Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Исследование р53-зависимых сигнальных путей, ответственных за поддержание целостности генома

На правах рукописи УДК 618.14-006-092.9

РГБ ОД

о; коз

ТУРОВЕЦ Николай Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ р53-ЗАВИСИ1\1ЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА ПОДДЕРЖАНИЕ ЦЕЛОСТНОСТИ ГЕНОМА

(Специальность 14.00.14)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1999

Работа выполнена в НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН, директор НИИ канцерогенеза - академик РАЕН Д.Г. Заридзе, директор ОНЦ РАМН - академик H.H. Трапезников.

Научный руководитель:

доктор биологическиж наук Б.П. Копнин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.Г. Татосян доктор биологических наук B.C. Прасолов

Ведущая организация:

Медико-генетический центр РАМН

Защита диссертации состоится J К od

на заседании специализированного Ученого Совета (К.001.17.01) при

ОНЦ РАМН (Москва, 115478, Каширское ш., 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН.

Автореферат разослан I9§ji

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета доктор медицинских наук, профессор B.C. Турусов.

f= СЧГ.Ч.О Д.Ptb-I4i

(У

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность проблемы

Генетическая нестабильность - характерная черта неопластических слеток, предопределяющая неуклонную прогрессию опухолей, выражающуюся } появлении и отборе все более и более агрессивных клонов. Убедительно тродемонстрировано, что ключевую роль в возникновении генетической нестабильности в неопластических клетках могут играть нарушения функции опухолевого супрессора р53, мутации которого являются самым частым "енетическим изменением в различных новообразованиях человека. Физиологическая функция этого белка, являющегося транскрипционным {¡актором, заключается в предотвращении пролиферации клеток, в которых уже троизошли или еще только могут произойти генетические изменения. В основе такой активности р53 лежит его способность активироваться при самых разных 5нутриклеточных аномалиях и вызывать в ответ на их возникновение либо зстановку клеточного цикла в определенных его точках (т.н. чекпойнтах или 'сверочных точках"), либо 'апоптоз (программируемую гибель клеток). Нарушение охранной функции р53 резко увеличивает скорость накопления слеток с самыми разными изменениями генома: разрывами и рекомбинациями сромосом, изменениями числа хромосом, амплификацией генов и, как ;ледствие, резко повышает вероятность развития новообразований. Однако до :их пор остается неясной роль отдельных сигнальных путей, контролируемых )53, в поддержании генетической стабильности.

1.2. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение роли отдельных элементов :игнальных путей р53 в контроле генетической стабильности. Было спланировано решение следующих экспериментальных задач:

1. Провести сравнительное исследование влияния гомозиготного нокаута енов р21ШАЛ (мишень трансактивационного действия р53), рЯЬ (мишень

p21WAF1) и pli)1^ (обеспечивает активацию р53 при некоторых аномалиях) на функциональную активность сверочных точек клеточного цикла, регуляцию индукции апоптоза при повреждениях ДНК и частоту возникновения числовых и структурных изменений хромосом в культивируемых in vitro мышиных эмбриональных фибробластах.

2. Изучить генетические последствия подавления в клетках человека и крысы функции недавно идентифицированного опухолевого супрессора рЗЗ11401 - кофактора транскрипционной активности р53.

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы.

Показано, что инактивация генов р53, p21WAF1, INK4a/ARF или Rt ослабляет эффективность работы сверочной точки клеточного цикла в G1 и значительно увеличивает частоту изменений кариотипа в пролиферирующи> клетках. При этом продемонстрировано, что степень генетическор нестабильности при нокауте указанных генов неодинакова: наибольшая частот, спонтанных и индуцированных изменений хромосом наблюдается npi инактивации гена р53, а наименьшая - при нокауте гена Rb. Обнаружено, чт< уровень хромосомной нестабильности в клетках с инактивированной функцие( сверочной точки в G1 зависит от уровня подавления в них реакций апоптоза Впервые показано, что трансдукция в р53-позитивные крысиные и человечески! клетки генетического супрессорного элемента рЗЗ-GSEas, понижающей экспрессию рЗЗшш, ослабляет эффективность работы сверочных точе клеточного цикла в G1 и S, и повышает частоту разрывов хромосом сестринских хроматидных обменов и изменений копийности генов. Показанс что генетические последствия трансдукции рЗЗ-GSEas, ингибирующег экспрессию рЗЗШС|, не отличаются от эффектов, наблюдаемых при трансдукци p53-GSE22, подавляющего транскрипционные активности р53 но доминантнс негативному механизму.

Результаты проведенной работы способствуют лучшему пониманию еханизмов опухолевой прогрессии, что является важным для создания ринципиально новых методов лечения злокачественных новообразований.

1.4. Апробация работы.

Диссертация апробирована 18 июня 1999 года на совместной научной энференции лабораторий цитогенетики, генетики опухолевых клеток, еханизмов канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов.

1.5. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 4 научные сгатьи.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1 Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, адержит 5 таблиц и 13 рисунков. Состоит из введения, глав: обзор литературы, атериалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение элученных результатов и выводов. Список литературы содержит 323 :точника, в том числе 4 отечественных.

2.2. Результаты 2.2.1. Сравнение влияния инактивации генов р53, р21™АР\ р16|",и,/р19АИ' и ИЬ на стабильность генома

2.2.1.1. Влияние нокаута геновр53, р21'УЛР', р1б'*иа 'р17ш и ЯЬ на частоту числовых и структурных нарушений хромосом в митотических клетках.

Для выяснения роли отдельных р53-регулируемых сигнальных путей в >нтроле целостности генома изучена частота числовых и структурных юмосомных аберраций в культурах мышиных первичных эмбриональных ибробластов с гомозиготным нокаутом генов р53, р21ШАР (мишень

трансактивационного действия р53, ответственная за остановку поврежденнь клеток в G1 фазе клеточного цикла), pRb (мишень p21WAF, контролирующ; переход из G1 в S фазу) и pl9ARF (обеспечивает активацию р53 при некоторь аномалиях). С этой целью были использованы сублинии MEF-p53-/-, ME p21WAF-/-, MEF-INK4a/ARF-/-1, MEF-Rb-/- на 4-8 пассажах in vitro (любез! предоставлены Dr. T.Jacks, Massachusetts Institute of Technology Center for Cane Research, Cambridge; Dr. S.Lowe, Cold Spring Laboratory; и Dr. A.V.Gugko Illinois University at Chicago).

Цитогенетический анализ этих сублиний показал, что частота спонтаннь структурных и числовых изменений хромосом в них значительно выше, чем контрольных культурах первичных мышиных эмбриональных фибробласт (МЭФ). Так, если в культурах МЭФ среднее число незарепарированш разрывов составляло 0,18x10"3 на хромосому, то во всех остальных сублини этот показатель колебался от 0,46x10° до 1,52x10(Табл. 1). При это наблюдались существенные различия между клетками с нокаутом разных гене Наименьший уровень повышения числа спонтанных разрывов хромое« наблюдался в культурах MEF-Rb-/- и MEF-INK4a/ARF-/-, а наибольший -культурах MEF-p53-/-. Такая же закономерность наблюдалась и при анали разрывов хромосом, индуцированных алкилирующим соединение этилметансульфанатом (ЭМС). В культурах клеток с нокаутированными гена1 р53 и р21WAF1 их число повышалось, соответственно, в 14 и 15 раз, в то вре как при инактивации генов Rb и INK4a/ARF в 5 и 10 раз (Табл. 1). Более того сублинии MEF-p53-/- после обработки ЭМС мы не нашли ни одной метафазн пластинки, в которой не было бы повреждений хромосом, тогда как доля так метафаз в культуре MEF-Rb-/- составляла около 32%. Важно заметить, что г не смогли определить частоту индуцированных хромосомных разрывов первичных эмбриональных фибробластах, поскольку культивирование их

1 Локус 1МК4а/А11Р кодирует два негомо.югичных белка - ингибитор циклюмавнеимых киназ С<1к4(6) р16 и р19АКГ. являющихся проду ктами альтернативных рамок считывания, В клетках сублинии МЕР-1МК4а/ проведена делеция оюонов 2 и 3 данного локуса. что привело к инактивации как р161КК'1". так вр19ш.

ечение 24 часов в среде, содержащей 600 мкг/мл ЭМС, приводило к [счезновению митозов (митотический индекс снижался более чем в 16 раз и оставлял <0,001).

Табл. 1. Влияние инактивации локусов р53, р21 WAF1,1№С4а-АКР и ЯЬ

на частоту спонтанных и индуцированных разрывов хромосом "

Клетки Метафазы с разрывами, о/ /о Число разрывов на хромосому6, х10 л

Контроль ЭМС* Контроль ЭМС'

iEF-p53-/- 40,0 ± 0,7 100,0г 1,52 ±0,09 21,43 ± 1,17

4EF-p21WAFl-/- 32,0 ± 0,6 98,0 ± 1,9 0,89 ± 0,05 13,89 ±0,72

(ffiF-INK4a/ARF-/- 18,0 ±0,3 72,0 ± 1,3 0,52 ± 0,03 5,34 ± 0,49

1EF-Rb-/- 18,0 ±0,3 68,0 ± 0,8 0,46 ± 0,04 2,46 ± 0,32

1ЭФ 10,0 ± 0,2 н.о.д 0,18 ±0,02 H.O.d

Представлены суммарные результаты трех независимых экспериментов Поскольку число хромосом в клетках сильно варьирует (см. рис.1), представлено эличество незарепарированных разрывов на хромосому.

ЭМС - этилметансульфонат, бООмкг/мл, 48 часов.

Поскольку полученная нами экспериментальная выборка из генеральной совокупности \н. выборочная совокупность [Рокицкий, 1967]) имеет равномерное распределение (во :ех проанализированных митозах были обнаружены разрывы хромосом), значение ■атистической ошибки могло быть оценено только "сверху" как < 1%. Соответствующий шной оценке доверительный интервал имеет вид [100,0; 99,0).

Обработка ЭМС мышиных эмбриональных фибробластов вызывала остановку клеточного лкла (митотический индекс снижался с 0,016 до < 0,001), в связи, с чем определить долю ;лящихся клеток с незарепарированными разрывами хромосом не представлялось

)ЗМОЖНЫМ.

601 MEF-p53 -/-

40 '

20 -

0

40

20 0

-_М_И ■-L

35 85 135 185

60

MEF-p21WAF -/-

■ ■ ■ ■ <

35 85 135 185

60 40

20 0

60 40

20 0

60 40 20 0

MEF-INK4a-ARF -/-

1

1

-Л-M

35 85 135 185

MEF-Rb -/-

35 85 135 185

МЭФ

35 85 135 185

Рис. 1. Распределение клеток по числу хромосом в культурах нормальных мышиных фибробластов (МЭФ) и их сублиниях с инактивированными генами р53, p21 WAF1, lNK4a-Ai и Rb. Абсцисса - число хромосом, ордината - процент клеток с данным числом хромосом

Наряду с повышением частоты хромосомных разрывов инактивация генов 53, р21адГАР1, ГИКЛа-АИР и ЯЬ увеличивает, по всей видимости, и вероятность оявления клеток с изменениями плоидносги. Клетки всех исследованных ублиний отличались от контрольных культур МЭФ большей гетерогенностью о числу хромосом (Рис. 1). При этом, вариабельность по числу хромосом оррелировала с повышением частоты хромосомных разрывов: наибольшие зменения обнаруживались в культуре МЕР-р53-/-, а наименьшие - в сублинии ШР-ЯЬ-/-.

2.2.1.2. Влияние инактивации генов р53, р2ГЛР1, р!61Ж4а/р19^р и ЯЬ на функционирование сверочных точек клеточного цикла в а и 02.

Поскольку накопление генетических аномалий обусловлено, в первую чередь, нарушениями охранных механизмов, обеспечивающих остановку оврежденных клеток в т.н. сверочных точках в и 02 фазах клеточного икла, было проведено сопоставление эффективности их работы в клетках сследуемых сублиний и в клетках контрольных культур МЭФ. Мы бнаружили, что добавление ЭМС к синхронизированным в 00/01 культурам 1ЭФ, вызывало остановку в 01 фазе клеточного цикла: число клеток, юпочающих 5-БДУ (т.е. входящих в Б фазу) снижалось более чем в 9 раз (Рис. ). В тоже время в культурах МЕР-р53-/-, МЕР-р21 \VAF1-/-, МЕР-МК4а/АИР-/-, ШР-ЯЬ-/- при аналогичных условиях подавляющее большинство клеток не станавливалось в 01 и входило в Б фазу. При этом, мы не выявили каких-либо гачимых различий между клетками с нокаутом разных генов (Рис. 2).

Клетки исследуемых сублиний существенно не отличались между собой и о способности поврежденных клеток переходить из 02 в митоз (Рис. 3). Во :ех культурах после обработки ЭМС ("600 мкг/мл) митотический индекс меньшался приблизительно в два раза. Сходная картина наблюдалась и в энтрольных культурах МЭФ, только доля останавливающихся клеток в них ыла несколько большей.

Рис. 2. Влияние инактивации генов р53, р21\УАР1, ШК4а-А11Р и ЯЬ на способность поврежденных мышиных эмбриональных фибробластов переходить из в Б фазу клеточного цикла.

Клетки синхронизировали в йО/а путем инкубации в бессывороточной среде в течениии 48 часов, инициировали их вход в Б фазу добавлением 10% сыворотки, добавляли последовательно ДНК-повреждающий агент (ЭМС, 600мкг/мп) и 5-бромдезоксиуридин (5-БДУ, ¡О'5М) и через 12 часов определят число клеток, включивших 5-БДУ.

Рис. 3. Влияние инактивации генов р53, р21ШАР1, ШК4а-АЯР и Из на способность мышиных эмбриональных фибробластов, обработанных ЭМС в 02 фазе клеточного цикла, входить в митоз.

ЭМС (бООмкг/мч) добавляли за 4 часа до фиксации и определят долю меток, находящихся в митозе

Таким образом, мы обнаружили, что инактивация генов р53, р21ХУАЛ, ГМК4а-АЯР и ЯЬ приводит к сходным нарушениям регуляции сверочной точки в 01, но не влияет существенно на остановку поврежденных клеток в 02 фазе клеточного цикла. Эти данные не могли объяснить дифференциальные эффекты нокаута отдельных компонентов сигнальных путей р53 на частоту появления клеток с генетическими аномалиями. Учитывая, что р53 регулирует не только клеточный цикл, но и ипотоз мы решили проанализировать жизнеспособность клеток исследуемых сублиний после действия мутагена и эффективность индукции в них апоптоза.

2.2.1.3. Влияние инактивации геновр53, р2111ЛП, р16КК4а'р19АКЕи М на жизнеспособность поврежденных клеток.

Сопоставив долю клеток, окрашивающихся трипановым синим (этот краситель попадает только в погибшие клетки) в разные сроки после добавления к культурам ЭМС, мы обнаружили различия в выживаемости клеток разных сублиний. Как через 24 часа, так и через 48 часов после добавления мутагена, наибольшее число погибших клеток обнаруживалось в культурах с нокаутом гена ЯЬ-/- (МЕР-ЯЬ-/-), а наименьшее - в культурах с чокаутом гена р53-/- (МЕР-р53-/-) (Рис. 4). Интересно, что наблюдаемый градиент жизнеспособности (МЕРр53-/- > МЕР-р21\УАР1-/- > МЕР-1МС4а/АЯР7- > МЕР-ЯЬ-/-) точно соответствовал градиенту частоты разрывов хромосом в этих культурах (Табл. 1). Следует подчеркнуть также, что в культурах нормальных МЭФ, которые в отличие от клеток с нокаутированными генами, после эбработки ЭМС останавливались в 01, существенной гибели клеток не наблюдалось (Рис. 4).

Чтобы подтвердить предположение о дифференциальном влиянии нокаута разных генов на эффективность индукции апоптоза в поврежденных <летках, мы сравнили долю ядер с типичными морфологическими признаками

апоптоза. Оказалось, что и по этому показателю исследуемые сублини» значительно отличались друг от друга, причем наблюдалась хороша* корреляция с результатами анализа выживаемости (Табл. 2).

Таким образом, исследовав нормальные мышиные фибробласты и го производные с нокаутом отдельных компонентов сигнальных путей р53, мь обнаружили, что генетическая нестабильность, в первую очередь детерминируется инактивацией сверочных точек клеточного цикла. Однако дополнительным фактором, сильно влияющим на степень нестабильносп генома, является подавление индукции апоптоза в генетически измененны: клетках. Ослабление функции сверочных точек в 01 и й2 при одновременно» подавлении сразу нескольких путей, запускающих апоптоз, по-видимому, ] обусловливает резкую дестабилизацию генома при нарушениях функцш опухолевого супрессора р53.

А? 100 -

X Н 80 -

9>

Ь 60 -

О

=1 40 -

О

* 20

Л

ш 0

24 часа

I I

1

Рис. 4. Влияние инактивации генов р53, р21 \VAF1, 11ЧК4а-АЯР и Шэ на выживаемость мышиных эмбриональных фибробластов в среде с ЭМС. Число клеток на момент добавления ЭМС принято за 100%.

Табл. 2. Влияние инактивации локусов р53, р21ШАР1, ШК4а-АКР и Шэ на частоту спонтанного и индуцированного апоптоза в культурах мышиных эмбриональных фибробластов

Клетки Доля клеток с апоптотическими ядрами, % "

Контроль ЭМС6

МЕР-р53-/- 12,7 ± 0,8 30,6 ± 2,2

14,2 ± 0,3 43,3 ± 2,2

МЕР-ШК4а/АИР-/- 23,4 ± 1,2 52,3 ± 2,7

МЕР-ЯЬ-/- 32,3 ± 1,6 65,3 ± 3,2

МЭФ 15,5 ±0,7 19,9 ± 0,9

4 Представлены суммарные результаты двух независимых экспериментов 6 ЭМС - этилметансульфонат, бООмкг/мл, 48 часов.

2.2.2. Влияние инактивации опухолевого супрессора рЗЗ0"01 на эффективность работы сверочных точек клеточного цикла и стабильность генома

2.2.2.1. Влияние трансдущии рЗЗ-С8Еаз на эффективность работы

сверочной точки в а. Для исследования влияния инактивации опухолевого супрессора рЗЗМС| на эффективность работы сверочных точек клеточного цикла и стабильность генома были использованы спонтанно иммортализованные крысиные эмбриональные фибробласты линии ЛЕР52, человеческие клетки рака восходящей толстой кишки линии ЫМ1215 и фибросаркомы линии НТ1080 (клетки всех этих линий экспрессируют р53 дикого типа и полученные ранее их

производные, в которые были трансдуцированы генетические супрессорные элементы, подавляющие функцию либо рЗЗШ01 (рЗЗ-ОБЕаз, экспрессирует фрагмент мРНК в антисмысловой ориентации), либо р53 (р53-05Е22, ингибирует трансактивационную способность р53 по доминантно-негативному механизму). В качестве контрольных использовали аналогичные сублинии, в которые были трансдуцированы векторы без вставки. Сублинии клеток ЯЕР52, ЫМ1215 и НТ1080, экспрессирующие р53-ОБЕ22 или рЭЗ-ОББая были получены в лаборатории П.М.Чумакова (Институт молекулярной биологии РАН).

Мы обнаружили, что в сублиниях 11ЕР52 и ЫМ1215 с введенным рЗЗ-СБЕаз наблюдается частичная отмена остановки поврежденных клеток в 01. Так, если в культуре контрольных клеток ЫЕР52/пео, синхронизованных в 00/01, после добавления ЭМС число клеток, включающих 5-БДУ (т.е. входящих в Б фазу) уменьшалось более чем в 7 раз и составляло менее 10%, то в культурах КЕР52/рЗЗ-05Еаз при аналогичных условиях не останавливалось в 01 и входило в Б фазу около 30% клеток (Рис. 5). Такая же картина выявлялась и при разрушении микротрубочек колцемидом (Рис. 5). Следует подчеркнуть, что в клетках линии ЯЕР52 действие рЗЗ-ОБЕаБ, подавляющего экспрессию рЗЗ1™1, практически не отличалось от эффекта, вызываемого трансдукцией р53-ОБЕ22, ингибирующего транскрипционную активность р53 по доминантно-негативному механизму: оба генетических супрессорных элемента примерно в равной степени инактивировали функцию сверочной точки в 01 (Рис. 5).

Сходные результаты были получены и при анализе клеток ЫМ1215, но степень проявления эффекта инактивации рЗЗ^01 в этих клетках была несколько ниже, чем в культуре ЛЕР52. Очевидно, это является следствием не столь ярко выраженной остановки в 01 фазе в ответ на действие цитостатиков, наблюдаемой в контрольных клетках ЫМ1215 (Рис. 5).

S 60

л

z

ш

s

о

с >

Ct Lü

40 -

20 -

о с

s х

rfl

REF52

rb

LIM1215

Л

□ контроль ШЭМС □колцемид

'Щ

рЗЗ-GSEas

р53-GSE22

neo

рЗЗ-GSEas

Рис. 5. Влияние трансдукции рЗЗ-ОБЕаБ и р53-ОБЕ22 на способность поврежденных клеток линий ЯЕР52 и Ь1М1215 переходить из О в Б фазу клеточного цикла.

Клетки синхронизировали в СО/О 1 путем инкубации в бессывороточной среде в течениии 48 часов, инициировали их вход в 5 фазу переводом в среду с 10% сыворотки, а затем добавлячи последовательно ДНК-повреждающий агент (ЭМС, б00мкг/.ш) или колцемид (100 нг/.ш) и 5-бро.мдезексокуридин (5-БДУ. ¡О'5 М) и через 12 часов определят число клеток, включивших 5-БДУ.

2.2.2.2. Влияние рЗЗ-GSEas на эффективность остановки клеток REF52 в S фазе клеточного цикла в ответ на воздействие PALA.

Как и другие исследователи [Agarwal ct al, 1998], мы наблюдали, что инкубация клеток REF52 в среде с PALA (30 мкМ) вызывает остановку клеточного цикла в S фазе. Об этом, в первую очередь, свидетельствуют результаты FACScan-анализа: через 48 часов после начала инкубации в среде с цитостатиком большинство клеток в популяции характеризовалось уровнем плоидности, промежуточным между 2п и 4п (Рис. 6), что свидетельствует о задержке клеток в S фазе. Об остановке клеточного цикла в этих культурах свидетельствует и тот факт, что они перестают включать предшественник ДНК.

После добавления 5-БДУ на 12 часов к культурам, предварительно инкубировавшихся с PALA в течение 3 суток, только 5-10% клеток окрашивались антителами на 5-БДУ, тогда как доля 5-БДУ-позитивных клеток в контрольных культурах, инкубировавшихся без PALA, составляла 70-80%. Клетки REF52 с трансдуцированным рЗЗ-GSEas, также как и клетки несущие p53-GSE22, угратили способность останавливаться в S фазе нри воздействии PALA. Согласно данным FACScan-анализа их распределение по количеству ДНК практически не отличалось от наблюдаемого в контрольных культурах (Рис. 6), а доля клеток включающих 5-БДУ составляла в них 50-60%. Таким образом, подавление экспрессии рЗЗша1 отменяет в клетках REF52 р53-зависимую остановку в S фазе, индуцируемую ингибитором обмена пиримидинов.

Известно, что в культурах, не способных отвечать остановкой клеточного цикла на недостаток пула нуклеотидов, возникающий при инкубации в среде с PALA, наблюдается быстрая гибель подавляющего большинства клеток и образование колоний из редких вариантов, в которых амплифицирован ген-мишень PALA - cad [Chemova et al, 1995; Agarwal et al, 1998; Livingstone et al, 1992; Yin et al, 1992; Stark et al, 1993]. Мы обнаружили, что в отличие от контрольных культур REF52, которые арестованы в S (Рис. 6) и не гибнут в среде с PALA в течение по меньшей мере 1,5 месяцев (другими исследователями было показано, что гибель не наступает и через 2-3 месяца [Agarwal et al, 1998]), клетки сублиний REF52/p33-GSEas и REF52/p53-GSE22 в аналогичных условиях погибают через 4-7 суток. Через 1-1,5 месяца в них с частотой примерно 5x10'5 на посаженную клетку возникают колонии устойчивых клеток, отсутствующие в культурах контрольных клеток REF52 (Табл. 3).

Контроль 48часов

PALA 17

REF52/neo

REF52/p53-GSE22

REF52/p33-GSEas

2n 4n

2n 4n

Рис. 6. Влияние трансдукции рЗЗ-GSEas и p53-GSE22 на распределение клеток по фазам клеточного цикла в культурах REF52, инкубировавшихся в среде с 30 мкМ PALA в течение 3 суток.

Абсцисса - плотность ДНК, ордината - число клеток с данной плоидностью согласно данным FACScan-анализа.

Табл. 3. Влияние экспрессии рЗЗ-GSEas и p53-GSE22 на поведение клеток REF52 в среде с PALA и частоту возникновения колоний, устойчивых к цитостатику

Клетки Поведение клеток в среде с 30 мкМ PALA Частота (хЮ5) PALA-устойчивых кдлоний*

REF52 Остановка в S; клетки не гибнут <0,01

REF52/p33-GSEas Гибель клеток 4,7+3,2

REF52/p53-GSE22 Гибель клеток 6,3+2,8

* Для каждой культуры приведены средние значения,

полученные в 3 независимых экспериментах.

2.2.2.3. Влияние трансдукции рЗЗ-СБЕаз на эффективность работы сверочной точки в 02.

Влияние инактивации рЗЗмси на функционирование сверочной точки клеточного цикла в определялась по способности к вхождению в митоз клеток, к которым ЭМС добавлялся за 2-4 часа до фиксации. В этом случае входящие в митоз клетки в момент добавления мутагена находились в а или поздней Б фазе. Мы обнаружили, что подавление экспрессии рЗЗМ01, как и нарушение функции р53 не отменяет задержки перехода поврежденных клеток из 02 в митоз. В культурах, экспрессирующих рЗЗ-СБЕаз или р53-ОБЕ22, также как и в контрольных культурах ЯЕР52/пео, обработка ДНК-повреждающим агентом вызывала уменьшение митотического индекса приблизительно в 2,5-3 раза (Рис. 7).

□ контроль

о

о о о

™ 20

а о

п О ь

О С и

? 0

пео

р331№1а/8

СБЕ22

г

не. 7. Влияние трансдукции рЗЗ-ОБЕаБ и р53-ОБЕ22 на способность оврежденных клеток И£Р52 переходить из 02 в митоз.

ЭМС (бООмкгли) добавляй! за 4 часа до фиксации и определят долю ■итотических клеток.

2.2.2.4. Влияние трансдукции рЗЗ-ОЯЕаъ на жизнеспособность поврежденных клеток.

Наряду с контролем работы сверочных точек клеточного цикла р53 существляет и регуляцию механизма апоптоза. Соответственно нарушение того механизма также может вызвать накопление различных генетических номалий. В связи с этим мы решили исследовать, каким образом уменьшение оличества р331Ж>1 и, по-видимому, ослабление транскрипционной активности 53 повлияет на выживаемость клеток. Сопоставляя доли клеток, имеющих зменения морфологии ядер, характерные для апоптоза или окрашивающиеся рнпановым синим в разные сроки после добавления к культурам клеток ЯЕР52 ЫМ1215 ЭМС, мы обнаружили, что экспрессия рЗЗ-ОБЕаз, ослабляя работу верочной точки в 01, несколько увеличивает "гибель клеток в результате поптоза (Рис. 8, Табл. 4).

100

* е ■ £

I5

рэзшси/»

доб.ЭМС

р331МО|«/|

сут

ж к

Рис. 8. Влияние экспрессии рЗЗ-СБЕаз на выживаемость клеток сублинии ЬГМ1215 и спонтанно иммортализованных крысиных эмбриональных фибробластов 11ЕР52 в среде с ЭМС (600 мкг/мл). Число клеток на момент добавления ЭМС принято за 100%.

Табл. 4. Влияние экспрессии рЗЗ-СБЕаБ на частоту индукции апоптоза в культурах клеток ЯЕР52 и ЫМ1215

1 ¡{летки Доля клеток с апоптотическими ядрами, % "

Контроль ЭМС0

ЫЕР52/пео 2,23 ±0,12 6,3 ± 0,4

ЯЕЕЗг/рЭЗ-СБЕаБ 2,94 ±0,15 14,2 ± 0,9

1ЛМ1215/пео 3,8 ± 0,2 35,2 ± 2,4

Ь1М1215/рЗЗ-08ЕаБ 3,4 ± 0,2 46,9 ±3,3

3 Представлены суммарные результаты двух независимых экспериментов

6 ЭМС - этилметансульфонат, бООмкг/мл, 48 часов.

2.2.2.5. Влияние инактивации гена р331Ж1 на частоту структурных и числовых изменений хромосом.

Цитогенетический анализ сублиний клеток ЯЕР52, ЫМ1215 и НТ1080 показал, что трансдукция рЗЗ-ОБЕаэ, как и экспрессия р53-С8Е22, существенно повышает вероятность появления разрывов хромосом в делящихся клетках (Табл. 5). Так, в клетках линии ЫМ1215 оба генетических супрессорных элемента примерно на порядок увеличивали долю метафаз со спонтанными разрывами хромосом и число разрывов на хромосому (Табл. 5).

Помимо увеличения числа хромосомных разрывов подавление экспрессии рЗЗ™1 приводило в клетках линий ЫМ1215 и НТ1080 к 2-3-кратному повышению частоты сестринских хроматидных обменов (СХО), причем и в этом случае эффект рЗЗ-ОБЕаз не отличался от действия р53-08Е22 (Табл. 5).

Наряду с повышением частоты структурных изменений хромосом инактивация рЗЗШ01, по всей видимости, увеличивает также вероятность появления клеток с изменениями плоидности. В частности мы обнаружили, что в культурах 1ЛМ1215/рЗЗ-05Еаз и ЫМ1215/р53-С8Е22 после инкубации с колцемидом (40 нг/мл, 48 час.) количество полиплодных клеток увеличивалось с 5-7% до 13-19%, в то время как в обработанных колцемидом культурах контрольных клеток ЫМ1215/пео число полиплоидов не превышало 8% (Рис. 9).

Таким образом, сопоставляя эффекты, вызываемые рЗЗ-ОБЕаз, подавляющего экспрессию рЗЗ^01 и р53-С8Е22, ингибирующего транскрипционную активность р53 по доминантно-негативному механизму, мы не обнаружили практически никаких различий в их действии на сверочные точки клеточного цикла и генетическую стабильность. По-видимому, дестабилизация генома, наблюдаемая при экспрессии этих генетических супрессорных элементов, связана с подавлением именно транскрипционных активностей р53.

Табл. 5. Влияние нарушений функции рЗЗ^01 и р53 на число спонтанных разрывов хромосом и сестринских хроматидных обменов (СХО) "

Клетки Метафазы с разрывами, % Число разрывов на хромосому6, хЮ"3 Число СХО на хромосому, хЮ"1

ЯЕР52/пео 16 ±0,7 2,3 ±0,15 и.о.'

ИЕР52/рЗЗ-08ЕаБ 48,9 ± 2,4 10,4 ±0,5

ЯЕР52/р53-08Е22 52,3 ± 2,6 10,8 ±0,5

ПМ1215/пео 1,35 ±0,07 0,28 ±0,014 0,82 ± 0,004

ЫМ1215/рЗЗ -СБЕаэ 11,2 ±0,6 2,60 ±0,16 2,16 ±0,010

ЫМ1215/р53-С8Е22 12,8 ±0,7 2,82 ±0,17 2,43 ±0,012

НТ1080/пео 6,9 ± 0,3 17,2 ±0,9 1,22 ±0,006

НТ1 ОвО/рЗЗ-СБЕаБ 16,4 ±0,8 47,6 ± 2,4 2,48 ±0,012

" Представлены суммарные результаты трех независимых экспериментов. В каждом опыте при подсчете числа хромосомных разрывов исследовали 75-100 метафаз на точку, а при анализе сестринских хроматидных обменов - 25-50 метафаз. При подсчете числа СХО суммировали число разрывов хромосом при данных СХО: терминальные обмены считали за 1, интерстициальные обмены - за 2. " Поскольку число хромосом в клетках варьирует в зависимости от культуры представлено количество незарепарированных разрывов на хромосому.

' Так как спонтанная частота СХО в контрольных клетках ЯЕР52/пео была очень высокой (более 3 обменов на хромосому, точное количество не поддавалось подсчету), то определить влияние трансдукции рЭЗ-ОБЕав на этот параметр не представлялось возможным.

20 1

- 15

10

□ контроль Е1 колцемид

■

пео р331МС1а/э 63Е22

5

Рис. 9. Влияние трансдукции рЭЗ-вБЕаз и р53-ОБЕ22 на частоту полиплоидных метафаз в обработанных колцемидом (40 нг/мл, 48 час.) культурах клеток 1ЛМ1215.

Представлены суммарные результаты двух независимых экспериментов; н каждой группе опыта проанализировано 1500-2000 метафаз.

выводы

1. Исследовано влияние инактивации генов р53, р21ад'АЛ, рШэ, р19АКР и рЗЗШ01 (кофактора транскрипционной активности р53) на функцию сверочныл точек клеточного цикла и генетическую стабильность. Показано, чтс подавление активности каждого из этих генов ослабляет эффективносп работы сверочной точки в 01, но не отменяет задержку поврежденныэ клеток в в2.

2. Инактивация генов р53, р21ШАП, рИЪ и р19АКР значительно увеличивает частоту изменений кариотипа в пролиферирующих мышины> эмбриональных фибробластах. При этом степень генетическое нестабильности при нокауте указанных генов неодинакова: наибольшая частота спонтанных и индуцированных изменений хромосом наблюдается при инактивации гена р53, а наименьшая - при нокауте гена ЯЬ.

3. В мышиных эмбриональных фибробластах с инактнвированной функцией сверочной точки в 01 степень хромосомной нестабильности зависит от уровня подавления в них реакций апоптоза.

4. Трансдукция в р53-позитивные крысиные и человеческие клетки генетического супрессорного элемента рЗЗ-ОБЕаз, понижающего экспрессию рЗЗ™1, ослабляет эффективность работы сверочной точки клеточного цикла в Б.

5. Подавление активности рЗЗШ01 увеличивает вероятность возникновения самых разных генетических нарушений: разрывов хромосом, сестринских хроматидных обменов и изменений копийности генов.

6. Генетические последствия трансдукции супрессорного элемента, ингибирующего экспрессию рЗЗ11401 (рЗЗ-ОБЕаз), не отличаются от эффектов, наблюдаемых при трансдукции супрессорного элемента р53-ОБЕ22, подавляющего транскрипционные активности р53 по доминантно-негативному механизму. Очевидно, генетические эффекты, наблюдаемые

при понижении экспрессии рЗЗ^01, обусловлены ингибированием транскрипционных активностей р53.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Agapova L.S., llyinskaya G.V., Turovets N.A., IvanovA.V., Chumakov P.M., Kopnin B.P. Chromosome changes caused by alterations of p53 expression. Mutation Research, 1996, v.354, p. 129-138.

2. Агапова Л.С., Туровец H.A., Иванов A.B., Ильинская Г.В., Чумаков П.М., Копнин Б.П. Индукция гипердиплоидии и хромосомных разрывов в клетках LIM1215, экспрессирующих экзогенный мутантный р53. Генетика, 1996, т.32, с. 1080-1087.

3. H.A. Туровец, Чумаков П.М., Копнин Б.П. Влияние инактивации различных компонентов сигнальных путей опухолевого супрессора р53 на стабильность генома. Гэнетика, 1999^12^

4. НЛ Туровец, П. С Агапова, Копнин П.Б., Тулина Н.М., Чумаков П.М., Копнин Б.П. Влияние инактивации опухолевого супрессора p33ING1 на функцию сверочных точек клеточного цикла и стабильность генома. Генетика,

Участок множительной техники OHLI им. Н. Н. Блохина РАМН

Подп. к печати Je т^. Q. 93 Г Заказ ^ 5

Тираж 100 эю