комбинированную терапию кортикостероидами (КС) и цитостатиками (ЦС), остальные 9% (п = 2) были лечень низкими дозами ПЗ (< 40 мг/сут.). Среди больных МКГН были лечены КС+ЦС - 61% (л = 14 больных, только ЦС - 13% (п = 3) больных и не получали ИД-терапии 26 % (п = 6) больных Больные ВН и МКГН были лечены ПЗ в дозе 40 - 60 мг/сут. в течение 1 - 2 месяце! с последующим снижением; ЦФА внутрь в дозе 100 - 150 мг/сут. или в виде «пульсов» п< 600 - 1000 мг. Внутривенно; АЗА внутрь в дозе 100 - 150 мг/сут. В среднем ИД-тералш больным ВН и МКГН проводилась в течение 8,0 + 3,8 (1-16) месяцев.

В целом, положительный ответ на лечение наблюдался у 13 из 20 (65%) больны) ВН (у 2 - результаты лечения не известны) и у 12 из 21 (57,1%) больных МКГН (у 2 -результаты лечения также не известны) (табл. 11,12).

Таблица 11. Результаты ИД-терапии ВН

Вид терапии Ответ «+» Ответ «—» Всего

п % п % п %

ПЗ < 40 мг/сут. ПЗ + ЦС 13 65 1 6 5 30 1 19 5 95

Всего 13 65 7 35 20 100

Таблица 12. Результаты ИД-терапии МКГН

Вид терапии Ответ «+» Ответ Всего

п % п % п %

Без лечения ПЗ + ЦС ЦС 3 8 1 14,3 38,1 4,8 2 5 2 9,5 23,8 9,5 5 13 3 23.8 61.9 14,3

Всего 12 57,1 9 42,9 21 100

Прогностическая роль уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации в ответе на лечение у больных ВН и МКГН оценивалась с помощью множественной логистической регрессии. Для каждого морфологического варианта нефрита (ВН и МКГН) построено по три многофакторные модели, в которые вводили одинаковый для всех моделей набор клеточных и молекулярных параметров (уровень экспрессии топоизомераз и степень моноцитарной инфильтрации) и параметры лечения, различные для каждой из трех моделей: тип терапии (модель 1), кумулятивные дозы ПЗ (модель 2) и ЦФА (модель 3) (табл. 13,14).

В результате статистического анализа для ВН в первой модели остались независимые переменные, достоверно предсказывающие ответ больных на лечение: уровень экспрессии топоизомераз I и На в МК почечных клубочков и эпителии почечных канальцев, выраженность моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках и

штерстиции (табл. 13). Тип лечения больных ВН не вошёл в конечную прогностическую

лодель из-за проведения у большинства больных ВН (91%) сочетанной терапии КС и ЦС.

Зо второй модели остались все независимые переменные кроме уровня экспрессии

опоизомеразы I в МК почечных клубочков, в третьей - кроме уровня экспрессии

опоизомеразы На в эпителии почечных канальцев. Кумулятивные дозы ИД-препаратов

!грали самостоятельную прогностическую роль: вероятность ответа на лечение

юзрастала с увеличение кумулятивной дозы ПЗ (модель 2) и/или ЦФА (модельЗ).

Таблица 13. Прогностическая роль уровня экспрессии топоизомераз и степени моноцитарной инфильтрации в ответе на лечение больных ВН

Независимые переменные

ÍL

X

J3_

Модель Na 1

X2 = 12,011 р = 0,062

ТОП I в клубочках ТОП I в канальцах ТОП На в клубочках ТОП На в канальцах МОН в клубочках МОН в интерстиции Тип терапии_

2,133

11,430

3,728

-7,754

-5,065

5,526

3,185 3,750 5,340 9,791 4,054 3,446

0,074 0,059 0,021 0,002 0,044 0,063

Модель N9 2

Х2= 12,538 р = 0,051

ТОП I в клубочках ТОП I в канальцах ТОП Па в клубочках ТОП На в канальцах МОН в клубочках МОН в интерстиции Кумулятивная доза ПЗ

0,472

13,500

4,600

-8,358

-6,095

6.256

-0,383

0,042

22,858

7,677

15,639

9,597

12,964

4,125

0,838 0,000 0,006 0,000 0,002 0,000 0,042

Модель № 3

Х2= 19,875 р = 0,003

ТОП I в клубочках -31,465 5,612 0,018

ТОП I в канальцах 17,472 26,614 0,000

ТОП Па в клубочках 240,185 335,001 0,000

ТОП На в канальцах 9,675 0,000 1,000

МОН в клубочках -277,039 408,670 0,000

МОН в интерстиции -155,627 110,977 0,000

Кумулятивная доза ЦФА -124,712 160,459 0,000

Примечание. Множественная логистическая регрессия.

У больных МКГН в первой модели остались все независимые переменные, а также гип терапии (табл. 14). Во второй модели - все переменные, кроме уровня экспрессии ■опоизомеразы Па в эпителии почечных канальцев, и в третьей модели - все временные, кроме выраженности моноцитарной инфильтрации в интерстиции. Также как 1 при ВН ответ на лечение зависел от кумулятивной дозы ПЗ (модель 2) и ЦФА (модель 3). 3 отличие от ВН прогностическим значением обладал тип терапии (модель 1), причём 1аще всего положительные результаты наблюдались при сочетанном лечении КС+ЦС (см. габл. 12).

Таблица 14. Прогностическая роль уровня экспрессии топоизомераз и степени моноцитарной инфильтрации в ответе на лечение больных МКГН

_Независимые переменные_[5_х2_р

Модель № 1 ТОП I в клубочках -5,524 4,862 0,027 ТОП I в канальцах 16,412 6,790 0,009 Х П П97 ТОП IIa в клубочках -58,938 86,620 0,000 Р" ' ТОП IIa в канальцах 5,028 2,896 0,089 МОН в клубочках 16,968 6,420 0,011 МОИ в интерстиции 2,485 4,073 0,044 _Тип терапии _-6,020 6,297 0,012

Модель Ш 2 ТОП 1 в клубочках -3,499 6,403 0,011

Х2= 15,368 р = 0,018 ТОП 1 в канальцах ТОП (la в клубочках 11,808 -34,355 7,795 63,859 0,005 0,000

ТОП IIa в канальцах 7,422 2,093 0,148

МОН в клубочках 8,643 5,462 0,019

МОН в интерстиции 4,373 4,867 0,027

Кумулятивная доза ПЗ -1,225 29,817 0,000

Модель Na 3 ТОП 1 в клубочках -1,644 4,808 0,028

Х2= 14,034 р = 0,029 ТОП 1 в канальцах ТОП На в клубочках 2,593 -19,811 2,911 35,786 0,088 0,000

ТОП IIa в канальцах 4,716 11,521 0,001

МОН в клубочках 3,456 3,901 0,048

МОН в интерстиции 1,210 0,806 0,369

Кумулятивная доза ЦФА -0,912 15,030 0,000

Примечание. Множественная логистическая регрессия.

Таким образом, при изучении прогностической роли уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации в ответе на лечение больных ВН и МКГН выявлены следующие закономерности. Резистентность к лечению ПЗ у больных ВН возрастала при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы I в эпителии почечных канальцев, топоизомеразы IIa в МК почечных клубочков и степени моноцитарной инфильтрации в интерстиции (табл. 13, модель 2); у больных МКГН - при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы I в эпителии почечных канальцев и степени моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках и интерстиции (табл. 14, модель 2). Резистентность к лечению ЦФА у больных ВН возрастала при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы I в эпителии почечных канальцев, топоизомеразы IIa в МК почечных клубочков (табл. 13, модель 3); у больных МКГН - при увеличении уровня экспрессии топоизомераз I, IIa в эпителии почечных канальцев и степени моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках (табл. 14, модель 3).

3.2. Факторы, предсказывающие развитие почечной недостаточности у больных ВН и МКГН

Прогностическая роль клинических и морфологических маркёров, предсказывающих прогрессирование почечной недостаточности у больных ВН и МКГН, оценивалась с помощью монофакторного варианта регрессионной модели Сох'а. Учитывалось время от

момента проведения биопсии почки до развития исхода, в качестве которого рассматривалось стойкое нарушение функции почек - повышение уровня сывороточного креатинина S 1,5 мг/дл. (суррогат «почечной смерти», используемый при классическом расчёте почечной выживаемости). Несмотря на то, что, выбранный в качестве «конечной точки» уровень креатинина отражал развитие лишь начальной стадии почечной недостаточности, для простоты изложения результаты анализа описывались как «почечная выживаемость». Графики, демонстрирующие прогностическую роль признаков, первоначально выявленных с помощью регрессионной модели Сох'а, получены методом Kaplan-Meier а. Достоверность различия между кривыми «почечной выживаемости» оценивалась методом log-rank.

У больных ВН прогностическим значением для развития почечной недостаточности обладали: уровень экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков и ответ больных на лечение. Пограничный уровень значимости имели: уровень экспрессии топоизомераз I и На в эпителии почечных канальцев, тип терапии и кумулятивная доза ПЗ (табл. 17).

Таблица 17. Влияние ряда клинических и морфологических факторов на скорость прогрессирования почечной недостаточности у больных ВН

Признаки Р х2 Р Влияние признака на прогноз

ТОП I в клубочках 2,881 12,226 < 0,0001 1

ТОП 1 в канальцах 3,408 3,387 0,066 1

ТОП IIa в клубочках 0,396 0,693 0,405 о

ТОП IIa в канальцах 1,546 3,141 0,076 1

МОН в клубочках 0,670 0,522 0,470 о

МОН в интерстиции 1,135 1,616 0,204 о

Ответ на лечение -3,227 11,862 0,001 т

Тип терапии* -0,933 1,737 0,081 Î

Кумулятивная доза ПЗ -0,398 3,064 0,080 Î

Кумулятивная доза ЦФА -0,247 1,358 0,244 о

Примечание. Монофакторный вариант модели Сох'а. Обозначения: «|» наличие признака или возрастание его величины ухудшают прогноз, «f» наличие признака или возрастание его величины улучшает прогноз, «о» признак не влияет на прогноз. «*» лечение ПЗ < 40 мг/сут. кодировалось «1», ПЗ+ЦС - «2»; изменение типа лечения с «1» на «2» приводило к улучшению «почечной выживаемости» больных ВН.

Так, у больных ВН с максимальным уровнем экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков (++++) трёхлетняя «почечная выживаемость» составила 0%, в то время как у больных с более низкими уровнями экспрессии (от - до +++) пятилетняя «почечная выживаемость» составила 100% (рис. 1).

2(

1.0

^ 0,0

ТОП I в клубочках

от-до +++

++++

Время от биопсии до последнего наблюдения (мес)

Рисунок 1. Влияние уровня экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков на «почечную выживаемость» больных ВН. Метод Kaplan-Meier, достоверность различия между кривыми р = 0,0006.

Отрицательное прогностическое значение имел и высокий уровень экспрессии

топоизомеразы I в эпителии почечных канальцев. Пятилетняя «почечная выживаемость» у

больных ВН с высоким уровнем экспрессии (+++) составила 47%, тогда как у больных с

более низкими уровнями (от - до ++) пятилетняя «почечная выживаемость» составила

100% (рис. 2).

Wr.-----—---ТОП I в канальцах

,9'

,8

Б 7

о

s .6

Ш

га

ш с

к

%

m

ГС

5 .з

CD

К .2

сс

с

г 1

¡2" 0,0

от - до ++

Время от биопсии до последнего наблюдения (мес)

Рисунок 2. Влияние уровня экспрессии топоизомеразы I в эпителии почечных канальцев на «почечную выживаемость» больных ВН. Метод Kaplan-Meier, достоверность различия между кривыми р = 0,066.

Неблагоприятное прогностическое значение имел также высокий уровень

экспрессии топоизомеразы На в эпителии почечных канальцев. Повышение уровня

экспрессии у больных ВН ухудшало пятилетнюю «почечную выживаемость» с 100% (при

о

тсутствии экспрессии) до 43% (при низком уровне экспрессии +) и до 33% (при овышенном уровне экспрессии +•+) (рис. 3).

г ш

ТОП На в канальцах

S 0,0

О 20 40 60 80

Время от биопсии до последнего наблюдения (мес)

'исунок 3. Влияние уровня экспрессии топоизомеразы На в эпителии почечных канальцев ia «почечную выживаемость» больных ВН. Метод Kaplan-Meier, достоверность различия 1ежду кривыми р = 0,025.

Чувствительность больных ВН к ИД-терапии в значительной степени улучшала

прогноз. У больных, ответивших на лечение, «почечная выживаемость» через 5 лет была

00%. Тогда как у больных, резистентных к ИД-терапии, через три года она составила 0%

(рис.4).

Ответ на печение

положительный ответ

отрицательный ответ

Время от биопсии до последнего наблюдения (мес)

'исунок 4. Влияние чувствительности к ИД-терапии на «почечную выживаемость» Зольных ВН. Метод Kaplan-Meier, достоверность различия между кривыми р = 0,0002.

У больных МКГН прогностическим значением для развития почечной недостаточности обладали: уровень экспрессии топоизомеразы На в клубочках и ответ больных на лечение (табл. 18).

Таблица 18. Влияние ряда клинических и морфологических факторов на скорость прогрессирования почечной недостаточности у больных МКГН

Признаки 3 х2 Р Влияние признака ____на прогноз__

ТОП I в клубочках 0,069 0,031 0,861 о

ТОП I в канальцах 0,435 0,344 0,557 о

ТОП Па в клубочках 3,684 3,604 0,058 1

ТОП На в канальцах 0,130 1,247 0,264 о

МОН в клубочках 0,191 0,150 0,698 о

МОН в интерстиции 0,679 0,877 0,349 о

Ответ на лечение -2,722 14,302 < 0,0001 г

Тип терапии* -0,080 0,076 0,783 о

Кумулятивная доза ПЗ -0,116 0,890 0,346 о

Кумулятивная доза ЦФА -0,107 0,620 0,431 о

Примечание. Монофакторный вариант модели Сох'а для оценки «почечной выживаемости». Обозначения: «!» наличие признака и возрастание его величины ухудшает прогноз, «|» наличие признака и возрастание его величины улучшает прогноз, «о» признак не влияет на прогноз.

Так, у больных МКГН с наличием экспрессии топоизомеразы Па в МК почечных клубочков пятилетняя «почечная выживаемость» составила 30%, тогда, тогда как при отсутствии экспрессии пятилетняя почечная выживаемость составила 100% (рис. 6).

ТОП На в клубочках

20 40 60 80

Время от биопсии до последнего наблюдения (мес)

Рисунок 6. Влияние уровня экспрессии топоизомеразы На в МК почечных клубочков на «почечную выживаемость» больных МКГН. Метод Kaplan-Meier, достоверность различия между кривыми р = 0,058.

Как и у больных ВН, чувствительность больных МКГН к ИД-терапии в значительной степени улучшала прогноз. У больных, ответивших на лечение, «почечная выживаемость» через 5 лет была 100%. Тогда как для больных, резистентных к ИД-терапии, уже через два с половиной года она составила 0% (рис. 7).

Ответ на лечение положительный ответ

отрицательный ответ

Время от биопсии до последнего наблюдения (мес)

'исунок 7. Влияние чувствительности к ИД-терапии на «почечную выживаемость» юльных МКГН. Метод Kaplan-Meier, достоверность различия между кривыми р = 0,0002.

Таким образом, ретроспективный анализ на небольших группах больных ВН и МКГН юзволил получить ряд общих предварительных тенденций, требующих проверки и юдтверждения в будущих крупных исследованиях. Показано, что уровень экспрессии опоизомераз и степень моноцитарной инфильтрации являются прогностическими факторами, позволяющими предсказать ответ больных ВН и МКГН на ИД-терапию. 1адёжность прогноза повышалась, когда наряду с уровнем экспрессии топоизомераз и 1ыраженностью моноцитарной инфильтрации учитывались другие прогностические факторы, что позволило с помощью множественной логистической регрессии выявить ia6op наиболее сильных прогностических факторов, позволяющих с наибольшей очностью предсказать ответ или резистентность больных ВН и МКГН к ИД-терапии. )бщей закономерностью явилось повышение резистентности к ИД-терапии при высоком ровне экспрессии топоизомераз I и Па в МК почечных клубочков и эпителии почечных анальцев. Для преодоления этой резистентности, по всей видимости, требуются более ысокие кумулятивные дозы иммунодепрессантов.

Предварительная попытка оценить влияние уровня экспрессии топоизомераз на тдалённый прогноз («почечную выживаемость») больных ВН и МКГН показала, что ысокий уровень экспрессии топоизомераз I и На в МК почечных клубочков и эпителии гачечных канальцев у больных ВН и МКГН в цепом ухудшал прогноз больных, что, юзможно, объяснялось ухудшением ответа на лечение. В свою очередь улучшение ответа ia лечение у больных ВН и МКГН с высоким уровнем экспрессии топоизомераз может быть !остигнуто более активной иммунодепрессивной терапией: применением сочетанной ерапии (ПЗ + ЦФА) и более высоких кумулятивных доз ПЗ и ЦФА.

выводы

1. В почечной ткани без патологических изменений (п = 12) и в почечных биоптата: больных с различными морфологическими вариантами нефритов (п = 132) выявлен; экспрессия топоизомеразы I в мезангиапьных клетках (МК), эндотелии и эпителиь почечных клубочков, эпителии почечных канальцев и интерстициальных клетках топоизомеразы Па - в МК почечных клубочков и в эпителии почечных канальцев.

2. Выявлены достоверные различия в уровне экспрессии топоизомераз I, IIa t выраженности моноцитарной инфильтрации при нефритах в сравнении с почечно( тканью без патологических изменений: уровень экспрессии топоизомеразы I в Ш почечных клубочков и эпителии почечных канальцев достоверно повышен только npv ВН; уровень экспрессии топоизомеразы На в МК почечных клубочков и эпителии почечных канальцев - при БПГН, и только в эпителии почечных канальцев - при ВН степень моноцитарной инфильтрации в клубочках увеличена при БПГН и уменьшенс при МИ, в интерстиции повышена при ВН.

3. Количество МК почечных клубочков и клеток эпителия почечных канальцев, мечены) топоизомеразами I и IIa, было высоким при пролиферативных (экстракипиллярном волчаночном и мезангиапьных) формах нефрита (75-100% клеток) и сниженным нормальным или незначительно повышенным при непролиферативных (МИ, ФСГС м МН) вариантах нефрита (0-50% клеток).

4. Уровень экспрессии топоизомераз I, IIa в МК почечных клубочков и эпителии почечны) канальцев коррелировал с выраженностью моноцитарной инфильтрации в клубочках ь интерстиции (одним из факторов повреждения почечной ткани), что указывает не патогенетическую роль топоизомераз в развитии нефрита.

5. Клинические (Кр сыв., ПУ, ГУ, АГ) и морфологические (ИА, ИС) параметры активное™ почечного процесса достоверно коррелировали с уровнем экспрессии топоизомераз I IIa и выраженностью моноцитарной инфильтрации в почечной ткани. В наибольшее степени величина ИА была прямо связана с выраженностью экспрессии топоизомеразь I в МК почечных клубочков и моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках величина ИС - с выраженностью экспрессии топоизомеразы IIa в МК почечны) клубочков и моноцитарной инфильтрации в интерстиции. Величина Кр сыв положительно коррелировала с уровнем экспрессии топоизомеразы IIa в эпителиу почечных канальцев и со степенью моноцитарной инфильтрации в интерстиции Выраженность ПУ была прямо связана с уровнем экспрессии топоизомеразы I е эпителии почечных канальцев и обратно - с уровнем экспрессии топоизомеразы I в MI1 почечных клубочков и выраженностью моноцитарной инфильтрации в интерстиции Уровень ГУ положительно коррелировал только с выраженностью моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках, а уровень АГ - со степенью моноцитарноС инфильтрации в интерстиции.

. Показано, что резистентность к иммунодепрессивной терапии (преднизолоном, циклофосфаном) у больных ВН возрастала при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы I в эпителии почечных канальцев, топоизомеразы На в МК почечных клубочков и степени моноцитарной инфильтрации в интерстиции; у больных МКГН - при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы I, На в эпителии почечных канальцев и степени МОН инфильтрации в клубочках и интерстиции. Для преодоления резистентности к иммунодепрессивной терапии требовались более высокие кумулятивные дозы преднизолона и циклофосфана.

. Почечный прогноз у больных ВН ухудшался при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы 1 в МК почечных клубочков и в эпителии почечных канальцев, топоизомеразы На в эпителии почечных канальцев; у больных МКГН - при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы IIa в МК почечных клубочков. Почечный прогноз у больных ВН и МКГН также ухудшался при отсутствии ответа на иммунодепрессивную терапию. Улучшение ответа на лечение и соответственно почечного прогноза у больных ВН и МКГН с высоким уровнем экспрессии топоизомераз может быть достигнуто более активной иммунодепрессивной терапией: применением сочетанной терапии (преднизолоном и циклофосфаном) и более высоких кумулятивных доз иммунодепрессантов.

1РАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

. Выраженная корреляция уровня экспрессии топоизомераз и степени моноцитарной инфильтрации в почечной ткани с традиционными клиническими (Кр сыв., ПУ, ГУ, АГ) и морфологическими (ИА, ИС) параметрами активности почечного процесса позволяет использовать их в качестве новых дополнительных маркёров активности нефрита, а также при решении вопроса о назначении иммунодепрессивной (ИД) терапии.

. Прогностическая роль уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации в ответе на лечение у больных ВН и МКГН может быть использована для выбора типа ИД-терапии, доз и длительности лечения ПЗ и ЦФА. Больным с высоким уровнем экспресии топоизомераз и моноцитарной инфильтрацией в почечной ткани (клубочках, канальцах, интерстиции) показано лечение более высокими дозами ПЗ и ЦФА.

. Уровень экспрессии топоизомераз в почечной ткани может быть использован для оценки почечной выживаемости у больных ВН и МКГН. Неблагоприятными прогностическими признаками у больных ВН явпяются высокий уровень экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков, а также топоизомераз I и IIa в эпителии почечных канальцев; у больных МКГН - высокий уровень экспрессии топоизомеразы IIa в МК почечных клубочков.

. Важность оценки уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной

2(

инфильтрации для предсказания ответа на ИД терапию и отдалённого прогноза больных ВН и МКГН делает необходимым проведение биопсии почки до начале терапевтического воздействия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванова Л.В., Rudolph Р., Тареева И.Е., Шилов Е.М., Proppe D. Экспрессия ДНК-топоизомераз при хронических заболеваниях почек // Материалы II Российской конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва. - 2001. - T. I. - С. 386.

2. Ivanova L.V., Rudolph P., Proppe D. Expression of DNA topoisomerases in chronic renal diseases II Pathological Society of Great Britain and Ireland. Abstracts of 180 th Meeting 18th-21st January 2000. - London, Great Britain. - Abstract 119.

3. Ivanova L.V., Rudolph P., Proppe D. Expression of DNA topoisomerases in chronic renal diseases // J, Pathol. - 2000. - Suppl. 190. - Abstract 30A.

4. Ivanova L.V., Rudolph P., Kellner U., Tareyeva I.E., Aim P., Proppe D. Expression of DNA topoisomerases in chronic proliferative kidney disease // Kidney International. - 2000. - V. 58 (4).-P. 1603-1612.

5. Ivanova L.V., Rudolph P., Proppe D. Correlation between topoisomerase expression and clinical parameters in chronic kidney disease // Kidney Blood Pressure Research. - 2000. - V. 23. - P. 254.

6. Ivanova L.V., Rudolph P., Proppe D. Correlation between topoisomerase expression and clinical parameters in chronic kidney disease // Abstracts of XXXVII Congress of the European Renal Association European Dialysis and Transplant Association. September 1720,2000. - Nice, France. - P. 6.

7. Ivanova L.V., Rudolph P., Proppe D. Correlation between topoisomerase expression and clinical parameters in chronic kidney disease II Nephrology Dialysis Transplantation. - 2000. -V. 15 (9).-Abstract A4.

8. Ivanova L.V., Rudolph P., Shilov E.M., Ivanov A.A., Tareyeva I.E., Proppe D. Evidence for an association of DNA topoisomerases with activity and progression of renal diseases // Abstracts of Second International Congress on immunointervention in nephrology. May 24-26, 2001.-Sardinia, Italy. - P. 16.

9. Ivanova L.V., Rudolph P., Shilov E.M., Ivanov A.A., Tareyeva I.E., Proppe D. Association between topoisomerase expression and progression in chronic kidney disease // Abstracts of XXXVIII Congress of the European Renal Association European Dialysis and Transplant Association. June 24-27, 2001. - Vienna, Austria. - P. 99.

¡ПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Л" - артериальная гипертензия

>ПГН - быстропрогрессирующий гломерулонефрит

!Н — волчаночный нефрит

У - гематурия

[ПВН - диффузный пролиферативный волчаночный нефрит

1А - индекс активности

1Д-терапия - иммунодепрессивная терапия

1С - индекс склероза

р сыв. - креатинин сыворотки

С - кортикостероиды

1И - минимальные изменения

1К- мезангиальные клетки

1КГН - мезангиокапиллярный гломерулонефрит

1Н - мембранозная нефропатия

ЮН - моноцитарная инфильтрация

1ПГН - мезангиопролиферативный гломерулонефрит

С - нефротический синдром

1ПВН - очаговый пролиферативный волчаночный нефрит 3 - преднизолон У - протеинурия

ИН - тубулоинтерстициальный нефрит ОП - топоизомеразы

С ГС - фокально-сегментарный гломерулосклероз С - цитостатики ФА - цикпофосфан

Актуальность проблемы

Гломерулонефрит (ГН) - одна из наиболее частых причин хронической почечной недостаточности. Лечение ГН остается сложной проблемой, и основу лечения, направленного на отдаление терминальной почечной недостаточности, составляет патогенетическая терапия, базирующаяся на современных представлениях об иммунных и неиммунных механизмах происхождения и прогрессирования ГН [И.Е. Тареева 1995; Т.Н. Краснова 1996]. Несмотря на достигнутый за последнее десятилетие прогресс в иммунодепрессивной терапии ГН, лечение прогрессирующих форм нефрита, в основе которых лежит иммунное воспаление с накоплением внеклеточного матрикса и развитием склероза, требует дальнейшей разработки [И.Е. Тареева с соавт. 1989; H.A. Мухин с соавт. 1989; Т.Н. Краснова 1991. 1998; Е.М. Шилов 1994; G. Banfi etal. 1991; С. Ponticelli 1992; G.G. Illei & J.H. Klippel 1998; G.M. Nassar et al. 1998; M. Klein et al. 1999; C.C. Geddes & D.C. Cattran 2000; P. Passerini & C. Ponticelli 2001]. Кроме того, большинство иммунодепрессантов вызывают ряд тяжёлых осложнений и обладают непосредственным нефротоксическим эффектом [J.L. Ader 1998; С. Ponticelli 1999; W.F. Finn 1999]. Поэтому остаётся актуальным дальнейшее углублённое изучение патогенеза ГН с целью поиска новых маркёров для оценки активности и прогноза ГН и, возможно, точек приложения действию новых классов иммунодепрессантов с принципиально другими механизмами действия, обладающих более высокой терапевтической эффективностью и меньшей токсичностью.

Известно, что иммунные реакции лежат в основе большинства ГН [W. G. Couser 1990, 1993, 1999], причём важную роль в возникновении и прогрессировании патологических процессов в почках играют иммунные комплексы и антитела (AT), а также реакции клеточного иммунитета [G.M. Nassar et al. 1998; J.Г. Ambrus et al. 1997]. Наиболее чётко это продемонстрировано при волчаночном нефрите (ВН) [С. Mohan et al. 1995; J.S. Cameron 1999; M.H. Foster et al. 1999]. Хотя антитела к ДНК и являются основным патогенетическим фактором [N. Suzuki et al. 1997; D.A. Isenberg et al. 1997; R. Suenaga et al. 1993], y пациентов с ВН были найдены другие аутоантитела [J.C. Kootstra et al. 1996], среди которых описаны AT к топоизомеразам I и На [A. Hoffmann et al. 1989; L. Stojanov et al. 1995; R. Meliconi et al. 1993; Chang et al. 1996; Kameda et al. 1997; Katsumi et al. 2000; Grigolo et al. 2000; Gussin et al. 2001].

Топоизомеразы (ТОП) - это ДНК-связанные ферменты, контролирующие топологическое состояние ДНК посредством участия в процессах транскрипции, репликации и сегрегации делящихся хромосом [J.C. Wang 1971, 1985, 1987, 1997; M. Geliert 1976, 1981; К. Drlica 1984]. Поскольку ТОП тесно связаны с ДНК [J.C. Wang 1985; W.C. Earnshaw 1985] то, следовательно, включены в процесс, ведущий к образованию AT к ДНК, на что указывает наличие антигистоновых AT при ВН [R. Suenaga 1996]. Приведенные данные свидетельствуют о возможной роли ТОП в аутоиммунном процессе.

Участвуя в процессах транскрипции и репликации, ТОГ1 могут служить индикаторами метаболической и пролиферативной активности клеток [IJ. Kellner et al. 2000], что успешно используется для оценки прогноза у пациентов со злокачественными заболеваниями [Р. Rudolph 1997, 1999; L. Nakopoulou 2001]. В клинической онкологии также широко применяют ингибиторы ТОГ1 I (топотекан, иринотекан) и Па (этопозид, тенипозид, доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, митоксантрон), которые при ряде злокачественных заболеваниях имеют достаточно хороший 1ераиевтический )ффект и многие из них (топотекан, иринотекан) обладают незначительным нефрогоксическим действием по сравнению с современными иммунодепрессантами [S. О Reilly et al. 1996; D. Abigerges 1995, 1996; P. Canal 1996; G.G. Chabot 1995; C. Kollmannsberger 1999|.

Однако опубликованных работ по исследованию экспрессии ТОП I и На в почечных биоптатах больных нефритами и в почечной ткани без патологических изменений к настоящему времени нет. Изучение этого аспекта является важным, так как уровень экспрессии этих ферментов может отражать клиническое течение нефритов и, таким образом, быть новым маркёром в оценке активности и прогноза нефритов. Также важно изучение патогенетических связей между экспрессией ТОП и другими маркёрами активности нефрита, в том числе моноцитарной инфильтрацией. Кроме того, доказательство экспрессии ТОП в клетках почечных клубочков и канальцев при развитии и прогрессировании нефрита может послужить обоснованием применения ингибиторов ТОП как нового метода лечения прогрессирующих форм нефрита.

Цель исследования: поиск новых маркёров активности и прогноза нефритов для повышения эффективности их терапии.

Задачи исследования

1. Оценить уровень экспрессии ТОГ1 I, На и степень моноцитарной инфильтрации в почечных биоптатах больных нефритами и в почечной ткани без патологических изменений.

2. Оценить связь уровня экспрессии ТОГ1 I, На и выраженности моноцитарной инфильтрации с клиническими и морфологическими параметрами активности и прогрессирования почечного процесса.

3. Оценить влияние уровня экспрессии ТОП I, IIa и степени моноцитарной инфильтрации на прогноз больных ВН и мезангиокапиллярным гломерулонефритом (МКГН) и их ответ на лечение.

Научная новизна

1. Впервые в мире продемонстрирована экспрессия ТОП I и IIa в почечных биоптатах больных с различными формами нефрита и в почечной ткани без патологических изменений.

2. Впервые описано наличие сильной корреляционной связи между уровнем экспрессии ТОП I, IIa и выраженностью моноцитарной инфильтрации (одним из маркёров активности почечного процесса), указывающее на патогенетическую р^ль ТОП в развитии нефрита.

3. Впервые показана возможность использования уровня экспрессии ТОП I и IIa в качестве маркёра морфологической и клинической активности почечного процесса.

4. Впервые продемонстрирована роль уровня экспрессии ТОП I и IIa в качестве предиктора ответа на иммунодепрессивную терапию у больных ВН и МКГН.

5. Впервые в мире уровень экспрессии ТОГ1 I и IIa использован для оценки скорости прогрессирования почечной недостаточности у больных ВН и МКГН.

6. Впервые продемонстрировано новое звено патогенетической цепи развития ГН, которое может стать мишенью селективного терапевтического воздействия, способного кардинально ишенить прогноз прогрессирующих форм нефрита, резистентных к современным иммунодепрессивным препаратам.

Практическая значимость Уровень экспрессии ГОН I и IIa предложен как новый молекулярно-биологический маркёр активности почечного процесса у больных различными морфологическими вариантами нефрита.

2. Определена прогностическая роль уровня жспрессии ТОП I, IIa и выраженности МОН инфильтрации в предсказании «почечной выживаемости» больных ВН, МКГН и их ответа на иммунодепрессивную терапию.

3. Создана теоретическая основа для проведения исследований по практическому применению нового класса препаратов - ингибиторов ТОП -в лечении прогрессирующих форм нефрита, резистентных к современным иммунодепрессивным препаратам.

Внедрение результатов исследования

Результаты настоящего исследования используются при обследовании и лечении больных Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний ММА им. И.М. Сеченова, включены в материалы лекционных курсов для курсантов кафедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образования ММА им. И.М. Сеченова.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, которые отражают изложенные результаты, положения и выводы.

Материалы работы представлены на научной конференции кафедры нефрологии и гемодиализа ФГ1ГЮ ММА им. И.М. С еченова (сентябрь, 1999 г.), на 180-м заседании Общества патологов Великобритании и Ирландии (18-21 января 2000 г., Лондон, Великобритания), на Конгрессе немецкого общества нефрологов (2-5 сентября 2000 г., Вена, Австрия), на XXXVII Конгрессе Европейской ассоциации по диализу и трансплантации (16-20 сентября 2000 г., Ницца, Франция), на Конференции молодых учёных России с международным участием (24-28 апреля 2001 г., Москва, Россия), на втором Международном Конгрессе «Иммунология в нефрологии» (24-26 мая 2001 г., Сардиния, Италия), на XXXVIII Конгрессе Европейской ассоциации по диализу и трансплантации (24-27 июня 2001 г., Вена, Австрия).

Апробация работы

Апробация работы проведена 3 сентября 2001 года на совместном заседании кафедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образований и отдела нефрологии Научно-исследовательского центра ММА им. И.М. Сеченова.

База проведения исследования

Основной базой проведения исследования являлись кафедра нефрологии и гемодиализа ФППО и отдел нефрологии НИЦ ММА им. И.М. Сеченова (зав.

- чл.-корр. РАМН, профессор! И.Е. Тареева| ), нефрологическое отделение (зав. к.м.н. Н.Г. Мирошниченко) Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней ММА им. И.М. Сеченова (дир. - академик РАМН, профессор Н.А. Мухин), НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова (дир. - академик РАМН и РАН, профессор М.А. Пальцев; зам. дир. -профессор А.А. Иванов), кафедра патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова (зав. - академик РАМН и РАН, профессор М.А. Пальцев), Клиника нефрологии Christian-Albrechts University, Kiel, Germany (дир. приват-доцент D. Proppe), Институт общей патологии Christian-Albrechts University, Kiel, Germany (дир. профессор G. Kloppel).

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научным руководителям - профессору Е.М. Нилову и профессору A.A. Иванову, а также академику РАМН, профессору H.A. Мухину, профессору Л.В. Козловской, к.м.н. Т.Н. Красновой, к.м.н. М.Ю Швецову, профессору В.А. Варшавскому, к.м.н. Е.Г1. Проскурневой, коллективам кафедры нефрологии и гемодиализа ФППО, отдела нефрологии НИЦ, Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. ЕМ. Тареева, НИИ молекулярной медицины, кафедры патологической анатомии ММА им. Е.М. Сеченова за неоценимую помощь в работе. Особую благодарность автор выражает чл.-корр.

РАМН, профессору! И.Е. Тареевоц , приват-доценту D. Ргорре и приват-доценту Р. Rudolph за возможность участия в международном проекте «ДНК-топоизомеразы» и постоянную помощь в самых различных организационных вопросах, включая финансирование данного проекта.

ВЫВОДЫ

1. В почечной ткани без патологических изменений (п = 12) и в почечных биоптатах больных с различными морфологическими вариантами нефритов (п = 132) выявлена экспрессия топоизомеразы I в мезангиальных клетках (МК), эндотелии и эпителии почечных клубочков, эпителии почечных канальцев и интерстициальных клетках, топоизомеразы На - в МК почечных клубочков и в эпителии почечных канальцев.

2. Выявлены достоверные различия в уровне экспрессии топоизомераз I, IIa и выраженности моноцитарной инфильтрации при нефритах в сравнении с почечной тканью без патологических изменений: уровень экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков и эпителии почечных канальцев достоверно повышен только при ВЫ; уровень экспрессии топоизомеразы IIa в МК почечных клубочков и эпителии почечных канальцев - при БПГН, и только в эпителии почечных канальцев - при ВН; степень моноцитарной инфильтрации в клубочках увеличена при БПГ H и уменьшена при МИ, в интерстиции повышена при ВН.

3. Количество МК почечных клубочков и клеток эпителия почечных канальцев, меченых топоизомеразами I и IIa, было высоким при пролиферативных (экстракипиллярном, волчаночном и мезангиальных) формах нефрита (75-100% клеток) и сниженным, нормальным или незначительно повышенным при непролиферативных (МИ, ФСГС и МН) вариантах нефрита (0-50% клеток).

4. Уровень экспрессии гопоизомераз I, IIa в МК почечных клубочков и эпителии почечных канальцев коррелировал с выраженностью моноцитарной инфильтрации в клубочках и интерстиции (одним из факторов повреждения почечной ткани), что указывает на патогенетическую роль топоизомераз в развитии нефрита.

5. Клинические (Кр сын., ПУ, ГУ, АГ) и морфологические (ИА, ИС) параметры активности почечного процесса достоверно коррелировали с уровнем экспрессии топоизомераз I, На и выраженностью моноцитарной инфильтрации в почечной ткани. В наибольшей степени величина И А была прямо связана с выраженностью экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков и моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках, величина ИС - с выраженностью экспрессии топоизомеразы Па в МК почечных клубочков и моноцитарной инфильтрации в интерстиции. Величина Кр сыв. положительно коррелировала с уровнем экспрессии топоизомеразы На в эпителии почечных канальцев и со степенью моноцитарной инфильтрации в интерстиции. Выраженность ПУ была прямо связана с уровнем экспрессии топоизомеразы I в эпителии почечных канальцев и обратно - с уровнем экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков и выраженностью моноцитарной инфильтрации в интерстиции. Уровень ГУ положительно коррелировал только с выраженностью моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках, а уровень АГ - со степенью моноцитарной инфильтрации в интерстиции.

6. Показано, что резистентность к иммунодепрессивной терапии (преднизолоном, циклофосфаном) у больных ВН возрастала при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы I в эпителии почечных канальцев, топоизомеразы На в МК почечных клубочков и степени моноцитарной инфильтрации в интерстиции; у больных МКГН - при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы I, Па в эпителии почечных канальцев и степени МОИ инфильтрации в кл\бочках и интерстиции. Для преодоления резистентности к иммунодепрессивной терапии требовались более высокие кумулятивные дозы преднизолона и циклофосфана.

7. Почечный прогноз у больных ВН ухудшался при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков и в тителии почечньи ланальцев, топоизомеразы Па в эпителии почечных канальцев; у больных МКГН - при увеличении уровня экспрессии топоизомеразы Па в МК почечных клубочков. Почечный прогноз у больных ВН и МКГН также ухудшался при отсутствии ответа на иммунодепрессивную терапию. Улучшение ответа на лечение и соответственно почечного прогноза у больных ВН и МКГН с высоким уровнем экспрессии топоизомераз может быть достигнуто более активной иммунодепрессивной терапией: применением сочетанной терапии (преднизолоном и циклофосфаном) и более высоких кумулятивных доз иммунодепрессантов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выраженная корреляция уровня экспрессии топоизомераз и степени моноцитарной инфильтрации в почечной ткани с традиционными клиническими (Кр сыв., ПУ, ГУ, АГ) и морфологическими (НА, ИС) параметрами активности почечного процесса позволяет использовать их в качестве новых дополнительных маркёров активности нефрита, а также при решении вопроса о назначении иммунодепрессивной (ИД) терапии.

2. Прогностическая роль уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации в ответе на лечение у больных ВН и МКГН может быть использована для выбора типа ИД-терапии, доз и длительности лечения ПЗ и ЦФА. Больным с высоким уровнем экспрессии топоизомераз и моноцитарной инфильтрацией в почечной ткани (клубочках, канальцах, интерстиции) показано лечение более высокими дозами ПЗ и ЦФА.

3. Уровень экспрессии топоизомераз в почечной ткани может быть использован для оценки почечной выживаемости у больных ВН и МКГН. Неблагоприятными прогностическими признаками у больных ВН являются высокий уровень экспрессии топоизомеразы I в МК почечных клубочков, а также топоизомераз I и Па в эпителии почечных канальцев; у больных МКГН - высокий уровень экспрессии топоизомеразы Па в МК почечных клубочков.

4. Важность оценки уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации для предсказания ответа на ИД герапию и отдалённого прогноза больных ВН и МКГН делает необходимым проведение биопсии почки до начала терапевтического воздействия.