Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изменения мембран и функции иммунокомпетентных клеток при свободнорадикальном окислении и норме и патологии

, & '3 О С о . ,

МШИСТ ЕГСТ Ю ЗДРАВООХРАНЕНИЯ' УССР КИЕВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ. АКАДЕМИКА А. А. ЮГОЮЛЬЦА

на правах рукописи

АМИНА Галина Борисовна

УДК 612.017:612.112. 94:576. 314.

2:577.12: 547. 915

ИЗМЕНЕНИЯ МЕМБРАН И ФУНКЦИИ ШЛШКЖОШШТБКТНЫХ КЛЕТОК ПРИ СВОЮД] ЮРАДИКАЛЬНОМ ОКИСЛЕНИИ В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Киев - 1991

Работа выполнена в Киевском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте им. акад. А. А. Богомольца в Научно-исследовательском лабораторном центре (зав. д. м. н.. профессор В. П. Яценко).

Официальные оппоненты: член-корреспондент АМН СССР, профессор А. А. Ярилнн

доктор медицинских паук, профессор ti.il. Лиспный

доктор медицинских наук профессор А. А. Чумак

Ведущая организация - 2-й Московский медицинский институт им. Н. И. Пирогова

ар

Защита диссертации состоится ____клХ(7<Л___1991 г.

в -13.30 на заседании специализированного совета Д 088.13. Об при Киевском медицинском институте им. акад. А. А. Богомольца (Киев, просп. Победы 34, санитарно-гигиеничесглй корпус, аудитория И 2).

Отзывы направлять по адресу: 252057, Киев-57. просп. Победы, 34, санитарно-гигиенический корпус.

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке Киевского медицинского института.

Автореферат разослан Опре

_1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

В. Г. Бордонос

i ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

^"Фатальность проблемы. Проблема направленной коррекции нарушений .„ чммунного гомеостаза одна из наиболее актуальных в совре-"ТЯЭииой^ммунологии и связана с доминированием регуляторых концепций во взглядах на развитие иммунопатологических процессов (Р. В. Петров и соавт.. 1972, 1980, 1987; А. Е Че редев в И Л. В. Ковальчук, 1981, 1988, 1990; H.A. Лебедев и соавт., 1989, 1990; А. А. Ярилин, 1988; Г. М, Бутенко, 1979; В. Benacerraf, 1980; R. К. Gershon, 1981; S.H.Snyder, 1985).

В настоящее время накоплены многочисленные данные по характеристике совокупности дефектов иммунной функции при различных заболеваниях. Однако, коррекция этих нарушений не всегда эффективна! Е. Ф. Чернушенко и соавт. , 1985; Г. К Дранник, 1989; IL M. Бережная и соавт. , 1966; А. М. Земсков, 1983; Э. В. Гюллинг, 1979; Л. R Ковальчук и А. ЕЧередеев, 1984, 1986; В. Е Bloom, 19вб; R. в. Coffey, 1985; S.'H. Polmar, 1984).

Причиной отсутствия успеха иммуномодулирущей терапии часто является недостаточность наших знаний об особенностях патогенетических механизмов, ведущих к дисбалансу иммунного гомеостаза, отсутствие должого внимания к биохимическим процессам, лежащим в основе иммунологических феноменов.

В настоящее время получены убедительные данные о влиянии физико-химического состояния мембран на Функциональную активность лимфоцитов и фагоцитов. Считается установленным, что структура и жидкофазное состояние липидной матрицы в значительной мере определяют конформацию, степень экспрессии и подвижность рецепторных образований иммунокомпетентных клеток ( Р. м. Хаитов и соавт., 1987; В. М. Freed, 1937; J.A. Hoxle, 1988). Это диктует необходимость изучения механизмов, обуславливающих изменения состава и структуры мембран лимфоцитов и клеток фагоцитарной системы. Одним из- них' является свободнорадикалыгое окисление (СРО) мембранных липидов, физиологическая роль которого в жизнедеятельности многих клеток и тканей установлена ( Ю. А. Владимиров и соавт., • 1972, 1986, 1909; Е. Б. Бурлакова и соавт. , 1979, 1980, 1984; В. 3. Ланкин, 1984, 1990; T.L. Dormridv, 1985; В. Hal 1 iwell, 1934;- J. R. üetfntr et al. , 1937; H. J.Forran et al., 1986). Однако, в системе иммунитета эти процессы изучены мало. Имеются единичные работ, сЕидетельствуюдае об участии процессов 0К> липидов мембран лимфоцитов в иммунном ответе на антигены и митопгчи, в развитии воспаления,

-г-

аутоагрессии и формировании иммунопатологических состояний. Пока-вана инициация свободнорадикальных реакций при м-таболизме антигенов и взаимодействиях "антиген-антитело" (Б. В. Пинегин и соавт.", 1985; М. И. Карсонова и соавт., 1985, 1987; И. М. Яетяев и соавт., 1988, 1989). Это Послужило основой для создания концепции о сопряженной функции иммунной и монооксигеназной ферментной системы (И. Е. Ковалев Д981). Однако, нет сведений о границах физиологического и Патологического действия СРО на иммунокомпетентные клетки, о компенсаторных возможностях последних, обеспечивавших резистентность к окисляющим воздействиям, об особенностях влияния сво-боднорадикальнЬн процессов (CPID на функциональное состояние и фенотипическую ориентацию лимфоцитов и фагоцитов. Отсутствуют данные об участии СРО в механизмах регуляции иммунного ответа и детерминации иммунных нарушений. Известно, что при действии ионизирующей радиации, гипо- и гипероксии, воспалениях и других состояниях, сопровождающихся активацией СРО в организме, наблюдается формирование иммунных нарушений (ЯНСеркиз и соавт., 1989; А. Ю. Сунгуров, 1983; А. А. Чумак и соавт., 1939, 1990; S. L. Kfeirklung, 1986; H.Sies,1985). Антирадикальные препараты, в частности супе-роксиддисмутаза, оказывают в этих случаях терапевтический эффект. Однако, сопряженность изменений в системе иммунитета с уровнем СРП в организме, в частности в мембранах иммунокомпетентных клеток, остается изученной мало. Имеются данные о иммунопротективном действии отдельных аитиоксидантов (К.Д Плецитый, 1985, 1987; 6, Chaudhri 1986), однако, целесообразность их применения и показания к назначению при иммунных нарушениях остаются неясны.

.Таким образом, изучение структуры взаимозависимых отношений уровня СРП, состояния липидного комплекса мембран, функциональной и фенотилической ориентации иммунокомпетентных клеток при иммунизации и в 'условиях формирования иммунных нарушений позволяют описать некоторые типовые признаки неизвестных ранее механизмов им-мунорегуляции и критерии их поломок, являясь вкладом в развитие теории вопроса детерминации приобретенной иммунологической недостаточности. Характеристика феноменологии взаимосвязи . мембранных процессов СРО и Функционального состояния иммунокомпетентных клеток раскрывает перспективы создания новых физиологичных способов управления иммунным ответом, учитывающих индивидуальные различия пациентов и включающих сочетанное применение иммуномодуляторов_и антиоксидантов.

Разработка данной проблемы целесообразна в медико-социальном аспекте, поскольку способствует созданию эффективных способов диагностики, лечения и профилактики иммунных нарушений при ряде заболеваний воспалительного и ишемического характера, приводящих часто к инвалидизации и смерти пациентов и сопровождающая активацией в организме СРП (Ю. А. Владимиров и соавт, ,1072, 1970, 1989; Б. Н Тарусов, 1976; И. В. Афанасьев, 1984). Повышение генерации свободных радикалов в организме является патогенетической основой радиобиологических эффектов, что придает оосбув значимость исследованиям сопряженности процессов СРО с функциональным состоянием клеток иммунной системы у лиц. получивших повышенные дозы ионизирующего облучения при ликвидации последствий аварии на ЧАЭС.

Осуществление представленной работы предусматривалось общесоюзными программами по решении важнейших проблем в области биологии и медицины, в частности, Государственной программой СССР по проблеме 00? "Диагностика и коррекция нарушений внутренней среды организма человека". Для решения этих задач в рамках научно -исследовательских разработок Киевского медицинского института тема: "Изучить функционирование мембранных структур клеток в условиях повреждения печени и сердца различного генеза н разработать принципы их направленной коррекций препаратами ангйоксидантов и модификаторов кальциевых каналов"( N ГР 0034949).

Исходя из вышеизложенного, цель представленной работы - изучить патогенетическую роль свободнорадйкальных процессов в детерминации иммунных нарушений, обосновать новые принципы иммуномоду-лирующей и антиоксидантной терапии для совершенствования методов иммунорегуляции, повышения эффективности диагностики, профилактики и коррекции иммунных нарушений.

Решение поставленной Цели определялось следующим перечнем основных задач:

- изучить в эксперименте на животных влияние СРП на состав и структуру мембран иммунокомпетентных меток, исследовать динамику СРП в липидном бислое при нормальном иммунном ответе - иммунизации различными по природе антигенами и в условиях патологии - при воспалении, инфекционном процессе, формировании ПЧЗТ действии ионизирующей радиации;

- установить последовательность, " направленность и интенсивность иммунных нарушений при активации СРП в мембранах лимфоцитов и нейтрофилов на моделях in vivo и ¡n vitro;

- исследовать особенности вваимосвязи динамики СРП, функционального состояния и рецепторного состава иммунокомлетентных клеток у больных с развитием приобретенной иммунологической недостаточности и у лиц, получивших повышенные дозы ионизирующего облучения при ликвидации последствий аварии на ЧАЗС;

- описать феноменологию взаимосвязи состояния иммунокомлетентных клеток с характером течения СРП, динамикой структуры и состава липИдного бислоя. Выявить физиологические границы и параметры Патологического действия СРО на иммунную систему и определить диагностические критерии развития вторичной иммунологической недостаточности-,

- выделить варианты преобразований рецепторного репертуара при активации СРО 6 мембранах лимфоцитов и описать некоторые типовые признаки совокупности выявленных изменений;

- обосновать научную концепцию патогенетического применения антиоксидантной терапии при коррекции иммунных нарушений и разработать новые принципа лечения приобретенной иммунологической недостаточности, путем воздействия на лшидную матрицу мембран иммунокомлетентных клеток Для нормализации ее состава и структуры. Показать эффективность сочетанного поэтапного применения иммуно-модуляторов и антиоксидантов.

Научная новизна работы. В результате проведенного исследования получены Новые данные о структуре взаимозависимых регулятор-ных отношений между СРП, состояние^ липидного комплекса мембран, функциональной и фенотипической ориентацией иммунокомлетентных клеток, что детерминирует особенности иммунного гомеостаза в нормальных физиологических условиях и при развитии патологических состояний, определяя течение, исход иммунных нарушений и эффективность иммунокоррйгирующих мероприятий. На основании корреляционно- регрессионного анализа разработана теоретическая и цифровая Модель регуляции функции иммунокомлетентных клеток в условиях иммунизации различными по природе антигенами и при развитии патологических состояний, сопровождающихся активацией в организме СРП. В их числе - введение ксенобиотика тетрахлорметана, инфекционная патология, действие различных доз ионизирующего облучения в эксперименте на животных и у пациентов, получивших повышенные дозы ионизирующего облучение при ликвидации последствий аварии на ЧА-ЭС. Выявлена совокупность информативных признаков и установлены особенности структуры взаимосвязей мевду различными параметрами

иммунного и липидного гомеостаза на уровне мембран иммунокомпетентных клеток у пациентов, получивших повышенные дозы ионизирующего облучения. Это позволило разработать новые прогностические и диагностические критерии действия радиационного фактора на иммунную систему. Выявлено участие рецепторов в формировании антиокси-даптпой устойчивости лимфоцитов, что послужило основанием для разработки гипотезы о структурном антиокснданге, отражающей закономерности регуляторной взаимосвязи рецепторного" репертуара клеток и устойчивости их мембран к окислительной деструкции. Показана роль СРП и состояния микровязкости липидов мембран иммуноком-петентных клеток в развитии ПЧЗТ при инфекционной патологи. Это раскрывает новые механизмы патогенеза данного феномена, позволяя рассматривать его как результат адаптации липидного комплекса мембран лимфоцитов к повторным окисляющим воздействиям. Предложена научная концепция патогенетического применения антиоксидантов при лечении иммунных нарушений, основанная на необходимости предварительной нормализации параметров липидного бислоя мембран лимфоцитов для оптимизации иммунокорригирующего эффекта. Обоснованы новые принципы иммунокорригирующей терапии с поэтапным сочетанным применением антиоксидантов и иммукомодуляторов, что защищено авторским свидетельством на изобретение.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получена качественно новая характеристика особенностей взаимосвязи иммунного и липидного гомеостаза на уровне мембран иммунокомпетентных клеток, раскрывающая закономерности изменений функциональной и фено-типической ориентации лимофицтов при активации в липидном бислое СРП, что определяет новое направление развития теории вопроса детерминации иммунных нарушений. Обосновано сопряжение ауторегуля-торных иммунных механизмов и СРП в иммунокомпетентных клетках. Разработана гипотеза оО участии рецепторов лимфоцитов в формировании устойчивости к повторным окисляющим воздействиям.

Установлены физиологические границы и параметры, определяющие развитие иммунных нарушений при активации в лимфоцитах СРП, что позволяет с новых позиций решать вопросы диагностики, прогноза и коррекции изменений в иммунной системе. Показаны перспективы системного подхода и интегральной оценки взаимосвязи СРП и иммунной Функции для направленной регуляции иммунного ответа. Предложены критерии оценки состояния СРП в лимфоцитах, позволяющие прогнозировать 'Ьормирои-ание иммунных нарушоннй, переход Фазы

адаптации в фазу декомпенсации липидного метаболизма и функциональной дезориентации лимфоцита. На баае корреляционно-регрессионного и дисперсного анализа определена совокупность информативных признаков, являвшихся диагностическими критериями повреждающего действия ионизирующего облучения, позволяющих прогнозировать степень развития иммунных нарушений. Обоснованы новые принципы иммуйотерапии с предварительной нормализацией параметров липидного бйелоя мембран иммунокомпетентных клеток для достижения оптимального иммунокорригирующего эффекта. Йй основании выявленных закономерностей регуляции иммунного ответа разработаны новые методы оценки состава популяций иммунокомпетентных клеток, их метаболической активности, клеточной сенсибилизации, развития иммунологической недостаточности и методы отбора препаратов для имму-нокоррекции, задащенные 7 авторскими свидетельствами на изобретения.

Положения, выносимые на ващиту.

1. СРИ участвуют й регуляции функциональной и фенотипической ориентации иммунокомпетентных Клеток, путем изменения структуры и состава липидного комплекса мембран, что детерминирует особенности иммунного гомеостаза в нормальных физиологических условиях и при,развитии приобретенной иммунологической недостаточности, определяя течение и исход иммунных нарушений и эффективность имму-нокорригирухэдих мероприятий.

2. При иммунизации кратковременное изменение параметров липидного бислоя лимофцитов с активацией СРП, ростом антиокеидант-ной активности и окисляемости липидов.транзиторным снижением экспрессии рецепторов и повышением экспрессии Гс/.-рецепторов носит адаптационный характер и способствует реализации Функциональных возможностей клеток.

3. В условиях патологии, вызванной введением ксенобиотика, действием ионизирующей радиации либо при инфекционном процессе, длительная активация СРО в лимфоцитах изменяет физиологические параметры липидного бислоя. Это ведет к истощению субстрата окисления, угнетению метаболизма жирных кислот в фосфолипидах, накоплению в клетках свободного холестерина, что способствует повышению микровязкости мембранных липидов, сопровождаясь сняжнием содержания цАМФ, цГМФ И циююиуклеотидзависимых фосфодиэстераз, угнетением индуцированного митогенеза и киллерной активности, снижением экспрессии Гс«-рецепторов лимфоцитов и развитием имму-

нологической недостаточности.

4. При радиационном воздействии наблюдается активация СРП, динамика которых в иммунокомлетенгных клетках имеет две фазы. 1а-за компенсации ассоциируется с иммуностимуляцией на "фоне активации липидного метаболизма, повышения антиоксидаданой устойчивости липидного бислоя и изменения его структурно-функциональных характеристик. При действии высоких доз радиации процесс переходит во вторую фазу - истощения, характеризующуюся угнетением метаболизма липидов, накоплением в клетках свободного холестерина, угнетением индуцированного митогенева, снижением экспрессии CD3, CD4-антигенов, рецепторов к Fc -фрагменту иммуноглобулина M и сопровождающуюся развитием иммунологической недостаточности.

5. У лиц, получивших повышенные дозы ионизирующего облучения при ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, нарушаются регулятор-ные взаимосвязи мевду системой метаболизма клеточных рецепторов, СРП и гомеостазом мембранных липидов, что приводит к функциональной дезориентации лимфоцитов.

6. Для коррекции нарушений в системе иммунитета целесообразно направленное воздействие на липидную матрицу мембран иммунокомпе-тентных клеток с целью нормализации ее состава и структуры, что достигается сочетанным поэтапным применением антиоксидантов и им-муномодуляторов.

Апробация работы,. Основные результаты работы были доложены и обсуищены на Всесоюзных конференциях и съездах: "Механизмы имму-ностимуляции (Киев, 1985); "Иммунодефицит и аллергия "(Москва, 1986); "Реактивность и резистентность: фундаментальные и. прикладные вопросы'ЧКиев, 1987); "Биохимия-медицине: Молекулярные механизмы формирования патологических состояний" (Ленинград, 1988); "Фундаментальные И прикладные аспекты применения миллиметрового электромагнитного излучения в медицине" (Киев, 1989); "Проблемы регионарной аллергологии" (Ташкент, 1989); "Биоантиоксидант" (Москва, 1989); "Стресс и иммунитет" (Ростов-на-Дону, 1989); на 1 Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 1989); "Реабилитация иммунной системы" (Цхалтубо, 1990).

lia республиканских конференциях и съездах: "Иммунологическая реактивность п патологии" (Киев - Винница, 1979); "Коррекция нарушений иммунологической реактивности" (Киев - Ив.-Франковск, 1903); "Актуальные проблемы иммунотерапий" (Ворошиловоград, 1988); "Изобретательство и рационализация на современном этапе

развития здравоохранения" (Киев, 1988); 7 съезде Украинского микробиологического общества (Черновцы, 1989); "Экологические проблемы иммунологии" (Минск, 1990).

На международных симпозиумах и конгрессах: 8 Европейском конгрессе по иммунологии (Вагреб, 1987); конгрессе по биохимии развития (Хельсинки, 1987); 9 Европейском конгрессе по иммунологии (РиМ, 1988); 14 Международном конгрессе по биохимии (Прага, 1988); 8 Ыевдународном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Монтрекс, 1988); 7 Международном конгрессе по иммунологии (Западный Берлин, 1989); 19 Европейском конгрессе по спектроскопии (Дрезден, 1989); Международном симпозиуме "Проблему реаниматологии, интенсивной терапии и критической медицины" (Те-лави, 1900); 20 Международном конгрессе по внутренней медицине (Стокгольм, 1990).

Публикаций. Ш материалам диссертации опубликовано 50 научных работ, Получено 5 авторских свидетельств и 2 положительных решения по еаявкаМ на изобретения, изданы 1 методические рекомендации й 4 информационных писЬШ, 1 отраслевое рационализаторское предложение. Разработанные методы диагностики и коррекции иммун-•нЫх нарушений внедрены в практику работы лечебно-профилактических и Научно-исследовательских учреждений республики и других регионов странь! (гг. Киева, ШсквЫ, Ленинграда, Владивостока, Запорожья, Донецка,ТерноПоля, Самарканда, Алма-Аты, Минска, Челябинска, Семипалатинска). Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафадрах эпидемиологии и терапии отоматфакультета Киевского медицинского института, на кафедре микробиологии Семипалатинского медицинского института и при проведении ваНятий факультета усовершенствования преподавателей Кафедры.патологической физиологии Киевского медицинского института.

ОбъеМ и структура работы. Диссертационная работа изложена на 320 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 475 источников (205 - отечественных и 270 -зарубежных авторов).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объем исследования. Работа основана на результатах клинических и экспериментальных исследований. Проведено комплексное ой-

нико-лабораторное обследование 39 пациентов отделения кардиологии Всесоюзного научного центра Радиационной медицины АМН СССР, получивших повышенные дозы ионизирующего облучения в диапазоне 0,20,4 Гр при ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, 52 больных хронической ишемической болезнью сердца( ХИЕС), не подвергавшихся действию ионизирующего облучения в дозах, превышающих радиационный фон г. Киева (все больные в возрасте от 25 до Бб лет) и 49 здоровых лиц и доноров крови (в воврасте от 23 до 62 лет).

Диагноз всем пациентам устанавливался на основании результатов клинического, лабораторного и инструментального обследования при непосредственном участии заведующих отделениями. Согласно полученным данный было проведено распределение больных на группы. 1 группу составили больные о хронической ишемической болеанью сердца, стенокардией 2-3 функционального класса. 2 группа включала пациентов с гипертонической болезнью 1-2 стадии. 3 группа -пациентов с нейроциркуляторной дистонией по кардиальному типу. Распределение больных на группы проводилось со строгим соблюдением принципа репрезентативности.

При проведении экспериментальных исследований изучен материал от 2327 животных, среди которых было 326 крыс линии Вистар, 1156 белых беспородных крыс, 621 мышь линии СВА, 21Б белых беспородных мышей к 9 кроликов породы Шиншилла.

Программа экспериментальных исследований включала иммунизацию животных эритроцитами барана и липополисахаридом Е. Coll (П. Ф. Здродовский и соавт. , 1972; И. Е Шргунов и соавт. ,1076,1983), воспроизведение острой и хронической интоксикации ксенобиотиком тетрахлорметаном (Ю. И. Губский, 1985, 1987). Моделирование генерализованной стафилококковой инфекции с использованием музейного штамма 75 Staphylococcus aureus (из музея культур института стандартизации ,и контроля медицинских биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича) проводили согласно рекомендациям (А. К Акатов, 1966, 1968), вводя крысам внутрибрюшинно 1 и ЕхШ1," а мышам' 1x10® микробных тел 24-х часовой культуры стафилококков. Формирование повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ) изучали на модели предложенной 3. В Гюллингом и ИВ Самбур (1981). Облучение животных на установке "Со проводили согласно рекомендациям (С, Т. Рыску-лова, 1986; А. Ю. Сунгуров, 1988) на кобальтовой пушке (Институт ЯЙерных исследований АН УССР). Для крыс доза облучения составляла 8,5 и 0,25 Гр. Мыши получали дозу - 6,5 и 0,25 Гр.

При изучении состояния Т-системы иммунитета у людей определяли общее количество Т-лимфоцитов и их субпопуляций методом непрямой иммунофлуоресценции с мышиными моноклональними антителами ОКТЗ, 0КТ4 и ОКТЭ ("Ortho", США) согласно рекомендациям (В. X. Ха-винсон и соавт., 1989). У крыс общее количество т-лимфоцитов оценивали методом Е-роэеткообразования (К Jondal et al., 1972) с эритроцитами гвинейской свинки и по унифицированному нами методу (А. С. N 1585707), а содержание субпопуляций Т- Лимфоцитов изучали по уровню клеток с рецепторами к Рс-фрагмёвту иммуноглобулинов классов U и В (A. Morettae, 1977). Антисыворотку получали на кроликах по рааработаННому нами способу (A.C. N 1431091). Содержание субпопуляций Б-лимфоцитов с поверхностными иммуноглобулинами классов М И Q у людей определяли прямым иммунофлуоресцентным методом со свиныМя шноклональньши аНтителамиС'Зеуас", ЧССР). Содержание ЕАС-розеткообразующих клеток оценивали по методу L. Blanco (1970). Содержание лимфоцитов с рецепторами к ацетилхолину ("Serva", ФРГ) определяли морфологическим методом (6.Schreiner, 1976). Митогенный ответ лимфоцитов на фитогемагглютшшн ("О i fco", США) И Конканавадин A ("Serva", ФРГ) определяли радиоизотопным методом, испольвуя метку8Н-тимидмна (К. Adller et al. , 1970; В. а Хоробрых и соавт., 1983) с регистрацией результатов исследования на сцинцилляционном счетчике "Intertechriique" SL-4000 (Франция) и морфологическим методом для оценки характера трансформации клеток (Е. Ф. Чернушенко, Л С. Когосова, 1978). Цитотоксичеекую активность ЕК-лимфоцитов По отношения к клеткам-мишеням - эритроцитам цыплят 5-тимесячного вовраста Исследовали радиоизотопным методом с использованием метки г1Сг (0. Ф. Мельников с соавт., 1985) с оценкой результатов на сцинцилляционном счетчике К-109. Структурные изменения хроматина ядер лимфоцитов и их метаболическую активность (отношение РНК/ДНК ) определяли методом флуоресцентного зондирования- с акридиновым оранжевым согласно рекомендациям (Е. И. Жербин й соавт., 1983; H.A.Карнаухов, 1978) и нашей модификации (Поло-жиг. решение N 4430606 от 28.11.90 г.). Кислородзависимый метаболизм нейтрофилов крови исследовали в реакции восстановления нито-синего тетразолия (Б. С. Нагоев и соавт., 1981).

Состояние мембран лимфоцитов и нейтрофилов изучали путем оценки микровязкости липидного бислоя методом флуоресцентного зондирования с пиреном ("Aldrich", ФРГ), образуюадам в липидной фазе зксимеры и мономеры (К Zalla et al., 1980). Измерения прово-

- и -

дили на спектрофлуориметре Хитачи 650-60 при длине волны возбуждающего света 334 ни и длине волн излучения 392 и 475 ни.

Состав жирных кислот фосфолипидов лимфоцитов и нейтрофилов и содержание в липидной фазе клеток свободного холестерина оценивали методом газожидкостюй хроматографии на хроматографе Цвет-164 с пламенно-ионизационным детектором. Исследование проводили согласно рекомендациям (К. М- Синяк и соавт., 1976) в нашей модификаций отраслевое рац. предложение N872 от 13.02.89 г.). Использовали хроматографические колонки, ааполнешше БХ полиэти-ленгликольсукцинатом на хроматоне AW-HMDS для анализа жирных кислот и колонки с ЪУ. полимером SE-3D для определения свободного холестерина, Расчет величины пиков выхода жирных киолат осуществляли методом внутреннего нормирования площадей и абсолютной калибровки. Уровень СРП в иммунокомпетентньгх клетках определяли методами хемилюминесцентного анализа. Измеряли спонтанную хемилюми-несценцию клеток и инициированную различными веществами - перекисью водорода, солями вакионого железа("Serva"; ФРГ} люминолом ("Fluka" Швейцария ) и др. Измерения проводили на хемилюминометре ХЛМ1Ц-01 с охлаждаемым До -11 ФЭУ-130 и камерой для термостатиро-вакия биапроб. Шкний уровень измерения устанавливали на 1MB. Оценивали кинетические параметры ОЕвчения клеток согласно реко-' кендациям (Ю. А. Владимиров и соавт., 1981,1983; Я И, Серкиз и соавт., 1984, 19QQ; А. Я. Лукащ и соавт. ,1084) И собственной модификации (Д.-С.N 1669705). Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в иммуйокомпетентных клетках определяли по уровню накопления малоиового диальдегида в НАДФН- и аскорбатэави-симой системах СЮ. А. Владимиров й А. И. Лрчаков., 1972). Содержание диеновых конъюгатов в липидах лимфоцитов и нейтрофилов определяли по методу И. Л- Стальной, (1977), измеряя оптическую плотность ли-пидных экстрактов при длине волны 233 нм на спектрофотометре "Specord", ГДР. Выявление шиффовйх оснований в лимфоцитах и нейт-рофилах проводили оценивая интенсивность флуоресценции липидных экстрактов при 440 нм и длине волны возбуждающего света 360 нм на спектрофлуориметре Хитачи 660 -60 (W. Bidlach et al. ,w1973). В качестве стандарта попользовали раствор сернокислого хинина (1 «г а мл). Содержание циклических нуклеотидов в лимфоцитах исследовали радиоиммуносорбентным методом, Используя наборы фирмы "Airersham", Англия, с регистрацией результатов ла сцинцилляционном жидкостном счетчике СБС-2, СССР. Активность фосфодизстераз цА)й и цГМФ исс-

ледовали путем инкубации ферментов с аН-цАМФ и последующим разделением йуклеотидов тонкослойной хроматографией. Радиоактивность проб измеряли на жидкостном сцинцилляционном счетчике Бета-1, СССР. Результаты исследований обрабатывали, используя параметрические (критерий Стьюдента) и непараметрнческие (Вилкоксона-Манна -Уитйй) критерийЕ. В. Рублер, 1978; Г. Ф. Ланкин, 1980), а также методы корреляционно-регрессионного анализа (Ю. Ф. Кабатов, ЕВ. Славин, 1976). Различия считали достоверными при Р<0,05. Использовали программы - для расчета статистических показателей на Mi-61 и программу для многофакторного анализа STEPR( реализованную на языке Фортран) На ЭВМ ЕС-1022.

' выполнение представленной работы осуществлено благодаря постоянному содействию и руководству д. м. н. Бордоноса В. Г., консультативной Помощи Профессора Чернушенко Е. Ф. За практическую Помощь В реализации проверенных исследований выражаю искреннюю признательность проф. Гуськову Е. П., ст. н. с. Брюзгиной Т.е. , Воровок М.И., Марценюку П. П. , асс. Глебовой Л.И РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОВСУВДШШЕ.

К решению вопроса об участии ОРП в ауторегуляторных иммунных механизмах мы подошли о двух основных позиций. Во-первых, было необходимо установить роль и значение СРО в физиологии йммунокомпетентных клеток. В Частности, мы рассматривали развитие нормальной Иммунной реакции организма, приводящей к синтезу антител при иммунизации Т-йависймым и Т-Невависимым антигенами. Далее предстояло выяснить, как СРП, активируемые различными экзогенными фактора^, влияют на состояние йммунокомпетентных клеток. В качестве моделей этих состояний мы использовали введение ксенобиотика тет-рахлорметана,действие ионизирующего облучения, развитие воспаления и активации "респираторного" процесса в клетках фагоцитарной скстеш при введении микроорганизмов. Это определило необходимость первоочередного проведения экспериментальных исследований. На моделях иммунизации животных эритроцитами барана и ДПС Е. Coll были установлены определенные изменения кинетики хемилюминесцен-ции, структуры и состава липидов мембран лимфоцитов и нейтрофи-лов, сопряженные с фазой иммунного ответа, функциональным состоянием и рецелторным составом йммунокомпетентных клеток. При обоих схемах иммунизации максимальная активация СРП наблюдалась на ранних этапах иммуногенеза. На 1 сутки после введения эритроцитов башва светосумма инициированной гидроген пероксидом хемилюминес-

цеиции лимфоцитов крови и селезенки мышей за 500 секунд возрастала в 1,53 и 1,23 раза, соответственно, до 84231447 и 75041380 имп (в контроле 6001+205 имп и 6050+Ш имп). У крыс этот показатель увеличивался в 1,3 и 1,2 раза, соответственно, до 8622±Б22 и 7692+380 имп (В контроле 6606^379 и 67141275 имп). Высота быстрой вспышки хемилюминесценции возрастала в лимфоцитах крови и селезенки мышей в 1,4 и 1,46 раза - до 122+7,6 и 137,6+6, 6 имп (в контроле 80,2+1.5 и 91,4+3,4 имп); у крые - в 1,4 и 1,7 раза - до 119,7+6,8 и 142,7+6,3 IIмп (в контроле 87_±3,5 и 85,8+3,0 имп). Спонтанное свечение клеток достоверно повышалось (Р<0,02), указывая на дисбаланс анти- и прооксидантных процессов, наступающий после антигенной стимуляции. 11а 3 сутки спонтанная хемилюминес-ценция лимфоцитов и нейтрофилов обоих видов животных снижалась, сопровождаясь ростом антиоксидантной устойчивости дипидной фазы клеток. В нейтрофилах крови мышей время индукции быстрой вспышки свечения при инициации увеличивалось, по сравнению с 1 сутками, в 5,7 раза (Р<0,001), а в нейтрофилах крыс - в 5,6 раз. На пике ан-тителопродукции, на 7 сутки, хемилюминесценция лимфоцитов крыс и мышей нормализовалась, а антиокеидантная устойчивость возрастала. Содержание конъюгированных диенов в лимфоцитах крови, селезенки и нейтрофилах животных повышалось на ранних этапах иммуногенеза до 96+3,9, 98,9+3,6 и 94,8+4,5 нмольЛО'меток (в контроле 74,8+1,6, 74,9+1,8 и 85,9+3,1 нмоль/ Ю'клеток), сменяясь к 7 суткам достоверным^ 0,05) увеличением количества шиффовых оснований. В лимфоцитах селезенки и нейтрофилах крови крыс этот показатель составил 1 ,о7+0,03 • и 0,8 10,02 усл. ед.( в контроле 0,84+0,05 и 0,6 +0,04). На 14 сутки после начала иммунизации эти продукты выявлялись в пределах контрольных значений, вероятно, вследствии обновления состава субпопуляций. Установлено, что лимфоциты крови и селезенки, в отличие от других типов клеток, характеризуются, преобладанием НАДФН-зависимых процессов липопереокисления над аскор-батэависимыми, что связано, вероятно, с присутствием в мембранах цитохрома Р -450( А. В. Караулов и соавт., 1984). Однако, на 1 сутки иммунизации эритроцитами барана в лимфоцитах крови крыс в 1,83 раза повышался уровень аскорбатзависимого липопереокисления, что определяет развитие СРП за счет других типов переокисления, в частности тиолэависимого, ведущего к появлению регуляторных белковых молекул. В динамике иммунизации эритроцитами барана интенсивность СРП возрастала в ряду - лимфоциты крови, лимфоциты селе-

зенки,. нейТрофилы, отражая, возможно, зтапность участия меток в процессах переработки антигена.Анализ жирнокислотного состава фос-фолипидов шмунокомпетентных клеток животных показал, что в лимфоцитах селезенки наблюдался более высокий уровень ненасыщенных ацилов и повышенная скор'ость их десатурацйи, определяя, вероятно, участие органа в продукции Простатландинов (V. СЬа1и™есИ, 1981).На 1-3 сутки иммунизации индекс десатурации полиеновых жирных кнолот повышался в фосфолнпвдах лимфоцитов селезенки крыс от 1,39 до 2,0, соответствуя активации липидного метаболизма. Это сопровождалось повышением текучести мембранных липидов лимфоцитов крови й селееенки яивотныхС^сО.Об, Р^0,02), что соответствует условиям пролиферации клеток. На 7 и 14 сутки эксимеризация пирена в мембранах лимфоцитов возвращалась к показателям контрольных значений. На пике антителойродукции уровень свободного холестерина в линидной фазе лимфоцитов увеличивался в 2,1 раза, по отношению к показателям контроля, до 2,610,02 нмоль на ю' клеток (в контроле 1,27 нмоль/Ю' клетоК), соответствуя росту антиоксидант-кой аадатк клетки. Поскольку накопление в мембранах свободного холестерина способствует увеличению площади мембранных структур (Э. Л Полякова, 1081; КГМ. Лопухин й соавт. ,1986), можно полагать, что рост его содержания 6 лимфоцитах на пике антителопродукции носит физиологический адаптационный характер,обеспечивая, наряду с увеличением клеточной массы, повышение резистентности мембран к повторным окисляадйм воздействиям. Этот механизм, наряду с клас-терообразуюцйм действием продуктов ПОЛ, усиливающим мембранный транспорт (К1Е. Вельтия^в и соавт., 1987; С. А. Аристархова и соавт.,. 1078),. мол»т определять ускорение проведения сигнала в клетку При повторном его поступлении, участвуя, таким образом, в формировании Коммитированного клона лимфоцитов. Динамика рецеп-торного состава в сопоставлении с кинетикой СРП обнаруживала снижение ' на ранни* этапах иммуногенеза супрессорной активности лимфоцитов. Уровень Гс^-поэйтивных лимфоцитов составлял 14,8+1,0 % или 0,35¿0,03 Г/л (в контроле ЕО,3+1,3* или 0,43+0,03 Г/л). Отмечалась тенденция к Повышению на 7 сутки Гс^-позитивных и Е-роает-кообразуюших клеток И лимфоцитов с рецепторами к ацетилхолину. При иммунизации, ЛПО уровень СРП в лимфоцитах крови, селезенки и нейтрофилах животных превышал значения этого показателя, выявляемые при иммунизации эритроцитами Сарана, соответственно, в 1,4, 2,3 и 1,7 раза и более длительно, до 7 суток, сохранялся на

высоких значениях. На 3 сутки высота быстрой вспышки хемилюминес-ценци при инициации гидроген пероксидом в лимфоцитах крови, селезенки и нейтрофилах крови крыс составляла 156,7+5,7,148,3.+9,5 и 338,4+17,9 имп(в контроле 87+5,2 83,8+3,0 и 271,2+12,4 имп), на 7 сутки в лимфоцитах селезенки высота быстрой вспышки составляла 142,4+9,9 имп, а в нейтрофилах 142,4+9,9 имп. Это сопровождалось преобладанием ферментативных процессов переокисления над аскор-батвависимыми, соответствуя продукции эйкозаноидов. На 7 сутки отношение НЗП/АЗП в лимфоцитах селезенки достигало 3,1, при 1,2 в контроле, что сопровождалось достоверным снижением устойчивости липидной фазы мембран меток к окислению (Р<0,02). При снижении уровня хемилюминесценции лимфоцитов на 14 сутки антиоксидантная устойчивость липидной фазы сохранялась на пониженных значениях, несмотря на тенденцию к увеличению времени индукции быстрой вспышки свечения в лимфоцитах крови, селезенки и нейтрофилах до 5,3+0,3, 5,910,3 и 3,4+0,2 сек (в контроле 4,7±0,4, 5,2+0,5 и 2,6+0,4, соответственно), Это повторялось при обоих схемах иммунизации, указывая на участие дополнительных механизмов повышения устойчивости клетки к окислению, формирующихся после антигенного воздействия на поздних этапах иммуногенеза.

Следующим этапом наших исследований было изучение обратной последовательности взаимосвязи "состояние липидной фазы - функция иммунокомнетентных клеток". При воспроизведении у крыс и мышей острой и хронической интоксикации тетрахлорметаном, активирующим СРП в организме, установлена универсальность и синхронность изменений лйпидного комплекса и функционального состояния иммунокомпетентных клеток. На райних этапах после введения ксенобиотика наблюдалась активация СРП в лйпидах и угнетение их функциональной и метаболической активности. Индекс симуляции определяемый по уровню отношения включения 3Н-тимидина в ДНК в опытной и- контрольной пробе, в лимфоцитах крови и селезенки крыс при инкубации с конканавалйном А составил 6,8 и 3,4 (в контроле 19,4 и 12,2), при инкубации с ФГА - 8,7 и 4,8 (в контроле -27,9 и 21,2). Это может определяться известным ингибирующим действием свободных радикалов на синтез ДНК (У. Прайор, 1979; А. В. Алесен-ко, 1981). Светосумма хемилюминесценции лимфоцитов крови, селезенки и нейтрофилов крыс повышалась черев 84 часа соответственно до 9419+391, 0725+402 и 16332+552 имп (в контроле 6311,6+142, 6024+838 и 20903+666 имп). У мышей этот показатель увеличивался,

соответственно, в лимфоцитах крови и селезенки до 7718+413 и 7699 +282 имп ва 500 сек (в контроле 5519±163 и 5600+314, Р, <0,001, Рг<0,01). Наблюдался достоверный СР<0,02) рост содержания Т-лимфоцитов с рецепторами к Fc-фрагменту иммуноглобулина м, что сменялось достоверным увеличением содержания (Р<0,05) Tj-позитивных лимфоцитов во второй фазе, через 2 недели после окончания введения ксенобиотика. В эти сроки наблюдалось истощение субстрата окисления, , декомпенсация липидного метаболизма и снижение уровня СРП в клетках. Содержание цАЫФ в лимфоцитах селезенки крыс снижалось ДО 6,6+0,85 пмольЛО' клеток (в контроле 22,0+1,7 пмоль/10* клеток), а цГМФ - до 1,3+0,2 пмоль-100 мкл-ю'клеток/мл (в контроле 12,й пмоль-ЮОмкл-Ю клеток/мл, Р, <0,001, Р2<0, 001). Уровень фосфодиэстеразы цАМФ составил 37,01+1,49 пмоль-ю'клеток-мин'св контроле 99,09+4р7 пмоль-10* клеток-мин'), фосфодиэстеразы цГМФ -4,б±0,42 пмоль-10*клеток*мин'(в контроле 23,l5j.l,94 пмоль-Ю* клеток'мин",1 Р, <0,001, PfO.OOl). в лимфоцитах крови и селезенки высота быстрой вспышки свечения уменьшалась, соответственно, в 1,65 и 2,2 раза 0,001, Р£0,001). Наиболее чувствительны к активации СРО окисления клетки фагоцитарного ряда. - Рост уровня хе-милюминесценции. И накопление продуктов перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ) наступали в них раньше, чем в лимфоцитах, уже через 6 часов после введения тетрахлорметана. Это сопровождалось активацией кислородвависимого метаболизма в 1,5 раза по данным НСТ-тес-та. При острой интоксикации ксенобиотиком интенсивность вышеуказанных изменений достигала больших значений, чем при хроническом воздействии (Р<0,01).В серии экспериментов in vitro установлено, что это обусловлено защитным действием эритроцитов и в меньшей степени сыворотки крови животных с хронической интоксикацией тет-рахлорметаном, которые при совместном инкубировании с нейтрофила-ми интактных животных снижали в них уровень хемилюминесценции и супрессировали кислородгекерируюшую активность клеток. Уровень инициированной перекисью водорода хемилюминесценции нейтрофилов за 500 секунд после 30-минутной инкубации с эритроцитами и сывороткой отравленных животных снизился до 2340+270 имп (в контроле 3460+300 имп, Р<0,05) и 2430+370 имп (в контроле 2900+250,Р>0,05). Показатель НСТ-восстанавливающей активности нейтрофилов после инкубации с эритроцитами и сывороткой составлял, соответственно, 12,6+1,24 и 12.1+1,5% (в контрольной пробе - 20.6+1,8, Р, < 0,001 и Р2 <-0,01). Это позволяет-полагать, что после многократного вве-

дения тетрахлорметана в эритроцитах и сыворотке крови животных накапливается фактор, способствующий адаптации клеток фагоцитарного ряда к окисляющим воздействиям. При изучении содержания продуктов ПОЛ в иммунокомиетентных клетках животных после введения ксенобиотика установлено значительное повышение их содержания в лимфоцитах и нейтрофилах, по сравнению с аналогичными показателями, выявленными при иммунизации. Содержание шиффовых оснований через 24 часа после введения препарата возрастало в лимфоцитах крови в 4,4 раза, до 3,45j.0,3 усл. ед. (в контроле 0,786±0,03 усл. ед.), а в лим^цитах селезенки - в 3,9 раза, до 3,33+0,2 усл. ед. (в контроле 0,8410,05 усл. ед.). Уровень диеновых конъюгатов увеличился, соответственно, в 1,3 и 2,4 раза - до 96,4+5 и 103,9¿ 5,3 нмоль/10* клеток(в контроле 74,8+1,6 и 74,8+1,8 нмоль/10' клеток) . При хронической интоксикации ксенобиотиком происходило истощение субстрата окисления. Уровень арахидоновой кислоты в мембранных фосфолипидах снизился в 3,3 раза, а при однократном введении препарата - в 1,2 раза. Это сопровождалось повышением микровязкости липидного бислоя (Р<0,05), наряду со снижением содержания свободного холестерина в 3,1 раза. Поскольку в зависимости от состава и структуры липидной фазы холестерин может проявлять анти-либо проксидантные свойства ( Е. Б. Бурлакова,-1980, 1985; Е. Oldfield, 1972), на фоне высоких значений СРП в нашем опыте он может выступать в качестве субстрата переокисления. В серии экспериментов in vitro добавление ксенобиотика к культуре лимфоцитов вызывало че--рез 30 минут снижение в 2- 3 раза содержания в фосфолипидах арахидоновой и линолевой кислот и повышение микровязкости липидной фазы клеток, подтверждая участие свободнорздикальных механизмов в реализещии действия тетрахлорметана на иммунокомпетентные клетки. Число пикнотических форм лимфоцитов при этом не различалось с аналогичным показателем контрольной пробы. Динамика рецептсрного состава лимфоцитов крови и селезенки крыс при хроническом воздействии ксенобиотиком характеризовалась в отдаленные сроки снижением содержания Т*- позитивных лимфоцитов и ростом содержания Fc^-n.isnTitBHbix Т~клеток. Учитывая сопутствующее снижение включения d ДНК лимфоцитов кроеи и селезенки 3Н-тимидпна при инкубации с ФГА в 2,4 и 2,7 раза, соответственно, и при инкубации с Кон А -в 3,6 и 2,0 раза, снижеиие ЕК-активности лимфоцитов крови в 1,42 раза, уменьшение содержания в мембранах лимфоцитов цЛМГ в 3,3 раза и цГМФ п 3,2 раза, снижение активности фосфодиэстераз uAl.tt и

цГМФ Б 2,6 и 5,0 раза, можно полагать, что введение тетрахлорме-тана, ДетерМинируя изменения липидного комплекса иммунокомпетент-ных клеток, приводит К формированию иммунологической недостаточности (табл. 1),

Существенное значение для понимания роли свободнорадикальных механизмов в патогенезе иммунных нарушений имеет изучение состояния липидного комплекса мембран лимфоцитов при активации "дыхательного взрыва" и Генерации свободных радикалов клетками фагоцитарной системы. Ё динамике генерализованной Стафилококковой инфекции у крыс И мышей в лимфоцитах крови, селезенки и нейтрофилах происходит длительная активация СРП, приводящая к истощению субстрата окисления, снижению Индекса десатурации ненасыщенных жирных кислот до 0,65 при 1(39 В контроле, снижению содержания арахидо-новой и линолевой кислот в фосфолипидах в 2,6 и 1,6 раза, соответственно, и накоплению в клетках свободного холестерина до 2,3 Нмоль /104кЛеТоК, При 1,'27 нмоль/Ю1 клеток, в контроле. Параллельно угйета^тся ИНдуцироЬаннЫй ФГА митогенез лимфоцитов в 1,54 раза, регуляторный Индекс снижается ( Гс^/Гс^) до 1,25, при 1,99, в Контроле. При этом экспрессия Рсц- рецепторов лимфоцитов сопряжена с динамикой антиоксидантнрй устойчивости, окисляемости и микровязкости липидов мембран и повышается при снижении скорости окисления, текучести липидов бислоя и повышении их антиокислительной активности. Анализ влияния липидного комплекса лимфоцитов на формирование ПЧЗТ к антигенам стафилококка при инфекционном процессе различной степени тяжести, позволил установить, что высокий уровень СРО ведет к декомпенсации липидного метаболизма, истощению субстрата окисления, низкому уровню развития ПЧЗТ и гибели животных. При компенсаторном характере ответа липидной фазы мембран лимфоцитов на.окисляющее воздействие с ростом антиокси-Дантной защиты клетки, сохранением физиологического содержания в фосфолипидах арахидоната, Линолевой кислоты и уровня десатураци-онных процессов,формирование ПЧЗТ повышается. Это сопровождается повышением текучести мембранных липидов лимфоцитов и благоприятно для выживаемости животных (табл. 2). Таким образом, формирование ПЧЗТ в организме можно рассматривать как результат адаптации липидной фазы мембран к повторным окисляющим воздействиям. Снижение уровня развития реакции при высокой интенсивности в мембранах СРО является неблагоприятным прогностическим признаком, свидетельствующим о декомпенсации липидного метаболизма и угнетении функциональных потенций иммунокомпетентных клеток.

ТаОлица 1,

Индекс стимуляции при инкубации о ФГА (ИС 1) и Ооп А (ИО й), индекс хемйлюминесценции (ИХЛ), индекс эксимериаацйй ПИрена (ИЭ), содержание диеновых конъюгатов (да) И шиффовых оснований (.Ш) в лимфоцитах крови (ЛК) и селевенки (ЛС) крЬга о острой Й хронической интоксикацией тетрахлорметаном (ОИТ и ХИТ) Cea леЧения и íiprt введении ««-токоферола в дозах 0,6 и 20 kttVKT массы • (ТФ).

Условия опыта

Клет- ИС 1 ИС 2 h БВ ХЛ да шэ

ки

ЙЭ

Контроль

хит

ОИТ ОИТ+Л

ЛК ЛС

лк

ЛС

ж

ЛС

лк

ЛС

ХИТ+ТФ|,ЛК

ЛС

ХИТ+ТФ,тЛК

ЛС

ХИТ+Л+ лк ТФсм- ЛС ХИТ+Т+ лк ТФад ЛС

27,9 21,2, 11,5* 7,8* 8,7"

8,6* 6,8* 23,6 30,0* 22,8* 34,5* 23,9

19,4 81,4t3, 12,2, 91,0+2, 6,3*134,0+3, 6,1*141,4±3, 5,8*162,619, 3,4*146,414, 7,8* 97,4±4, 8,1*102,016, 14,2* 55,1±3, 69,313, 96,416, 96,3±2, 65»213, 64,1^3,

25,6! 22,3. 27,0* 10,7

О 74,8+1,6 0,7910)03 2 74,711,8,0,6410,05, 4 96,4+6,0^3, 50+0,30,

6*103,916, аг 3,33+0,20 ?'" "

1*

4! ВЗ,1±Э,Б

6

1,7810,04

1,80+0,04,

2,36£0(02

0.

87,1¿3,2

77.112.7 81,б±3,7

76.613.8

80.112.9 7б,'7±3,8 80,810,1

I

0,9210,04 0,9210,04 0,841.3,80 0,92±0,05 0,8310,07 О,86+0,06

1,03+0,04

,60+0,80. 13410,03 1,78+0,07

■ —i+ir

1,86+0,03 1,7910,02 1,78+0,04 1;7710,08 1,7610,05

х- различия с группой контроля достоверны (Р <0,05); И БВ ХЛ-время индукции быстрой вспышки ХЛ; ДК в нмоль 10' кл.; 11Ю в усл. ед.

Учитывая выявленную сопряженность динамики СРП и функционального состояния иммунокомпетентных клеток, ш исследовали влияние на иммунные процессы препаратов, нормализующих параметры ли-пидной фазы мембран. На моделях интоксикации Тетрахлорметаном и при инфекционном процессе установлена положительная динамика структуры и состава мембранных липидов лимфоцитов и фагоцитов При применении левамизола, тиМаЛина и тимогена, о часто опререкаюией выявляемостью липонормализуюших эффектов. Это послужило основанием для предположения о необходимости Предварительной нормализации липидного комплекса мембран лимфоцитов для оптимизаций иммунокор-ригирующего воздейстивия. Используя различные Дозы липидного модулятора и антиоксиданта«<-тоКоферола и его сочетания с традиционными иммуномодуляторами, мы установили, что малые Дозы препарата, 0,5 мг/кг массы, обладают отчетливым иммунокорригирующим действи-

Таблица 2

Состав жирных кислот(ЖК) фосфолипидов и уровень свободного холестерина (СХС) в лимфоцитах селезенки мышей с генерализованной стафилококковой инфекцией без коррекции и при введении А -токоферола в дозе 0,5 мг/кг массы.

Состав ЖК Z Контроль ин-тактные мыши Стафилококковая инфекция

3 сутки 14 сутки Введение d -ТФ

216:0 018: 0 £18:1 С18: 2 С20: 4 ИД пнжк нши СХС п=9 39,7+0,8 25,4{1,б 16,2±0,5 7,8±1,0 10,9±1,0 1,39 18,7±1,2 34,9ll, 0 1,3±0,1 п-9 38,7±4,6 31,8+2,2 18,Oil,2 3,410,4* 8,2+2,3 2,4 11,6±2,6 29,5+3,2 2,810,2* п=8 38,9±2,1 35,2+4,1* 17,9±1,7 4,8+1,2 3,1Ю,7* 0,65 7,9±1,8* 25,9±3,3* 2,3+0,1* п=7 38,7+2,5 36,2+2,3* 13,911,2* 4,8±0,б 6,4tl,l 1,3 11,2±1,3 25,1+1,5 1,3±0,1

Примечания: * - различия с группой контроля достоверны при Р~<0,05; ПНЖК-полиненасыщенные жирные кислоты; ШЖК-ненасыщенные жирные кислоты; СХС-свободный холестерин в нмоль/10* клеток.

Таблица 3.

з

Показатели включения Н-тимидина в ДНК лимфоцитов, прирост массы регионарного лимфоузла (ЛУ) и индекс эксимеризации пирена (Ри/Ря) в динамике стафилококковой инфекции

10 10 обусловленной введением 1x10 (1 группа) и 8x10 (2 группа) микробных тел стафилококков у крыс.

Сроки изучения, сутки Группы животных 3 Включение Н-тиМидина в ДЖ, имп/мин ИС Прирост массы ЛУ. 7, Индекс эксимеризации, FM/F3

1 1 2006411124* 15,6 _ 2,14Ю,0б*

2 1860011361* 13,1 - 1,49+0,04*

7 . 1 £729811476* 16,1 126,714,1* 1,6810,06

г - 121,614,2* 2,0710,07

14 1 199001 634* 15,4 134,215,1* 1,8510,08

2 18734+ 435* 13,8 122,414,9* 2,06+0,06*

21 1 210501 880* 15,7 148,515,6* 1,5810,04*

2 17721Ц351* 14,3 -117,013,8 2,1510,1*

к- 251401 813 18,7 113,7+1,1 1,78+0,05

Примечания : * - различия с группой контроля достоверны (Р<0,С К - контроль, штактные животные.

ем, нормализуя параметры липидного бислоя мембран лимфоцитов. Известно, что о»-токоферол в дозах выше 20 мг/кг массы может разобщать окислительное фосфорилирование и сам служить источником свободных радикалов (Н. Г. Храпова и соавт. , 1977, С. А. Аристархова и соавт., 1978). Нами установлено,что у иммунодефицитных животных препарат в дозе 20 мг/кг массы значительно, в 1,7 раза угнетает ретроспективно пониженную ЕК-цитотоксичность лимфоцитов - до 9,7+1,86 7. (в контроле 23,211,5 X, при введении тетрахлорметана -16,7+1.8 X), но стимулирует индуцированный ФГА митогенез клеток. Индекс стимуляции при инкубации лимфоцитов крови и селезенки крыс с ФГА составлял 23,6 и 30,0 (в контроле 27,9 и 21,2), при инкубации с Кон А - 14,2 и 25,6 (в контроле 19,4 и 12,2,соответственно). Аналогичный эффект отмечался у мышей с хронической интоксикацией тетрахлорметаном. У интактных животных такое действие не выявлялось. Установлено, что введение 0,5 мг/кг массы*-токоферола предпочтительно, поскольку оказывает иммунопротективный эффект уже на ранних этапах инфекционного процесса, когда введение иммуномоду-ляторов не рекомендуется. Индекс стимуляции лимфоцитов селезенки крыс при инкубации с ФГА на 3 сутки введения малых доз препарата составлял 16,1 (в контроле 18, 7 и 15, 5 у животных со стафилококковой инфекцией), на 14 сутки - 18,2 (у животных не получавших препарат - 15,4, Р<0,05). Используя различные сочетания малых доз токоферола с левамизолом, тималином и тимогеном установлено, что для повышения эффективности иммунокоррекции целесообразно соче-танное поэтапное применение антиоксидантов и иммуномодуляторов с предварительной нормализацией параметров липидного бислоя лимфоцитов. Это ускоряет достижение положительных результатов лечения и позволяет снижать дозы препаратов. Новизна предложенного нами подхода защищена авторским свидетельством на изобретение. Исходя из вышесказанного, показания к назначению антиоксидантов с целью иммунокоррекции должны основываться на результатах выявления повышенного уровня СРП и нарушений структуры и состава липидного комплекса мембран иммунокомпетентных клеток.

Перспективы системного подхода и интегральной оценки взаимосвязи СРП и функциональной активности иммунокомпетентных клеток открывают еще один важный аспект проблемы иммунорегуляции и развития патологических состояний при действии ионизирующего обручения. На моделях с использованием крыс и мышей и у индивидов, мучивших повышенные дозы ионизирующей радиации при ликвидации

последствий аварии на ЧАЭС, нами выявлена первичность изменений липидного шэмплекоа лимфоцитов при облучении, что детерминирует в дальнейшем развитие иммунных нарушений. Установлено, что выживаемость животных, получивших сублетальные дозы ионизирующей радиации (8,5 Гр - для крыс и ,6,Б Гр - для мышей) взаимосвязана с состоянием липидного комплекса иммунокомпетентных клеток. На ранних этапах после радиационного воздействия липидный метаболизм в лимфоцитах селезенки животных активируется. Индекс десатурации жирных киолот фосфолипидов увеличивается в 1,8 раза - до 3,1 (в контроле 1,8). Время индукции быстрой вспышки инициированной хе-милюминёсценции в лимфоцитах крови сокращается в 1,6 раза, а в нейтрофилах - В 4,7 раза. Уровень свободного холестерина в мембранах лимфоцитов крови и селезенки снижается в 3,5-4 раза до 0,3 нмоль/10г клеток при 1,2 нмоль/ю'клеток в группе контроля.

Ненасыщенность ацильных остатков фосфолипидов не изменяется или возрастает, активируется хелперная субпопуляция лим-.фоцитов, а экспрессия Рсу-рецепторов Т-клеток снижается. Содержание Рс,,-позитивных лимфоцитов составляет 1,22+0,09 Г/л (в контроле 0,77+0,03 Г/л), уровень Рсг- позитивных клеток -0,35+0,2 г/Л (В контроле 0,48+0,03 Г/Л, Р<0,05). При этом включение 8Н-тимидина В ДНК лимфоцитов крови у крыс снижается в 1,45 раза (Р<0,02). Кислородгенерирующая активность в нейтрофилах крови животных достоверно активируется. Аналогичные изменения наблюдались На ранних этапах активации СРП тетрахлорме-таном. На 5 -10 сутки*после ионизирующего воздействия наблюдалась вторая стадия-Пострадиационных изменений в иммунокомпетентных клетках, соответствующая супрессии СРП. Антиоксидантная активность липидйой фазы лимфоцитов повышалась в 1,6-1,7 раза, а хеми-люминесцентный ответ снижался, по сравнению с показателями контроля, в 1,6-1,6 раза. Ненасьнценность. жирнокислотного состава фосфолипидов достоверно уменьшалась (Р<0,05) с накоплением труд-ноокисляемых фракций, а содержание свободного холестерина воз--растало й'4,5 раза, до 5,7 нмолъ/10* клеток. ЭТо было сопряжено с ростом содержания Рс^- позитивных лимфоцитов. У крыс в популяции лимфоцитов• крови экспрессия Рр^г.решпторов. увеличивалась в 1,6 раза с инвдрсией'>индекса:1/,/^|!'До:Ю,'94,1!при> 1,82: в■•данграда. .Индуцированный митогенеа■лимфоцитов: при инкубации в ФРА угнетался-в:1?8 раза. , Если вторая.стадия оала кратковременна и сменялась активацией липидного метаболизма, . то прогноз для выживания животных

благоприятный. При усугублении нарушений липидного комплекса мембран, наступала терминальная третья стадия, соответствующая еще большей супрессии липидного метаболизма, торможейию СРП В Мембранах, функциональной дезориентации лимфоцитов и сопровождающаяся гибелью животных. Малые дозы радиации, 0,25 Гр, вызывали комплекс изменений, который можно характеризовать как активаЦйю липидного метаболизма. Высота быстрой вспьшки инициированной хемйлюминесцен-ции в лимфоцитах крови и селезенки крыс на 1 сутки возрастала в 1,4 и 1,35 раза, в лимфоцитах крови И селезенки мышей В 1,35,1,37 раза. С 15 по 30 сутки наблюдался рост антисксйдантной активности липидной фазы и незначительное снижение хемилюминесцентного ответа лимфоцитов, что сохранялось на 60 сутки. Это коррелировало со снижением на 1 сутки содержания Гоу -позитивных Т-Лймфоцитов до 15,7+0,46 %. (0,43+0,04 Г/Л), при 19,710,7 1 (0,4710,03 Г/л) В контроле, а уровень Тдклеток не изменялся. На 5 сутки Наблюдалось повышение количества ^-позитивных лИмфоШпой. до 44,211,0%,Р<0,02 (1,36+0,07 Г/л, Р<0,01) и увеличение индексё Т^/Т^до 2,1. К 30 суткам происходило увеличение количества клеток С Fc -рецепторами к иммуноглобулину М и снижение индекса Т^/Т^до 1,8; а К 60 суткам - до 1,13. Таким образом мы наблюдали определенную динамику рецепторного репертуара лимфоцитов после ионизирующего воздействия, сопряженную с изменениям! липйдйого комплекса иммуйокомпе-тентных клеток и определяемую периодом времени, прошедшим после облучения. При малых дозах ионизирующей радиации наблюдалось ослабление силы корреляционных взаимосвязей между иммунологическими параметрами и увеличение числа сильных взаимосвязей между показателями иммунного и липидного гомеостаза. Это указывает На дисбаланс иммунных процессов(К. А. Лебедев, 1990) й повышение влияния на них состояния липидной фазы мембран клеток. Пациенты, полупившие повышенные дозы ионизирующего облучения в Диапазоне 0,2-0,4 Гр, отличались значительным дисбалансом количественных И качественных показателей ИКК, что затрудняло анализ материала при сопоставлении средних значений изучаемых параметров. Иная картийа выявлялась при изучении структуры взаимосвязей • между параметрами (табл. 4). Линейные коэффициенты корреляций между содержанием CD3, CD4, CDS-антигенов т-лимфоцитов. уменьшались) ослаблялась взаимосвязь между В-лимфоцитами, несущими поверхностные иммуноглобулины классов М и G и лимфоцитами с/рецепторами к ацетилхоли-ну; содержанием CD3- и С04-лозитивних и ЕАС- риэеткообразуюищ

Таблица 4

Коэффициенты множественных корреляций между параметрами свободнорадикальяого окисления, рецепторным составом и метаболической активностью иммунокомпетэнтных клеток у здоровых доноров и пациентов, получивших повышенные дозы ионизирующего облучения при ликвидации последствий аварии на ЧАЗС.

Изу- Г р У п п ы обследованных

мые Здоровые доноры Ликвидаторы последствий Ликвидаторы последствий Ликвидаторы последствий

пара- аварии на ЧАХ с 1ткпом авар. на ЧАЗС со 2типом аварии на ЧАЗС с Зтипом

метры кинетической кривой ХЛ кинетической кривой ХЛ кинетической кривой ХЛ

1 2 3 4 1 2. 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

5 0,589 0,562 0,589 0,567 0,164 0,215 0.232 0,230 0,689 0,696 0,541 0,696 0,570 0,526 0,581 0,557

б 0,535 0,355 0,535 0,484 0,511 0,510 0,387 0,495 0,451 0,427 0,462 0,362 0,349 0,524 0,219 0,513

7 0,497 0,460 0,493 0,391 0,749 0,729 0,749 0,742 0,374 0,388 0,264 0,180 0,456 0,468 0,452 0,513

8 0,510 0,485 0,509 0,510 0,472 0.292 0,460 0,411 0,644 0,663 0,660 0,591 0,431 0,454 0,375 0,308

9 0,536 0,504 0,562 0,547 0,251 0,189 0,276 0,275 0,624 0.628 0,572 0,641 0,299 0,296 0,265 0,303

10 0,309 0,285 0,299 0,316 0,426 0,404 0,423 0,418 0,493 0,529 0,370 0,529 0,506 0,477 0,505 0,417

11 0,416 0,453 0,444 0,457

12 0,459 0,474 0,470 0,474 0,441 0,534 0,505 0,533 0,628 0,655 0,433 0,687 0,525 0,401 0,526 0,530

13 0,364 0,252 0,440 0,447 0,189 0,280 0,282 0,272 0,593 0,733 0,756 0,765 0,614 0,555 0,603 0,617

14 0,330 0,410 0,413 0,396 0,409 0,509 0,546 0,569 0,360 0,413 0,387 0,264 0,461 0,435 0,466 0,467

15 0,466 0,495 0,520 0,361 0,362 0,521 0,520 0,361 0,546 0,663 0,661 0,663 0,330 0,441 0,502 0,502

Примечания: 1- время индукции быстрой вспышки хемилюминесценции (ХЛ); 2- высота быстрой вспышки ХЛ;

3-светосумма ХЛ; 4- спонтанная ХЛ; 5 - антиокислительная активность липидов; 6 - метаболическая активность лимфоцитов; 7 - методическая активность нейтрофшюв; 8, 9, 10 - содержание СОЗ, С04 и СЛ8-позитивных Т-лимфоцитов; 11 - содержание Е-РОК; 12 - содержание ЕАС-РОК; 13, 14 - содержание лимфоцитов с поверхностными иммуноглобулинами классов м и Б; 15 - количество лимфоцитов с рецепторами к ацетилхолину.

клеток. Эти изменения наблюдались в общей группе обследованных и в выборках с диагнозами Х11БС и гипертоническая болеэнь. У больных с аналогичной патологией, но не подвергавшихся действию ионизирующей радиации в дозах, превышающих радиационный фон г. Киева, наблюдались более однотипные изменения вышеуказанных параметров, с сохранением числа и структуры сильных связей меяду ниш. В этих группах выявлена высокая корреляционная зависимость между параметрами состояния антиоксидантной активности липидной фазы меток и экспрессией на мембранах лимфоцитов CD8, CD3 и С04-антигенов. Корреляционно- регрессионный многофакторный анализ с построением матрицы множественных корреляций выявил три варианта кинетических параметров хемилюминесценции, сопряженных с функциональной и фе-нотипической ориентацией иммунокомпетентных клеток у пациентов, получивших повышенные дозы ионизирующего облучения при ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, что может быть ранним диагностическим и прогностическим признаком пострадиационных изменений. По нашим данным 1 тип кинетической кривой хемилюминесценции лимфоцитов при инициации гидроген лероксидом соответствует адаптации к окисляющим воздействиям и характеризуется t рис. 1) понижением хемилюми-несцентного ответа клеток, тенденцией к увеличению времени индукции быстрой вспышки свечения, ростом антиоксидантной активности

.г ч: та. "V7"

ЛШйШМЮЖтШШй

-Luiuiuii

........Ш.

.iliiiUUitUitiiS,

"'и*

iVH

шШ

Е£Э «««'г.1

CD "

ton 1"

Рисунок I. Варианты кинетических параметров хемилюминесценции лимфоцитов крови пациентов, получивших повышенные дозы ионизирующего облучения при ликвидации последствий аварии на ЧАЭС. В контроле лимфоЦитй здоровых доноров.

липидной фазы. Ослабляются взаимосвязи между параметрами, характеризующими течение СРП и состояние антиоксидантной защиты клетки. Формируется новая зависимость между содержанием CDe-антигенов на лимфоцитах (г- 0,423), ЕАС-РОК (г*=0,605), IgG-позитивными В-лимфоцитами (г- О.Б46) и уровнем светосумма хемилюминесцэнции. Происходит рост сопряженности метаболической активности нейтрофилов с уровнем инициированной кемилюминесценции лимфоцитов (г= 0,749, при 0,635, в контроле), указывая на участие нейтрофилов в регуляции СРП в лимфолдноД популяции. Второй тип кинетической кривой соответствует высокому уровню CPIL Сокращается время индукции быстрой" вспышки свечения, увеличивается ее интенсивность и светосумма. Антиоксидантная активность липидов снижается, формируются новые сильные корреляционные взаимосвязи мевду параметрами хеми-люминесценции и содержанием CD3, CD4 и CDS-антигенов, уровнем В-лимфоцитов о поверхностными иммуноглобулинами класса 0 (табл.4). Повышается влияние антиоксидантной активности липидной фазы на .уровень генерации лимфоцитами свободных радикалов(г=0,696) и возрастает влияние на этот показатель состояния рецепторного репертуара клеток. Увеличиваются коэффициенты корреляции между уровнем антиоксидантной защиты и экспрессией CD4, CDS -антигенов, рецепторов к ацетилхолину и поверхностных иммуноглобулинов классов М и 6 на лимфоцитах. В представленной выборке 7 из 10 изучаемых параметров имеют высокие корреляционные взаимосвязи (г<0,6) о процессами, протекающими в липидном бислое иммунокомпетентных клеток, указывая на "напряжение" иммунного гомеостаза (К. А.Лебедев и И. Д. Понякшга, 1690) и увеличение влияния на него липидной фазы.

Третий вариант кинетической кривой'хемилюминесценции наблюдается, у лиц, Получивших наиболее высокие дозы ионизирующего облучения в исследуемой выборке и характеризуется нами как декомпенсация липидного метаболизма. Время индукции быстрой вспышки свечения сокращается, снижается уровень антиоксидантной защиты клетки. При инициации перекисью водорода происходит резкий подъем Вспышки хемилюминесценции, затем -быстрый спад ее ниже уровня контрольных значений, Uto сохраняется в течение длительного времени. Светосумма хемилюминесценции за 500 секунд достоверно уменьшается (Р <0,01). Снижается содержание в фосфолипидах арахи-доновой кислоты в 1,4 раза, суммы полиеновых жирных кислот в 1,36 раза, индекс десатурации уменьшается в 1,3 раза. Этот кинетический тп свечения ассоциируется с ослаблением всех имеющихся взаи-

мосвязей между параметрами иммунного и липидного гомеостаза, снижением доли участия рецепторного фактора в регуляции СРП в лимфоцитах и уменьшением содержания CD3 и CD4 -антигенов на Т-клетках. Содержание С08-позитивных лимфоцитов возрастает, наряду с повышением силы корреляционной связи этих показателей с уровнем антиок-сидантной активности липидной фазы и хемилюминесцентного ответа клеток. Многофакторный анализ изучаемых компонент позволил установить, что 1 тип хемилюминесцентного ответа лимфоцитов находится в сильной корреляционной взаимосвязи с экспрессией определенных рецепторов на мембранах иммунокомпетентных клеток. Сила взаимосвязи возрастает в ряду ацетилхолин-, CD4-, IgM-, CD3-, IgG-позитивные лимфоциты(г возрастет от 0,693 до 0,931).Следует отметить,что при гипертонической болезни у индивидов, получивших повышенные дозы ионизирующего облучения обнаруживается высокая степень корреляционной взаимосвязи между уровнем СРП и экспрессией лимфоцитами CDe-антигенов (г<0,9), что представляет интерес для уточнения механизмов патогенеза иммунных нарушений при данной патологии. При оценке содержания свободного холестерина в лимфоцитах, эритроцитах и плазме крови больных ХИБС, получавших аитигиперхо-лестеринемический препарат "Липостабил", выявлено перераспределение липида между клетгами и плазмой. Несмотря на снижение содержания свободного холестерина в плазме крови и лимЗоцитах в 2,3 и 2,35 раза, соответственно, в эритроцитах его уровень возрос в 2,2 раза (у одного из больных - в 3,8 раза), что может обуславливать нежелательные гемодинамические эффекты. Выявленный механизм перераспределения липидов между форменными элементами крови, изменяя состояние липидного комплекса мембран лимфоцитов, может быть ответственным, как показано выше, за изменения функционального состояния последних.

Данные проанализованы методами кластерного анализа с выявлением главных компонент, что может быть использовано в практике клинико-лабораторного исследования лиц, получивших повышенные дозы ионизирующего облучения, для индивидуализации диагностики и прогноза иммунных нарушений.

Для углубленного изучения выявленной при действии ксенобиотика, инфекционном процессе и ионизирующем облучении взаимосвязи СРП в липидах и рецепторного репертуара лимфоцитов мы провели серию экспериментов in vitro. Оценивали влияние окисляющего воздействия гидроген пероксидом на уровень СРП, антиоксидантную ак

тивность, экспрессию б популяции лимфоцитов периферической крови CD3, CD4 и CD8-антигенов,рецепторов к ацетилхолину, поверхностных иммуноглобулинов классов Ни 3 у больных ХИБС и у здоровых доноров. Установлено, что актиьация СРП в лимфоцитах крови доноров in vitro через 2 часа после инициации приводит к снижению экспрессии CD3, С04-антигенов и росту содержания IgG-позитивных лимфоцитов. Хемилюминесценция клеток при этом активируется, а антиокси-дантная активность снижается. Число клеток с пикнотическими ядрами в пробе составляет 7,3tfl,5X. Чэрез 48 часов наблюдается реэкспрес-сия CD3 и С04-антигенов и снижение содержания СП8-антигенов. Уровень хемилюминесценции при повторном внесении окислителя возрастает в значительно меньшей степени, а ангиоксидантная устойчивость клетки, определяемая по периоду индукции свечения, повышается. Это происходит без роста антиокислительной устойчивости липидной фазы, вероятно в результате стабилизации мембран на уровне рецеп-торного аппарата иммунокомпетентных клеток. При ХИБО, на фоне .ретроспективно измененного рецепторного репертуара лимфоцитов, происходит более длительная и интенсивная активация СРП в клетках. Это сопровождается снижением экспрессии CD3 и CD4 антигенов и рецепторов к ацетилхолину. Число клеток с пикнотическими ядрами составляет 6,4t_ 0,5%.Повышается экспрессия С08-антигенов. Антиок-сидантная защита лимфоцитов снижается. Учитывая сопряженность уровня СРП, антиоксидантной зашиты и рецепторного репертуара лимфоцитов, выявленную нами на моделях in vivo и in vitro, можно полагать, что процессы СРП в лимфоцитах могут ограничиваться рецеп-торным фактором, "структурным антиоксидантом", определяемым пространственной ассоциацией и экспрессией на мембранах тех либо иных рецепторных образований. Изменения экспрессии на мембранах лимфоцитов определенных рецепторов при иммунных нарушениях, в частности CD3, CD4, CD8 -антигенов, рецепторов к ацетилхолину и поверхностных иммуноглобулинов классов М и G, способствуют снижению эффективности структурной антиоксидантной зашиты, гиперактивации процессов липоперерокисления,- росту, а затем истощению антиоксидантной устойчивости мембранных липидов и функциональной дезориентации клетки.

Таким образом, проведенный анализ свидетельствует об участии свободнорадикальных механизмов в регуляции иммунных процессов, в формировании функциональной.и фонотипической ориентации лимфоцитов-и в детерминации иммунных нарушений, обосновывая па-

тогенетическое значение антиоксидантной и липидонормализующей терапии в иммунокоррекции.

ВЫВОДИ

1. Динамика свободнорадикальных процессов в иммунокомпе-тентных клетках находится во взаимозависимых регуляторных соотношениях с их функциональной и фенотипической ориентацией, детерминирует изменения структуры и состава липидного комплекса мембран в физиологических условиях и при развитии Иммунных нарушений, определяя их течение, исход и эффективность иммунокор-ригируюших мероприятий.

2. Установлены особенности взаимосвязи состояния жирнокис-лотного состава фосфолипидов, содержания свободного холестерина и продуктов ПОЛ, микровязкости липидной фазы, ее антиоксидантной устойчивости, кинетики хемилюминесценции при добавлении инициаторов и функциональной активности Мононушеаров и нейтрофильных гранулоцитов в нормальных физиологических условиях и при развитии патологических процессов, что может служить ранними диагностическими и прогностическими критериями формирования иммунных нарушений.

3. При иммунизации кратковременное изменение параметров липидного бислоя лимфоцитов с активацией свободнорадикальных процессов, ростом антиоксидантной активности и окисляемости липидов, транзиторным снижением экспрессии Гс^--рецепторов и повышением экспрессии Бс^ -рецепторов носит адаптационный характер и способствует реализации функциональных возможностей иммунокомпетентных клеток.

4. Длительная активация свободнорадикального окисления в мембранах лимфоцитов при действии ксенобиотика, инфекционном процессе или ионизирующем облучении изменяет физиологические параметры липидного бислоя, ведет к истощению субстрата окисления,угнетению метаболизма жирных кислот фосфолипидов, накоплению свободного холестерина, снижению микровязкости мембран, угнетению активности циклазных ферментных каскадов, что обуславливает снижение содержания хелперной субпопуляции Т-клеток,- угнетение индуцированного митогенеза, киллерной активности лимфоцитов И развитие иммунологической недостаточности.

5. Экспериментальная стафилококковая инфекция сопровождается Формированием ШЗТ к антигенам стафилококка, интенсивность которой определяется уровнем свободнорадикального окисления и состоя-

нием микровязкости мембранных липидов лимфоцитов. Рост устойчивости липидов к окислению и уменьшение их микровязкости обуславливают более легкое течение инфекционного процесса и способствуют повышению уровня развития ПЧЗТ. Увеличение микровязкости и истощение антиоксидантной защиты мембран утяжеляют прогноз , обуславливая снижение функциональной активности лимфоцитов, угнетение развития ПЧЗГ и гибель экспериментальных животных. Формирование ПЧЗТ можно рассматривать как результат адаптации лимфоцитов к повышенному уровню свободнорадикального окисления мембранных липидов путем роста антиоксидантной устойчивости и изменения структуры липидной фазы.

6. При радиационном воздействии наблюдается активация сво-боднорадиглльных процессов, динамика которых в иммунокомпетентных метках имеет две фазы. <1аза компенсации ассоциируется с иммуно-стимуляцией на фоне активации липидного метаболизма, повышения антиоксидантной защиты липидного бислоя и изменения его структурно-функциональных характеристик. При действии высоких доз радиации процесс переходит во вторую фазу - истощения, характеризующуюся угнетением метаболизма липидов, накоплением в клетках свободного холестерина, угнетением индуцированного митогенеза, снижением экспрессии СБЗ, СЭ4-антигенов и развитием иммунологической недостаточности.

7. Система поддержания состава рецепторов лимфоцитов взаимосвязана с системой регуляции гомеостаза мембранных липидов и определяет функциональные возможности клетки. Снижение ненасыщенности жирнокислотного состава фосфолипидов и окисляемости липидной фазы, повышение ее микровязкости и рост уровня свободного холестерина сопровождаются увеличением активности супрессорной популяции - лимфоцитов.

8. У лиц, получивших повышенные дозы ионизирующего облучения при ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, нарушаются регулятор-ные взаимосвязи между системой клеточных рецепторов, свободнора-дикальными процессами и гомеостазом- мембранных липидов, что приводит к функциональной дезориентации лимфоцитов и является ранним диагностическим признаком развития иммунных нарушений.

9. Повышение устойчивости к повторному окисляющему воздействию в лимфоцитах крови здоровых доноров сопровождается повышением экспрессии СБЗ, С04-антигенов и поверхностных иммуноглобулинов

класса G. Ретроспективно пониженное содержание CD3, CD4-позитивных и повышенное содержание CDS-позитивных лимфоцитов у больных ХИЕС ведет к гиперактивации свободнорадикальных процессов, снижению устойчивости клеток к окисляющим воздействиям и их функциональной дезориентации.

10.d-токоферол обладает дозозависимым иммунокорригирующим действием, нормализуя структурно-функциональные параметры ли-пидного бислоя в зависимости от его исходного состояния. Дозы препарата 0,5 мг/кг массы на ранних этапах стафилококковой инфекции и при .введении тетрахлорметапа оказывают «ммунопротек-тивный эффект, а дозы SO мг/кг массы вызывают стимуляцию индуцированного митогенеаа, но угнетение киллерной активности лимфоцитов у иммунодефицитных животных, что необходимо учитывать при назначении препарата.

11. Для коррекции нарушений в иммунной системе целесообразно направленное воздействие на липидную матрицу мембран лимфоцитов с предварительной нормализацией ее состава и структуры, что достигается поэтапным сочетанным применением антиоксйдантов и иммуномодуляторов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОЮТШКОВАШШ ПО ТЕШ! ДИССЕРТАЦИИ.

1. Афонина Г. Б. Изменения липидов мембран И функции лимфоцитов при стафилококковой инфекции и формировании IM3T // Дурнад микробиол. эпидемиол. и иммунобиол.-1990.-N6.-С. 76-79.

2. Афонина Г. Б. Изменения окислительного метаболизма и функции иммунокомпетентных клеток при действии левамизола и й-токоферола у крыс с вторичным иммунодефицитом // иммунология и аллергология.-Киев: Здоров"я, 1989.-Вьп. 23.-0.115-116.

3. Афонина Г. Б. Ацетилхолиповые рецепторы лимфоцитов как регуляторы их функции // Реактивность и резистентность:- фундаментальные и прикладные вопросы.-Киев, 1987.-С. 22-23.

4. Афонина Г. Б. оценка терапевтической эффективности имьф-нокоррекции // 14 Республ. конф. медиков Грузии: Гез. докл.-Ба-куриани, 1987.-С. 245-246.

5. Афонина Г. Б. Биохимические механизмы иммунорегуляции в норме и патологии // Биохимия медицине: молекулярные механизмы формирования патологических состояний.-Ленинград, 1988.-С. 30-31,

6. Афонина Г. Б. Влияние окислительного стресса на рецепторы лимфоцитов // Стресс и иммунитет: Тез. докл. -Ростов-на-Дону,

1989. -С. 104-105.

7. Афонина Г. Б. , Бордонос В. Г. Роль свободнорадикального окисления липидов мембран лимфоцитов в развитии иммунологической недостаточности и ее коррекция «-токоферолом // Иммунология. -1990.-N5.-С. 33-35.

8. Афонина Г. Б., Брюзгина Т. С., Глебова JLIL и др. Изменения структуры мембран и функции лимфоцитов при свободноради-кальном окислении в норме и патологии // Деп. редкол. жури. Иммунология в ВИНИТИ. N576-В, от 05. 02. 91г.

9. Афонина Г. Б., Бордонос В. Г. Изменения структуры мембран и функции лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов в норме и при патологии//Иммунология и аллергия. -Киев: Здоров"я, 1991. -Вып. 24. -С, 103-105.

10. Афонина Г. Б., Бордонос В. Г. Изучение мембранных механизмов формирования ГЗТ к стафилококку // Проблемы региональной аллергологии; Тез. докл.-Ташкент, 1989.-с. 24.

11. Афонина Г. Б., Бордонос В. Г., Хзмазюк ЕЕ Состояние сво-боднорадикальных процессов в лимфоцитах крови ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС//Итоги оценки мед. последствий аварии на ЧАЭС: Тез. респ. конф.-Киев, 1991.- С. 13-15.

12. Афонина Г. Б., Блохина Е. В., Брюзгина Т. С. и др. Роль свободнорадикальных процессов в формировании иммунологической недостаточности при радиационном воздействии // Экологические проблемы иммунологии: Tea докл.-Минск, 1990.-С. 50.

13. Афонина Г.В., Брюзгина Т.С., Кравченко Э.Я. Применение антиоксидантов для регуляции ПОЛ в иммунокомпетентных клетках // Биоантиоксидант.-Москва, 1989.-С. 146-147. '

14. Афонина Г. Б., Брюзгина Т. С., Кравченко Э. Я. Изучение дозозависимого действия о<-токоферилацетата на иммунный ответ // Проблемы клинической и экспер. фармакологии и побочного действия лекарств, препаратов: Тез. 5 Шждунар. конференции.-Тбилиси, 1990. -С. 172.

15. Афонина Г. Б., Брюзгина Т. С. , Кравченко Э. Я. Изменения липидов Мембран лимфоцитов при иммунизации и стафилококковой инфекции // Журнал микробиол. зпидемиол. и иммуноОиол.-1991. -N6.- С. 71-76.

16. Афонина Г. Б. , Глебова Л. П., Бурлай В. Г. Определение сенсибилизации к стрептококку в диагностике латентно протекающих миокардитов // Деп. журн. "Лаборат. дело" в НПО" союзмедин-

форм", N Д20595, 18.10.90г.

17. Афонина Г. Б. , Колесников (Л М. Развитие повышенной чувствительности замедленного типа при действия ботулинического токсина // Иммунология и аллергология. -Киев: 8доров"я, 1987. -Вып. 21.-С. 102-105.

18. Афонина Г. Б. , Корницкая А. И., Милютина Е П. Сочетанное применение иммуномодуляторов и антиоксидантов при коррекции вторичных иммунодефицитов // Актуальные проблемы иммунотерапии: Тез. докл. Республ. конфер.-Ворошиловоград, 1988.-С. 10-11.

19. Афонина Г. Б. , Майданник В. Г. Клинические аспекты применения хемилюминесцентного анализа (Обзор литературы) // Вра-чебн. дело.-1990.-N9.-С. 73-76.

20. Афонина Г. Б. , Марченко Е Е , Вордонос В. Г., Моргунов И. Е Способ количественной оценки иммуноглобулинсвязыВающей способности Т-хелперов и Т-супрессоров // 1 научная конференция "Изобретательство и рационализация на соврем, этапе развития здравоохран: Тез. дои. - Киев, 1988.-С. 4.

21. Афонина Г. Б., Моргунов 0. И. Хемилюминесценция мембран лимфоцитов при действии бактериальных антигенов // 7 съезд Ук-ранск. микробиол. общества: Тез. докл. -Черновцы, 1989. -С. 129.

22. Шохина Е. В. , Афонина Г. Б. Синтетическая активность лимфоцитов как критерий эффективности пострадиационного восстановления иммунного статуса // Реабилитация иммунной системы: Тез. докл. Мевдунар. симпозиума.-Цхалтубо, 1990.-С. 51-52.

23. Еордонос В. Г., Афонина Г. Б. , Глебова Л. Е , Заяц Т. А. Различное восстановление ЕК-клеток иммуномодуляторами и антиок-сидантами при коррекции вторичного иммунодефицита у крыс // 1 Всесоюзн. съезд иммунологов: Тез. докл. -Сочи, 1989. -С. 176.

24. Бордонос Е Г., Афонина Г. Б. , Куюн Л А. И др. Влияние микроволновой резонансной терапии на липидную пероксидацию и функциональное состояние лимфоцитов /У фундаментальные и прикладные аспекты применения миллиметрового эл. магнитного излучения в медицине: Тез. докл. 1 Всесоюзн. симпозиума с межд. участ. -Киев, 1989.-С. 303-304.

25. Бордонос В. Г., Гаркавая Е. Г., Афонина Г. Г. и др. Иммунные реакции животных при воздействии на организм разбавителя эпоксидных смол УП-616 // Гигиенические вопросы взаимодействия организма с факторами окруж. среды'разной природы.-Киев: Типограф. мед. института, 1984. -С. -126-130.

- 34 -

26. Глебова JL П., Афонина Г. Б. , Бурлай В. Г. Диагностическая ценность иммунологических показателей при ревматических и неревматических кардитах // Врачебное дело.-1991.-N5.-С. 37-39.

27. Гоц Ю. Д., Попович Е. Б., Афонина Г. Б. и др. Влияние локализованной синегнойной инфекции на факторы естественной невосприимчивости и иммунологическую реактивность организма //Гигиенические вопросы взаимод. организма с факторами окруж. среды разной природа-Киев: Типограф, мед. института, 1984.-С. 152156.

26. Губский Д И., Афонина Г. Б, Брюзгина Г. С. и др. Влияние левамйзола на функциональную активность и жирнокислотный состав лимфоцитов при повреждении клеточных мембран тетрахлорметаном // Вопросы мед. химии.-1989. - N2. -С. 64-68.

29. Губский К1 И., Афонина Г. Б., Гаркавая Е. Г. Левамизол как модулятор иммунологической реактивности при действии тетрахлор-метана // Реактивность и резистентность: фундаментальные и прикладные воцросы. - Киев, 1987.-С. 58-60.

30. Лэгановская Е. И., Каткова Я А., Афонина Г. Б. Нарушения иммунологической реактивности и их коррекция у больных одонто-генными флегмонами // Коррекция нарушений иммунологической реактивности: Тез. докл. 6 Республ. конференции. -Киев - Ив.-Фран-ковск. 1983.-С. 127.

31. йайданник а Г. , Афонина Г. Б., Бордонос а Г. , Багдаса-рова И.Е Хемилкшнесценция сыворотки крови и мочи у детей больных пиело- и гдоиерулонефритом // Шдиатрия. -1989. -N12. -С. 43-47.

32. Цайдацник а Г., Французова с. Б., Афонина Г. Б. Влияние «-токоферола На обмен адениПнуКлеотидов в печени при остром экспериментальном пиелонефрите // Биоантиоксидант. -Москва, 1989.-С. 46-47.

33. Марченко R Е , Бордонос В. Г., Афонина Г. Б. К изучению активности регуляторных субпопуляций лимфоцитов // Реактивность и резистентность: Фундаментальные и прикладные вопросы. -Киев, 1987. - С. 100.

34. Митченко И. К. , Бордонос В. Г. , Дехтяренко 0. И. , Куюн X А., Афонина Г. R и др. Циркулирующие иммунные комплексы и состояние Т и В-звеньев системы иммунитета у больных вирусным гепатитом // Врачебн. дело.- 1987.-NS.-С. 119-120.

35. Моргунов И. а , Афонина Г. Б. , Бордонос В. Г. и др. Роль

изменений рецепторов к ацетилхолину в патогенезе ботулинической интоксикации // Актуальные вопроси современной физиологии.-Ки-ев: Наукова думка, 1986.-С. 210-211.

36. Моргунов И. Н. , Афонина Г. Б.', Бордонос Е Г. Иммунодефицит ы, вызванные экзотоксинами бактерий как причина иммуностиму-ляции и аллергизации организма // Иммунодефицита и аллергия: Тез. докл. всесоюзн. симпозиума с междунар. участием.-Москва, 1986.-С. 263-264.

37. Моргунов 0. И. , Бордонос В. Г., Афонина Г. Б. и др. Применение микроволновой резонансной терапии при активации свобод-норадикального окисления в клеточных мембранах // фундаментальные и прикладные аспекты применения миллиметровго эл. магнитного излучения в медицине: Тез. докл. 1 всесоюзн. симпозиума с междунар. участием.-Киев, 1989.-С. 232.

38. Сахарчук И. И., Бордонос Е Г., Афонина г. Б. и др. Принципы коррекции иммунных нарушений у больных хрбкическим легочным сердцем // Иммунол. реактивность в патологии: Тез. докл.-Винница, 1979.-С. 29.

39. Бордонос а Г., Афонина Г. Б. Функциональное состояние регуляторных субпопуляций лимфоцитов у больных хроническим легочным сердцем //Тез. доклада республ. съезда медиков Грузии. -ТбИЛИСИ, 1986: -С. 186.

40. Afonina G. В., Chomazuc l.N. , BruzginaT^S. et al. The state of lymphocytei lipid complex ih cardiovascular pathology// J. Intern. Med.-1990.-V. 228.-Suppl. 733.-P. 1.

41. Afonina S. B. The receptor to acetylcholine and peroxide oxidation of membrane lipids of iimwnocytes by the delyed hypersensitivity // 13 Int. Congr. of All erg. and Clin. Immunol.-Montreux, 1988.-P. 779.

42. Afonina 3. B. The change of the immunocyte membranes by the development and correction of secondary immunodeficience in rats // 9 Europ. Immunol. Mitting: Abstr. book. - Roma, 1988.-P. 75.

43. Afonina S. B. , Bordonos V. G. , Kuyn L. A. Differentiation of lymphocytes and receptors to acetylcholine // Europ. Development Biol. Congress: AbStr. book.:Helsinki7 1987.-P. 340. ' ,

44. 'Afonina G. B. , Bordonos V. G. , Bruzgina T. S. et al. Gaschromatographiс investigation of phospholipids of immunocytfe

membranes // 17 Intern. Symposium on Chromatography.-V/ien, 1988.-P. 125.

45. Afonina G. В., Bordonos V. G. Structural antioxidant of lymphocyte // Int. Syirp, on problems of resuscitation, intensivi therapy emergency and disaster medicine.-Telavi, 1990.-P. 21-24.

46. Afonina G. B. , Bruzgina T.S. , Kravhcenco E. Y. The generation of free radicals by the lymphocytes menbranes in norm and by the immunodeficiency in rats // 14 Int. Congr. of Biochem: Abstr. book. -Praga, 1988. -P. 193.

'47. Bordonos V. S. , Afonina 0. В., Bruzgina Т. S. Tocoferol action on the immune respons // 7 Intern. Congress of Immunol: Abstract book.-Berlin (West), 1989.-P. 288.

48. Morgynov I. N. , Afonina 6. B, Bordonos V. G. The role of acetylcholine in neuro-immune interaction // 8 Europ. Immunol. Congress: Abstr. book. - Zagreb, 1987. -P. 60.

49. t.forgynov 0. I., Afonina Q. B. Relation between fluorescent spectrum shift and chemiluminescence of' patients lymphocytes // 19 Europ. Congr. of Molecul. Spectroscopy: Abstr. book. -Dresden, 1989. -P. 170.

50. Vozjanova Zh. I., Bordonos V. G., AfoninaG.B. et al. Antipancreatic lypoproteid antibodies detection of patients with hepatitis virus // J. Hepatitis Memoranda -N2. -P. 19-21.

СПИСОК ИЗОБРЕТЕНИЙ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Способ получения антисыворотки / А. С. N 1431091 от 25.07,86 г. (соавт. Вордонос ЕГ., Моргунов И. Е , Колесников ИМ.).

2. Способ определения сенсибилизации к аллергенам / А. С. И 1569705"от 08.02. ВО г. (соавт. Бордонос В. Г. , Губский Ю. И, ).

3. Способ диагностики т-иммунодефицита /А. С. N 1585707 от 16.04.90 г. (соавт. Павленко В. А., Глебова Л. П., Ищэнко Е. М.).

4. Способ диагностики ревматического миокардита / А. С. N 1561038 от 15.04.90 г. (соавт. Бордонос В. Г. , Глебова Л. П.).

5. Способ коррекции нарушений Т-клеточного звена иммунной системы / А. С. N 4476124 от 28.12.89 г. (соавт. Бордонос В. Г., Глебова Л. П.).

6. Способ определения индивидуальной чувствительности к им-муномодуляторам / Полож. решение N 4812331 от 19.11.90 г. ( соавт.

tob / Полож. решение N4430606 от 28.11.90 г. ( ссавт. Дышловой В. Д., Бордонос В. Г. , Марценюи П. П. , Гариавач Е. Г.).

1. Унифицированные иммунологические методы обследования больных на амбулаторном и стационарном этапах лечения,- Киев, 1988.-18 с. ( соавт. Чернушенко Е. Ф., Когосова Л. С. , Бордонос В. Г. и др).

1. Реакция бласттрансформации лимфоцитоп для диагностики бактериальной аллергии // Вып. 12 по проблеме "Реактивность организма и аллергия".-Киев, 1984.-3 с. (соавт. Бордонос В. Г. и др.)

2. Методика оценки функциональной активности Т-хеллеров и Т-супрессоров // Еип. 4 по проблеме "Иммунология и аллергология". -Киев, 1986.-2 с. (ссавт. Бордонос В. Г., Моргунов И. И , Марченко Н. Н.).

3. Способ газохроматографического определения жирных кислот и свободного холестерина из одной биологической пробы //Вып. 5 по'проблеме "Биологическая и медицинская химия".-Киев, 1989,3 с. (соавт. Брюзгина Т. С., Кравченко 9. Я.).

4. Методика определения сенсибилизации к аллергенам // ■Вып. б по проблеме "Иммунология и аллергология".-Киев, 1980.-3 с. (соавт. Бордонос В. Г., Губский Ю. !1 , Скрипка ЛИ.).

1. Способ газохроматографического определения жирных кислот и свободного холестерина из одной биологической пробы (Удостоверение N 872 от 13.02.89 г. ).- Соавт. .Брюзгина Т.С., Кравченко Э. Я

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ШЕЕОГМАЦИОНИхЕ ПИСЬМА.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ