Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клинические и генетические аспекты наследственного рака молочной железы (РМЖ)

На правах рукописи

БИТ-САВА Елена Михайловна

КЛИНИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НАСЛЕДСТВЕННОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Специальность: -14.00.14 - онкология 03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Государственном Учреждении Науки НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН Доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

Владимир Федорович Семиглазов Евгений Наумович Имянитов

Лев Михайлович Бериггейн Михаил Николаевич Блинов

Ведущее научное учреждение:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. H.H. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится "_"_2005 г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д ГУН НИИ онкологии им. проф.

Н.Н.Петрова Федеральное Агентство по здравоохранению и социальному развитию (197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, д.68)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "_"_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н.

Р.В. Орлова

JS&fdL ¿UX/<POYO

VtiVL к

Актуальность темы

Заболеваемость раком молочной железы (РМЖ) как в России, так и в большинстве стран продолжает увеличиваться. Рак молочной железы является одной из наиболее частых причин смерти у женщин. В течение первого года с момента установления диагноза РМЖ на 2003 год летальность составила 12,1% (Чиссов В.И.. и др., 2004).

За последние 18 лет РМЖ в структуре заболеваемости занимает первое место в России (Мерабишвили В.М., 2003; Чиссов В.И. и др., 2003). Прогресс молекулярной генетики с привлечением биохимии позволяет по-новому рассмотреть некоторые стороны этиологии и патогенеза РМЖ, базируясь на результатах клинических и эпидемиологических исследований. На сегодняшний день патогенез РМЖ можно рассматривать как результат многоступенчатых генетических мутаций, происходящих в течение длительного промежутка времени в эпителиальных клетках протоков и долек молочной железы. Но вероятнее всего, одна из наиболее важных внутренних внутриклеточных причин - это наследование поврежденного гена, которое увеличивает индивидуальный риск РМЖ (Szabo С., 1995). Только 5 % случаев РМЖ имеют истинно наследственную природу, связанную с мутацией в генах репарации ДНК: BRCA1(185 del AG и 5382 Ins С), BRCA2 (6174 del Т) (Caldas С. et al., 1997; Grren M.H., 1997; Narod S,A., 1994).

Носительство мутаций в BRCA1 и BRCA2 увеличивает индивидуальный риск развития РМЖ до 85-100%, в 10 раз вероятность рака яичников, а также риск развития рака во второй молочной железе до 35% (Narod S.A., 1999).

Положительный семейный анамнез в отношении РМЖ - один из самых значительных факторов риска развития заболевания. Женщины, у которых родственники первой степени родства болели РМЖ, риск заболевания увеличивается в 2-3 раза по сравнению с общей популяцией, и в 8 раз - если болела родная сестра (Семиглазов В.Ф. с соав., 2003). Тем не менее, во многих семьях с предполагаемым аутосомно-доминантным типом наследования предрасположенности к РМЖ, не обнаруживают мутаций в этих генах или сцепленности с ними. Это позволяет предположить, что, по всей видимости, существуют другие, еще необнаруженные высокопенетрантные гены, предрасполагающие к РМЖ.

Широкий генетический скрининг наследственных форм РМЖ представляется пока невозможным, ДНК-диагностика применяются только в отношении тех женщин, у которых имеются косвенные клинические признаки наследственного ракового синдрома:

1. Случаи РМЖ и/или РЯ у ближайших кровных родственников пациентки (прежде всего, у матери и сестёр);

2. Первично-множественный характер онкологического процесса (сочетания опухолей молочной железы и яичников);

3. Молодой возраст больной при выявлении заболевания (до 45 лет);

4. Кипятеря пкный пак молочной железы (БРМЖУ

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА •Д^Петервург

1<>К

Диагноз «наследственного» РМЖ имеет, безусловно, клиническую значимость, т.к. позволяет выделить группы повышенного (иногда почти фатального) риска РМЖ и РЯ. Для подобных относительно небольших групп женщин представляется целесообразным создавать специальные условия, гарантирующие повышенную доступность и высокую надёжность ранней диагностики РМЖ и РЯ. В исключительных случаях диагноз наследственного ракового синдрома заставляет рассматривать не только схему диагностических мероприятий, но и обоснованность профилактического оперативного вмешательства. Необходимо четко определить сходные и различные признаки наследственного и спорадического РМЖ, используя, по показаниям, генетическое консультирование для пациентов с учетом клинических особенностей перечисленных выше. Диагноз «наследственного» РМЖ имеет на сегодняшний день огромную клиническую значимость, т.к. позволяет обнаружить у женщин с помощью лабораторных тестов высокий риск возникновения РМЖ и РЯ.

Цель исследования

Целью настоящей работы является изучение клинических особенностей BRCA-ассоциированного РМЖ, и их взаимосвязь с носительством «founder» мутаций в генах BRCA1 и BRCA2.

Задачи исследования:

1. Определить частоту BRCA-ассоциированных характеристик РМЖ (семейный анамнез РМЖ, РЯ, молодой возраст при выявлении заболевания, первично-множественный характер онкологического процесса) у больных РМЖ.

2. Оценить ассоциации между косвенными признаками наследственного РМЖ.

3. Выяснить частоту повторяющихся мутаций в генах BRCA (185delAG (BRCA1), 5382insC (BRCA1), 6174dclT (BRCA2)) в Российской популяции.

4. Изучить характер взаимосвязи между косвенными признаками BRCA-ассоциированного РМЖ и «foundcTO-мутациями в генах BRCA1, BRCA2.

Научная новизна

1. Впервые определен удельный вес и распространенность BRCA-ассоциированной формы заболевания среди больных РМЖ T1-4N0-3M0

2. Проанализирован характер и ассоциации косвенных характеристик наследственного РМЖ.

3. Определена частота терминальных мутаций генов BRCA1 (185delAG, 5382insC), 6174delT (BRCA2) у больных с косвенными признаками наследственного РМЖ.

4. Оценены юшнико-морфологические особенности BRCA-ассоциированного РМЖ.

Практическая значимость

Выработаны рекомендации по отберу пациешок для медико-генешческого консультирования. На основании оценки результатов молекулярно-генетических исследований внедрены в рутинную клиническую практику некоторые лабораторные процедуры, позволяющие идентифицировать BRCA-ассоциированные формы РМЖ.

Положения, выносимые на защиту

1. Представляется целесообразным проведение медико-гснетической консультации больным первичным РМЖ моложе 45 лет, больным с первично-множественными опухолями (РМЖ и РЯ), у больных синхронным БРМЖ, а также при наличии в семейном анамнезе РМЖ и\или РЯ.

2. При сочетании нескольких косвенных признаков наследственного заболевания возрастает вероятность взаимосвязи РМЖ с носительством «Аэипс1ег»-мутаций в генах BRCA1 (5382insC), BRCA2 (6174delT).

3. В половине случаев синхронный БРМЖ ассоциирован с мутациями в терминальных генах BRCA1 (5382insC), BRCA2 (6174delT).

Внедрение результатов работы в практику

Результаты работы внедрены и используются в практической и научно-исследовательской работе НИИ онкологии им.проф. Н.Н.Петрова.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, общего заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертационная работа изложена на 105 страницах машинописного текста, включает таблиц 11 и 18 рисунков. Список литературы состоит из 231 источника отечественных и иностранных авторов.

Содержание работы

Материалы и методы

В исследование вошли больные раком молочной железы T1-4N0-3M0, прошедшие лечение в отделении опухолей молочной железы НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова с октября 2003 по октябрь 2004 п. Из 653 больных были отобраны 103 женщины с косвенными признаками наследственного рака молочной железы, которым в последствии проводилось медико-генетическое обследование.

Проведенная работа состояла из трех частей:

1. Анализ наследственных аспектов заболевания путем опроса больной и изучения первичной документации.

2. Медико-генетическая консультация пациентов с BRCA-ассоциированными признаками.

3. Лабораторное тестирование на наличие мутаций генов BRCA1 (185delAG, 5382insC), 6174delT (BRCA2) в образцах крови больных, прошедших медико-генетическую консультацию с «положительным результатом».

Медико-генетическая консультация проводилась при наличии одного или нескольких косвенных признаков наследственного РМЖ: 1 .Случаи РМЖ и/или РЯ у ближайших кровных родственников пациентки (прежде всего у матери, дочери и сестёр); первично-множественный характер онкологического процесса у родственников 1-2 степени родства.

2.Возраст женщин до 45 лет на момент выявления РМЖ

3.Первично-множественный характер онкологического процесса у больной; сочетание РМЖ и РЯ.

4. Синхронный и метахронный БРМЖ.

Дополнительные клинические и морфологические данные больных РМЖ были получены из первичной медицинской документации (история болезни, амбулаторная карта).

Для генетического исследования «йшпс1ег»-мутаций в генах BRCA1 (185delAG, 5382insC), BRCA2 (6174delT) использовались методики выделения ДНК, аллель-специфической ПЦР и электрофоретического анализа ДНК-фрагментов.

Выделение ДНК

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови производилось с помощью модифицированного соль-хлороформного метода (Mullenbach R. et al., 1989). Эритроциты крови подвергались гипоосмолярному лизису путем разбавления препарата в 3 раза водой, затем путем центрифугирования осаждали лейкоциты. Далее лейкоциты ресуспендировали в 1 мл Трис-HCL (рН=8,3), 1шМ ЭДТА. С целью разрушения мембраны клеток добавляли к полученной смеси Тритон до концентрации 1%. Ядра клеток осаждались при центрифугировании, ресуспендировались в 1 мл Трис-HCL (рН=8,3), 1шМ ЭДТА и лизировались при добавлении додецилсульфата натрия до концентрации 0,5%. В течении 12 часов при температурном режиме 65 С проводился частичный протеолиз белков с помощью протеиназы К (100 мкг/мл), далее к раствору добавлялся NaCL до конечной концентрации 1,5 М и равный объем хлороформа. Экстракция проводилась органическим растворителем производилась на протяжении 30 минут, при медленном покачивании, с целью удаления нерастворимых элементов клеток, белков и липидов. По окончании центрифугирования ДНК, содержащуюся в водяной фазе, переосаждали двумя объемами 96% С2Н50Н; осадок промывали 70% С2Н50Н, далее растворяли до концентрации 1 мкг/мкл в растворе ТЕ.

Полимеразная цепная реакциия (ПЦР) Для изучения потерь гетерозиготности применялись локус-специфические пары праймеров. В целях оптимизации результатов полимеразной цепной реакции (ПЦР) в работе использовались следующииие геномные праймеры и фрагменты:

Мутапия 185 HelAfi

■ brl-lws 5'-gCT Atg CAgAAAATCTTA gAg TgT С -3'

■ brl-2ms 5'- ATg СТА TgC AgA AAA TCT TAg TgT CC -3'

■ brl-3a 5'-CAg TTA Agg AAA TCA gCA ATT АСА ATA g-3'

Мутация 53S7.insC

■ brl-4ws 5'-AAg CgA gCA AgA gAA TTC CAg -3'

■ brl-5ms 5'-AgC gAg CAA gAg AAT TCC CA - 3'

■ brl-6a 5'-AgA ACC TgT gTg AAA gTA TCT Age ACT g -3'

, Мутация 6174delT

■ br2-ls 5'-CAT AAC CAA AAT ATg TCT ggA TTg gAg -3'

■ br2-wa 5'-CTg ATA CCT ggA CAg ATT TTC CAC -3' ) • br2-3ma 5'-CCT ggA CAg ATT TTC CCT TgC -3'

Условия полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Состав ПЦР реакции: 50 шМ KCl, Tris-EDTA буфер рН=8.2,200 mkM dATP,

dTTP, dCTP, dGTP каждого. 2,5 шМ MgC12, 0.5 mkM каждого праймера, 2

единицы Thermos tar taq pol (heat-activated), 1 ткл раствора ДНК.

Объем реакции - 10 mkl.

Полимеразная иепная реакция амплификации.

Реакция производилась на приборе Mini Cicler (MI Research)

1-й цикл: 15 минут при температуре +95°С для активации фермента.

2-й цикл: фаза отжига при температуре + 64 °С в течение 45 сек, фаза синтеза при температуре +72 °С в течение 1 минуты, фаз денатурации при температуре +95°С в течении 30 сек; число повторов - 35.

Полученный продукт реакции анализировался путем вертикального электрофореза фрагментов в 10% полиакрил-амидном геле с их последующей визуализацией в УФ-свете после окраски бромидом этидия. » Состав полиакриламидного геля (ПААГ): акрил -амид-10%, бис-акриламид-

0,3%.Буфер - lx TBE рН=7,0-7,4.

Рис. 1. Пример анализа мутации BRCA1 5382тзС посредством аллель-специфической ПЦР

Каждый исследуемый образец представлен парой, в одной из которой производилась амплификация нормального (дикого) аллеля, а в другой -мутантного. Нечетные образцы - дикий тип, четные - мутантный. Образец в дорожках 15-16 гетерозиготен по данной мутации. Дорожка с мутантным фрагментом отмечена знаком Hf.

Результаты

У 103 больных обнаружены один или несколько признаков наследственного РМЖ. Всем больным проведено медико-генетическое консультирование и ДНК-исследование мутаций в генах BRCA1, BRCA2. Мутации BRCA1 (5382 insC) были найдены у 16 женщин, BRCA2 (6174 deIT) - у одной, а дефект BRCA1 (185 delAG) - не обнаружен вовсе.

BRCA2 (6174delT)

0-9% 15.5%

BRCA -

Рис.2. Спектр мутаций BRCA1 и BRCA2 у больных с косвенными признаками наследственного РМЖ

Основным, часто встречающимся критерием, согласно которому пациенты обследовалась дополнительно, явился возраст больной при выявлении злокачественной опухоли молочной железы. Из общего числа пациентов, прошедших медико-генетическую консультацию (N=103) у 52 (50,5 %) одним

BRCA1 (5382insC)

из косвенных признаков был возраст женщины до 45 лет на момент обнаружения опухоли молочной железы. Наиболее пристальное внимание уделялось отягощенному онкологическому семейному анамнезу; всем пациентам, кровные родственники 1 -2 степени родства которых страдали РМЖ и/или РЯ, предлагалось пройти генетическую консультацию. Предварительно детально изучался семейный анамнез таких больных: возраст выявления злокачественного новообразования у родственников 1-2 степени родства, характер проведенного лечения, стадия заболевания, продолжительность жизни. Не все больные РМЖ, родственники которых страдали такими злокачественными опухолями как рак желудка, рак легких, рак тела мазки и др. проходили консультацию врача-генетика, учитывая нехарактерное сочетание с данным заболеванием. Только при сочетании с одним из косвенных признаков I наследственного РМЖ или при наличии нескольких случаев злокачественных

опухолей в пределах одной семьи, больные проходили дополнительное клинико-генетическое обследование. Онкологический семейный анамнез (РЯ и/или РМЖ) у кровных родственников пациентов определял обязательное медико-генетическое обследование. В пределах одной семьи у 46 пациентов (44,7 %) встречались от 1 до 3 случаев РМЖ.

БРМЖ также выделялся в отдельный критерий проведения генетической консультации, причем с синхронной опухолью было 8 (7,8%) случаев, с метахронной -13 (13,6 %) больных.

Особо выделялись редкие сочетания РЯ и РМЖ - 8 больных (7,8%), как наиболее вероятные случаи нахождения мутаций генов репарации ДНК. Для пациентов с первично-множественными опухолями других локализаций (0,6%) также было рекомендовано исследование крови на предмет «Аэипс1ег»-мутаций в исследуемых генах ВЯСА1, ВЯСА2.

Таблица 1

Встречаемость ВЯСА-ассоциированных характеристик среди больных

с косвенными признаками наследственного РМЖ*

Клинические особенности Число Больных (п=103) %

Пациенты < 45-лет 52 50,5 %

Наличие РМЖ у кровных родственников пациента 46 44,7 %

Билатеральный метахронный РМЖ 14 13,6%

Билатеральный синхронный РМЖ 8 7,8 %

Первично-множественные опухоли (РМЖ и РЯ) 8 7,8 %

Наличие РЯ у родственников пациента 7 6,8 %

* может быть сочетание нескольких признаков у одной больной

Билатеральный рак молочной железы

В ходе проведенного исследования выявлено, что 31,8% всех случаев БРМЖ ассоциировано с мутациями в генах ВЯСА1, ВЯСА2

В ходе проведенной работы выявлено, что 50% всех синхронных БРМЖ ассоциировано с мутациями в генах ВЛСА.

50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0

□ ВР!СА+ ■ В1*СА-

Рис. 3. Мутации ВЛСА-генов у больных синхронным БРМЖ

На долю ВЯСА-ассоциированного метахронного БРМЖ приходится только 21,4% от общего числа больных метахронным БРМЖ.

а вга;А+ ШВИСА-

Рис. 4. Мутации ВЛСА-генов у больных метахронным БРМЖ

Для ВЯСА-ассоциированных РМЖ более характерен двусторонний опухолевый процесс: из общего числа ВЯСА-позитивных РМЖ (п=17) на долю двусторонних опухолей приходится 41,1% (7 больных): на синхронный БРМЖ - 23,5 % (4 больнных), и на метахронный БРМЖ - 17,6 % (3 больные)

Следует отметить молодой возраст больных (от 29 до 45 лет) при выявлении первой опухоли среди тех, где обнаружены мутации генов репарации ДНК.

РМЖ у молодых женщин

Из 52 пациентов моложе 45 лет, прошедших медико-генетические обследования в 9 случаях были найдены мутации генов репарации ДНК. Однако следует обратить внимание на комбинацию двух косвенных признаков BRCA-ассоциированного РМЖ: ранний возраст больной при выявлении заболевания и РМЖ и/или РЯ у кровных родственников (п=34). Среди этой выборки (34 пациента) обнаружено 6 случаев «founder» мутаций генов репарации (17,6%).

При сопоставлении числа мутаций генов наследственной предрасположенности у женщин моложе и старше 45 лет, частота обнаружения «founder» мутаций у больных моложе 45 лет - 53 % (9 случаев), у больных старше 45 лет - 47 % (8 случаев), в то же время 70, 6 % (12 случаев) больных BRCА-ассоциированным-РМЖ пременопаузального статуса (табл.5). Таким образом, возраст больной при выявлении РМЖ является определяющим критерием отбора для проведения генетической консультации. Частота мутаций BRCA выше при сочетании с другими характеристиками BRCA-ассоциированного РМЖ (напрййер, с наличием РЯ и/или РМЖ в семейном анамнезе). %

Первично-множественные опухоли (рак молочной железы и рак яичников)

В 25 % случаев сочетания РМЖ и РЯ найдена терминальная мутация в гене

BRCA1 5382insC.

%

■ BRCA+

■ BRCA-

Рис.5. Статус BRCA-генов у больных с первично-множественными опухолями

(РМЖ и РЯ)

Онкологический семейный анамнез (РМЖ, РЯу кровных родственников 1-2 степени родства)

Агрегация случаев РМЖ, РЯ и других опухолей вариабельна в семьях, где была найдены дефекты в генах репарации ДНК. Определяющей характеристикой ВЯСА-ассоциированного РМЖ является наследственный компонент, в частности случаи РЯ у кровных родственников в предыдущем поколении: из 7 больных РМЖ с данным признаком у 4 была обнаружена мутация ВЯСА1 5382тьС, у 1 - ВЯСА2 6174<1с1Т. Случаи РМЖ в пределах одной семьи ассоциированы с носительством мутаций в генах ВШГА1, ВКСД2 в 15,2%.

1

Рис. 6. Мутации генов ВЯСА1 5382тзС, ВЯСА2 6172с1е1Т, у больных РМЖ с наличием в семейном анамнезе случаев РМЖ

Рис. 7. Мутации генов ВЯСА1 5382тБС, ВЯСА2 6172с1е1Т у больных РМЖ не имевших случаев РМЖ в семейном анамнезе.

Мы сравнили частоту нахождения мутаций в генах BRCA1, BRCA2 в двух группах больных: в одной группе кровные родственники 1-2 степени родства болели РМЖ (п=46), в другой группе этой важной характеристики наследственной формы заболевания не было отмечено (п=57). На приведенных рис.6 и 7 видно, что частота «BRCA-позитивных» РМЖ выше в первой группе больных и составляет 15,2 %, во второй - 8,8 % (р <0.05).

Сочетания косвенных признаков наследственного РМЖ Сочетание таких признаков как молодой возраст при выявлении РМЖ и наличие РМЖ у родственников встречались в 21 случае (20,4 %); в 3 случаях из которых была найдена мутация BRCA1 (5382insC). При сочетании таких косвенных признаков наследственного РМЖ как молодой возраст при обнаружении первичной опухоли и наличие РЯ у кровных родственников больной в 80% случаев были найдены дефекты генов наследственной предрасположенности (у 4 женщин обнаружена мутация BRCA-1 (5382insC) и у 1 женщины - BRCA-2 (6172 del Т)).

Таблица 2

Сочетания некоторых косвенных признаков наследственного РМЖ и взаимосвязь их с генетическими дефектами BRCA-генов

Сочетания признаков Число случаев BRCA1 (5382insC) BRCA2 (6174delT)

РМЖ и РЯ 8 2(12,5%)

Наличие РМЖ у родственников больной РМЖ моложе 45 лет 21 3 (14,3 %)

Наличие РЯ у родственников больной РМЖ моложе 45 лет 5 4 (80 %)

При тщательном изучении семейного онкологического анамнеза выявлено, что у 6 из 22 больных билатеральным РМЖ, у которых в пределах семьи были случаи РМЖ или РЯ, найдена терминальная мутация гена BRCA1 5382 insC, у одной пациентки обнаружена мутация BRCA2 6174 delT. На представленной родословной прослеживается носительство «founder», передающееся по отцовской линии: в первом поколении носительство BRCA-мутации (5382 insC) фенотипически представлено билатеральным РМЖ, тогда как в третьем -монолатеральным, что не исключает высокий риск развития рака во второй молочной железе (рис.8).

Рис.8 Генеалогическое дерево больной И. 32 лет

® РМЖ

гJ

/

I

II

ш

@ БРМЖ

Рис.9. ВКСА-статус в зависимости от наличия одного, сочетания двух, трех косвенных признаков наследственного РМЖ

На рис.9 показана зависимость ВЛСА-статуса от количества косвенных признаков наследственного РМЖ: 1 ряд представлен наличием одного из перечисленных признаков В11СА-ассоциированного РМЖ, в 15.2 % случаев найдена «Гоипс1ег»-мутация генов ВЯСА; при сочетании двух признаков вероятность взаимосвязи с генетическими дефектами генов репарации повышается до 18,5 %; и, наконец, при комбинации трех признаков - достигает 25%.

Комбинация таких косвенных признаков В11СА-ассоциированного РМЖ, как двустороннее поражение молочных желез и наличие в семье пробанда случая рака яичников в 100 % случаях определялось терминальными мутациями в генах ВИСА1 (5382ш5С) и ВКСА2 (6174 с!е1Т)].

Клинические и морфологические особенности ВЯСА-ассоциированного РМЖ

Из 103 больных с признаками наследственного РМЖ у 17 (16,6 %) выявлена взаимосвязь с мутациями генов-ВЯСА 47 % больных ВИСА-ассоциированным РМЖ моложе 45 лет, причем только у двух пациентов этот признак был единственным показанием для проведения генетического анализа, в остальных случаях были сочетания с другими косвенными признаками (табл.3) Примечательно, что РЯ в семейном анамнезе является в какой-то мере «индикатором наследственной формы»: среди больных В11СА-ассоциированным

РМЖ данный признак встречался в 29,4 % случаев, тогда как у пациентов с отрицательным ДНК анализом лишь в 2,3 % случаев. На приведенном рис. 7 изображена родословная больной Т.37 лет: у пробанда и у сестры пробанда РМЖ, РЯ и БРМЖ у сестры пробанда во втором поколении, и БРМЖ во втором поколении, однако при генетическом исследовании «1Ъипс1ег»-мутаций генов В КС А1, ВЯСА2 не обнаружено. Что, вероятно, объясняется существованием дефектов в других генах репарации ДНК неизвестных на сегодняшний день. При сравнительном анализе В1£СА-ассоциированного РМЖ и РМЖ с признаками наследственного синдрома, но не связанного с мутациями ВЛСА-генов, выявлено, что в первом случае в 11.8% имелось сочетание РМЖ и РЯ, тогда как во втором — в 8 %, в тоже время в 12,5% случаев первично-множественных опухолей (РМЖ и РЯ) найдены «Аэипс1ег»-мутации в генах репарации ДНК (табл.4). Примечательно, что из общего числа больных РМЖ с терминальными мутациями в генах репарации ДНК (п=17) синхронный БРМЖ встречается в 23,5 % случаев, а у больных с отрицательным ДНК-тестом (п=86) - в 4,7 % случаев, что, несомненно, выделяет данную форму РМЖ, в одну из определяющих характеристик наследственного синдрома (табл.3).

Из приведенной табл.5 видно, что 70,6 % больных ВЯСА-ассоциированным РМЖ (п=17) - женщины пременопаузального периода, т.е. возраст выявления основного заболевания относительно молодой, что в некотором смысле оправдывает выделенный нами признак - молодой возраст больной при выявлении РМЖ в отдельный критерий генетического исследования. У 15 больных наследс1 венным РМЖ в пределах семьи были диагностированы от двух и более случаев онкологических заболеваний различной локализации (рак желудка в трех случаях, рак легких - в двух (табл.4), что является характерной особенностью наследственной форм неоплазий.

Рис. 10 Генеалогическое дерево больной Т. 37 лет

4

ф рак яичников ® РМЖ

О рак тела матки @ БРМЖ ¡■^ рак желудка

О

6, 7Л /

II

III

IV

Таблица 3

Сравнительные характеристики у больных с признаками наследственного РМЖ и у носителей ВЯСА-мутаций

Число больных Возраст < 45 лет Онкологическ ие заболевания у родственнико в: Рак желудка Рак легких РМЖ у родственников РЯу родственников РМЖ и РЯ Другие первично-множестве иные опухоли Метахро-нный БРМЖ Синхронный БРМЖ

с признаками наследствен но го РМЖ % (п=86) 36 (34,9%) 20 (23,2 %) 9 (10,5 %) 38 (44.2%) 2 (2,3 %) 6 (7 %) 5 (5,8 %) 11 (12,8%) 4 (4,7%)

Наследствен ный РМЖ %(п=17) 9 (53 %) 3 (17,6%) 2 (11,8%) 7 (41,2 %) 5 (29,4%) 2 (11,8%) 0 3 (17,6%) 4 (23,5 %)

Таблица 4

Клинические характеристики больных BRCA-ассоциированным РМЖ

Клинический параметр Число случаев (п=17)

Менопауза До После 12(70,6%) 5 (29,4 %)

Онкологические заболевания у родственников Нет 1 >=2 1 (5,9 %) 1(5,9%) 15(88,2%)

РМЖ у кровных родственников Нет 1 >=2 10(58,9%) 4 (23,5 %) 3(17,6%)

РМЖ у матери или сестры Да Нет 7(41.1%) 10(58.9%)

РЯ у кровных родственников Да Нет 5 (29,4 %) 12(70,6%)

Статус первичной опухоли Тх Tis Т1 Т2 ТЗ Т4 Число случаев (п=24)* 1(4,2%) 0 5 (20,85 %) 11 (45,8 %) 5 (20,85 %) 2 (8,3 %)

Наличие метастазов в регионарные л\у Nx N0 N1 N2 N3 1 (4,16%) 13(54,2%) 18 (33,3 %) 2 (8,34 %) 0

Статус ЭР первичной опухоли + 13(54,2%) 11 (45,8%)

Статус ПР первичной опухоли + 5 (20,8 %) 19(79,2%)

* число опухолей (п) - 24 , т.к. у 7 больных БРМЖ

Наиболее часто встречающийся гистологический тип опухоли при ВЯСА-ассоциированном РМЖ, также как и при спорадическом РМЖ - инвазивный протоковтлй рак. Однако, существует некоторая особенность: у 1! ,8 % больных наследственным РМЖ выявлена медуллярная карцинома (2 больных), в то время как при спорадическом РМЖ данная форма встречается не чаще 2 %.

Иммуногистохимическая характеристика ВЛСА-ассоциированных РМЖ несколько отличается от спорадического: имеется тенденция к более низкому уровню экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона в опухолевой ткани. В 19 опухолях (79,1 %) - уровень экспрессии рецепторов прогестерона отрицательный; в 11 опухолях (45,80/о) - уровень экспрессии эстрогенов отрицательный (табл.5).

У больных ВКСА-ассоциированным РМЖ, не было выявлено гиперэкспрессии Нег-2/Ыеи в ткани опухоли. Известно, что в общей группе больных РМЖ гиперэкспрессия Нег-2/ТЧеи встречается в 25 % случаев.

Выводы

1.Определены критерии отбор' больных РМЖ для проведения медико-генетической консультации и оценена их встречаемость:

а) случаи РМЖ и/или РЯ у ближайших кровных родственников - 12,4%;

б) возраст женщин до 45 лет на момент выявления РМЖ -10,6%;

в) сочетание РМЖ и РЯ - 1,2%;

г) синхронный и метахронный билатеральный рак молочной железы -2,4%.

2. У 16,4% больных с косвенными признаками наследственного РМЖ выявлены «й>шк1ег» - мутации в генах репарации ДНК: мутация 5382тзС генаВ11СА1 обнаружена у 16 больных, мутация 6174 с!е1Т генаВЯСА2- у одной больной.

В ходе исследования не обнаружены мутации !85с1е1ЛС в гене ВЯСА1.

3. Синхронный билатеральный РМЖ в 50% случаях ассоциирован с мутациями в генах В11СА1, ВЯСА2, а при сочетании этого признака наследственного заболевания с РЯ у кровных родственников больной, терминальные мутации в генах репарации ДНК выявляются в 100% случаев.

4. Терминальные мутации в генах ВЛСА1, ВЯСА2 выявлены у 71,4% больных РМЖ с наличием РЯ у кровных родственников 1-2 степени родства, и у 15,2% - с наличием РМЖ.

5. Для ВЛСА-ассоциированного РМЖ характерно сочетание косвенных признаков наследственного заболевания: при наличии одной характеристики частота мутаций в генах В11СА1, ВЯСЛ2 равна 15,2%, при сочетании двух признаков возрастает до 18,5%; и, наконец, при комбинации трех признаков достигает 25 %.

6. Между больными спорадическим РМЖ и наследственным РМЖ нет существенных отличий по гистологическому типу опухоли: преимущественно встречается инваэивный протоковый рак, однако медуллярный рак при BRCA-ассоциированной форме заболевания встречается несколько чаще (в 11.8 % против 1.9 %). Имеется тенденция к более низкому уровню экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и отсутствие сверхэкспрессии Her-2/Neu в опухолевой ткани у больных наследственным РМЖ.

Практические рекомендации

1. Больным РМЖ с косвенными признаками наследственного заболевания: наличие у кровных родственников 1-2 степени родства рака молочной железы и/или рака яичников, больным с первично-множественными опухолями (РМЖ и РЯ), больным билатеральным раком молочной железы показано медико-генетическое обследование с последующим молекулярным анализом мутаций генов BRCA1 (5382insC), BRCA2 (6172deIT).

2. Определение BRCA-носительства мутаций (BRCA1 (5382insC), BRCA2 (6172delT)) целесообразно проводить у кровных родственников больных наследственным РМЖ.

3. Следует рекомендовать динамическое диспансерное наблюдение органов репродуктивной системы больным BRCA-ассоциированным РМЖ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бит-Сава Е.М. / Иевлева А.Г., Соколенко А.П., Чекмарева Е.В., Митюшина Н.В., Розанов М.Е., Беломытцева Н.В., Буслов К.Г, Лазарева Ю.Р., Туркевич Е.А, Мацко Д.Е, Бит-Сава Е.М., Семиглазов В.Ф., Чагунава О.Л., Devilee P., Cornelisse, Хансон К.П., E.H. Имянитов . «Славянская» мутация в гене NBS1 может увеличивать риск рака молочной железы.// Вопр.онкологии. - 2005, Т.51. - №1 (приложение). -10 С.

2. Bit-Sava Е.М. / Buslov К. G., Iyevleva A.G., Chekmeriova E.V., Suspitsin E.N., Togo A.V., Kuligina E.Sh., Sokolenko A.P., Matssko D.E., Turkevich E.A., Lazareva Y.R., Chagunava O.L., Bit-Sava E.M., Semiglazov V.F., Devilee P., Cornelisse P., Hanson К. P., Imyanitov E.N. / Nbs 1 657 Mutation Contribute only to a limited fraction of breast cancer cases in Russia.// Int. J. Cancer. -2005. - Vol. 114(4). - p. 585-589

3. Bit-Sava E.M. / Imyanitov E.N., Buslov K. G., Bit-Sava E.M., Iyevleva A.G., Suspitsin E.N., Togo A.V., Kuligina E.Sh., Sokolenko A.P., Semiglazov V.F., Matssko D.E., Lazareva Y.R., Hanson K.P. «Comparison of extremes» approach reveals a noticeable breast cancer predisposing role of the BRCA1 5382insC founder mutation in Russia.// ESMO Educational Conference, Budapest. - 2005

4. Бит-Сава Е.М. / Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В., Клетцель A.A., Бараш Н.Ю., Жильцова Е.К., Цырлина Е.В., Божок A.A., Мельникова O.A., Палтуев P.M., Дашян Г.А., Петровский С.Г., Арзуманов A.C., Иванов В.Г., Топузов Э. Э., Берштейн JI.M., Бит-Сава Е.М., Дамениа А.О., Зернов К.Ю. «Современная эндокринная терапия рака молочной железы».// Вопр. онкологии. - 2005.

Благодарности

Выражаю искреннюю признательность научному руководителю чл.-корр. РАМН, заслуженному деятелю науки РФ, профессору, доктору медицинских наук В.Ф. Семиглазову и всем сотрудникам НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова, особенно сотрудникам I хирургического отделения.

Приношу глубокую благодарность научному руководителю профессору, доктору медицинских наук E.H. Имянитову и всем сотрудникам лаборатории молекулярной онкологии.

РНБ Русский фонд

2005-4 44582

/ * ! а»

' I

\ & *

V. £ ^

ч

07 МАЙ 2005

2 С 62

Экспериментальные и клинические исследования в значительной мере объясняют причины и механизмы возникновения рака молочной железы (РМЖ), как результат накопления генетических повреждений на протяжении определенного промежутка времени. На сегодняшний день известно, что гормоны, в частности эстрогены, являются важным, но не единственным звеном в патогенезе РМЖ, вызывая усиление репликации клеток, гены которых подверглись мутации. Два варианта нарушений на молекулярном уровне отвечают за развитие злокачественной опухоли: мутации ДНК и индукция клеточной пролиферации (Wemstein I., 1988). Под воздействием мутаций ключевые гены, регулирующие хромосомную репликацию, рост, развитие, дифференцировку и гибель клетки, либо инактивируются, либо активируются (Wemstein I., 1990). Каждый из этих генов (EGFR, Her2/neu, erbB2, с-шус, циклин D1) амплифицируется при РМЖ, и способен усиливать клеточное деление (Pearson О., 2000). Пролиферация вызывает «опухоль-формирующий» эффект, путем усиления экспансии клеток (Cohen S., 1990) Характеристика генетических повреждений позволяет отчетливее рассмотреть общую картину патогенеза РМЖ и разработать более целесообразные меры профилактики, ранней диагностики и лечения.

На сегодняшний день выделяют «семейный» и «наследственный» рак молочной железы. Под семейным РМЖ подразумевается аккумуляция нескольких случаев данного заболевания в пределах одной семьи. Подобный феномен может, в частности, быть ассоциированным с воздействием общего канцерогенного фактора. Следует оговориться, что ни один из подобных канцерогенов пока не идентифицирован. В других случаев, семейная агрегация РМЖ определяется наследованием специфического генетического дефекта, обусловливающего резко увеличенный риск возникновения новообразования. В настоящее время считается, что не менее 5 % случаев рака молочной железы имеют наследственную природу. Некоторые из т.н. «высокопенетрантных» генов РМЖ уже идентифицированы. Наиболее часто упоминаются гены BRCA1 и BRCA2, отвечающие за репарацию двунитевых разрывов ДНК. Носительство мутаций в BRCA1 и BRCA2 увеличивает индивидуальный риск развития РМЖ до 85-100%. Мутации в генах BRCA ассоциированы не только с РМЖ, но и с раком яичников (РЯ). Пенетрантность BRCA-дефектов по отношению к РЯ несколько ниже, и составляет примерно 30-60%. Относительно редко наследственные формы РМЖ связаны с наличием мутаций в других генах, таких как р53, ATM, СНЕК-2 и т.д.

Диагноз «наследственного» РМЖ позволяет выделить группы повышенного (иногда почти фатального) риска возникновения РМЖ и РЯ. Для подобных относительно небольших групп женщин представляется целесообразным создавать специальную систему диспансеризации, гарантирующую доступность и высокую надёжность ранней диагностики РМЖ и РЯ. В исключительных случаях диагноз наследственного ракового синдрома предполагает обоснование не только определенной схемы диагностических мероприятий, но также и обоснованность профилактического хирургического вмешательства.

К сожалению, диагностика и, тем более, скрининг наследственного РМЖ затруднен, из-за высокой стоимости соответствующих лабораторных тестов. Широкий генетический скрининг наследственных форм РМЖ представляется пока невозможным по соображениям экономического характера. В подавляющем большинстве стран, ДНК-диагностика применяются только в отношении тех женщин, у которых имеются косвенные клинические признаки наследственного ракового синдрома. К таковым относят: 1) случаи РМЖ и/или РЯ у ближайших кровных родственников пациентки (прежде всего, у матери и сестёр); 2) ранний возраст возникновения заболевания (до 35-40 лет; при более свободной трактовке этого критерия - до 50 лет); 3) первично-множественный характер онкологического процесса (синхронные и метахронные билатеральные РМЖ; сочетания опухолей молочной железы и яичников) 4) национальная принадлежность (еврейская, польская, эстонская, литовская).

Как упоминалось выше, полноценная диагностика BRCA мутаций пока остаётся малодоступной для практической медицины. Действительно, секвенирование примерно 20 ООО пар нуклеотидов, необходимое для определения статуса генов BRCA, подразумевает наличие соответствующего дорогостоящего оборудования, большие расходы на лабораторные реагенты (примерно 2000-3000 долларов США на 1 анализ) и огромные трудозатраты (примерно 2 человеко-месяца на одно исследование). Однако,, некоторые «паллиативные» подходы могут быть предложены для широкого внедрения уже сегодня. В частности, большого внимания заслуживает тот факт, что некоторые BRCA-мутации обнаруживаются с повышенной частотой практически во всех популяциях. Например, мутации 185deIAG (BRCA1), 5382insC (BRCA1), 6174delT (BRCA2), первоначально обнаруженные у женщин-евреек европейского происхождения, обнаруживаются с повышенной частотой у больных РМЖ в странах Западной Европы, России, Польше, странах Прибалтики, Испании и т.д., причём не только у пациенток еврейской национальности.

В отличие от полномасштабного анализа всей нуклеотидной последовательности генов BRCA, диагностика подобных «горячих» мутаций представляется вполне реалистичной задачей.

В Российской Федерации генетическое консультирование онкологических больных пока развито несколько хуже, чем в промышленно развитых странах Европы и США. Остаётся неясным, какая доля пациентов нуждается в подобном дополнительном обследовании (т.е. какова встречаемость клинических признаков, ассоциированных с наследственными онкологическими синдромами). Предстоит также выяснить, в какой мере относительно простые и доступные лабораторные тесты, в частности анализ «горячих» мутаций в РМЖ-ассоциированных генах, могут улучшить ситуацию в отношении профилактики и ранней диагностики РМЖ. Остается также неясным характер клинического течения наследственного РМЖ, его чувствительность к эндокринотерапии, химиотерапии и другим лечебным мероприятиям.

Цель исследования

Целью настоящей работы является изучение клинических особенностей BRCA-ассоциированного РМЖ, и их взаимосвязь с носительством «founder» мутаций в генах BRCA1 и BRCA2.

Задачи исследования:

1. Определить частоту BRCA-ассоциированных характеристик РМЖ (семейный анамнез РМЖ, РЯ, молодой возраст при выявлении заболевания, первично-множественный характер онкологического процесса) у больных, проходящих лечение в НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова.

2. Оценить ассоциации между косвенными признаками наследственного РМЖ.

3. Выяснить, частоту повторяющихся мутаций в генах BRCA (185delAG (BRCA1), 5382insC (BRCA1), 6174delT (BRCA2)) в Российской популяции.

4. Изучить характер взаимосвязи между косвенными признаками BRCA-ассоциированного РМЖ и «1Ъиг^ег»-мутациями в генах BRCA1, BRCA2.

Научная новизна

1. Впервые определен удельный вес и распространенность BRCA-ассоциированной формы заболевания среди больных РМЖ T1-4N0-3M0

2. Проанализирован характер и ассоциации косвенных характеристик наследственного РМЖ.

3. Определена частота терминальных мутаций генов BRCA1 (185delAG, 5382insC), 6174delT (BRCA2) у больных с косвенными признаками наследственного РМЖ.

4. Оценены клинико-морфологические особенности BRCA-ассоциированного РМЖ.

Практическая значимость

Выработаны рекомендации по отбору пациенток для медико-генетического консультирования. На основании оценки результатов молекулярно-генетических исследований внедрены в рутинную клиническую практику некоторые лабораторные процедуры, позволяющие идентифицировать BRCA-ассоциированные формы РМЖ.

Положения, выносимые на защиту

1. Представляется целесообразным проведение медико-генетической консультации больным РМЖ с возрастом выявления злокачественной опухоли до 45 лет, первично-множественной опухоли (РМЖ и РЯ), билатерального рака молочной железы или при наличии онкологического семейного анамнеза по РМЖ и\или РЯ.

2. При сочетании нескольких косвенных признаков наследственного заболевания возрастает вероятность взаимосвязи РМЖ с носительством «£эипс1ег»-мутаций в генах BRCA1 (5382insC), 6174delT (BRCA2).

3. В половине случаев синхронных БРМЖ заболевание ассоциировано с мутациями в терминальных генах BRCA1 (5382insC), 6174delT (BRCA2).

4. Двустороннее поражение молочных желез и наличие в семье пробанда случая рака яичников в 100 % случаях определялось мутациями в генах BRCA1 (5382insC) и BRCA2 (6174 delT).

Реализация результатов работы

Результаты работы внедрены и используются в практической и научно-исследовательской работе НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова МЗ РФ

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, общего заключения, * выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертационная работа изложена на 105 страницах машинописного текста, включает таблиц 11 и 18 рисунков. Список литературы состоит из 231 источников отечественных и иностранных авторов.

Выводы

1 .Определены критерии отбора больных РМЖ для проведения медико-генетической консультации и оценена их встречаемость: а) случаи РМЖ, РЯ у ближайших кровных родственников пациентов -12,4%. б) возраст женщин до 45лет на момент выявления рака молочной железы-10,6%. в) сочетание РМЖ и РЯ - 1,2%. г) синхронный и метахронный билатеральный рак молочной железы — 2,4%.

2. У 16,4 % больных с косвенными признаками наследственного РМЖ выявлены «founder» - мутации в генах репарации ДНК: мутация 5382insC гена BRCA1 обнаружена у 16 больных, мутация 6174 delT гена BRCA2 у одной больной. В ходе исследования не обнаружены мутации 185delAG в гене BRCA1.

3. Синхронный билатеральный РМЖ в 50% случаях ассоциирован с мутациями в генах BRCA1, BRCA2, а при сочетании этого признака наследственного заболевания с РЯ у кровных родственников больной терминальные мутации в генах репарации ДНК выявляются в 100% случаев.

4. Терминальные мутации в генах BRCA1, BRCA2 выявлены у 71,4% больных РМЖ с наличием РЯ у кровных родственников 1-2 степени родства, и у 15,2% - с наличием РМЖ.

5. Для BRCA-ассоциированного РМЖ характерно сочетание косвенных признаков наследственного заболевания: при наличии одной характеристики частота мутаций в генах BRCA1, BRCA2 равна 15,2%, при сочетании двух признаков возрастает до 18,5%; и, наконец, при комбинации трех признаков достигает 25 %.

6. Между больными спорадическим РМЖ и наследственным РМЖ нет существенных отличий по гистологическому типу опухоли: преимущественно встречается инвазивный протоковый рак, однако медуллярный рак при

BRCA-ассоциированной форме заболевания встречается несколько чаще (в 11.8 % против 1.9 %). Имеется тенденция к более низкому уровню экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и отсутствие сверхэкспрессии Нег-2/Neu в опухолевой ткани у больных наследственным РМЖ.

Практические рекомендации

1. Больным РМЖ с косвенными признаками наследственного заболевания: наличие у кровных родственников 1-2 степени родства рака молочной железы и/или рака яичников, больным с первично-множественными опухолями (РМЖ и РЯ), больным билатеральным раком молочной железы показано медико-генетическое обследование с последующим молекулярным анализом мутаций генов BRCA1 (5382insC), BRCA2 (6172delT).

2. Определение BRCA-носительства мутаций (BRCA1 (5382insC), BRCA2 (6172delT)) целесообразно проводить также и у кровных родственников больных наследственным РМЖ.

3. Следует рекомендовать динамическое диспансерное наблюдение органов репродуктивной системы больным BRCA-ассоциированным РМЖ.