Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Изучение роли пролинспецифических пептидаз в развитии экспериментальных депрессивных состояний

На правах рукописи

БОГДАНОВА НАТАЛЬЯ ГРИГОРЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПРОЛИНСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕПТИДАЗ В РАЗВИТИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДЕПРЕССИВНЫХ СОСТОЯНИЙ

14.03.03 - патологическая физиология 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 ЛЕК 2011

Москва-2011

005006462

Работа выполнена в лаборатории общей патологии нервной системы Учреждения Российской АМН Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии РАМН.

Научные руководители: доктор биологических наук

Н.А.Крупина

доктор биологических наук, профессор Н.Н.Золотов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор, О.А. Гомазков

доктор биологических наук, профессор, Т.А. Гудашева

Ведущее учреждение: Московский государственный

университет им. М.В.Ломоносова, факультет фундаментальной медицины

Автореферат разослан 2011

года

Защита диссертации состоится » ¿¿¿¿МиЗ^^с^-- 2011 года в часов на

заседании Диссертационного совета Д ООЙОЗ.СИ при'Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, Балтийская улица, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.Н.Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Депрессивные расстройства разных нозологических форм относятся к числу наиболее распространенных психических расстройств. По данным Всемирной Организации Здравоохранения депрессией страдают 4-5% населения земного шара, а к 2030 г. депрессии, предположительно, выйдут на 1-е место по распространенности, обойдя сердечно-сосудистые заболевания (Бюллетень ВОЗ, 2008а,б; Sartorius N., 2001). По оценкам исследователей в экономически развитых европейских странах эндогенными и психогенными депрессивными расстройствами страдают около 20% психических больных (Paykel E.S. et al., 2005; Wittchen H.U., 2005).

Депрессия по современным представлениям рассматривается как хроническое заболевание, связанное с субъективным ощущением тяжелых страданий, характеризующееся снижением эмоционального фона, интеллектуальной и физической активности, что приводит к социальной декомпенсации заболевших (Мосолов С.Н., 2005; Solomon D.A. et al., 1997). Низкий процент полной ремиссии, длительная социальная дезадаптация, высокий суицидальный риск, побочные действия лекарственных препаратов снижают качество жизни пациентов, ограничивают их профессиональную пригодность, что определяет медико-социальную и экономическую значимость проблемы изучения патогенеза и поиска эффективной терапии депрессивных расстройств разного типа.

В настоящее время появляется все больше свидетельств того, что патогенез депрессивных расстройств связан с нарушением функций многих нейрорегуляторных систем, к числу которых относятся моноаминергические системы мозга, гипоталамо-гипофизарно-адреналовая ось, цитокины, нейропептиды и пептидные гормоны, нейротрофические факторы, системы вторичных мессенджеров (Delgado P.L. et al., 2000; Ressler K.J., Nemeroff C.B., 2002; Bacher I. et al., 2009; Foltyn W. et al., 2002; Kozicz T. et al., 2008; Maletic V., Robinson M. et al., 2007; De Wied D., Sigling И.О., 2002; Jabbi M. et al, 2008; FiSar Z., Hroudova J., 2010; Hasler G., 2010).

Известно, что многие нейропептиды, опосредующие депрессивную симптоматику, являются субстратами протеолитических ферментов, к числу которых относятся пролинспецифические пептидазы - пролилэндопептидаза (ПЭП) и дипептидилпептидаза-IV (ДП-IV) (Крупина Н.А., Хлебникова Н.Н., 2010; Cunningham D.F, O'Connor В., 1997; Scharpe S. et al., 2001; Myohanen T.T. et al., 2008,2009).

В клинике имеются свидетельства изменения активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-IV в сыворотке и плазме крови больных с симптомами большой депрессии и постгравматическим стресс-расстройством (Maes М. et al., 1994-2004; Min Li et al., 2010). В недавних экспериментах на грызунах с дефицитом активности ДП-IV, вызванным мутацией гена фермента, показано снижение стресс-реактивности и уменьшение выраженности депрессивно-подобного поведения у животных (Karl Т. et al., 2003; El Yacoubi M. et al., 2006). У крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-IV в раннем постнатальном периоде, в динамике взросления наблюдали развитие тревожно-депрессивного состояния, которое сопровождалось повышением активности ПЭП и ДП-IV в структурах мозга, опосредующих развитие эмоционально-мотивационного поведения (Крупина Н.А. и др.,

2009; Кушнарева Е.Ю. и др., 2011). Увеличение активности обеих пептидаз было выявлено в подкорковой области мозга мышей на модели «поведенческого отчаяния» в тесте принудительного плавания, причем синтетические дипептидные ингибиторы ПЭП (обшей формулы Z-AA-Pro-OH, где АА - остатки аминокислот Gly, Ala, Не, и Pro) на этой модели проявляли свойства антидепрессантов (Золотев H.H. и др., 1992). По совокупности данных, можно предполагать, что пролинспецифические пептидазы участвуют в механизмах развития депрессивных состояний, однако их роль в процессах развития депрессивных расстройств до сих пор не ясна. Поиск ответа на этот вопрос связан с изучением активности пептидаз в структурах головного мозга в процессе развития депрессивного состояния разной этиологии. Для выяснения патофизиологических механизмов депрессивных расстройств и поиска новых подходов к комплексной патогенетической терапии депрессий разного генеза полезно изучение эффектов новых ингибиторов ПЭП на экспериментальных моделях депрессивных состояний.

Целью исследования являлось сравнительное изучение активности протеолитических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV в структурах мозга крыс на разных моделях экспериментальных депрессивных состояний и возможности коррекции депрессивно-подобного поведения новыми ингибиторами пролилэндопептидазы.

Задачи исследования:

1. Провести анализ изменения активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-IV флуорометрическим методом в структурах головного мозга крыс - фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме и прилежащем ядре - параллельно с контролем эмоционально-поведенческих изменений у животных на модели дофамин-дефицитзависимого экспериментального депрессивного синдрома у крыс, вызванного введением пронейротоксина 1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП).

2. Изучить эффекты синтетического неконкурентного ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(5)-цианопирролидина (Z-Met-Prd-N) и синтетического конкурентного ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-аланил-пролина (Z-Ala-Pro-OH) в условиях их субхронического введения на течение экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома.

3. Изучить эффекты ингибитора ПЭП Z-Met-Prd-N в условиях его субхронического введения на формирование экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома, тревожно-фобический уровень и стресс-реактивность (по показателю массы стресс-компетентных органов) у крыс.

4. Изучить влияние ингибитора ПЭП Z-Met-Prd-N в условиях его субхронического введения на активность ПЭП и ДП-IV в структурах мозга крыс на модели экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома у крыс.

5. Провести анализ изменения активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-IV флуорометрическим методом в структурах головного мозга крыс - фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме и прилежащем ядре - параллельно с контролем эмоционально-поведенческих изменений у животных на модели депрессивно-подобного состояния в тесте принудительного плавания (модель стресс-индуцированного «поведенческого отчаяния» по Порсолту).

6. Изучить эффекты ингибитора ПЭП 7-Ме!-Рг(1-Ы в условиях его острого введения на депрессивно-подобное поведение и активность ПЭП и ДП-1У в структурах мозга крыс на модели стресс-индуцированного «поведенческого отчаяния» по Порсолту.

7. Провести сравнительный анализ изменения активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-1У в структурах головного мозга крыс и эффектов ингибитора ПЭП 2-Ме1-Рп)-N на двух моделях экспериментальных депрессивных состояний.

Научная новизна. Впервые выявлено повышение активности пролинспецифических ферментов ПЭП и ДП-1У во фронтальной коре мозга и стриатуме крыс на модели дофамин-дефицитзависимого МФТП-индуцированного экспериментального депрессивного синдрома и модели стресс-индуцированного депрессивно-подобного состояния в тесте принудительного плавания'по Порсолту. Обнаружено, что синтетический неконкурентный ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(5)-цианопирролидин проявляет свойства антидепрессанта на обеих моделях, нормализуя поведение животных и активность ПЭП и ДП-1У в структурах мозга. На модели МФТП-индуцированного экспериментального депрессивного синдрома этот ингибитор проявляет свойства антидепрессанта в условиях его субхронического введения по разным схемам, подавляя признаки депрессивно-подобного состояния у крыс с выраженным депрессивным синдромом или предотвращая формирование ряда симптомов депрессивного синдрома у животных. На данной модели впервые обнаружено анксиолитическое и антистрессорное действие бензилоксикарбонил-метионил-2(5)-цианопирролидина. Антидепрессантное действие синтетического конкурентного ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-аланил-пролина на модели МФТП-индуцированного депрессивного синдрома было менее выражено, чем действие бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина и проявлялось в период восстановления поведенческой активности после отмены МФТП.

Теоретическая и практическая значимость. Факт повышения активности пролинспецифических ферментов ПЭП и ДП-1У на этиологически различных моделях депрессивно-подобного состояния свидетельствует о том, что эти пептидазы участвуют в механизмах развития депрессивных расстройств, что расширяет существующие представления о патогенезе аффективных нарушений. Данные о том, что синтетический неконкурентный ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин на разных экспериментальных моделях депрессии проявляет свойства антидепрессанта, нормализуя при этом повышенную активность пептидаз в структурах мозга, свидетельствуют в пользу существования общих механизмов в развитии депрессивных расстройств различной природы. Сравнительный анализ двух ингибиторов ПЭП с различным механизмом действия показал, что неконкурентный ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин более эффективен как антидепрессант, чем конкурентный ингибитор бензилоксикарбонил-апанил-пролин и обладает более широким спектром действия. Полученные результаты открывают перспективы поиска новых препаратов для комплексной патогенетической терапии депрессивных расстройств различной этиологии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Развитие депрессивного состояния у крыс на экспериментальных моделях дофамин-дефицитзависимого МФТП-индуцированного депрессивного синдрома и стресс-индуцированного «поведенческого отчаяния» сопровождается повышением активности пролинспецифических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV во фронтальной коре мозга и стриатуме.

2. Синтетические ингибиторы пролилэндопептидазы с разным механизмом действия бензилоксикарбонил-метионил-2(5)-цианопирролидин и безилоксикарбонил-аланил-пролин проявляют свойства антидепрессантов на экспериментальных моделях депрессивного состояния у крыс.

3. Антидепрессантное действие ингибитора пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-метионил-2(5)-цианопирролидина в условиях его предварительного введения сопровождается предотвращением повышения активности пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV в структурах мозга крыс на моделях депрессивного состояния различной этиологии.

Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), на научной конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС» (Пенза, 2006), на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), на XVI Всероссийской конференции «Нейроиммунология» «Нейроимидж» и научно-практической конференции неврологов (Санкт-Петербург, 2007), на XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), на III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на XIV Всемирном конгрессе по психиатрии (Чешская республика, Прага, 2008), на 24 Конгрессе Европейского Колледжа по нейропсихофармакологии (Франция, Париж, 2011).

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 13 работ, из них 9 тезисов, 1 публикация в книге, 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа включает 28 рисунков и 16 таблиц. Список литературы содержит 321 источник, из них 46 работ отечественных и 275 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проведены на 300 белых крысах-самцах популяции Вистар. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде.

Новые дипептидные ингибиторы ПЭП - бензилоксикарбонильные производные цианопирролидина и аланил-пролина - были разработаны с использованием

фармакологического дизайна д.б.н., профессором H.H. Золотовым и синтезированы д.х.н. В.Ф.Поздневы.м в УРАМН НИИ фармакологии им. В.В.Закусова.

Ингибиторы ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(5)-цианопирролидин (Z-Met-Prd-N), неконкурентный ингибитор (м.в. 333,41), константа ингибирования ПЭП из подкорковых структур по субстрату 2-А1а-Рго-7-амино-4-кумариламиду составляет 4,4 нмоль/л, из коры -1.4 нмоль/л) и бензилоксикарбонил-аланил-пролин (Z-AIa-Pro-OH), конкурентный ингибитор (м.в. 320,34), константа ингибирования ПЭП из подкорковых структур мозга по субстрату Z-А1а-Рго-7-амино-4-кумариламиду составляет 20.0 мкмоль/л, из коры - 90.0 мкмоль/л) вводили в дозах 1,0; 2,0 и 3,0 мг/кг. Все препараты вводили внутрибрюшинно.

Для моделирования дофаминдефицитзависимого экспериментального депрессивного синдрома использовали пронейротоксин 1-метил-4-фенил-1,2,3,6,-тетрагидропиридин (МФТП), (м.в. 175,27), синтезированный в УРАМН НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН.

Моделирование экспериментальных депрессивно-подобных состояний у крыс

Модель дофаминдефицитзависимого экспериментального депрессивного синдрома создавали путем системного введения животным пронейротоксина МФТП, специфического в отношении ДА-ергических нейронов (в дозе 20 мг/кг, в объеме 1 мл на кг массы тела внутрибрюшинно, ежедневно в течение 14 дней). Контрольным крысам по той же схеме вводили физиологический раствор (ФР) (Крыжановский Г.Н., Крупина H.A., 1995). Поведение животных оценивали в конце двухнедельного периода введения препаратов (стадия выраженной депрессии поведения в случае введения МФТП) и через 2 недели после их отмены (стадия восстановления поведенческой активности в случае введения МФТП).

Определение суточного потребления жидкости и предпочтения сахарозы у крыс. Тест альтернативного выбора сахароза/вода принят для оценки переживания удовольствия у крыс (Willner Р., 1992, 2005). На протяжении 17-32 дней наблюдения (в зависимости от поставленной задачи) ежедневно регистрировали количество выпитой воды и 10%-го раствора сахарозы для каждого животного (суточное потребление жидкости, г) и определяли предпочтение сахарозы воде (в процентах от общего количества выпитой жидкости). Снижение предпочтения сахарозы свидетельствует о проявлении признаков агедонии а снижение потребления жидкости - о снижении уровня одной из жизненно важных мотиваций - питьевой.

Тест принудительного плавания [методика Порсолта (Porsolt R.D. et al., 1978) в модификации Щетинина Е.В. с соавт. (Щетинин Е.В. и др., 1989)]. Животных помещали в бак, заполненный водой на высоту 35 см, температура воды составляла 24-25 °С. В течение 10 мин фиксировали длительность и число периодов активного плавания, пассивного плавания и иммобилизации (полное отсутствие плавательных движений). Вычисляли ритмологический индекс депрессивности (ИД), определяемый отношением числа периодов иммобилизации длительностью до 6 с к общему числу периодов активного плавания. Увеличение длительности иммобилизации свидетельствует о наличии «поведенческого отчаяния» у животных, а увеличение ИД - о наличии биоритмологических нарушений, характерных для депрессивных состояний.

Массу тела крыс определяли перед началом эксперимента и далее еженедельно. Снижение массы тела рассматривали в качестве косвенного показателя снижения пищевой мотивации.

О развитии депрессивно-подобного состояния у крыс судили по появлению признаков агедонии; "поведенческого отчаяния", биоритмологических нарушений; снижению уровня жизненно-важных мотиваций. Оценку выраженности экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома проводили по совокупности изменений по методу интегральной оценки выраженности депрессии поведения у крыс (Крупина Н.А. и др., 1999). В основу метода положена ранжированная шкала изменения (в баллах) основных перечисленных выше показателей депрессивности в поведении крыс.

Двигательную активность у животных оценивали в стандартных условиях «открытого поля» по числу пересеченных квадратов в течение 3 мин.

Для определения уровня тревожности у крыс применяли комплексный многопараметровый метод оценки тревожно-фобических состояний у крыс (в баллах) (Родина В.И. и др., 1993). В основу метода положен анализ изменения видоспецифических поведенческих ответов у крыс с помощью ранжированной шкалы в серии этологически адекватных тест-стимулов, моделирующих мягкое стрессогенное воздействие. В состав шкалы входят 9 тестов для оценки поведения крыс в двух основных ситуациях, связанных с проявлением страха и тревоги: 1) столкновение с незнакомым неживым объектом или незнакомой ситуацией и 2) действие руки экспериментатора (приближение и поглаживание). Для характеристики тревожно-фобического уровня у крысы используется показатель суммы баллов, присваиваемых животному по результатам полного обследования.

Оценка стресс-компонента в поведении животных на модели МФТП-индуцированного депрессивного синдрома. Через сутки после последнего введения препаратов (на стадии выраженной депрессии поведения у крыс с введением МФТП) животных опытных и контрольных групп декапитировали и оценивали относительную массу (на г массы тела) стресс-компетентных органов - надпочечников, тимуса и селезенки.

Модель стресс-индуцированного депрессивно-подобного состояния. Депрессивно-подобное состояние у животных вырабатывали в тесте принудительного плавания по классической методике Порсолта (Porsolt R.D. et al., 1978). В первый день каждую крысу помещали на 15 мин в сосуд, заполненный водой до отметки на высоте 35 см, температура воды составляла 24-25°С. В течение первых 5 минут оценивали длительность пассивного плавания, к которому относили периоды, во время которых крысы совершали только гребковые движения, необходимые для поддержания тела на плаву, и периоды иммобилизации, во время которых плавательные движения отсутствовали. Кроме того, оценивали длительность и число периодов активного плавания. Через 24 ч проводили тестирование выработки депрессивно-подобного состояния у крыс, для чего животное снова помещали в сосуд для плавания на 5 мин. Увеличение длительности пассивного плавания по сравнению с днем выработки свидетельствует о развитии у подопытных крыс так называемого «поведенческого отчаяния», которое можно рассматривать как модель стресс-реактивной депрессии (Lu X-Y., et al., 2006; Bowers S.L. et al., 2008).

Определение активности пролинспецифических пептидаз

Выделение структур мозга осуществляли сразу после декапитации крыс: в серии с МФТП-индуцированиым депрессивным синдромом - через сутки после последнего введения препаратов, либо через 2 недели после их отмены, в серии со стресс-индуцированным «поведенческим отчаянием» - через 30 мин после тестирования. Измерения активности пептидаз проводили на базе лаборатории психофармакологии УРАМН НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН.

Активность ПЭП и ДП-IV определяли во фронтальной коре, стриатуме, прилежащем ядре и гипоталамусе флуорометрическим методом. Метод основан на определении освобождающегося в процессе ферментативной реакции 7-амино-4-метилкумарина с пептидом Z-Ala-Pro-MCA (для ПЭП) или с пептидом Gly-Pro-MCA (для ДП-IV), имеющего отличный от пептидов спектр флуоресценции. Гидролиз субстрата регистрировали после 30 минут инкубации при 37°С на спеюрофлуорометре LS-5B (Perkin-Elmer, США). Количество освободившегося 4-метил-7-аминокумарина определяли из величины флуоресценции.

Белок определяли спектрофотометрически с красителем Кумасси голубым G-250 по методу Брэдфорд (Bradford М, 1976), используя в качестве стандарта сывороточный альбумин человека (Sigma, США). Оптическую плотность проб измеряли на фотоколориметре КФК-2-УХЛ 4.2 (Россия) со светофильтром 590 нм.

Статистическую обработку результатов проводили по алгоритмам программы "Statistica 6.0" с проверкой соответствия распределения эмпирических данных нормальному закону по критерию Колмогорова-Смирнова: в случае соответствия применяли однофакторный дисперсионный анализ one way ANOVA с последующим сравнением средних значений в группах по тесту Ньюмана-Кеулса; при несоответствии -непараметрический однофакторный дисперсионный анализ Kruskall-Wallis ANOVA, в этом случае post hoc анализ проводили по непарному непараметрическому U-критерию Манна-Уитни. Внугригрупповые изменения оценивали с помощью дисперсионного анализа для повторных измерений repeated measures ANOVA (post hoc анализ по тестам Ньюмана-Кеулса, Дункана, LSD). Сравнение показателей в двух зависимых группах проводили с использованием парных критериев - непараметрического критерия Вилкоксона либо параметрического t-критерия Стьюдента, в двух независимых группах - с использованием непарного непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05. Если достигнутый уровень статистической значимости превышал критическое значение, принималась нулевая гипотеза. Данные представлены в виде M±SEM, где М - среднее, SEM - стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Модель дофамин-дефицитзависимого МФТП-индуцированного депрессивного синдрома у крыс.

Исследование поведения. Проведено две серии исследований по одинаковой схеме: депрессивное состояние у крыс моделировали путем системного введения МФТП (см. «Материалы и методы исследования»). Для биохимических исследований в каждой из серий

часть животных опытных и контрольных групп декапитировали через сутки после последнего введения МФТП или ФР, оставшихся животных декапитировали на 15-й день после отмены препаратов. В обеих сериях получены сходные результаты по изменению поведения животных и активности пролинспецифических пептидаз в структурах мозга под влиянием МФТП, поэтому данные двух серий были объединены.

Предпочтение потребления сахарозы воде в период введения пронейротоксина уменьшалось у животных опытных групп [F(14,210)=8,755; р<0,001; repeated measures ANOVA] по сравнению с исходными значениями показателя, эффект сохранялся практически в течение всего времени введения препарата. В период восстановления поведенческой активности у животных опытных групп примерно в течение недели сохранялось сниженное предпочтение сахарозы [F(14, 98)=6,826, р<0,001]. У животных контрольных групп ни на одном из сроков не было отличия в предпочтении раствора сахарозы перед водой. Суточное потребление жидкости у крыс в период введения МФТП было снижено [F(14, 210)=4,585, р<0,001; repeated measures ANOVA] и быстро нормализовалось в период отмены. В группе с введением ФР такого снижения не наблюдали.

В конце двухнедельного периода введения МФТП длительность иммобилизации, и индекс депрессивности у крыс опытных групп статистически значимо превышали величины соответствующих контрольных показателей: длительность иммобилизации, составила соответственно 14,8±4,4 с в сравнении с 3,8±1,2 с; ИД - 1,2±0,3 в сравнении с 0,3±0,1 (в обоих случаях р<0,05, критерий Манна-Уитни). В период отмены эти показатели снижались по величине, однако по-прежнему превышали контрольный уровень.

В динамике обследования масса тела животных опытных групп была снижена через 1 и 2 недели введения МФТП по сравнению с исходным уровнем (р<0,001 по критерию Вилкоксона), тогда как в контроле изменение массы тела не было выявлено. В восстановительном периоде отмечена тенденция к увеличению массы тела у крыс контрольных групп.

На протяжении обследования различий в двигательной активности между группами МФТП и ФР не было выявлено.

Данные свидетельствовали о развитии у животных опытных групп гедонических нарушений, состояния «поведенческого отчаяния», появлении нарушений биоритмологической структуры плавательного поведения, о снижении уровня питьевой мотивации и, по косвенным показателям, пищевой мотивации, то есть о развитии у крыс экспериментального депрессивного синдрома.

Выраженность депрессии по интегральному показателю в баллах по окончании введения МФТП у животных опытных групп значительно превышала контрольный уровень (рис. 1А). Через 2 недели после отмены МФТП поведение животных постепенно нормализовалось. В период выраженной депрессии поведения и в период восстановления поведенческой активности у крыс опытных и контрольных групп был выявлен повышенный по сравнению с исходным уровень тревожности, по уровню тревожности статистически значимых отличий между группами ни на одном из сроков не было обнаружено (рис. 1 Б).

Рис. 1. Изменение выраженности депрессии (А) и тревожно-фобического уровня (Б) у крыс (в баллах) в динамике развития МФТП-индуцированного депрессивного синдрома.

Обозначения групп: 1 - крысы опытных групп, 2 недели введения МФТИ (п=16); 2 - крысы контрольных групп, 2 недели введения ФР (п=17); 3 - крысы опытных групп, 2 недели отмены МФТП (п=16); 4 - крысы опытных групп, 2 недели отмены ФР (п=16). Обозначения столбиков: светлые - исходный уровень; темно-серые - в конце периода введения МФТП/ФР, светло-серые - через 2 недели отмены МФТП/ФР. ***р<0,001 - по сравнению с группой 2; +р<0,001 - по сравнению с группой 3 (по критерию Манна-Уитни); #р<0,05; ##р<0,01; р=0,103 - по сравнению с исходным значением показателя в данной группе (по критерию Вилкоксона).

Изменения активности пептидаз в структурах мозга крыс в динамике развития

экспериментального_дофсшин-дефицитзависимого_МФТП-индуцированного

депрессивного синдрома. Активность ПЭП и ДП-1У во фронтальной коре на стадии выраженной депрессии поведения была выше, чем в контроле, активность ПЭП в стриатуме также превышала контрольный уровень (табл. 1). Через 2 недели после отмены препаратов нормализация поведения сопровождалась нормализацией активности изученных пептидаз в структурах мозга.

Схожие изменения активности ПЭП в гипоталамусе и активности ДП-1У в прилежащем ядре у животных опытных и контрольных групп могут свидетельствовать о неспецифическом для депрессивного состояния характере этих изменений в ответ на действие общего для обеих групп раздражителя - процедуру многократного введения препаратов, вероятно, являющуюся стрессогенной, в пользу чего свидетельствуют данные об изменении активности обеих пептидаз в гипоталамусе в стрессогенной ситуации отмены морфина (1ёапраап-Не1ккПа .1. е! а!., 1996).

Однако изменения активности ПЭП и ДП-1У во фронтальной коре и в стриатуме можно рассматривать как специфические для депрессивного состояния, так как животные опытных и контрольных групп не различались по уровню тревожности ни на одной из стадий обследования, а выраженность депрессии у крыс опытных групп была значительной по сравнению с контролем.

Активность ПЭП у крыс опытных групп была повышена в структурах-мишенях двух центральных дофаминергических систем - мезокортикальной и нигростриатной, а активность ДП-1У - в структуре-мишени только одной системы - мезокортикальной, что свидетельствует о различном характере вовлеченности этих пептидаз в центральные механизмы развития дофаминдефицитзависимого депрессивного состояния и, возможно, об их разной роли в этом процессе.

Таблица 1.

Активность пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV в структурах мозга крыс в динамике развития экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома.

Группы Срок введения МФТП или физ. р-ра Активность пролилэндопептидазы, нмоль/мг/мин Активность дипептидилпептидазы IV, пмоль/мг/мин

Фронтальная кора Стриатум Гипоталамус Прилежащее ядро Фронтальная кора Стриатум Гипоталамус Прилежащее ядро

Интакт-ные Без введения 0,034±0,006 (п=14) 0,042±0,010 (п=13) 0,062±0,015 (п=14) 0,032±0,006 (п=13) 0,010±0,001 (п=14) 0,011 ±0,002 (п=13) 0,009±0,001 (п=14) 0,005±0,001 (п=13)

МФТП 2 недели от начала введения 0,041 ±0,004 (п=16) ** 0,112±0,031 (п=16) ***, VV, ## 0,035±0,004 (п=16) и 0,028±0,004 (п=15) 0,017±0,003 (п=16) *** V # 0,007+0,001 (п=16) 0,008±0,001 (п=16) 0,009±0,001 (п=15) т

2 недели после отмены 0,03010,004 (п=1б) 0,032±0,004 (п=16) 0,034±0,007 (п=16) и 0,025±0,003 (п=16) 0,010±0,001 (п=16) 0,007±0,001 (п=16) 0,010+0,001 (п=16) 0,007±0,001 (п=16)

Физ. р-р 2 недели от начала введения 0,021 ±0,002 (п=17) 0,025±0,003 (п=17) 0,012±0,002 (п=17) шт 0,020±0,002 (п=17) 0,008±0,001 (п=17) 0,011 ±0,002 (п=17) 0,008±0,001 (п=17) 0,008±0,001 (п=17) V,#

2 недели после отмены 0,022±0,003 (п=16) 0,024±0,005 (п=16) 0,028±0,007 (п—16) # 0,035±0,007 (п=16) 0,011±0,001 (п=16) 0,008±0,001 (п=16) 0,006±0,000 (п=!6) 0,005±0,001 (п=16)

Примечание к табл.1: post hoc анализ проведен по тесту Ньюмана-Кеулса: **р<0,01; ***р<0,001 - по сравнению с соответствующим по сроку значением в группе с введением физ. р-ра; V р<0,05; VVp<0,01 - по сравнению со значением в той же группе на следующем сроке наблюдения; #р<0,05; ##р<0,01; ###р<0,001 - по сравнению со значением в группе интактных животных.

io

Влияние ингибитора пролилэндопептидазы бензилоксикир6онил-метионил-2(5)-цианопирролидина на течение экспериментального МФТП-индуиированного депрессивного синдрома. Части опытных и контрольных животных в течение второй недели введения препаратов за 30 минут до инъекции МФТИ или ФР вводили ингибитор ПЭП Z-Met-Prd-N в дозе 3,0 мг/кг (группы «Z-Met-Prd-N+МФТП», п=9 и «Z-Met-Prd-N+ФР», л=8), остальным животным - ФР (группы «ФР+МФТП», п=9 и «ФР+ФР», п=8).

У крыс в группах «ФР+МФТП» и «Z-Met-Prd-N+МФТП» выявлено снижение предпочтения сахарозы воде по сравнению с исходными значениями [соответственно F(28,224)=l 0,852; р<0,001 и F(28,224)=8,092, р<0,001; repeated measures ANOVA], которое в группе без ингибитора после отмены препаратов сохранялось дольше, что свидетельствовало о нормализующем действии Z-Met-Prd-N. При межгрупповом сравнении у крыс опытной группы в присутствии Z-Met-Prd-N более быстрое восстановление предпочтения сахарозы (рис. 2) проявлялось уже на фоне введения МФТП: на 5 и 6-й дни введения ингибитора предпочтение сахарозы у крыс было выше, чем в группе без ингибитора. Сам по себе Z-Met-Prd-N не влиял на предпочтение сахарозы (рис. 2, группа 4).

Рис. 2. Динамика предпочтения 10% раствора сахарозы воде в ходе развития МФТП-индуцированного депрессивного синдрома в присутствии Z-Met-Prd-N. 1, 2, 3,4- группы «ФР+МФТП» (♦), «Z-Met-Prd-N+МФТП» (■), «ФР+ФР» (A), «Z-Met-Prd-N+ФР» (О).

По оси абсцисс - дни введения препаратов; 0 - до начала введения; по оси ординат -предпочтение 10% раствора сахарозы,%.

Стрелками последовательно отмечено начало введения МФТП/ФР, Z-Met-Prd-N/ФР, прекращение введения препаратов. *р<0,05 - для группы 1 по сравнению с группой 3; +р<0,05 - для группы 2 по сравнению с группой 4; «р<0,05- для группы 1 по сравнению с группой 2 (критерий Манна-Уитни).

В группах крыс «ФР+МФТП» и «Z-Met-Prd-N+МФТП» в данной серии не выявлено снижения потребления жидкости относительно исходного уровня, отмечено однократное снижение потребления жидкости относительно соответствующего контрольного уровня.

Z-Met-Prd-N препятствовал развитию «поведенческого отчаяния» и биоритмологических нарушений у крыс опытной группы, предотвращая увеличение иммобилизации и рост ИД в тесте принудительного плавания, при этом сам по себе не влиял на поведение крыс в тесте принудительного плавания (рис. 3).

Масса тела животных в группе «ФР+МФТП» не изменялась на фоне введения МФТП, отмена введения препаратов приводила к ее нарастанию [F(4,32)=27,970, р<0,001, repeated measures ANOVA], В группе «Z-Met-Prd-N+МФТП» масса тела животных нарастала уже в

период сочетанного введения препаратов и далее в период их отмены [F(4,32)=42,947, р<0,001 repeated measures ANOVA]. В контрольных группах крыс нарастание массы тела наблюдалось на протяжении всего обследования. Данные свидетельствуют о том, что нарастание массы тела в присутствии Z-Met-Prd-N происходило быстрее. Двигательная активность исходно в группах не различалась и не изменялась в условиях введения Z-Met-Prd-N.

+ Длительность иммобилизации, с

il.....1

i и-'

2 нед. введения МФТИ

ФР+МФТП Z-Met-Prd-N ФР+ФР Z-Met-Prd-N

2 нед. введения МФТП

2 нед.

Рис. 3. Длительность иммобилизации и индекс депрессивности у крыс опытных и контрольных групп в тесте принудительного плавания в условиях введения Z-Met-Prd-N. *р<0,05 - по сравнению с группой «ФР+ФР»; #р<0,05 - по сравнению с группой «Z-Met-Prd-N+МФТП»; +р<0,05 - по сравнению с группой «Z-Met-Prd-N+ФР» (post hoc анализ по критерию Манна-Уитни).

Выраженность депрессии превышала соответствующий контрольный уровень только в группе «ФР+МФТП» (1,7±0,6 по сравнению 0,4±0,4 баллов в группе «ФР+ФР»; р<0,05 по критерию Манна-Уитни), тогда как в группе «Z-Met-Prd-N+МФТП» отличий от контроля («Z-Met-Prd-N+ФР») не было выявлено (соответственно 0,6±0,2 и 0,1±0,1 баллов; р>0,05).

Таким образом, Z-Met-Prd-N проявлял свойства антидепрессанта, подавляя развитие симптомов дофаминдефицитзависимого экспериментального депрессивного синдрома.

Влияние ингибитора пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-аланил-пролина на течение экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома. Части опытных и контрольных животных за 30 минут до инъекции МФТП или ФР в течение второй недели введения препаратов вводили ингибитор ПЭП Z-Ala-Pro-OH в дозе 3,0 мг/кг (группы «Z-Ala-Pro-OH+МФТП», п=7 и «Z-Ala-Pro-OH+ФР», п=8), остальным животным - ФР (группы «ФР+МФТП», п=8 и «ФР+ФР», п=8).

Предпочтение раствора сахарозы воде в динамике наблюдения уменьшалось у животных в группах «ФР+МФТП» [F(29,174)=3,268; р<0,001; repeated measures ANOVA] и «Z-Ala-Pro-OH+МФТП» [F(29,174)=6,069; р<0,001; repeated measures ANOVA] по сравнению с исходными значениями параметра и со значениями в контрольных группах (рис. 4А). После отмены препаратов предпочтение сахарозы в группе «ФР+МФТП» оставалось сниженным по сравнению с остальными группами в течение двух недель, тогда как у животных из группы «Z-Ala-Pro-OH+МФТП» не наблюдалось отличий от контроля уже через неделю после отмены препаратов.

Суточное потребление жидкости в динамике наблюдения снижалось в течение всего времени введения пронейротоксина у крыс в группах «ФР+МФТП» [F(29,174)=3,025; р<0,001; repeated measures ANOVA] и «Z-Ala-Pro-OH+МФТП» [F(29,174)=5,376; р<0,001; repeated measures ANOVA] как по сравнению с исходными значениями параметра в группах, так и по сравнению с соответствующими контрольными значениями (рис.4Б). Восстановление потребления жидкости в группе «Z-Ala-Pro-OH+МФТП» до контрольных значений происходило в первые дни после отмены препаратов. В группе «ФР+МФТП» сниженное потребление жидкости сохранялось в течение двух недель после отмены.

ингибитора ПЭП Z-Ala-Рго-ОН. 1, 2, 3, 4 - группы «ФР+МФТП» (♦), «Z-Ala-Pro-OH+МФТП» (■), «ФР+ФР» (А), «Z-Ala-Pro-OH+ФР» (О) соответственно. По оси абсцисс - сутки, 0 - до начала введения препаратов. Стрелками последовательно отмечено начало введения МФТП/ФР, ингибитора/ФР, прекращение введения препаратов; по оси ординат - А: предпочтение раствора сахарозы воде, %; Б: суточный объем потребления жидкости, мл. Post hoc анализ по критерию Дункана: *р<0,05 - для групп 1 и 2 по сравнению с группой 3; +р<0,05 - для групп 1 и 2 по сравнению с группой 4; *р<0,05 - для группы 1 по сравнению с группой 2.

В конце двухнедельного периода отмены препаратов только у крыс из группы «ФР+МФТП» не было выявлено снижения величины показателей длительности иммобилизации и ИД по сравнению с соответствующими значениями по окончании двухнедельного периода введения препаратов (рис. 5), что свидетельствовало о подавлении ингибитором «поведенческого отчаяния» и биоритмологических нарушений.

Масса тела животных в группе «ФР+МФТП» уменьшалась по сравнению с исходным значением в течение двух недель введения МФТП; отмена препаратов приводила к восстановлению массы тела животных [F(4, 28)=5,209, р=0,003 repeated measures ANOVA]. В группе «Z-Ala-Pro-OH+МФТП» масса тела животных снижалась в первую неделю введения МФТП, возвращалась к исходному уровню на фоне сочетанного введения ингибитора и МФТП и, в отличие от группы «ФР+МФТП», нарастала в период отмены препаратов [F(4,24)= 16,524, р<0,001, repeated measures ANOVA], В контрольных группах крыс отмечалось сходное нарастание массы тела в период отмены препаратов. Z-Ala-Pro-OH не влиял на характер двигательной активности крыс.

Длительность нммооилнгдции. с

45 . Ж

ФР+МФТП г-Аи-Рго-ОН ФР+ФР Х-А1а-Рп>-ОН ♦МФТП +ФР

■ 2нед введения 02нед. отмены

Индекс депрессивносги

ФР+МФТП г-А1а-Рго-ОН ФР+ФР г-АЬ-Рго-ОН +МФТП +ФР

■ 2нед введения а2нед отмены

Рис. 5. Характеристика поведения крыс с экспериментальным МФТП-индуцированным депрессивным синдромом в тесте принудительного плавания в условиях введения ингибитора ПЭП 7-А1а-Рго-ОН. *р<0,05 - по сравнению с исходными значениями показателей (критерий Вилкоксона).

Выраженность депрессии в группах «ФР+МФТП» и «2-А1а-Рго-ОН+МФТП» в период введения препаратов не различалась (3,8±0,8 и 3,3±0,6 балла) и превышала величину этих показателей в группах «ФР+ФР» и «г-А1а-Рго-ОН+ФР» (0,6±0,3 и 0,3±0,3 балла) [Н(3, Ы=31)=16,574, р=0,001 КгизЫЛУаШв АЫОУА; в обоих случаях р<0,05 по критерию Манна-Уитни]. В период отмены только в группе крыс «ФР+МФТП» сохранилось превышение интегральной оценки выраженности депрессии (2,3±0,8 балла) над показателями во всех остальных группах (менее 0,8 балла) [Н (3, N=30=13,675, р=0,003 Кпкка^аШв ANOVA; р<0,05 по критерию Манна-Уитни].

Таким образом, г-А1а-Рго-ОН не оказывал существенного влияния на течение МФТП-индуцированного депрессивного синдрома у крыс, однако, после отмены МФТП способствовал более быстрому устранению симптомов депрессии поведения, то есть проявлял свойства антидепрессанта.

Сравнительный анализ эффектов двух ингибиторов ПЭП - г-МеЬРгё^ и г-А1а-Рго-ОН в период введения и отмены МФТП показал, что более выраженным антидепрессантным действием обладает г-Мй-Ргй-Ы, который проявлял нормализующее действие уже на фоне введения пронейротоксина (по показателям в тесте принудительного плавания и по предпочтению сахарозы воде), тогда как Z-Ala-Pro-OH обнаруживал свойства антидепрессанта только в восстановительном периоде.

Влияние ингибитора пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-метионил-2($)-иианопирролидинч на формирование экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома. Части опытных и контрольных животных за 30 минут до инъекции МФТП или ФР в течение двух недель вводили ингибитор ПЭП Е-Мй-РгсШ в дозе 1,0 мг/кг (группы «г-Мй-Ргё-Ы+МФТП», п=8 и «2-Ме1-Ргс1-Ы+ФР», п=8), остальным животным - ФР (группы «ФР+МФТП», п=12 и «ФР+ФР», п=12). По окончании введения препаратов животные были декапитированы, после чего были взяты образцы ткани мозга для анализа активности ПЭП и ДП-1У.

В указанных условиях Z-Met-Prd-N не предотвращал снижения предпочтения раствора сахарозы воде и снижения суточного потребления жидкости относительно исходных

значений и значений показателей в контрольных группах. Также не выявлено статистически значимых различий по этим показателям у крыс опытных групп «ФР+МФТП» и «г-Мй-Ргс!-Ы+МФТП». В группе «г-Ме1-Ргс!-Ы+ФР» суточное потребление жидкости возрастало [Р(14,84)=2,187, р=0,015] и периодически превышало потребление в группе «ФР+ФР».

г-Мй-Ргё-Ы предотвращал увеличение длительности иммобилизации и рост ИД у крыс в тесте принудительного плавания (рис. 6), то есть проявлял защитное действие в отношении развития «поведенческого отчаяния» и биоритмологических нарушений.

Рис. 6. Характеристика поведения крыс в тесте принудительного плавания в условиях введения ингибитора ПЭП г-Ме^Ргё-Ы в период формирования экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома (2 недели введения препаратов). *р<0,01 - по сравнению с соответствующими значениями в остальных группах (критерий Манна-Уитни).

Масса тела животных в группах «ФР+МФТП» и «г-Ме!:-Ргс1-Ы+МФТП» сходным образом снижалась через две недели введения препаратов, и оставалась сниженной после отмены [соответственно Р(2,22)=5,753; р=0,010 и |Т(2,14)=3,679; р=0,05; во всех случаях р<0,05 по тесту Дункана]. Двигательная активность крыс в опытных и контрольных группах в процессе обследования не различалась.

Таким образом, г-МеЬРгсМЧ в условиях введения в течение двух недель перед МФТП, предотвращал развитие у животных таких симптомов депрессивного синдрома как «поведенческое отчаяние» и нарушение биоритмологической структуры плавательного поведения, но не влиял на развитие других симптомов депрессивного синдрома. Вследствие этого, выраженность депрессии поведения в группах «ФР+МФТП» и «г-Мй-Ргё-Ы+МФТП» статистически значимо не различалась (соответственно 4,2±0,7 и 3,3±0,6 балла), превышая величину показателя в контрольных группах [соответственно 0,5±0,3 и 0,9±0,3 балла: Н (3, 1М=40)=19,919; р<0,001; по критерию Манна-Уитни р<0,001].

По уровню тревожности исходно животные опытных и контрольных групп не различались. г-МеьРМ-Ы предотвращал повышение уровня тревожности в опытной и контрольной группах в процессе обследования (рис. 7), что свидетельствует о наличии у него анксиолитических свойств.

Рис.7. Изменение уровня тревожности у крыс (в баллах) в условиях введения Z-Met-Prd-N в период формирования МФТП-индуцированного депрессивного синдрома. *р<0,05 - по сравнению с исходным уровнем в данной группе (парный критерий Вилкоксона).

Влияние ингибитора пролилэндопептидазы 6ензилоксикарбонил-метионил-2($)-цианопирролидина на массу стресс-компетентных органов у крыс в условиях его введения в период формирования МФТП-индуцированного депрессивного синдрома.

2-Ме1-Р^-Ы не препятствовал увеличению относительной массы надпочечников, но предотвращал снижение относительной массы тимуса у крыс опытных групп (табл. 2). Результаты дают основание предполагать наличие у этого ингибитора ПЭП антистрессорных свойств.

Таблица 2.

Изменение относительной массы стресс-компетентных органов (мг/г массы тела) у крыс с МФТП-индуцированным депрессивным синдромом.

Группы Надпочечники Тимус Селезенка

ФР+МФТП 0,17+0,01* + 0,61+0,09* + • 3,93+0,36

ФР+ФР 0,14+0,01 0,91+0,05 3,98+0,28

г-МеЬРгсШ+МФТП 0,17+0,01* + 0,89+0,07 3,78+0,24

г-меьРга-ы+ФР 0,13+0,01 1,05+0,06 4,17+0,42

Примечание к табл. 2: *р <0,01 - по сравнению с группой «ФР+ФР»; +р<0,01 - по сравнению с группой «г-МеЬРМ-Ы+ФР»; «р<0,01 - по сравнению с группой «г-Ме^Ргё-Ы+МФТП» (по тесту Ньюмана-Кеулса).

Влияние бензилоксикарбонил-метионил-2($)-иианопирролидина на активность пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-1У в структурах мозга крыс в период формирования МФТП-индуцированного депрессивного синдрома В данной серии у крыс группы «ФР+МФТП» активность ПЭП во фронтальной коре мозга, в стриатуме и гипоталамусе была выше, чем у крыс остальных групп (рис. 8). Выявленное повышение активности ПЭП в гипоталамусе по сравнению с группой с введением МФТП (см. табл. 1), может быть связано с повышенной чувствительностью депрессивных животных к дополнительному стрессированию при увеличении числа ежедневных инъекций. Активность ДП-1У в группе «ФР+МФТП» была повышена во фронтальной коре, что соответствовало данным, полученным в наших предыдущих экспериментах. Таким образом, в разных экспериментальных сериях паттерн изменения активности ферментов в структурах-мишенях

ю,о т

9,0 8,0 7,0 6,0 5,0

I

□ до введения И 2 нед. введения

[У

ФР+МФТП ФР+ФР ггМе1-РгЛ-К ММ-Рг^Л +МФТП +ФР

мезокортикальной и нигростриатной ДА-ергических систем мозга, в целом, был воспроизведен.

г-Ме1:-Ргс1-Ы при введении в период формирования МФТП-индуцированного депрессивного синдрома предотвращал повышение активности пептидаз в структурах мозга крыс. Можно полагать, что механизм антидепрессантного действия Z-Met-Prd-N связан с подавлением повышенной активности ПЭП и ДП-1У во фронтальной коре и стриатуме, а одним из механизмов антистрессорного действия ингибитора может быть подавление повышенной активности ПЭП в гипоталамусе.

□Интакгные Офр+фр «ФР+МФТП ог-В/Ы-Рг^+ФР я г-Ме1-Ргс1-М+МФТП

нмоль/мг/мин

Фронтальная

Фронтальная

ПЭП

Стриатум

Гипоталамус

Рис. 8. Активность ПЭП и ДП-ГУ в структурах мозга крыс в условиях введения ингибитора ПЭП г-МеЬРгё-Ы в период формирования МФТП-индуцированного депрессивного синдрома. *р<0,05 по сравнению с остальными группами (по тесту Ньюмана-Кеулса).

Модель стресс-индуцированного депрессивно-подобного состояния у крыс (модель «поведенческого отчаяния»).

Влияние ингибитора пролилэндопептидизы дензиликсикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина на поведение крыс в тесте принудительного плавания. В день выработки «поведенческого отчаяния» длительность пассивного плавания в группах за первые 5 мин наблюдения не различалась. В день тестирования в отсутствие ингибитора длительность пассивного плавания у крыс повышалась на 25,7% (р<0,01, парный критерий Стьюдента), что подтверждало развитие у крыс состояния «поведенческого отчаяния». Ъ-МеЬРгсЪЫ вводили за 30 мин до тестирования. В группе «г-Мй-Ргё-Ы, 2 мг/кг» длительность пассивного плавания была увеличена, тогда как в группе <й-Ме!-Ргс1-Ы, 1 мг/кг» длительность пассивного плавания не превышала исходное значение в день выработки и была ниже, чем в остальных группах. Таким образом, г-Ме1-Ргс1-Ы в дозе 1,0 мг/кг предотвращал развитие «поведенческого отчаяния», что подтверждало наличие у него свойств антидепрессанта, выявленных нами ранее на модели экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома у крыс.

Влияние оензилоксикир6онил-метионил-2($)-цианопирролидинч на активность пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-1У в структурах мозга крыс на модели апресс-инбудированной депрессии У крыс с моделью «поведенческого отчаяния» активность ПЭП была повышена по сравнению с активностью у интактных крыс во

фронтальной коре и стриатуме, а активность ДП-1У - в стриатуме (табл. 3). 2-Ме1-Ргс1^ в дозе 1,0 мг/кг, препятствовавшей развитию «поведенческого отчаяния», также предотвращал повышение активности пептидаз в структурах мозга. В дозе 2,0 мг/кг 2-Ме1-Рг(1-Ы не проявлял свойств антидепрессанта на данной модели, при этом предотвращал повышение активности ПЭП и ДП-1У в стриатуме, но не предотвращал повышение активности ПЭП во фронтальной коре.

Таблица 3.

Активность ПЭП и ДП-1У в структурах мозга крыс с моделью «поведенческого отчаяния» в условиях введения бензилоксикарбонил-метионил-2(5)-цианопирролидина.

Группы Фронтальная кора Стриатум Гипоталамус Прилежащее ядро

Активность пролилзндопептидазы, нмоль/мг/мин

Интактные 0,092± 0,003 0,09010,002 0,09710,002 0,09810,001

Модель 0,111±0,002 0,107±0,002 ++Ш** 0,10510,003 0,10610,001

Z-Met-Prd-N, 1 мг/кг 0,096±0,004 0,094±0,002 0,09410,004 0,09610,003

Z-Met-Prd-N, 2 мг/кг 0,100±0,005 0,09610,003 0,099+0,002 0,10010,006

Активность дипептидилпептидазы IV, нмоль/мг/мин

Интактные 0,055± 0,004 0,048+0,001 0,05210,002 0,05110,001

Модель 0,059± 0,002 0,05810,001 ++##** 0,05710,001 * 0,05610,002

Z-Met-Prd-N, 1 мг/кг 0,056±0,001 0,04810,002 0,050+0,001 0,05210,002

Z-Met-Prd-N, 2 мг/кг 0,058±0,002 0,04910,003 0,05210,003 0,05510,006

Примечание к табл. 3: post hoc анализ по тесту Ньюмана-Кеулса - ##р<0,01, ###р<0,001 - по сравнению с группой «Интактные»;*р<0,05; **р<0,01 - по сравнению с группой «Z-Met-Prd-N, 1 мг/кг»; ++р<0,01 - по сравнению с группой «Z-Met-Prd-N, 2 мг/кг». Во всех группах п=10.

Сопоставление данных, полученных на двух моделях экспериментального депрессивного состояния у крыс, позволяет прийти к заключению, что признаки депрессии в поведении у животных сопровождаются схожим увеличением активности ПЭП во фронтальной коре и в стриатуме, тогда как повышение активности ДП-IV отмечается в разных структурах мозга: во фронтальной коре на модели МФТП-индуцированного депрессивного синдрома и в стриатуме на модели стресс-индуцированного «поведенческого отчаяния». Активность обоих ферментов нормализуется при исчезновении депрессивной симптоматики - спонтанно или в условиях действия ингибитора ПЭП Z-Met-Prd-N, проявляющего свойства антидепрессанта.

Полученные данные прямо свидетельствуют о том, что дизрегуляция активности ПЭП и ДП-IV в структурах-мишенях мезокортикальной (фронтальная кора) и нигростриатной (стриатум) дофаминергических систем мозга может быть патогенетическим механизмом развития депрессивных состояний разной этиологии. Вовлеченность ПЭП и ДП-IV в

центральные механизмы развития депрессивных состояний разного генеза, по-видимому, имеет структурозависимый характер. Результаты исследования свидетельствуют в пользу ранее высказанного предположения о том, что в основе депрессивного состояния лежит формирование сложной патологической системы, в состав которой входят многие структуры ЦНС, вовлеченные в реализацию эмоционально-мотивационного поведения (Крыжановский Г.Н., 1980, 2002; Крупина H.A., 2003). Можно полагать, что вовлечение фронтальной коры и стриатума в патологическую систему депрессивного синдрома, независимо от его этиологии, является закономерностью. Высока вероятность вовлечения гипоталамуса. В целом, расстройства в системе пролинспецифических пептидаз можно рассматривать как новое звено в цепи механизмов, запускающих и поддерживающих развитие депрессивных расстройств, в основе функционирования которого может лежать взаимовлияние пептидергических, моноаминергических, нейроэндокринных, нейроиммунных систем организма.

Сравнительный анализ эффективности известных антидепрессантных препаратов и изученных ингибиторов ПЭП позволяет говорить о перспективах поиска новых антидепрессантов среди ингибиторов пролилэндопептидазы и о возможности создания новой группы антидепрессантов на основе этих ингибиторов для их включения в комплексную патогенетическую терапию аффективных расстройств.

ВЫВОДЫ

1. На модели дофамин-дефицитзависимого экспериментального депрессивного синдрома у крыс, вызванного введением пронейротоксина МФТП (20 мг/кг, в течение двух недель), показано, что развитие симптомов депрессивно-подобного состояния - снижения уровня жизненно важных мотиваций, агедонии в тесте предпочтения сахарозы перед водой, «поведенческого отчаяния», биоритмологических нарушений в тесте принудительного плавания - сопровождается повышением активности пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV во фронтальной коре мозга и повышением активности пролилэндопептидазы в стриатуме.

2. Синтетический неконкурентный ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин при субхроническом внутрибрюшинном введении в дозе 3 мг/кг (в течение второй недели введения МФТП) подавлял проявление основных симптомов МФТП-индуцированного депрессивного синдрома у крыс - агедонии, «поведенческого отчаяния», биоритмологических нарушений, а также способствовал восстановлению массы тела животных, то есть проявлял свойства антидепрессанта.

3. Синтетический конкурентный ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-аланил-пролин при субхроническом внутрибрюшинном введении в дозе 3 мг/кг (в течение второй недели введения МФТП) не оказывал существенного влияния на течение МФТП-индуцированного депрессивного синдрома у крыс, однако, после отмены МФТП способствовал более быстрому устранению агедонии в тесте предпочтения сахарозы перед водой, а также нормализации уровня питьевой мотивации, показателей плавательного поведения и массы тела животных. Данные свидетельствуют о наличии у бензилоксикарбонил-аланил-пролина свойств антидепрессанта.

4. Ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин при субхроническом внутрибрюшинном введении в дозе 1 мг/кг (в течение двух недель введения МФТП) предотвращал развитие симптомов депрессивного синдрома в тесте принудительного плавания. Ингибитор препятствовал нарастанию тревожно-фобического уровня у крыс, а также предотвращал снижение относительной массы одного из стресс-компетентных органов - тимуса. Данные свидетельствуют о наличии у этого ингибитора антидепрессивного, анксиолитического и антистрессорного действия.

5. Эффекты ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина сопровождались снижением повышенной активности ПЭП во фронтальной коре мозга, стриатуме и активности ДП-IV во фронтальной коре.

6. На модели стресс-индуцированного депрессивно-подобного состояния («поведенческого отчаяния» в тесте принудительного плавания по Порсолту) у крыс выявлено повышение активности ПЭП во фронтальной коре мозга и стриатуме и ДП-IV в стриатуме.

7. Ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(5)-цианопирролидин при остром введении в дозе 1 мг/кг предотвращал развитие «поведенческого отчаяния» и повышение активности ПЭП и ДП-IV в структурах мозга. В дозе 2 мг/кг ингибитор ПЭП не влиял на развитие «поведенческого отчаяния», однако предотвращал повышение активности ПЭП и ДП-IV в стриатуме.

8. Данные свидетельствуют о том, что повышение активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-IV во фронтальной коре и стриатуме может быть одним из патогенетических механизмов развития депрессивно-подобных состояний разной этиологии, а ингибиторы ПЭП перспективны для разработки комплексной патогенетической терапии депрессивных состояний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Золотое H.H., Назарова Г.А., Богданова Н.Г., Куксин Д А. Физиологически активные пептиды и протеолитические ферменты мозга. Взаимодействие нейромедиаторных систем // Тез. докл. III Российского конгресса по патофизиологии. 9-12 ноября 2004 г. -М.-2004.-С. 139.

2. Крупина H.A., Золотов H.H., Богданова Н.Г., Орлова И.Н., Хлебникова H.H., Крыжановский Г.Н. Активность пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV в структурах мозга крыс с дофаминдефицитзависимым МФТП-индуцированным депрессивным синдромом // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2006. - Т. 142. - № 11. С.497-500.

3. Богданова Н.Г., Крупина H.A., Орлова И.Н., Хлебникова H.H., Золотов Н. Н., Крыжановский Г.Н. Активность пролинспецифических пептидаз в структурах мозга крыс с МФТП-индуцированным депрессивным синдромом // Тез. докл. и стенд, сообщений научной конференции «Нейроспецифические метаболиты и этимологические основы деятельности ЦНС». 25-27 сентября 2006 г. Пенза. - 2006. -С.72-73.

4. Золотов H.H., Крупина H.A., Кушнарева Е.Ю., Лебедева М.А., Саноцкая Н.В., Мациевский Д.Д., Назарова Г.А., Крайнева В.А., Богданова Н.Г., Воронина Т.А.,

Гарибова Т.Л. Ингибиторы пролинспецифических пептидаз в моделировании патологических состояний и их патогенетической коррекции // Тез. докладов и стенд сообщений VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов». 23-25 апреля 2007. -М.-2007.-С. 51.

5. Золотое H.H., Крупина H.A., Богданова Н.Г., Кушнарева Н.Ю., Назарова Г.А., Лебедева М.А., Кудрин B.C., Клодт П.М., Воронина Т.А. Изменения активности дипептидилпептидазы IV (CD26) при различных иммунных и неврологических состояниях в эксперименте // Материалы XVI Всероссийской конференции «Нейроиммунология» «Нейроимидж» и научно-практической конференции неврологов. 23-26 мая 2007, г. СПб., 2007. Нейроиммунология. - 2007. - T.V. - №2. - С. 49-50.

6. Золотое H.H., Крупина H.A., Кушнарева Е.Ю., Лебедева М.А., Саноцкая Н.В., Мациевский Д.Д., Назарова Г.А., Крайнева В.А., Богданова Н.Г., Лосев A.C., Кудрин

B.C., Клодт П.М., Воронина Т.А., Гарибова Т.Л. Ингибиторы пролинспецифических пептидаз в патогенетической коррекции при моделировании экспериментальных патологических состояний // Материалы III Съезда фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению». СПб. 23-27 сентября 2007 г. Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7. - Спец. выпуск. - 4.1. -

C. 1706.

7. Крупина H.A., Орлова И.Н., Хлебникова H.H., Панкова Н.Б., Богданова Н.Г., Кушнарева Е.Ю., Родина В.И. Дизрегуляционные механизмы в развитии экспериментальных эмоционально-поведенческих расстройств //В кн.: «Дизрегуляционная патология». Материалы Объединенного пленума Российского и Московского научных обществ патофизиологов, Научного совета по общей патологии и патофизиологии РАМН и Минздравсоцразвития РФ, посвященного 85-летию академика РАМН Г.Н.Крыжановского 13 -14 ноября 2007 г. - Патогенез. - Приложение 1.-2007.-С. 13-14.

8. Богданова Н.Г. Активность пролин-специфических пептидаз в структурах мозга и эффекты синтетических ингибиторов пролилэндопептидазы у крыс с МФТП-индуцированным депрессивным синдромом //Тез. V Конф. молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». 19-22 мая 2008 г. - М. - 2008. - С. 60-61.

9. Bogdanova N., Krupina N., Khlebnikova N.. Orlova I., Zolotov N., Kryzhanovskii G. Synthetic inhibitors of prolyl endopeptidase exhibit antidepressant-like effects in rats with dopamine deficient-dependent mptp-induced depressive syndrome // Abstracts of the XIV World Congress of Psychiatry. Prague. September 20-25, 2008. - J. of Czech and Slovak Psychiatry. - 2008. - V. 104. - Suppl. 2. - P.l 102.

10. Хлебникова H.H., Крупина H.A., Богданова Н.Г., Золотов H.H., Крыжановский Г.Н. Влияние ингибитора пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-метионил-2(5)-цианопирролидина на развитие экспериментального депрессивного синдрома у крыс // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2009. - Т. 147. - №1. - С.27-31.

11. Хлебникова H.H., Крупина H.A., Орлова И.Н., Богданова Н.Г., Золотов H.H., Крыжановский Г.Н. Влияние ингибитора пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-

аланил-пролина на развитие экспериментального депрессивного синдрома у крыс // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2009. - Т. 147. - №3. - С. 261-266.

12. Krupina N.A., Khlebnikova N.N., Zolotov N.N., Kushnareva E.Yu., Bogdanova N.G., Orlova I.N. Synthetic inhibitors of prolyl endopeptidase exhibit antidepressant-like effects in rat models of depressive syndrome and anxiety-depression state // In: "Antidepressants: Types, Efficiency and Possible Side Effects" /Ed. Jayden T. Van Leeuwen. NY: Nova Science Publishers, Inc. - 2010. - Ch. 5. - P. 135-154.

13. Krupina N.A., Bogdanova N.G., Khlebnikova N.N., Zolotov N.N., Orlova I.N. Effects of synthetic inhibitor of prolyl endopeptidase benzyloxycarbonyl-methionyl-2(S)-cyanopyrrolidine in Porsolt forced swim test // Abstracts of the 24th ECNP Congress. Paris, Sept. 3-7. 2011. France. Eur. Neuropsychopharmacol. - 2011. - V.21. - Suppl. 3. - P. S415.

Bogdanova Nataliya Grigorievna Study of the proline-specific peptidases in the development of experimental depression-like states.

The aim of present investigation was to assess the activities of two serine proline-specific peptidases - prolyl endopeptidase (PEP) and dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) in rat brain structures and to estimate the effects of PEP inhibitors in two experimental models of depression-like state. The first model of depression-like syndrome was induced in male Wistar rats by repeated systemic specific-for-dopamine-neurons proneurotoxin l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration (20 mg/kg, i.p., for 2 weeks) that caused anhedonia, behavioral despair in the forced swim test and low level of vital motivation in animals. Brain tissues were processed to analyze enzymes activity by fluorometric assay. MPTP-induced depression-like behavior was accompanied by the increase of PEP activities in frontal cortex and striatum and DPPIV activity in the frontal cortex. Novel synthetic non-competitive PEP inhibitor benzyloxycarbonyl-methionyl-2(S)-cyanopyrrolidine (Z-Met-Prd-N, 3 mg/kg, i.p., for a week) suppressed the symptoms of depressive syndrome and prevented (1 mg/kg, i.p., for two weeks) the development of behavioral despair in this model. Z-Met-Prd-N prohibited rats from increasing the anxiety-phobic state and prevented the decrease of relative thymus mass. This PEP inhibitor also prevented the increase of PEP and DPPIV activities in the brain structures. Synthetic competitive PEP inhibitor benzyloxycarbonyl-alanyl-proline (Z-Ala-Pro-OH, 3 mg/kg, i.p., for a week) did not suppress main symptoms of MPTP-induced depression-like syndrome but promoted faster reduction of depressionlike behavior in rats after MPTP withdrawal. In the second model of depression-like state, a model of stress-induced behavioral despair in Porsolt forced swim test, increased immobility in rats was accompanied by the increase of PEP activities in frontal cortex and striatum and DPPIV activity in the striatum. Z-Met-Prd-N (1 mg/kg, i.p., 30 min prior to testing) prevented the development of behavioral despair and reduced heightened PEP and DPPIV activities in rat brain structures. At a dose of 2 mg/kg Z-Met-Prd-N did not reduce behavioral despair but prevented the increase of PEP and DPPIV activities in striatum. The results obtained in two rat models of depression-like state suggest the increase of brain PEP and DPPIV activities to be one of the mechanisms of depression, prove antidepressant-like properties for PEP inhibitors Z-Met-Prd-N and Z-Ala-Pro-OH and afford grounds for a new approach to treatment strategy for depressive disorders including synthetic inhibitors of PEP.

Подписано в печать: 28.10.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 477 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Рождественка, 5/7,стр.1 (495) 623-93-06; www.reglet.ru

Актуальность темы. Депрессивные расстройства разных нозологических форм относятся к числу наиболее распространенных психических расстройств. По данным Всемирной Организации Здравоохранения депрессией страдают 4-5% населения земного шара, а к 2030 г. депрессии, предположительно, выйдут на 1-е место по распространенности, обойдя сердечно-сосудистые заболевания (Бюллетень ВОЗ, 2008а,б; Sartorius N., 2001). По оценкам исследователей в экономически развитых европейских странах эндогенными и психогенными депрессивными расстройствами страдают около 20% психических больных (Paykel Е. et al., 2005; Wittchen Н., 2005).

Депрессия по современным представлениям рассматривается как хроническое заболевание, связанное с субъективным ощущением тяжелых страданий, характеризующееся снижением эмоционального фона, интеллектуальной и физической активности, что приводит к социальной декомпенсации заболевших (Мосолов С.Н., 2005; Solomon D. et al., 1997). Низкий процент полной ремиссии, длительная социальная дезадаптация, высокий суицидальный риск, побочные действия лекарственных препаратов снижают качество жизни пациентов, ограничивают их профессиональную пригодность, что определяет медико-социальную и экономическую значимость проблемы изучения патогенеза и поиска эффективной терапии депрессивных расстройств разного типа.

В настоящее время появляется все больше свидетельств того, что патогенез депрессивных расстройств связан с нарушением функций многих нейрорегуляторных систем, к числу которых относятся моноаминергические системы мозга, гипоталамо-гипофизарно-адреналовая ось, цитокины, нейропептиды и пептидные гормоны, нейротрофические факторы, системы вторичных мессенджеров (Delgado Р. et al., 2000; De Wied D., Sigling H. 2002; Foltyn W. et al., 2002; Ressler K., Nemeroff C., 2002;

Maletic V., Robinson M. et al., 2007; Jabbi M. et al., 2008; Kozicz T. et al., 2008; Bacher I. et al., 2009; Fisar Z., Hroudovä J., 2010; Hasler G., 2010).

Известно, что многие нейропептиды, опосредующие депрессивную симптоматику, являются субстратами протеолитических ферментов, к числу которых относятся пролинспецифические пептидазы — пролилэндопептидаза (ПЭГ1) и дипептидилпептидаза-IV (ДП-IV) (Крупина H.A., Хлебникова H.H., 2010; Cunningham D., O'Connor В., 1997;Scharpe S. et al., 2001; Myöhänen T. et al., 2008, 2009).

В клинике имеются свидетельства изменения активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-IV в сыворотке и плазме крови больных с симптомами большой депрессии и посттравматическим стресс-расстройством (Maes М. et al., 1994-2004; Min L. et al., 2010). В недавних экспериментах на грызунах с дефицитом активности ДП-IV, вызванным мутацией гена фермента, показано снижение стресс-реактивности и уменьшение выраженности депрессивно-подобного поведения у животных (Karl Т. et al., 2003; El Yacoubi M. et al., 2006). У крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-IV в раннем постнатальном периоде, в динамике взросления наблюдали развитие тревожно-депрессивного состояния, которое сопровождалось повышением активности ПЭП и ДП-IV в структурах мозга, опосредующих развитие эмоционально-мотивационного поведения (Крупина H.A. и др., 2009; Кушнарева Е.Ю. и др., 2011). Увеличение активности обеих пептидаз было выявлено в подкорковой области мозга мышей на модели «поведенческого отчаяния» в тесте принудительного плавания, причем синтетические дипептидные ингибиторы ПЭП (общей формулы Z-AA-Pro-OH, где АА - остатки аминокислот Gly, Ala, Не, и Pro) на этой модели проявляли свойства антидепрессантов (Золотов H.H. и др., 1992). По совокупности данных, можно предполагать, что пролинспецифические пептидазы участвуют в механизмах развития депрессивных состояний, однако их роль в процессах развития депрессивных расстройств до сих пор не ясна. Поиск ответа на этот вопрос связан с изучением функциональной активности пептидаз в структурах головного мозга в процессе развития депрессивного состояния разной этиологии. Для выяснения патофизиологических механизмов депрессивных расстройств и поиска новых подходов к комплексной патогенетической терапии депрессий разного генеза полезно изучение эффектов новых ингибиторов ПЭП на экспериментальных моделях депрессивных состояний.

Целью исследования являлось сравнительное изучение активности протеолитических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV в структурах мозга крыс на разных моделях V экспериментальных депрессивных состояний и возможности коррекции депрессивно-подобного поведения новыми ингибиторами пролилэндопептидазы.

Задачи исследования:

1. Провести анализ изменения активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-1У флуорометрическим методом в структурах головного мозга крыс - фронтальной коре, стриатуме, гипоталамусе и прилежащем ядре - параллельно с контролем эмоционально-поведенческих изменений у животных на модели дофамин-дефицитзависимого экспериментального депрессивного синдрома у крыс, вызванного введением пронейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП).

2. Изучить эффекты синтетического неконкурентного ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина (2-Ме1:-Ргс1-1ч[) и синтетического конкурентного ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-аланил-пролина (2-А1а-Рго-ОН) в условиях их субхронического введения на течение экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома.

3. Изучить эффекты ингибитора ПЭП г-Ме^Ргё-Ы в условиях его субхронического введения на формирование экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома, тревожно-фобический уровень и стресс-реактивность (по показателю массы стресс-компетентных органов) у крыс.

4. Изучить влияние ингибитора ПЭП 2-Ме1-Ргс1-М в условиях его субхронического введения на активность ПЭП и ДП-1У в структурах мозга крыс на модели экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома у крыс.

5. Провести анализ изменения активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-1У флуорометрическим методом в структурах головного мозга крыс - фронтальной коре, стриатуме, гипоталамусе и прилежащем ядре - параллельно с контролем эмоционально-поведенческих изменений у животных на модели депрессивно-подобного состояния в тесте принудительного плавания (модель стресс-индуцированного «поведенческого отчаяния» по Порсолту).

6. Изучить эффекты ингибитора ПЭП 7-Ме1;-Ргс1-Ы в условиях его острого введения на депрессивно-подобное поведение и активность ПЭП и ДП-1У в структурах мозга крыс на модели стресс-индуцированного «поведенческого отчаяния» по Порсолту.

7. Провести сравнительный анализ изменения активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-1У в структурах головного мозга крыс и эффектов ингибитора ПЭП 2-Ме1-Ргс1-К на двух моделях экспериментальных депрессивных состояний. Научная новизна. Впервые выявлено повышение активности пролинспецифических ферментов ПЭП и ДП-1У во фронтальной коре мозга и стриатуме крыс на модели дофамин-дефицитзависимого МФТП-индуцированного экспериментального депрессивного синдрома и модели стресс-индуцированного депрессивно-подобного состояния в тесте принудительного плавания по Порсолту. Обнаружено, что синтетический неконкурентный ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин проявляет свойства антидепрессанта на обеих моделях, нормализуя поведение животных и активность ПЭП и ДП-1У в структурах мозга. На модели МФТП-индуцированного экспериментального депрессивного синдрома этот ингибитор проявляет свойства антидепрессанта в условиях' его субхронического введения . по разным схемам, подавляя признаки депрессивно-подобного состояния у крыс с выраженным депрессивным синдромом или предотвращая формирование ряда симптомов депрессивного синдрома у животных. На данной модели впервые обнаружено анксиолитическое и антистрессорное действие бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина. Антидепрессантное действие синтетического конкурентного ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-аланил-пролина на модели МФТП-индуцированного депрессивного синдрома было, менее выражено, чем действие бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина и проявлялось в период восстановления поведенческой активности после отмены МФТП.

Теоретическая и практическая значимость. Факт повышения активности пролинспецифических ферментов ПЭП и ДП-1У на этиологически различных моделях депрессивно-подобного состояния свидетельствует о том, что эти пептидазы. участвуют в механизмах развития депрессивных расстройств, что расширяет существующие представления о патогенезе аффективных нарушений. Данные о том, что синтетический неконкурентный ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин на разных экспериментальных моделях депрессии проявляет свойства антидепрессанта, нормализуя при этом повышенную активность пептидаз в структурах мозга, свидетельствуют в пользу существования общих механизмов в развитии депрессивных расстройств различной природы. Сравнительный анализ двух ингибиторов ПЭП с различным механизмом действия показал, что неконкурентный ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин более эффективен как антидепрессант, чем конкурентный ингибитор бензилоксикарбонил-аланил-пролин и обладает более широким спектром действия. Полученные результаты открывают перспективы поиска новых препаратов для комплексной патогенетической терапии депрессивных расстройств различной этиологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Развитие депрессивного состояния у крыс на экспериментальных моделях дофамин-дефицитзависимого МФТП-индуцированного депрессивного синдрома и стресс-индуцированного «поведенческого отчаяния» сопровождается повышением активности пролинспецифических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV во фронтальной коре мозга и стриатуме.

2. Синтетические ингибиторы пролилэндопептидазы с разным механизмом действия бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин и безилоксикарбонил-аланил-пролин проявляют свойства антидепрессантов на экспериментальных моделях депрессивного состояния у крыс.

3. Антидепрессантное действие ингибитора пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина в условиях его предварительного введения сопровождается предотвращением повышения активности пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV в структурах мозга крыс на моделях депрессивного состояния различной этиологии.

Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), на научной конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС» (Пенза, 2006), на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), на XVI Всероссийской конференции «Нейроиммунология» «Нейроимидж» и научно-практической конференции неврологов (Санкт-Петербург, 2007), на XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), на III Съезде фармакологов России «Фармакология — практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на XIV Всемирном конгрессе по психиатрии (Чешская республика, Прага, 2008), на 24 Конгрессе Европейского Колледжа по нейропсихофармакологии (Франция, Париж, 2011).

выводы

1. На модели дофамин-дефицитзавиеимого экспериментального депрессивного синдрома у крыс, вызванного введением пронейротоксина МФТП (20 мг/кг, в течение двух недель), показано, что развитие симптомов депрессивно-подобного состояния — снижения уровня жизненно важных мотиваций, агедонии в тесте предпочтения сахарозы перед водой, «поведенческого отчаяния», биоритмологических нарушений в тесте принудительного плавания - сопровождается повышением активности пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV во фронтальной коре мозга и повышением активности пролилэндопептидазы в стриатуме.

2. Синтетический неконкурентный ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин при субхроническом внутрибрюшинном введении в дозе 3 мг/кг (в течение второй недели введения МФТП) подавлял проявление основных симптомов МФТП-индуцированного депрессивного синдрома у крыс -агедонии, «поведенческого отчаяния», биоритмологических нарушений, а также способствовал восстановлению массы тела животных, то есть проявлял свойства антидепрессанта.

3. Синтетический конкурентный ингибитор ПЭП бензил оксикарбонил-аланил-пролин при субхроническом внутрибрюшинном введении в дозе 3 мг/кг (в течение второй недели введения МФТП) не оказывал существенного влияния на течение МФТП-индуцированного депрессивного синдрома у крыс, однако, после отмены МФТП способствовал более быстрому устранению агедонии в тесте предпочтения сахарозы перед водой, а также нормализации уровня питьевой мотивации, показателей плавательного поведения и массы тела животных. Данные свидетельствуют о наличии у бензилоксикарбонил-аланил-пролина свойств антидепрессанта.

4. Ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин при субхроническом внутрибрюшинном введении в дозе 1 мг/кг (в течение двух недель введения МФТП) предотвращал развитие симптомов депрессивного синдрома в тесте принудительного плавания. Ингибитор препятствовал нарастанию тревожно-фобического уровня у крыс, а также предотвращал снижение относительной массы одного из стресс-компетентных органов - тимуса. Данные свидетельствуют о наличии у этого ингибитора антидепрессивного, анксиолитического и антистрессорного действия.

5. Эффекты ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина сопровождались снижением повышенной активности ПЭП во фронтальной коре мозга, стриатуме и активности ДП-IV во фронтальной коре.

6. На модели стресс-индуцированного депрессивно-подобного состояния («поведенческого отчаяния» в тесте принудительного плавания по Порсолту) у крыс выявлено повышение активности ПЭП во фронтальной коре мозга и стриатуме и ДП-ГУ в стриатуме.

7. Ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин при остром введении в дозе 1 мг/кг предотвращал развитие «поведенческого отчаяния» и повышение активности ПЭП и ДП-1У в структурах мозга. В дозе 2 мг/кг ингибитор ПЭП не влиял на развитие «поведенческого отчаяния», однако предотвращал повышение активности ПЭП и ДП-1У в стриатуме.

8. Данные свидетельствуют о том, что повышение активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-1У во фронтальной коре и стриатуме может быть одним из патогенетических механизмов развития депрессивно-подобных состояний разной этиологии, а ингибиторы ПЭП перспективны для разработки комплексной патогенетической терапии депрессивных состояний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании проведено изучение роли пролинспецифических пептидаз мозга - пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV - в механизмах депрессивных состояний. Активность ПЭП и ДП-1У была определена в структурах мозга крыс на двух моделях депрессии - модель экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома и модели стресс-индуцированного «поведенческого отчаяния» в тесте принудительного плавания Порсолта. Эти модели различаются по своей этиологии. Фармакологическую модель МФТП-индуцированного депрессивного синдрома по характеру развития депрессивной симптоматики в поведении на фоне дефицита ДА-ергической передачи в ЦНС можно сопоставить с клиническим прообразом эндогенной депрессии, тогда как стресс-индуцированную депрессию по Порсолту можно сопоставить с прообразом реактивной депрессии. На этих принципиально различающихся по своему происхождению моделях мы обнаружили схожие изменения активности ПЭП и ДП-1У в структурах мозга, вклад которых в модуляцию эмоционально-мотивационного поведения не подлежит сомнению - это фронтальная кора и стриатум. Важно подчеркнуть, что на обеих моделях характер изменения активности пептидаз был схожим: выявлено только повышение активности ферментов. Можно полагать, что дизрегуляция активности ПЭП и ДП-1У в мозге является одним из патогенетических механизмов развития депрессивно-подобных состояний.

Это предположение получило экспериментальное подтверждение в экспериментах с применением ингибиторов ПЭП с разным механизмом действия - 2-Ме1>Ргс1-1Ч и 2-А1а-Рго-ОН. Оба эти ингибитора нормализовали поведение животных. г-Ме^Ргё-К на обеих моделях подавлял повышенную активность пролинспецифических пептидаз в структурах мозга. Нами было обнаружено, что 2-Ме1;-РгсЫ\[ проявляет также анксиолитическое и антистрессорное действие, предотвращая повышение тревожно-фобического уровня и снижение относительной массы одного из стресс-компетентных органов — тимуса у крыс. По-видимому, ингибиторы ПЭП обладают широким спектром действия.

Известно, что развитие депрессии часто сопровождается когнитивными нарушениями (Lockwood К. et al., 2000; Avila R., Bottino C.M., 2006). Ноотропное действие выявлено у многих ингибиторов ПЭП, в частности, ингибиторы ПЭП Z-Met-Prd-N и Z-Gln-Prd-N, нормализуя активность ПЭП на экспериментальных моделях амнезии, эффективно восстанавливали способность к обучению у крыс (Назарова Г.А. и др. 2007; Назарова Г.А. 2008). Можно предположить, что другие ингибиторы ПЭП, помимо Z-Met-Prd-N, например, Z-Gln-Prd-N, также будут обладать свойствами антидепрессантов.

Важно, что новые синтетические ингибиторы ПЭП по данным настоящего исследования (см. гл. «Результаты исследования») и известные ингибиторы ПЭП по данным литературы (Morain Р. et al., 2000) обладают лишь незначительным побочным действием в сравнении с известными антидепрессантами, что повышает интерес к продолжению исследований в этом направлении.

В настоящее время нет ясности в отношении механизмов антидепрессантного действия ингибиторов ПЭП, однако на основании данных литературы (см. «Обзор литературы») с высокой вероятностью можно предполагать, что повышение активности ПЭП и ДП-IV в структурах мозга взаимосвязано с изменением функции тех систем организма, для которых подтверждено их участие в патогенезе депрессий.

Дальнейшее изучение новых ингибиторов ПЭП расширят существующие на сегодняшний день представления о спектре их действия и, возможно, создаст основу для выделения этих веществ в новую подгруппу антидепрессантов, перспективных для включения в комплексную патогенетическую терапию депрессий разной этиологии.