Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение бронхолитической активности химических модуляторов окислительно-восстановительных процессов

На правах рукописи

ПРОСКУРИНА Оксана Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ БРОНХОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ МОДУЛЯТОРОВ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□ил А •

Москва, 2007 г

003174019

Работа выполнена в ОАО "Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ" (г Старая Купавна) и в Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН (Москва)

Научный руководитель доктор медицинских наук,

профессор, академик РАЕН И Е Ковалев

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор В Л Ковалева

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор Б С Утешев

доктор медицинских наук, ИД Ионов

Ведущая организация Московский медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится 13 ноября 2007 г в 10 30 час на заседании диссертационного совета Д 217 004 01 в ОАО " Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ" (142450, Московская обл , Ногинский р-он, г Старая Купавна, ул Кирова, д 23)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО "Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ" (г Старая Купавна)

Автореферат разослан «_»_2007г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Л В Корольченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бронхиальная астма (БА) относится к одной из наиболее сложных проблем современной медицины Для этого заболевания характерно неуклонное прогрессирование процесса с возможным развитием летального исхода (Чучалин А Г , 2000, Cserhati Е , 2004, Han Р , 2004, Milgrom Н , 2004)

Распространенность бронхиальной астмы значительно возросла в последние три десятка лет, по данным ВОЗ, она относится к числу наиболее распространенных болезней человека на сегодняшний день число болеющих БА составляет около 300 млн человек (World Health Organization, 2006) В детской популяции БА самое частое хроническое заболевание (American Thoracic Society, 2005)

В последние годы достигнут значительный прогресс в фармакотерапии бронхиальной астмы в целом, однако проблема успешного лечения этого заболевания далеко не решена в полной мере (Barnes Р J, 2004, Waikart L , 2004, Slominski JM, 2004, Nunes de Melo M , 2004, Siroux V , 2004) В соответствии с рекомендациями G1NA для купирования спазма бронхов и обеспечения нормальной проходимости дыхательных путей применяются две основные группы лекарственных препаратов противовоспалительные средства (ингаляционные и системные глюкокортикостероиды, препараты кромолинового ряда) и бронходилятаторы (Р2-адреномиметики, М-холинолитики, спазмолитики миотропного действия) (Чучалин АГ, 1997, O'Bryne Р М, 1997) Однако их использование во многих случаях не предотвращает развитие финальной стадии аллергического воспаления дыхательных путей - необратимой обструкции бронхов (Чучалин А Г, 1998, Ковалева BJI, 1995), и кроме того, эти препараты имеют серьезные побочные эффекты (Чучалин А Г , 2000)

Несмотря на расширение современных представлений о механизмах формирования БА, многие аспекты патогенеза остаются малоисследованными Согласно современным представлениям, болезнь определена как хроническое, вне зависимости от степени тяжести, воспалительное заболевание дыхательных путей, протекающее при участии эозинофилов и других клеток иммунной системы Эксперты, составляя проект GINA, поддержанный как официальный документ ВОЗ, подчеркнули, что человек, страдающий бронхиальной астмой, может находиться в состоянии стойкой ремиссии, но у него остаются морфологические признаки воспаления (Чучалин АГ, 2005, Дрынов ГИ, 2003, Barnes Р J, 2004, Milgrom Н, 2004)

В настоящее время в литературе широко обсуждается вопрос о значении оксида азота (NO) в патогенезе БА (Barnes Р J, 1996, Khantonon S , 1997) Как недостаток, так и избыток NO могут нарушать процессы регуляции тонуса гладкой мускулатуры бронхов, мукоцилиарного клиренса и оказывать

провоспалителыюе и бронхоконстрикторное действие (Freem an В А, 1995) С нарастанием длительности и тяяести процесса увеличивается число эпителиоцитов, вырабатываю щ их NO-синтазу Секреция N0 эпигелиоцитами бронхов в условиях воспаления направлена прежде всего на защ иту организма, но его избыточное количество наруш ает работу ресничного аппарата клеток Согласно литературным данным, релаксирую щ ее влияние №)на гладкие миоцитыпроисходит через активацию растворимой гуанилатциклазы (ГЦ) плазмэлемиыи синтеза вторичного посредника - циклической ГМ Ф (цГМ Ф ) Избыточное накопление NO в результате экспрессии iNOS может оказывать опосредованное констрикторное воздействие через активацию сосудистой проницаемэсти и появления воспалительного отека в результате накопления свободных радикалов и увеличения продукции провоспалительных простагландинов (Nj kam р F Р , 1994) Кромг того, однимю ваяизйш их звеньев патогенеза БАявляется наруш ение процессов обеспечения кислородом и его производными физико-химических биологических процессов организма, т е окислительно-восстановительных процессов (Ковалев И Е , 1999, Rahm an I , 2000, Reynaert NL , 2005)

Hi основании выш еизлояенного очевидна необходимэсть развития нового направления в поиске бронхолигических средств, базирую щ ееся на использовании фаршкологических вещ еств, обладаю щ их как прямьм бронхолигичес ким действием (Bousquet J , 1996, Murray J , 2004), так и способностью мэдулировать окислительно-восстановигельньЕ процессыв организме (Ковалев И Е , 1 999, Пирузян Л А , 2000)

Ц ель и з а д а ч и исследования

ОзновноИ целью настоящ его исследования явилось изучение бронхолитической активности на неделях бронхоспазш i n vi t го и i n vi vo вещ еств, обладаю щ их окислительно- восстановительнкм потенциалом и модуляторов активности NO-синтезы Дня достижения цели были поставлены следую щ ие основные задачи

1 Изучить на моделях гистамин-, ацетилхолин- и антиген-индуцированной контрактуры гладких мыл ц изолированной трахеи шрекой свинки in vitro бронхорасш иряю щ ие свойства метиленового синего как классического модулятора окислительно-восстановигельньк процессов и ингибитора N3 с инт а з ы

2 Исследовать бронхопротективную активность этиленового синего на мэдели гистамин-индуцированного бронхоспазш in vivo

3 Изучить броихолитическую и бронхопротективную активности на моделях бронхоспазма in vitro и in vivo нейролептика аминазина -производного фенотиазина и ингибитора NO-синтазы

4 Изучить бронхорасширяющую активность антибиотика доксорубицина - модулятора активности NO-сшггазы

5 Исследовать броихолитическую активность на моделях бронхоспазма модуляторов окислительно-восстановительных процессов с антиоксидантными свойствами - изатина и карнозина

6 Изучить бронхорасширяющие свойства веществ, обладающих редокс-псггенциалом - байкалина и шлемника байкальского

Научная новизна и теопетическая ценность

В представленной работе на экспериментальных моделях бронхоспазма m vitro и m vivo впервые показаны бронхорасширяющие свойства веществ, обладающих окислительно-восстановительным потенциалом - метиленового синего, аминазина, доксорубицина, изатина, карнозина и шлемника байкальского

Впервые продемонстрирован выраженный бронхорасширяющий и бронхопротективный эффекты метиленового синего - классического модулятора редокс-потенциала и ингибитора NO-сиш-азы Выявлено бронхолитическое и бронхопротективное действие у нейролептика аминазина

У карнозина впервые обнаружен значительный протективный эффект в отношении гистамин-индуцированного и анафилактического бронхоспазма

Практическая ценность

Проведенные исследования дают возможность рассматривать вещества с окислительно-восстановительными свойствами и ингибиторов NO-синтазы как перспективные для дальнейшего изучения в качестве потенциальных препаратов для лечения бронхообструктивного синдрома при БА, ХОБЛ и других обструктивных заболеваниях дыхательных путей

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на лабораторной конференции лаборатории отдела фармакологии ОАО "ВНЦ БАВ" (г Ст Купавна, 2002, 2005, 2006, 2007), на лабораторной конференции лаборатории теоретических основ иммунофармакологии (Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН) (Москва, 2002, 2004), на заседаниях ученого совета Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН (Москва, 2002, 2004), на IX Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2002)

Публикация результатов исследования Материалы диссертации отражены в 11 публикациях

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 115 страницах машинописного текст н состоит нз обжей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 226 источников, в том числе 59 отечественных и 167 иностранных. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками л документирована 12 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с задачами дайкой работы мы провели фармакологическое исследование веществ, обладающих окислительно-восстановительным потенциалом,

Исследуемые вещества

Исследуемое вещество Химшсская формула

Метипеиовый синий г и а • зн;о

Бриллиантовый синий О . - ✓-■У" Х^1 V --1 V

Аминазин сн,

Доксорубицина гидрохлорид II QÍI í ^ ОХХ> ОМе 0 ÓH О ,-о /ен} 4J Otis .. /

Изатин ^QCSvi; СЦт^ОН н 1 11

Карнозин ^^-CHpCHCOOil J \/H NH С—О 1 CHjC HjNH¡

Байка лин }-< jfn > ........r?:/J

В качестве препаратов сравнения использовали субстанции традиционных бронхолитиков - сальбугамола сульфата (селективный р2-адреиомиметик) и теофиллина (ингибитор фосфодиэстеразы цАМФ).

В экспериментах были использованы 110 морских свинок обоего пола массой 400-600 г.

Животные содержались в стандартных условиях вивария ВНЦ БАБ при 12-часовом режиме освещения, доступ к воде и корму - ad libitum.

Для достижения решения поставленных задач использовали модели бронхошазма in vitro и in vivo.

Экспериментальные исследования проведены. в соответствии с Методическими указаниями по изучению бронх шптгическ их средств (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005) и этическими требованиями по работе с лабораторными животными.

При исследовании in vitro использовали модели гистамин- и ацетилхолин-индуцированных контрактур гладких мышц изолированной трахеи неиммунизированной морской свинки по Blattner R (1980) Сокращения гладкомышечного препарата (ГМП) вызывали добавлением в среду инкубации гисгамина (Sigma) или ацетилхолина (Sigma) в концентрации 10'5-10~б М Через 30-60 сек регистрировали максимальную амплитуду сокращения гладких мышц И после того, как амплитуда достигала плато, в ванночку добавляли исследуемые вещества в концентрациях 10'12-104 М кумулятивно или однократно в одной из концентраций в объеме 0,1 мл Для оценки превентивного действия тестируемых веществ исследуемые вещества вносили в инкубационную среду за 15 минут до введения бронхоконстриктора

Метод активной иммунизации морских свинок Морских свинок обоего пола активно иммунизировали по методу Р Andersson однократным введением смеси антигена (АГ) с адъювангом - 10 мкг овальбумина (OA) (Sigma) и 100 мг гидроокиси аллюминия (А1(ОН)3) на свинку в объме 1 мл -по 0,2 мл внутримышечно в оба бедра и 0,6 мл внутрибрюшинно Период иммунизации продолжался 30-40 дней Модель ангаген-индуцированной контрактуры гладких мышц изолированной трахеи морской свинки по Koda et al (1970) создавали на предварительно сенсибилизированных морских свинках Величину индуцированной овальбумином контрактуры сравнивали с величиной сокращения, вызванного гнетам ином (10"' М) Амплитуда сокращения, вызванного OA, должна составлять не менее 80% от амплитуды сокращения, вызванного гистамином

Эффект исследуемых веществ оценивали по степени расслабления ГМП трахеи и выражали в процентах относительно амплитуды максимального сокращения гладких мышц Строили кривую «концентрация - эффект» и определяли графически 1С50 по методу Лигчфильда и Вилкоксона (Беленький М Л,1963)

Модель гистамин- и антиген-индуцированного бронхоспазма m vivo у ненаркотизированной морской свинки (во втором случае использовали сенсибилизированных морских свинок) В эксперименте использовали морских свинок обоего пола массой 400-600 г Ненаркотизированным морским свинкам при помощи небуляйзера (фирмы PARI) вводили ингаляционно раствор гистамина (Sigma) в дозе 500 мкг/кг или раствор овальбумина (Sigma) в дозе 3 мг/кг Время экспозиции бронхоконстриктора для каждого животного индивидуально до наступления бронхоспазма В развитии бронхоконстрикторной реакции у морских свинок выделяли 2 фазы 1) острая фаза (положение морской свинки на боку, дыхание глубокое, частота дыхания - 10-15 в мин), 2) подострая (положение сидячее, усиление работы всех вспомогательных мышц трудной клетки, учащенное дыхание -40-50 в мин) Тестируемые вещества, растворенные в физиологическом растворе, вводили в разных дозах в виде аэрозоля при помощи небуляйзера в объеме 1 мл в течение 3 минут Эффект воздействия вещества оценивали по

длительности (секунды) и выраженности бронхоспастической реакции животного в сравнении с контрольной группой

Статистическая обработка полученных результатов Полученные в каждой серии экспериментов результаты обрабатывали методами вариационной статистики с применением стандартного пакета программ "Ms ЕхеГ 2003" на ЭВМ IBM- Pentium II Использованные приемы дали возможность определить достоверность различий и сходство результатов исследований, сгруппированных по отдельным признакам Для этого вычисляли среднюю арифметическую (М), стандартную ошибку средней арифметической (ш) и достоверный интервал при заданном уровне вероятности Достоверность различий или сходство результатов исследований оценивали при анализе "нулевой гипотезы" с помощью рангового U-критерия Вилкоксона (Мана-Уитни) (Гублер Е В , 1970)

Все цифровые материалы оформлены в виде таблиц и графиков с помощью прикладного пакета "Microsoft Graph" в программном продукте "Microsoft Office 2003"

Результаты собственных исследований и их обсуждение

1. Изучение бропхорасширяющей активности метиленового синего, бриллиантового синего и синего Эванса на моделях бронхоспазма in vitro и in vivo

Метиленовый синий используется в фармакологических исследованиях как выраженный модулятор окислительно-восстановительных процессов и ингибитор NO-синтазы NO увеличивает образование цГМФ через активацию растворимой гуанилагциклазы, которая в свою очередь активирует Са2+ АТФ-азу, что способствует снижению содержания внутриклеточного Са2+ и обеспечивает релаксацию гладких миоцитов сосудов и сокращение миоцитов бронхов Однако бронхолитические свойства МС мало изучены Задачей первого этапа исследования было выяснить, обладает ли метиленовый синий, являющийся классическим модулятором окислительно-восстановительных процессов и ингибитором NO-сшггазы, бронхолитической активностью на моделях in vitro и in vivo, а также протестировать на моделях бронхоспазма in vitro другие красители -бриллиантовый синий и синий Эванса В гистохимии голубой краситель Эванса применяется для прижизненного окрашивания мукополисахаридных комплексов (Gerch I , 1949, Cachpole 1, 1950) У синего Эванса, как и у метиленового синего, была выявлена иммунофармакологическая активность оба вещества активировали бласттрансформащпо лимфоцитов человека (Пирузян Л А , 2000)

В качестве препаратов сравнения были использованы субстанции традиционных бронхолитиков, предназначенных для купирования бронхообструктивного синдрома - сальбутамола сульфата и теофиллина

1 1 Изучение in vitro бронхорасширяющей активности метиленового синего, бриллиантового синего и синего Эванса на моделях контрактуры гладких

мышц изолированной трахеи морской свинки._индуцированной

гистамином. ацетилхолином и овапьбумином

Как показано на рис 1, внесение МС в ванночку в очень низких концентрациях (Ю'п - 1011 М) вызывало расслабление гистамин-индуцированной контрактуры При этих концентрациях наблюдалось снижение амплитуды сокращения гладких мышц она составила в разных опытах 15-24% от контроля С дальнейшим увеличением концентрации МС в инкубационной среде расслабление гладких мышц трахеи усиливалось прямо пропорционально увеличению ее концентрации Среднеэффективная концентрация для МС составила 5 х 10'8 М

Другой краситель - бриллиантовый синий - также проявляет способность расслаблять контрактуру гладких мышц трахеи, вызванную гистамином Динамика расслабления гладких мышц в зависимости от концентрации была аналогичной таковой у МС, но среднеэффективная ингибирующая концентрация была ниже - 8 х 105 М Краситель Эванса не влиял на величину амплитуды ГМПТ, следовательно, не проявлял бронхолитических свойств

Среднеэффективная ингибирующая концентрация препаратов сравнения составляла для сальбутамола 5 х Ю'10 М, а для теофиллина- 10"4М

При однократном введении на высоте гистамин-индуцированной контрактуры метиленовый синий в концентрации 104 М тормозил сокращение в среднем на 83,8 %, в то время как бриллиантовый синий в этой же концентрации не оказывал расслабляющего действия на изолированную трахею морской свинки

Для того чтобы выяснить, взаимодействуют ли исследуемые вещества с Hl-гистаминовыми рецепторами, была проведена серия экспериментов, в которых вещества добавляли в инкубационную среду за 15 минут до введения гистамина

Выявлено, что, метиленовый синий уже в концентрации 10"6 М тормозил гистамин-индуцированную контрактуру, т к полностью предотвращал развитие бронхоспазма, что позволяет говорить о его взаимодействии с Hl-гистаминовыми рецепторами В отличие от метиленового синего бриллиантовый синий и синий Эванса при превентивном введении не вызывали изменения амплитуды сокращения ГМП изолированной трахеи

С Р- - -О

0 >

■

> & >

Я'"

/ /

-1—

-12 -11 .10-9-8-7 -6 -5 Концентрация вещес?еа> М

— -0- — Гйетиленовый синий - - Я- - -Бриллиантовый синий

""'ii 'Синий Эванса — ♦ Сэльбутэмол

— ■ — -Теофнллин

Рис, 1, Влияние метиле нового синего, брилп иант ового синего и синего Эванса на гнетам ин-г wdyiptpoeau ну to контрактуру изолированной трахеи негшмунизированной морской свинки in vitro (кумулятивное введение)

Далее мы ионытллисъ выяснить, влияют ли изучаемые вещества на холинергические структуры бронхов.

Для этото использовали модель а цетилхолин-индуцированной кошрактуры изоли ром иной трахеи морской свинки. Показано, что метиленовый синий и бриллиантовый синий как при кумулятивном введении, гак при »¡ведении за 15 минут до бронхоконстриктора не проявили бронхшштичесшй активности, л то врем» как препараты сравнения сальбутамол и теофшишн эффективно иншбирокали сокращение ГМП изолированной чрахсм (1С50 И)"" М и 10"4 М, соответственно).

Таким образом, в отличие от известных бронхолитиков метиленовый синий и бриллиантовый синий не и:;аимо действовали с М-холиноредепторами. Па основании этих результатов можно говорить о разных механизмам действия традиционных брокхожгеиков (сальбутамола и теофиллина) и исследуемых не шести.

При исследовании влияния метилепового синего на контрактуру ГМП трахеи сенсибилизированной морской свинки, вызванную ов альбумином, было обнаружено, что препарат при введении на высоте контрактуры не оказывал расслабляю щето влияния на ГМП шогшрешткой трахеи морской свинки, в отличие от препаратов сравнения - садьбутамола сульфата и теофиллина, среднее ффектинная изггибирующая концентрация которых составила 1,3XIО"12 М и 8X10"6 М, соответственно. Однако в случае Превентивного введения метиленовый синий не уменьшает амплитуды

сокращения трахеи, но способствует ее быстрому расслаблению. При введении как на высот« антиген-индуцированной контрактуры, так и предварительном введении у бриллиантового синего янгабиругощего эффекта выявлено не было.

1.2 Изучение бронхо расширяю щей активности метиленового синего на модели гиста ми! I- аил.унир о ва иного броцхоснязма ш утуо у ненаркотизиромниой морской свинки

Т.к. метиленовый синий проявил активность ¡й \'Нто, подставилось целесообразным его Исследование на модели гисгамин-индуцирование го бронхоспачма т \1\'о, дающей представление о механизмах опосредованного влияния в условиях целого организма на бронхоепастические реакции.

Как показано на рис. 2, у морских свинок, получавших МС в виде аэрозоля, острая фаза бронхосиазма вообще не была отмечела, у частя животных наблюдалось лишь небольшое учащение дыхания (подострая фаза), которое нормализовалось в среднем через 90 сек., тогда как в контрольной гр}ти7е у животных резко вьраженная отдьглжп (острая фаза) после аэрозольного воздействия гистамина продолжалась 89,16±11,2 с, а длительность по дострой фа:зы бронхоконстрикторной реакции составляла 55.5,3±45,5 с. Следовательно, МС при аэрозольном введении в дыхательные пути в дозе 0,5 мг/кг оказывал значительный бропхопротсктквный эффект.

Острая фаза Подострая

фааа

L"J Контрольная группа в Мотипвновый схнии

Рис, 2. Влияние метиленового синего (0,5 мг/кг) ла гистамин-индуцированный бронхоспазм in vivo у не наркотизированной морской свинки

Таким образом, в условиях модели шегамин-индуцированной контрактуры гладком ышечного препарата изолированной трахеи in vitro метиленовый синий и бриллиантовый синий, в отличие от голубого красителя Эванса, вызывали выраженный дозозанисимый бронхорасширяющий эффект. При этом по указанной активности

метиленовый синий и бриллиантовый синий при тестировании их активности в условиях данной модели бронхоспазма m vitro превосходили теофиллин, но уступали сальбутамолу На основании полученных результатов, можно предположить способность метиле нового синего взаимодействовать с Н1-гистаминовыми рецепторами Однако ни метиленовый синий, ни бриллиановый синий не оказывали влияния на холинорецепторы На модели гистамин-индуцированного бронхоспазма in vivo в условиях целого организма метиленовый синий проявлял выраженный протективный эффект

2. Изучение бронхорастиряющей активности нейролептика аминазина

Аминазин как объект изучения был выбран на основании его структурного сходства с эталонным модулятором окислительно-восстановительных процессов - метиленовым синим (Fratelli М, 1995)

Аминазин широко известен в медицине как нейролептическое, психотропное, седативное, миорелаксируюгцее средство, обладающее антигистаминной и М-холинолитической активностью (Машковский М Д, 2005) Кроме того, для нас представляют интерес литературные данные о том, что аминазин является ингибитором NO-синтазы (Bosch-Morell F, 2002, Fratelli М, 1995, Palacios М, 1993) Установлено, что аминазин снижает накопление цГМФ и влияет на растворимую гуанилатциклазу (Fratelli М, 1995) Ранее было обнаружено, что нитропруссид натрия и другие соединения, активирующие растворимую форму гуанилатциклазы, оказывают мощное расслабляющее действие на гладкомышечные клетки дыхательных путей экспериментальных животных in vitro (Gruetter, 1994) Показано, что активация растворимой гуанилатциклазы активирует Са2+-АТФ-азу, что способствует снижению содержания внутриклеточного Са2+ (Невзорова В А, 1997) В связи с этим нельзя не упомянуть "кальциевую гипотезу" гиперреактивности дыхательных путей (Чучалин А Г, 1997) Согласно этой гипотезе ионы Са2+ играют ключевую роль в процессе секреции гормонов, нейропептидов сокращения гладкой мускулатуры дыхательных путей, реакции хемотаксиса клеток, ответственных за формирование воспалительной реакции Изменение внутриклеточной концентрации Са2+ может приводить к нарушениям в этих процессах при БА (Middleton Е, 1984, Баранова М А , 1991) Хотя в литературе есть сведения, что аминазин обладает антигистаминной активностью, мы не нашли убедительного экспериментального подтверждения влияния аминазина на бронхоспастическую реакцию

Вышесказанное и определило одну из задач исследования, а именно, исследование нейролептика аминазина на моделях бронхосгазма m vitro и in vivo

2 1 Изучение ш vitro бронхорасширяющей активности аминазина на моделях контрактуры гладких мышц изолированной трахеи морской свинки, индуцированной гистамином. ацегилхолином и овальбумшюм

Показано, что аминазин на модели гистамин-индуцированной контрактуры ГМПТ морской свинки при однократном введении на высоте сокращения в концентрации Ю4М вызывал 100 % расслабление в среднем за 9,6 минут, а в концентрации 10'5 М полное расслабление сокращения наблюдалось за 18 минут В более низких концентрациях расслабляющего эффекта не наблюдалось

В условиях предварительного введения аминазин в концентрации 10'4 М ингибировал развитие сокращения изолированной трахеи морской свинки в среднем на 95,30±2,71 % Следует отметить, что повторные введения гистамина в инкубационную среду на протяжении нескольких часов не вызывали развитая сокращения ГМП изолированной трахеи независимо от способа введения аминазина (таб 1) Таким образом, можно предположить, что аминазин, взаимодействуя с Н1-гистаминовыми рецепторами, длительное время остается связанным с ними

Таблица 1

Влияние аминазина на гистамин-индуцированную контрактуру ГМП

Торможение сокращение ГМП трахеи, %

до введения исследуемого препарата (фоновые показатели) через 15 минут после введения исследуемого препарата через 1 час после введения препарата (ГМПТ отмыт)

Физ раствор 0±0 0±0 0±0

Аминазин 10"4М 0±0 95,3±2,7 100±0

Аминазин по эффективности бронхолитического действия на модели гистамин-индуцированной контрактуры изолированной трахеи морской свинки при кумулятивном введении (среднеэффективная концентрация аминазина (1С30) составила 10'5 М) превосходит препарат сравнения теофиллин, ГС50 которого равна 10'4 М, но значительно уступает сальтутамолу (1С50 - 5ХЮ'10 М)

В условиях использования другого бронхоконстриктора - ацетилхолина -выявлено, что при введении на высоте сокращения ГМП трахеи морской свинки, вызванного ацетилхолином, аминазин в концентрации 10"4 М полностью расслаблял контрактуру за 9,5±0,5 минут 1С30 аминазина на модели ацетилхолин-индуцированной контрактуры составила 10"4 М Среднеэффективная ингибирующая концентрация сальбутамола и

теофиллина на данной модели составила 109 М и 10"4 М, соответствешю Анализируя полученные данные, можно говорить о том, что аминазин на модели ацетилхолин-индуцированной контрактуры ГМП трахеи уступает по эффективности препарату сравнения - сальбутамолу Несмотря на то, что и у аминазина и у теофиллина среднеэффективная концентрация одинакова (1С50 - 10'4 М), препарат сравнения более эффективен расслабляющее действие теофиллина развивается постепенно начинается в концентрации 106 М и при увеличении концентрации расслабление гладких мышц усиливалось У аминазина в концентрациях 10s-10"5 М бронхолитического эффекта не выявлено, однако при внесении в инкубационную среду 104 М наблюдалось резкое торможение сокращения ГМП трахеи

Аминазин при введении в концентрации 10"4 М за 15 минут до ацетияхолина полностью блокирует развитие контрактуры ГМП (100% торможение) Следовательно, проявляет выраженный бронхопротекгивный эффект

В условиях модели антиген-индуцированной контрактуры гладких мышц изолированной трахеи активно сенсибилизированной морской свинки (реакция Шульца-Дейла), так же, как и на других моделях бронхоспазма in vitro, аминазин оказывал бронхолитическое действие Препарат в дозе 10"4 М на высоте контрактуры вызывал торможение сокращения ГМПТ, вызванного овальбумином, на 87,2±6,93 % через 11,33±0,67 минут после внесения в ванночку При кумулятивном введении 1С50 аминазина составила 10"4 М В условиях превентивного введения на данной модели бронхоспазма аминазин тормозил развитие сокращения на 92,97±3,52%

2 2 Изучение бронхорасширяющей активности аминазина на модели гистамин-индуцированного бронхоспазма in vivo у ненаркотизированной морской свинки

У морских свинок, которым вводили аминазин в дозе 5 мг/кг ингаляционно при помощи ультразвукового небуляйзера, острая фаза на модели гистамин-индуцированного бронхоспазма in vivo не развивалась, в то время как в контрольной группе она составила 93,3± 10,1 сек, длительность подострой фазы реакции уменьшилась в 4,9 раза относительно контроля Однако при использовании аминазина в дозе 0,5 мг/кг в условиях этой модели длительность острой и подострой фаз составила 92,3± 12,4 сек и 400,0±119,3 сек соответственно, что не отличает их от показателей бронхоспастической реакции у контрольных животных, которым вводили дистиллированную воду Следовательно, бронхопротективный эффект аминазина зависит от дозы и проявляется в дозе 5 мг/кг

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод, что нейролептик аминазин обладает бронхопротективным, и в меньшей степени, бронхорасширяющим эффектом как в условиях моделирования бронхоспастической реакции in vitro, так и in vivo

3.3 Изучение бронхорасширяющей активности противоопухолевого антибиотика доксорубицина

Доксорубицин широко используется в противоопухолевой химиотерапии Является модулятором окислительно-восстановительных процессов Однако его широкое применение ограничивается дозозависимой кардиотоксичностью, которая сопровождается значительным увеличением кардиальных ферментов, свободных радикалов и NO (Abd El-Gawad H M , 2004, Aldien E, 2002) В последнее время показано, что доксорубицин вызывает дозозависимое увеличение активности NO-синтазы и уровня нитрита, являющегося метаболитом NO (Kondakova IV , 2004, Mohamed H E , 2004, Fadilhoglu E , 2003, Aldien E , 2002)

Мы исследовали бронхолитическую активность данного антибиотика на моделях бронхоспазма m vitro и hi vivo

3 1 Изучение бронхорасширяющей активности доксорубицина на моделях бронхоспазма in vitro у морской свинки

В экспериментах in vitro было выявлено неоднозначное влияние доксорубицина на гистамин-индуцированную контрактуру гладкомышечного препарата трахеи У части животных исследуемый препарат в дозе 10'4 M при добавлении в инкубационную среду на высоте сокращения вызывал полное расслабление изолированной трахеи за 12 минут, а у других морских свинок данного эффекта не наблюдалось Эти результаты подтвердились при кумулятивном введении доксорубицина в концентрациях 108-10'4 M у 50 % животных после добавления препарата в дозе 10'4 M наблюдалось 100 % торможение сокращения, у другой половины животных торможение было равно 0 Доксорубицин в меньших дозах (108—105 М) не влиял на бронхоспазм, индуцированный гистамином Доксорубицин уступает по эффективности препаратам сравнения - теофиллину и сальбутамолу

При предварительном введении доксорубицин в дозе 10'4 M не вызывал изменений амплитуды сокращения контрактуры по сравнению с контролем

На моделях ацетилхолин- и антиген-индуцированной контрактуры изолированной трахеи морских свинок доксорубицин не вызывал расслабления сокращения ГМП трахеи, те не оказывал бронхолитического эффекта

3 2 Изучение бронхорасширяющей активности доксорубицина на модели гистамин-индуцированного бронхоспазма ш vivo у ненаркотизированной морской свинки

Доксорубицин в дозе 5 мг/кг вводили морским свинкам ингаляционно с помощью небуляйзера в объеме 1 мл в течение 3 минут

После введения доксорубицина в дозе 5 мг/кг бронхоспастическая реакция на гистамин не отличалась от бронхоспазма в контрольной группе

Следовательно, в дозе 5,0 мг/кг доксорубицин в условиях целого организма не проявлял бронхопротективного действия

Таким образом, доксорубицин проявляет прямое бронхорасширяющее действие только в условиях гистамин-индуцированной контрактуры ГМП изолированной трахеи морской свинки, что свидетельствует о его антигистаминной активности

4. Изучение бронхорастиряющей активности изатина и карнозина

Изатин - производное индола, один из его метаболитов Изатин является ингибитором ЫО-синтазы (Ма&еш М Т, 2007, Рал^ С , 2006) Кроме того, исследования показали, что изатин способен уменьшать выработку фактора некроза опухоли (ЮТ-альфа), циклооксигенызы-2 (МаШеш М Т , 2007)

Карнозин (ЬеШ-акпуЬЬ-ЫвМте) - эндогенный дипептид гистидина Точная биологическая роль карнозина полностью не изучена, однако в нескольких исследованиях показано, что он обладает сильными свойствами антиоксиданга (вшеу У, 2006, Иакадахуа К, 2006, ВоМугеу А А, 2005, Бе^иПа N И , 2005, Но1есек V, 2004) В ходе ряда исследований было высказано предположение, что карнозин связан с ИО-синтазой и посредством ее способен снижать выработку N0 (Tomonaga Э , 2005, игагаеу А К ,1998) Кроме того, установлено, что карнозин оказывает положительное влияние на функции митохондрий после повреждающего воздействия N0 (Са1аЬгезе V, 2005) По данным экспериментов карнозин эффективно нейтрализует свободные радикалы и предотвращает повреждения белков, вызванных оксидативным стрессом (Nakagawa К, 2006, ВоШугеу А А, 2005, Уап Н, 2006, випеу У , 2006)

Показано что, изатин и карнозин обладают выраженными окислительно-восстановительными свойствами (Майав М Т, 2007, Раггщ С , 2006, ТЫо Ь Ь, 2006)

4 1 Изучение бронхорасширяющей активности изатина и карнозина на моделях бронхоспазма in vitro

Так же как и у доксорубицина, при исследовании изатина было обнаружено его неоднозначное влияние на контрактуру изолированной трахеи неиммунизированной морской свинки, индуцированную гистамином В концентрации 10'4 М у 30% морских свинок изатин вызывал расслабление контрактуры ГМП трахеи на 94,7±5,3 % за 7,8±1,2 минут, а в дозе 10"5 М -67,7±4,2 % за 12,0±1,2 минут (рис 3) IC50 изатина у этих животных составила 103 М

При превентивном внесении в инкубационную среду изатин в концентрации 10"4 М полностью (100% торможение) предотвращал развитие гистамин- индуцированного сокращения ГМП трахеи В дозе 105 М изатин

гтри введении в инкубационную среду за 15 минут до введения констриктора вызывал торможение сокращения на 42,7 %.

В условиях ацетилхолин- и антиген-инду цироваиной контрактуры гяадкомьпщчнето препарата изолированной трахеи морской свинки изатин бр он хора и ширяющей активности не проявлял.

У карнозина на моделях гнетам ин-, ацетилхолин и антигся-инАудированной контрактуры Г'МП изолированной трахеи морской свинки бронхо логического эффекта не было обнаружено.

К Контроль И Изатин (-4) 0 Изатин (-5) Е Изатин {-в)

Рис. i. Дтозависимый протекшивньш эффект изатина (модель гистамин-ипдуциротнпеш контрактуры изолированной трахеи неиммунизироваиной морской свинки in vitro (однократное введение))

4.2. Изучение бронхорасширяюшей активности карнозина на моделях бр онм)спазма m vivo

При исследовании карншиш условиях. Моделирования

бронхоспастической реакции m vivo, вызванной гнетами ном, было выявлено, что препарат в дозе 5,0 мг/кг при ингаляционном введении полностью предотвращал развитие бронхоеназма острая фаза бронхоспастической реакции отсутствовала (в контрольной группе острая фаза продолжалась 135,0±14,3 сек), а длительность нодострой фазы была в 8,6 раз меньше таковой в контрольной группе (45,0*28,7 сек у морских свинок, которым ингалировали карнозин в дозе 5,0 мг/кг, и 390,0±38.7 сек. у животных в контрольной труппе). При введении карнозина в дозе 0,5 мг/кг данного эффекта обнаружено не было (таб. 2).

Таблица 2

Влияние к ар Потна на гистамгщ-индуцированный брокхойпазм in vivo у ненаркомызированной морской свинки ___ _

■--^показатели труппы Время экспозиции, сек ДлЕт-егь острой фазы, сек 135Х)±Пи Длит-сть | подострой фазы,сек

Контрольная группа (диет, вода) 110,0i27,4 390,0±38,7

Карнозин, 0,5 мг/кг 110,0*27,4 136,5:17,1 402,5±35,7

Карнозин, 5.0 мг/кг 110,0±27.4 0±0 45.0±28,7 1

Аналогичный результат был получен и на модели антиген-инду дарованного фояхоспазыа т \туо, Как видно на рис. 4, кар поз ии в дозе 5,0 мг/кг при ингаляционном введении полностью предотвращал развитие бронхоспастичсской реакции. инду цир он аш юй овалъбумкном, у иммунизированных морских свинок. В контрольной группе в ответ па воздействие антигена у животных наблюдалась острая фаза бронхоспазма длительностью 29б,7±!С4,б чек, а длительность подострой фазы составила 628,3±80,6 сек. V морских свшюк, которым предварительно вводили карзюзин (дататционно) в лозе 5,0 мг/кг острая фаза отсутствовала, а общая длительность бронхосшстическоЙ реакции состарила 23,3±23,3 В дозе 0,5 мг/кг карнозин не оказывал бронхолитическо№ эффекта в условиях данной модели.

Острая Подфст Г

фазы

[ Ш^онтрояь Ц Карнозин 0,5 Hgfr И Каркозин 5,0 Mt-for|

Рис. 4. Влияние карнозина на антиген-индуцированный бронхоспазм in vivo у не наркотизированной морской свинки

Таким образом, карнозин несомненно обладает выраженной протективной активностью как на модели гистамин-индуцированного, так и на модели антиген-индуцированного бронхоспазма in vivo Следовательно, можно говорить как о бронхолитической, так и антиастматической активности карнозина Изатин проявляет бронхолитическую и бронхопротективную активность только на модели гистамин-индуцированной контрактуры ГМП изолированной трахеи морской свинки in vitro

S. Изучение бронхорасширяющей активности байкалина и шлемника байкальского

Шлемник байкальский - лекарственное растение с высокой биологической активностью, в частности противовоспалительной и антиоксидантной Байкалин - флавоноид, выделенный из Шлемника байкальского, обладающий окислительно-восстановительными свойствами, а также влияющий на выработку NO (Kim D Н , 2006, Chen J С , 2005, Zhao Y , 2006, Antoshina S V )

5 1 Изучение бронхорасширяющей активности байкалина и шлемника байкальского на моделях бронхоспазма in vitro

При однакратном введении на высоте гистаминовой контрактуры в концентрации 10"4 М и байкалин и шлемник байкалький не проявили бронхорасширяющей активности - торможение сокращения, индуцированного гистамином, было равно 0 Однако, как показано на рис 5, при кумулятивном введении в концентрациях 10'8-10"4 М у шлемника байкальского 1С so составила 10"4 М, у байкалина бронхолитического эффекта не наблюдалось При сравнительном анализе с референтными препаратами можно заключить, что шлемник байкальский сходен по бронхолитической активности с теофиллином

При превентивном введении байкалин не проявлял активности в отношении гистамин-индуцированной контрактуры ГМП трахеи В отличие от него у шлемника байкальского выявлен незначительный дозозависимый бронхопротективный эффект в концентрациях 10"4 М и 10"5 М он предотвращал развитие сокращения ГМП трахеи на 44,0±5,6 % и на 29,6±4,5 % соответственно, в дозе 10'6 М амплитуда сокращения не отличалась от контрольной (рис 6)

При исследовании байкалина и шлемника байкальского на моделях ацетилхолин- и антиген-индуцированной контрактуры ГМП бронхорасширяющего эффекта выявлено не было

Таким образом, можно говорить о том, что шлемник байкальский в отличие от байкалина обладает бронхорасширяюшей активностью на модели

гнетам mi-индуцированной хоптракгурь! ГМП изолированной трахеи ненммуниз иро в а иной морокой свинки.

-12 -11 -10 .9 -S .7 -6 -S -Л Кон центра ЦП я ващ^ств, М

—♦ - Шлемник байкальские Байкал т

'Саль5у*амол —■Х-Те^филлнн

Рис. 5. Влияние байкалина и шлемника байкальского на ¿ыстамин-индуцированную контрактуру Шжырованнай трахеи нашмунтировашюй морской свинки т Щго (кумулятивное введение.)

Рис. 6. ДозозавиышЫй протективный эффект гилемпта байкальского (модель листами)!-индуцирован ной контрактуры изолированной трахеи неиммуинзиравашой морской свинки in vitro (превентивное введение}}

aKDWTpOIlb C-UilWWUHK байкальский И)

Заключение

В настоящее время бронхиальная астма рассматривается как аллергическое воспаление легких, сопровождающееся, во-первых, окислительно-восстановительным дисбалансом, что является одной из главных причин повреждения клеток, а во-вторых, нарушением образования

оксида азота (недостаток или избыток), приводящее к бронхоконстрикции Нами в условиях моделирования бронхоконстрикции ш vitro и т vivo проведено исследование бронхолитической и бронхопротективной активности химических модуляторов окислительно-восстановительных процессов и активности N0 - синтазы, принадлежащих к различным химическим классам

Анализ экспериментальных данных показал, что вещества, обладающие окислительно-восстановительным потенциалом, и модуляторы NO-синтазы способны в той или иной степени оказывать бронхолитическое и бронхопротективное действие

В качестве основного исследуемого вещества был выбран классический модулятор окислительно-восстановительных процессов и ингибитор NO-синтазы метиленовый синий, который в условиях моделирования бронхоспазма in vitro, индуцированного гистамином, оказывал выраженное дозозависимое бронхорасширяющее действие Кроме того, установлено, что МС при превентивном введении предотвращает развитие гистамин-индуцированного бронхоспазма как на моделях бронхоспазма in vitro, так и ш vivo Следовательно, можно говорить о бронхопротективном эффекте данного исследуемого вещества Однако в отличие от традиционных бронхолитихов - сальбутамола и теофиллина - МС не оказывал расслабляющего действия на модели ацетилхолин-индуцированной контрактуры ГМП трахеи морской свинки Указанное обстоятельство свидетельствует о том, что МС, в отличие от препаратов сравнения, вероятно, не является функциональным антагонистом холинорецепторов

Другой исследуемый препарат - нейролептик аминазин, являющийся ингибитором NO-синтазы и имеющий структурное сходство с МС также проявляет выраженное бронхопротективное и бронхолитическое действие Аминазин проявляет бронхорасширяющую активность на моделях гистамин-, ацетилхолин- и антиген-индуцированной контрактуры ГМП трахеи морской свинки, однако уступает по эффективности препаратам сравнения Бронхопротективное действие препарата более выраженное, чем бронхолитическое, и проявляется на моделях бронхоспазма как in vitro, так и in vivo

Изучение антиоксидангов - изатина и карнозина, обладающих выраженными окислительно-восстановительными свойствами, показало что, изатин проявляет бронхолитическую и бронхопротективную активность только на модели гистамин-индуцированной контрактуры ГМП изолированной трахеи морской свинки Карнозин оказывает выраженную бронхопротективную активность на модели гистамин- и антиген-индуцированного бронхоспазма m vivo

Шлемник байкальский обладает бронхолитической активностью на модели гистамин-индуцированной контрактуры ГМП изолированной трахеи морской свинки У байкалина бронхолитического действия выявлено не было

К числу наиболее активных из изученных веществ можно отнести метиленовый синий, аминазин и карнозин

Большинство испытанных препаратов по активности бронхолитического действия превосходят традиционный, широко использующийся бронхолитик теофиллин, но уступают р2-адреномиметику сальбутамолу

Исходя из вышесказанного, можно утверждать, что вещества, относящиеся к модуляторам окислительно-восстановительных процессов и ингибиторы МО-синтазы, могут быть потенциальными эффективными средствами терапии бронхолегочных заболеваний

ВЫВОДЫ

1 Впервые показано, что модуляторы окислительно-восстановительных реакций проявляют бронхолитическую и бронхопротективную активность

2 Метиленовый синий и бриллиантовый синий, в отличие от голубого красителя Эванса, вызывают выраженный дозозависимый бронхорасширяющий эффект в условиях моделирования контрактуры гладких мышц изолированной трахеи морской свинки При этом по указанной активности метиленовый синий и бриллиантовый синий на модели бронхоспазма in vitro превосходят теофиллин, но уступают рг-агонисту - сальбутамолу Метиленовый синий оказывает выраженный протективный эффект в условиях целого организма на модели бронхоспазма in vivo

3 Аминазин на моделях гистамин-, ацетилхолин- и антиген-индуцированной контрактуры ГМПТ в больших концентрациях (10-4М) проявляет выраженное бронхорасширяющее и бронхопротективное действие

4 Изатин обладает бронхолитической активностью на модели гистамин-индуцированной контрактуры ГМП изолированной трахеи морской свинки

5 Карнозин проявляет выраженную бронхопротективную активность на модели гистамин- и антиген-индуцированного бронхоспазма in vivo

6 Шлемник байкальский в отличие от байкалина обладает бронхорасширяюшей активностью на модели гистамин-индуцированной контрактуры ГМП изолированной трахеи морской свинки

7 Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что вещества, относящиеся к модуляторам окислительно-восстановительных процессов, могут быть потенциальными эффективными средствами терапии бронхолегочных заболеваний

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Ковалева В Л, Разыграева О В (Проскурина О В), Ковалев И Е Фармакологические модуляторы окислительно-восстановительных процессов как потенциальные бронхолитических средств // Лекарства - человеку, Харьков, 2000 г , Т 12, N 2, С 139-145

2 Ковалева В JI, Разыграева О В (Проскурина О В), Ковалев И Е Бронхорасширяюпще свойства метиленового синего и других красителей//Хим-фарм журн 2001 Т 35 N 6 С 3-4

3 Ковалева В JI, Разыграева О В (Проскурина О В) Бронхорелаксирующие эффекты модулятора окислительно-восстановительных процессов - метиленового синего // IX Нац Конгресс Человек и лекарство, Москва, 2002 г, С 629

4 Пирузян Л А, Ковалев И Е, Ковалева В Л, Проскурина О В Новый путь поиска фармакологических средств терапии бронхиальной астмы на основе применения модуляторов окислительно-восстановительных процессов в системе цитохрома Р-450 // XI Нац Конгресс Человек и лекарство, Москва, 2004 г, С 821

5 Проскурина О В, Ковалев И Е, Ковалева В Л. Изучение бронхолитической активности веществ, обладающих окислительно-восстановительным потенциалом на модели tn vitro // XII Нац Конгресс Человек и лекарство, Москва, 2005 г, С 697

6 Проскурина О В , Ковалева В Л , Ковалев И Е , Лисицына В Б Бронхорасширяюпще и протективные свойства химических модуляторов окислительно-восстановительных процессов // Пульмонология Сборник тезисов, Москва, 2005 г, С 64

7 Проскурина О В , Ковалев И Е , Ковалева В Л Эффекты аминазина в условиях моделирования бронхоспазма in vitro и m vivo // XIII Нац Конгресс Человек и лекарство, Москва, 2006 г, С 647

8 Ковалева В Л , Небольсин В Е, Проскурина О В , Желтухина Г А , Чучалин А Г Бронходилятирующий эффект Ингамина на моделях бронхоспазма m vitro // 16 Нац конгресс по болезням органов дыхания, II Конгресс Евроазиатского Респираторного Общества, Санкт-Петербург, 2006 г С 122

9 Проскурина О В , Ковалева В Л , Ковалев И Е, Румянцева Е И Бронхорелаксирующее действие редокс-модуляторов -доксорубицина и аминазина // Экология человека, 2006, № 12 (Приложение 4/2)

10 Ковалева В Л , Скачилова С Я , Проскурина О В, Шилова Е В , Сернов Л Н Исследование бронхолитических свойств нового отечественного антиастматического средства Антиастмин // XIV Нац Конгресс Человек и лекарство, Москва, 2007 г, С 829

11 Проскурина О В , Ковалева В Л , Северина И С , Ковалев И Е Изучение бронхопротекторных свойств ингибиторов NO-сингазы и редокс-модуляторов // XIV Нац Конгресс Человек и лекарство, Москва, 2007 г, С 186

Отпечатано в полиграфическом объединении «Формат», Г Торжок Подписано в печать 8 10 2007

Тираж 50 экз Заказ 548

Актуальность проблемы

Бронхиальная астма (БА) относится к одной из наиболее сложных проблем современной медицины. Для этого заболевания характерно неуклонное прогрессирование процесса с возможным развитием летального исхода (Чучалин А.Г., 2000; Cserhati Е., 2004; Нал Р., 2004; Milgrom Н., 2004).

Распространенность бронхиальной астмы значительно возросла в последние три десятка лет; по данным ВОЗ, она относится к числу наиболее распространенных болезней человека: на сегодняшний день число болеющих БА составляет около 300 млн. человек (World Health Organization, 2006). В детской популяции БА самое частое хроническое заболевание (American Thoracic Society, 2005).

В последние годы достигнут значительный прогресс в фармакотерапии бронхиальной астмы в целом, однако проблема успешного лечения этого заболевания далеко не решена в полной мере (Barnes Р.J., 2004; Waikart L., 2004; Slominski J.M., 2004; Nunes de Melo M., 2004; Siroux V., 2004). В соответствии с рекомендациями GINA для купирования спазма бронхов и обеспечения нормальной проходимости дыхательных путей применяются две основные группы лекарственных препаратов: противовоспалительные средства (ингаляционные и системные глюкокортикостероиды; препараты кромолинового ряда) и бронходилятаторы ф2-адреномиметики, М-холинолитики, спазмолитики миотропного действия) (Чучалин А.Г., 1997; О'Вгупе P.M., 1997). Однако их использование во многих случаях не предотвращает развитие финальной стадии аллергического воспаления дыхательных путей - необратимой обструкции бронхов (Чучалин А.Г., 1998; Ковалева В.Л., 1995), и кроме того, эти препараты имеют серьезные побочные эффекты (Чучалин А.Г., 2000).

Несмотря на расширение современных представлений о механизмах формирования БА, многие аспекты патогенеза остаются малоисследованными. Согласно современным представлениям, болезнь определена как хроническое, вне зависимости от стегени тяжести, воспалительное заболевание дыхательных путей, протекающее при участии эозинофилов и других клеток иммунной системы. Эксперты, составляя проект GINA, поддержанный как официальный документ ВОЗ, подчеркнули, что человек, страдающий бронхиальной астмой, может находиться в состоянии стойкой ремиссии, но у него остаются морфологические признаки воспаления (Чучалин А.Г., 2005; Дрынов Г.И., 2003; Barnes P.J., 2004; Milgrom Н., 2004).

В настоящее время в литературе широко обсуждается вопрос о значении оксида азота (NO) в патогенезе БА (Barnes P.J., 1996; Kharitonon S., 1997). Как недостаток, так и избыток NO могут нарушать процессы регуляции тонуса гладкой мускулатуры бронхов, мукоцилиарного клиренса и оказывать провоспалительное и бронхоконстрикторное действие (Freeman В.А., 1995). С нарастанием длительности и тяжести процесса увеличивается число эпителиоцитов, вырабатывающих NO-синтазу. Секреция NO эпителиоцитами бронхов в условиях воспаления направлена прежде всего на защиту организма, но его избыточное количество нарушает работу ресничного аппарата клеток. Согласно литературным данным, релаксирующее влияние NO на гладкие миоциты происходит через активацию растворимой гуанилатциклазы (ГЦ) плазмолеммы и синтеза вторичного посредника - циклической ГМФ (цГМФ). Избыточное накопление NO в результате экспрессии iNOS может оказывать опосредованное констрикторное воздействие через активацию сосудистой проницаемости и появления воспалительного отека в результате накопления свободных радикалов и увеличения продукции провоспалительных простагландинов (Nijkamp F.P., 1994). Кроме того, одним из важнейших звеньев патогенеза БА является нарушение процессов обеспечения кислородом и его производными физико-химических биологических процессов организма, т.е. окислительно-восстановительных процессов (Ковалев И.Е., 1999; Rahman I., 2000; Reynaert N.L., 2005).

На основании вышеизложенного очевидна необходимость развития нового направления в поиске бронхолитических средств, базирующееся на использовании фармакологических веществ, обладающих как прямым бронхолитическим действием (Bousquet J., 1996; Мштау J., 2004), так и способностью модулировать окислительно-восстановительные процессы в организме (Ковалев И.Е., 1999; Пирузян JI.A., 2000).

Цель и задачи исследования

Основной целью настоящего исследования явилось изучение бронхолитической активности на моделях бронхоспазма in vitro и in vivo веществ, обладающих окислительно-восстановительным потенциалом и модуляторов активности NO-синтазы. Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить на моделях гистамин-, ацеталхолин- и антиген-индуцированной контрактуры гладких мышц изолированной трахеи морской свинки in vitro бронхорасширяющие свойства метиленового синего как классического модулятора окислительно-восстановительных процессов и ингибитора NO-синтазы.

2. Исследовать бронхопротективную активность метиленового синего в условиях модели гистамин-индуцированного бронхоспазма in vivo.

3. Изучить бронхолитическую и бронхопротективную активности на моделях бронхоспазма in vitro и in vivo нейролептика аминазина производного фенотиазина и ингибитора NO-синтазы.

4. Изучить бронхорасширяющую активность антибиотика доксорубицина - модулятора активности NO-синтазы.

5. Исследовать бронхолитическую активность на моделях бронхоспазма модуляторов окислительно-восстановительных процессов с антиоксидантными свойствами - изатина и карнозина.

6. Изучить бронхорасширяющие свойства веществ, обладающих редокс-потенциалом - байкалина и шлемника байкальского.

Научная новизна и теоретическая ценность

В представленной работе на экспериментальных моделях бронхоспазма in vitro и in vivo впервые показаны бронхорасширяющие свойства веществ, обладающих окислительно-восстановительным потенциалом - метиленового синего, аминазина, доксорубицина, изатина, карнозина и шлемника байкальского.

Впервые продемонстрирован выраженный бронхорасширяющий и бронхопротективный эффекты метиленового синего - классического модулятора редокс-потенциала и ингибитора NO-синтазы. Выявлено бронхолитическое и бронхопротективное действие у нейролептика аминазина.

У карнозина впервые обнаружен протективный эффект в отношении гистамин-индуцированного и анафилактического бронхоспазма.

Практическая значимость

Проведенные исследования дают возможность рассматргзать вещества с окислительно-восстановительными свойствами и ингибиторов NO-синтазы как перспективные для дальнейшего изучения в качестве потенциальных препаратов для лечения бронхообструктивного синдрома при ьА, ХОБЛ и других обструктивных заболеваний дыхательных путей.

выводы

1. Впервые показано, что модуляторы окислительно-восстановительных реакций проявляют бронхолитическую и бронхопротективную активность.

2. Метиленовый синий и бриллиантовый синий, в отличие от голубого красителя Эванса, вызывают выраженный дозозависимый бронхорасширяющий эффект в условиях моделирования контрактуры гладких мышц изолированной трахеи морской свинки. При этом по указанной активности метиленовый синий и бриллиантовый синий на модели бронхоспазма in vitro превосходят теофиллин, но уступают {Зг-агонисту - сальбутамолу. Метиленовый синий оказывает выраженный протективный эффект в условиях целого организма на модели бронхоспазма in vivo

3. Аминазин на моделях гистамин-, ацетилхолин- и антиген-индуцированной контрактуры ГМПТ в больших концентрациях (10-4М) проявляет выраженное бронхорасширяющее и бронхопротективное действие.

4. Изатин обладает бронхолитической активностью на модели гистамин-индуцированной контрактуры ГМП изолированной трахеи морской свинки.

5. Карнозин проявляет выраженную бронхопротективную активность на модели гистамин- и антиген-индуцированного бронхоспазма in vivo.

6. Шлемник байкальский в отличие от байкалина обладает бронхорасширяюшей активностью на модели гистамин-индуцированной контрактуры ГМП изолированной трахеи морской свинки.

7. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что вещества, относящиеся к модуляторам окислительно-восстановительных процессов, могут быть потенциальными эффективными средствами терапии бронхолегочных заболеваний.

Заключение

В настоящее время бронхиальная астма рассгатриг 1ется как аллергическое воспаление легких, сопровождающееся, во-первых, окислительно-восстановительным дисбалансом, что является одной из главных причин повреждения клеток, а во-вторых, нарушением образования оксида азота (недостаток или избыток), приводящее к бронхоконстрикции. Нами в условиях моделирования бронхоконстрикции in vitro и in vivo проведено исследование бронхолитической и бронхопротективной активности химических модуляторов окислительно-восстановительных процессов и активности N0 — синтазы, принадлежащих к различным химическим классам.

Анализ экспериментальных данных показал, что вещества, обладающие окислительно-восстановительным потенциалом, и модуляторы NO-синтазы способны в той или иной степени оказывать бронхолитическое и бронхопротективное действие.

В качестве основного исследуемого вещества был выбран классический модулятор окислительно-восстановительных процессов и ингибитор NO-синтазы метиленовый синий, который в условиях моделирования бронхоспазма in vitro, индуцированного гистамином, оказывал выраженное дозозависимое бронхорасширяющее действие. Кроме того, установлено, что МС при превентивном введении предотвращает развитие гистамин-индуцированного бронхоспазма как на моделях бронхоспазма in vitro, так и in vivo. Следовательно, можно говорить о бронхопротективном эффекте данного исследуемого вещества. Однако в отличие от традиционных бронхолитиков - сальбутамола и теофиллина - МС не оказывал расслабляющего действия на модели ацетилхолин-индуцированной контрактуры ГМП трахеи морской свинки. Указанное обстоятельство свидетельствует о том, что МС, в отличие от препаратов сравнения, вероятно, не является функциональным антагонистом холинорецепторов.

Другой исследуемый препарат - нейролептик аминазин, являющийся ингибитором NO-синтазы и имеющий структурное сходстго с МС также проявляет выраженное бронхопротективное и бронхолитическое действие. Аминазин проявляет бронхорасширяющую активность на моделях гистамин-, ацетилхолин- и антиген-индуцированной контрактуры ГМП трахеи морской свинки, однако уступает по эффективности препаратам сравнения. Бронхопротективное действие препарата более выраженное, чем бронхолитическое, и проявляется на моделях бронхоспазма как in vitro, так и in vivo.

Изучение антиоксидантов — изатина и карнозина, обладающих выраженными окислительно-восстановительными свойствами, показало что, изатин проявляет бронхолитическую и бронхопротекгивную активность только на модели гистамин-индуцированной контракгуры ГМП изолированной трахеи морской свинки. Карнозин оказывает выраженную бронхопротекгивную активность на модели гистамин- и антиген-индуцированного бронхоспазма in vivo.

Шлемник байкальский обладает бронхолитической активностью на модели гистамин-индуцированной контрактуры ГМП изолированной трахеи морской свинки. У байкалина бронхолитического действия выявлено не было.

К числу наиболее активных из изученных веществ молото отнести метиленовый синий, аминазин и карнозин.

Большинство испытанных препаратов по активности бронхолитического действия превосходят традиционный, широко использующийся бронхолитик теофиллин, но уступают р2-адреномиметику сальбутамолу.

Исходя из вышесказанного, можно утверждать, что вещества, относящиеся к модуляторам окислительно-восстановительных процессов и ингибиторы NO-синтазы, могут быть потенциальными эффективными средствами терапии бронхолегочных заболеваний.