Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследование по созданию биологически активного гидролизата на основе культур молочнокислых бактерий

Гаранян Гаянэ Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПО СОЗДАНИЮ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ГИДРОЛШДДТА НА ОСНОВЕ КУЛЬТУР МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 4 033

ПЯТИГОРСК-2011

4855977

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования

«ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Оганесян Эдуард Тоникович Официальные оппоненты: доктор фармаг/евтичеких наук, профессор

Защита состоится «16» февраля 2011 года в 900 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.069.01 по защитам диссертаций при ГОУ ВПО « Пятигорской ГФА Росздрава» (357532, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава».

Автореферат разослан «15» января 2011г.

Компанцев Владислав Алексеевич доктор медицинских наук, профессор Тюренков Иван Николаевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Курский государственный

медицинский университет федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

А|\туальность.

Биологически активные соединения бактериальных клеток, а именно белки, пептиды, незаменимые аминокислоты, органические кислоты, и др. могут быть получены гидролитическими методами и часто использоваться как для парентерального питания, так и в медицинских целях.

Эубиотические препараты, для получения которых используют молочнокислые бактерии, находят широкое применение в медицине. Замечено, что использование этих бактерий в нативном состоянии часто малоэффективно из-за их инактивации под действием ферментов желудочного сока. Очевидно, и это показывает практика, что более целесообразно использований гидролизатов молочнокислых бактерий, поскольку они. легче усваиваются и легче вовлекаются в биохимические процессы.

Иммуностимулирующие действие молочнокислых бактерий обусловлено продуктами расщепления их клеточной мембраны, содержащей пептидогликаны и тейхоевые кислоты. Именно это обстоятельство является обоснованием для их применения в медицинской практике.

Ряд лекарственных препаратов, используемых в качестве иммуномодуляторов, представляют собой лизаты различных микроорганизмов (ИРС-19, Имудон, Бронхо-мунал), производимые за рубежом. К сожалению, в нашей стране подобные препараты не производятся.

В настоящее время имеются публикации, посвященные разработке способов получения, методик анализа основных биологически активных веществ гидролизатов молочнокислых бактерий, а также стандартизация и

з

первичная фармакологическая оценка лекарственного препарата на основе гидролизата бактерий Lactobacillus acidophilus.

Известно, что для закваски при производстве сыров и молочнокислых продуктов, чаще всего используются не индивидуальные штаммы, а их смеси. Например, при производстве мягких и рассольных сыров с низкой температурой второго нагревания используется поливидовая закваска БК-Углич-№4, представляющая собой концентрат включающий Lactococcus Lactis subsp. lactis, Lactococcus Lactis subsp. cremoris, Lactococcus Lactis subsp. diacetilactis, Leuconostoc lactis. Необходимо отметить, что указанная закваска выпускается отечественной микробиологической промышленностью и широко доступна.

В связи с этим актуальным является проведение исследований по разработке способов получения биологически активной субстанции на основе гидролизатов лактобактерий, а также изучение их качественного и количественного состава, а также стабильности.

Цель и задачи исследовании. Целью настоящей работы является получение биологически активного гидролизата на основе поливидовой закваски БК-Углич №4 и исследование его химического состава, а также антиоксидантных и иммунологических свойств.

Для реализации поставленной цели предполагается решение следующих задач:

- экспериментально изучить оптимальные условия гидролиза закваски БК-Углич-№4 ферментативным способом;

- исследовать качественный и количественный состав компонентов гидролизата;

- осуществить исследования с целью выявления влияния гидролизата на различные показатели иммунитета.

Научная новизна. Впервые для получения биологически активного гидролизата предлагается использовать мезофильную закваску БК-Углич-№4, представляющая собой сумму тест культур.

Выбраны оптимальные условия получения биологически активном субстанции путем ферментативного гидролиза поливидовой закваски БК-Углич-№4, позволяющего получить целевой продукт.

Методами химического и физико-химического анализа в гидролизате молочнокислых бактерий, входящих в состав закваски БК-Углич-№4, доказано наличие таких биологически, активных веществ, как пептиды, аминокислоты, моносахариды, высшие жирные кислоты, макро- и микроэлементы.

Изучены качественное и количественное содержание свободных аминокислот, моносахаридов, а также макро- и микроэлементов, а также высших жирных кислот в гидролизате.

Установлена антиоксидантная активность гидролизата, что обусловлено в первую очередь наличием таких аминокислот, как глутаминовая кислота (0,94%), метионин (0,39%) и тирозин (0,29%).

Выявлено положительное влияние компонентов гидролизата поливидовой закваски БК-Углич-№4 на различные показатели иммунитета и установлено, что имеет место повышение фагоцитарной активности.

Практическая значимость работы. В результате химического и биохимического исследования доказана возможность и перспективность использования гидролизата мезофильной закваски БК-Углич-№4 в качестве биологически активного компонента для кисломолочных' продуктов.

Разработан способ получения гидролизата ферментативным способом, заключающимся в том, что субстрат предварительно кипятят 30 минут, после чего охлаждают, добавляют фермент,- инкубируют 6 часов, центрифугируют и получают целевой продукт. Определена его антиоксидантная и иммунотропная активность.

5

Внедрение в практику. По материалам диссертации составлено информационное письмо «Исследование по созданию биологически активных гидролизатов на основе культур молочнокислых бактерий», которое передано в ЗАО Тбилисский МСЗ для дальнейших совместных исследований.

Положения, выдвигаемые на защиту:

- экспериментальные данные по разработке условий получения биологически активного гидролизата на основе поливидовой закваски БК-Углич-№4;

- качественный и количественный состав биологически активных компонентов гидролизата;

- результаты исследования антиоксидантной активности

- материалы по предварительному изучению влияния гидролизата на иммунную систему.

Апробация и публикации результатов исследований.

Основные положения диссертационной работы изложены на

1. Ежегодных научных конференциях ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (Пятигорск 2009-2010 гг.).

2. 1-ой межрегиональной конференции ГОУ ВПО СевероОсетинская Мед Академия Росздрава «Актуальные проблемы фармации» (Владикавказ 2010г.)

По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена. в соответствии с планом научно-исследовательской работы (НИР) ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, а также в соответствии с. соглашением о выполнении НИР между Федеральным агентством по здравоохранению и социальному развитию и

ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (номер государственной регистрации 01200805781).

Объем п структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 119 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы н 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 150 источников, в том числе 36 иностранных; содержит 40 таблиц, 10 рисунков и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Разработка условий гидролиза молочнокислых бактерий, входящий в

состав поливидовой закваски БК-Углич №4 2.1 Оптимизация процесса гидролиза

При производстве биологически активных субстанций из белоксодержащего сырья наиболее важным этапом является его переработка, предусматривающая расщепление молекул практически до составляющих мономеров. С этой точки зрения наиболее рациональным и перспективным является ферментативный способ гидролиза, позволяющий осуществлять производство белковых гидролизатов, содержащих такие ценные биологически активные соединения, как полипептиды и свободные аминокислоты. Качество и свойства таких гидролизатов, в зависимости от области применения и спектра биологической активности, обусловлены как природой исходного сырья и способа гидролиза, так и последующей обработки полученного продукта.

В качестве объекта исследования использовали поливидовую закваску БК-Углич №4, которая широко используется в молочной промышленности для получения кисломолочных продуктов. Процесс гидролиза осуществляли, используя широко применяемый фермент -микробиальный ренин "МеЬо", имеющий торговое название Пепсин. Для его активации использовался 0,01 М раствор кислоты хлоровородной, что

7

соответсвует рН 2-3. Соотношение субстрата к раствору кислоты - 1:100 было неизменным. Переменными факторами при получении гидролизата были количество фермента, (соотношение субстрат/фермент) и время гидролиза.

В некоторых случаях для получения ферментативных гидролизатов рекомендуется использовать предварительное кипячение суспензии субстрата в растворе кислоты. При этом происходит денатурация белка, сопровождающаяся разрушением его третичной структуры, что способствует большему контакту фермента с полипептидными звеньями. Здесь под предварительным кипячением подразумевается доведение гидролизуемой смеси субстрата в растворе кислоты до кипения и последующее её выдерживание в этом режиме в течение определённого времени.

Влияние предварительного кипячения мы сочли. целесообразным исследовать в зависимости от времени.

На первом этапе была изучена зависимость между соотношением субстрат/фермент и временем предварительного кипячения.

Оценку полученных гидролизатов производили по количественному

содержанию аминокислот в пересчете на глутаминовую кислоту, так как

она является преобладающей. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Выход аминокислот в зависимости от концентрации пепсина и времени предварительного кипячения

Количество фермента, мг/мл Продолжительность предварительного кипячения

• Без кипячения 15 минут 30 минут 45 минут 1 час

Выход аминокислот, %

0,1 0,18 1,23 1,78 2,32 2,85

0,2 0,23- 2,05 2,28 , ' 3,12 3,76

0,3 0,42 3,32 3,35 3,76 4,16

0,4 0,42 3,35 3,37 -" 3,78 4,19

0,5 0,43 3,37 3,38 3,78 4,21

Сопоставляя полученные результаты, можно сделать вывод о том, что выход аминокислот при повышении концентрации пепсина от 0,3 до 0,5 мг/мл изменяется в пределах ошибки, в связи с чем, достаточной следует считать концентрацию фермента 0,3 мг/мл.

Следующим этапом явился выбор оптимального времени гидролиза. При постоянных условиях (рН 2-3, температурный режим эксперимента 37°С), время гидролиза варьировало от 1 часа до 7. В ходе эксперимента были получены по 7 гидролизатов при различных режимах предварительного кипячения. Соотношение бактериальной массы к количеству фермента было выбрано с учетом результатов экспериментов, представленных в таблице 1, и составило 0,3 мг/мл.

Качество гидролизатов после предварительной очистки также оценивали по количественному содержанию аминокислот в пересчете на глутаминовую кислоту.

Таблица 2 - Выход аминокислот в зависимости от времени гидролиза и предварительного кипячения

Время гидролиза, час Продолжительность предварительного кипячения

Без кипячения 15 минут 30 минут 45 минут 1 час

Выход аминокислот, %

1 0,28 2,13 2,19 2,93 2,95

2 0,38 2,75 .3,12 3,16 3,20

3 0,41 3,32 4,35 4,55 4,76

4 0,41 ' 4,12 5,73 5.97 6,21

5 0,42 5,23 7,25 7,28 7,31

6 0,66 6,18 7,40 7,41 7,42

7 0,68 6,25 7,40 7,44 7,44

Таким образом, учитывая полученные результаты, следует считать, что оптимальное время гидролиза составляет 6 часов.

На основании полученных данных предлагается следующая методика ферментативного гидролиза. Точную массу (около 1,0 г) сухой бактериальной культуры заливают 100 мл 0,01 М кислоты хлороводородной, кипятят 30 минут и добавляют примерно 0,3 мг/мл кристаллического пепсина. Смесь инкубируют 6 часов при температуре 37°С, после чего полученную взвесь центрифугируют в режиме 5000 мин"' 20 мин, супернатант декантируют.

Важным этапом исследования гидролизата является выбор консерванта, что осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XII. При проведении эксперимента изучали консервирующую способность двух консервантов, относящихся к органическим соединениям - это молочная кислота и нипагин.

Результаты исследований показали, что консервантом обеспечивающим оптимальный срок хранения гидролизата следует считать нипагин в концентрации 0,5 г/л.

Изучение химического состава гидролизата поливидовои закваски БК-Углич №4

Анализ элементного состава проводился в Центральной Испытательной Лаборатории при ФГУП Кавказгеолсъемка по методике предприятия МП 4-С - «Полуколичественный спектральный метод анализа минерального сырья из кратера угольного электрода в плазме электрической дуги переменного тока (ДГ-2)».

Обнаружено 11 элементов, среди которых следует отметить высокое содержание натрия, фосфора и калия.

Изучение гидролизата на содержание аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе АА-33 (¡УНскиесЬа, Чехия) в стандартных условиях, обычно используемых для разделения белковых гидролизатов. Результаты представлены в таблице 3.

ю

Следует отметить высокое содержание глутаминовой кислоты, фенилапанина, аспарагиновой кислоты, треонина, глицина, метионниа, лейцина, тирозина, гистидина, лизина.

Таблица 3 - Аминокислотный состав гидролиза поливидовой закваски БК-Углич-№4

№ п/|1 Название Концентрации* Концентрации,

аминокислоты мг/кг %

1 аргшшн 15,92-102 0.16

2 лизин* 9,17-10" 0,09

3 тирозин 29,04-10" 0,29

4 фенилалании* 41,86-10" 0,42

5 лейцин+изолейцин** 18,13-10" 0,18

6 метиошш* 37,94-10" 0,38

7 валнн* 11,20-Ю2 0,11

8 пролин 20,68-10" 0,21

9 треонин* 9,13-10" 0,09

10 серии 792,4-10" 0,79

11 аспарагиновая 12,78-10" 0,13

' 12 гистидин 11,00-10" 0,11

13 глутаминовая 94,01-10" 0,94

14 глицин 13,90-10" 0,14

15 триптофан 5,06-10" 0,05

ИТОГО 337,79-10" 3,38

■"Незаменимые аминокислоты

Количественное определение компонентов в гидролизат, чувствительных к нингидрину, проводили спектрофотометрическим методом. С этой целью определяли оптическую плотность раствора продукта взаимодействия гидролизата с 0,2%-ным раствором нингидрина, который характеризуется широкой полосой поглощения с максимумом при длине волны 568 нм.- В качестве стандарта использовали глутаминовую кислоту.

С целью определения достоверности методики была проведена её валидация на примере стандартного образца глутаминовой кислоты по таким показателям, как линейность, прецизионность, правильность.

В ходе определения линейности было установлено, что график зависимости оптической плотности от концентрации для данной методики имеет линейный характер в определённом диапазоне (таблица 4).

Далее устанавливали прецизионность на уровне сходимости по величине относительного стандартного отклонения результатов шести параллельных определений. В результате установлено, что данная величина соответствует требованиям международной конференции по гармонизации ICH (таблица 4).

Завершающим этапом оценки выбранной методики было установление правильности полученных определений. Для этого подвергали анализу согласно выбранной методики девять модельных растворов на трёх уровнях концентраций.

Следующим этапом в исследовании гидролизата было изучение его углеводного состава. Предварительным хроматографическим анализом было установлено высокое содержание галактозы. Количественное определение углеводов проводили йодимерическим титрованием.

Данная методика также была оценена по показателям: линейность, прецизионность и правильность (таблица 4). В ходе работы было установлено, что все изучаемые показатели удовлетворяют требованиям международной конференции по гармонизации ICH.

Таблица 4 - Валццационные характеристики методик количественного определения

Характеристики Спектрофотометричекое определение аминокислот Йодиметрическое определение углеводов

Уравнение линейности . у=238,2х+0,007 у=1,099х+0,044

' Коэффициент корреляции, г 0,998 0,999

Прецизионность, RSD (%) 4,88 0,873

Праивльность, к (%) traö. tpnccH. SD RSD (%) 99,79 2,31 0,065 9,73 9,75 100,66 2,31 1.03 2,05 2.04

Методом ВЭЖХ изучено хроматографическое поведение пептидных компонентов гидролизата. Наиболее значительная часть пептидов элюируется в градиенте плотности от 0 до 36% в первые 30-60 минут элюирования. В данной фракции обнаруживаются как минимум 21 пептидный пик из которых наиболее выраженные выделяются между 4555 минутами элюирования при градиенте плотности от 30 до 40 % (7 пептидных компонентов). Дальнейшее повышение градиента плотности элюирующего раствора позволило выделить незначительное число пептидов (5 пептидных компонентов). Наиболее выраженный пептидный компонент элюировался при градиенте плотности 50%.

Методом ГЖХ согласно методике ФС 42-0163339002 изучен жирнокислотный состав гидролизата молочнокислых бактерий (таблица 5). Идентифицировано 9 насыщенных и ненасыщенных высших жирных кислот. Таблица 5- Результаты определения жирнокислотного состава гидролизата

№ пика Время удерживания метилового эфира, мин Содержание, % Числовой символ Результаты идентификации кислоты

1 2,79 4,76 14:0 миристиновая

2 3,67 0,48 15:0 пеитодекановая

3 3,93 3,40 - не идентифицирована

4 4,95 25,83 16:0 пальмитиновая

5 6,66 5,71 - не идентифицирована

6 7,91 2,04 - не идентифицирована

7 8,99 14,60 18:0 стеариновая

8 9,98 3,29 18:1 олеиновая

9 12,15 15,13 18:2 линолевая

10 16,57 9,93 18:3 линоленовая

И 19,06 2,08 20:1 гондоиновая

12 20,78 0,83 - не идентифицирована

13 22,75 5,74 20:2 эйкозодиеновая

14 25,55 6,21 - не идентифицирована

Далее гидролизат изучали на содержание антиоксидантов. Исследование проводили на жидкостном хроматографе «Цвет Яуза-01-АА». Концентрацию антиоксидантов определяли по площади пика дифференциальной кривой полученного гидролизата. Площадь пика и концентрация антиоксидантов в пересчете на глутаминовую кислоту представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Содержание антиоксидантов в гидролизате

Исследуемый объект Площадь пика (8„нА/с) Суммарная концентрация антиоксидантов, в пересчете на глутаминовую кислоту, мг/г Суммарная концентрация антиоксидантов, в пересчете на глутаминовую кислоту, %

Гидролизат 9845 34,54±0,97 3,45±0,09

Определение показателей качества гидролизата поливидовой закваски

БК-Углич №4

Исследования по определению показателей качества полученного биологически активного гидролизата молочнокислых бактерий, входящих в состав поливидовой закваски БК-Углич №4 проводились согласно ОСТ 4291500.05.001-00 по следующим показателям: описание, подлинность, удельное вращение, прозрачность раствора, цветность раствора, рН, микробиологическая чистота, количественное определение, срок годности.

Определение срока годности проводили при 1=4-8°С согласно «Инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности».

Показатели качества биологически активного гидролизата представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Показатели качества биологически активного гидролизата молочнокислых бактерий входящих в состав полнвидовой закваски БК-

Углич №4

Показатели Методы Результаты анналпза Показатели качесч ва гпдролнзага

Описание Визуально Прозрачный раствор светло-коричневого цвета Прозрачным раствор светло-коричневого цвета

Подлинность

Нингидрпнактивные компоненты Спектрофотометрия в видимой области спектра Спектр поглощения испыт. и стаид. раствора имеют один максимум при 568±2 нм Спектр поглощения испыт. и станд. раствора должны иметь один максимум при 568±2 им

Удельное вращение Поляриметрия +33,4±0,27 от+33,0 до+35,0

Прозрачность раствора Визуально Прозрачный раствор Прозрачный раствор

Цветность раствора Визуально Цветность раствора соответсаует эталонному раствору ВУ4 Цветность раствора должна соответствовать эталонному раствору ВУ4

рН Патенциометрически 3,5 от 3,0 до 3,5

Микробиологическая чистота ГФ XII, вып.2,стр. 160 Соответствует категории ЗБ Соответствует категории ЗБ

Количественное определение:

Компоненты, чувствительные к нингидрину Спектрофотометрия в видимой области 7,42 г/100мл 6,5-8,0 г/100мл

Галактоза Титриметрическое титрование 2,03 г/100мл 2,0-2,5 г/100мл

АнтиокСиданты Амперометрический метод 3,45 г/100мл . Не менее 3,0 г/100мл

Срок годности 1 месяц

Также была проведена валидация методик определения действующих компонентов гидролизатов.

количественного

Валидационные характеристики предлагаемых методик количественного определения аминокислот, углеводов и антиоксидантов гидролизата представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Валидационные характеристики методик количественного определения биологически активных веществ гидролизата.

\ Методики Методика Методика Методика

определения определения определения

компонентов, углеводов антиоксидантов

Показатели чувствительных к

шшгидрнну

Прецизионность, ЯБЭ (%) 2,70 0,697 2,44

Праивльность, я (%) 100,28 100,5 99,07

1таб. 2,31 2,31 2,31

1рассч 0,45 0,67 1,21

1,82 2,30 2,54

ЯЭО (%) 1,82 2,29 2,56

Биологическая активность гидролизата поливидовой закваски БК-Углич №4

Выше было показано, что в исследуемом гидролизате содержание антиоксидантов в пересчете на глутаминовую кислоту составляет 3,45 %. Аминокислотный анализ, свительствует о высоком содержании глутаминовой кислоты (0,94%), ыетионина (0,39%) и тирозина (0,29%), обладающих антиокидантными свойствами.

Исходя из полученных данных, можно предположить, что характеризуясь .антиоксидантными свойствами, гидролизат, возможно, способен нормализировать процесс генерации супероксидного анион-радикала, и тем самым опосредованно может стимулировать клеточный иммунитет.

. Данное предположение в качестве рабочей гипотезы послужило основанием для проведения иммунологических исследований.

В клинической практике для оценки уровня активности иммунной системы в настоящее время широко применяются методы выявления популяционной и субпопуляционной принадлежности лимфоцитов периферической крови.

При проведении иммунологических исследований нами использовалась кровь, взятая из вены натощак у 7 здоровых доноров в возрасте от 20 до 23 лет.

Для выделения мононуклеарных клеток венозную кровь подвергали центрифугированию в градиенте плотности фиколл-верографин <1=1,078 . После двухкратного отмывания в среде 199 клетки ресуспендировали в среде ЯРМ1 1640, содержащей 2шМ Ь-глутамина, 10 гпМ Нереэ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 40мкг/мл гентамицина. Культивирование клеток проводили в С02 -инкубаторе (5% С02, 37°С) в 96-луночных планшетах в конечном объеме 200 мкл на лунку (с учетом добавленного объема гидролизата). Количество клеток составляло 200 тыс. на лунку.

Идентифицировали лимфоидные клетки, несущие следующие кластеры дифференцировки: - СО 3+ - все Т-лимфоциты; - СО 4+ - Т-лимфоциты хелперы-индукгоры; - СО 8+ - Т-лимфоциты цитотоксические; - СО 19+ - все В-лимфоциты; - СО 16+ - естественные клетки киллеры (МК-клетки); - СО 25+ -активированные Т-клетки, несущие мембранный рецептор к ИЛ-2. Полученные данные представлены в таблице 9.

Кратковременное 30-минутное культивирование клеток (таблица 9) с бактериальным лизатом в концентрации 10 и 50 мкл/лунку практически не влияет на экспресиию основных субпопуляций лимфоидных клеток, за исключением активационного маркера (СО 25+).

Культивирование клеток в течение 3-х дней с лизатом бактерий

приводит к стимуляции экспрессии Т-лимфоцитов (СО 3+) и их

субпопуляций с хелперной активностью (СО 4+). Наиболее выраженные

17

эффекты бактериального лнзата проявляются в отношении экспрессии СО 16+и особенно СЭ 25+ рецепторов лимфоцитов.

Таблица 9 - Популяционный н субпопуляцонный состав лимфоидных клеток крови здоровых доноров при 30-мииутном и 3-х дневном культивировании (М±ш)

Показатели Группы CD3+ CD-1+ CD8+ CD 19+ CD16+ CD25+

% Ю'/л % Ю'/л % Ю'/л % 109/л % Ю'/л % Ю'/л

Контроль (без добавления гндролизата) 50,2± 1,6 1,16± 3,08 13,3± 3,4 1,01± 3,06 24,1+ 1,7 3,47+ 3,03 15,6± 1,3 э,зо+ 0,02 11,5+ 3,8 3,22+ 3,02 12,6± 3,3 3,24+ 3,02

30 мши культнвиро-вание 10 мкл 57,1+ 5,1 1,09+ 0,07 41,4* 3,9 0,77+ 0,С4 22,4± 1,8 0,45± 0,04 17,1± 1,4 0,3 5± 0,03 14,1+ 1,0 0,26+ 0,02 15,2± 0,9 0,29± 0,02

50 мкл 56,3± 3,6 1,07± 0,07 38,6J 3,9 0,74+ 0,04 23,7+ 1,7 0,45± 0,04 17,8+ 1,6 Э,34± 0,02 13,3+ 0,9 3,25+J 0,02 16,4± 0,9* 3,31± 0,03

3-дневное культивирование 10 мкл 67,6± 6,2 1,39+ 0,09 54,1+ 3,9* 1,01+ 0,07 24,6+ 2,0 0,60± 0,04 17,2+ 0,13 0,36+ 0,03 23, б± 2,9* 0,48+ 0,03 20,1± 2,5* 043± 0,04

50 мкл 74,2± 5,3* 1,16+ 0,0 62,3+ 3,3* 0,81± 0,06 22,7± 1,9 0,44± 0,03 19,3+ 1,3 0,37± 0,04 22,0± 1,2* 0,45^ 0,02* 21,0i 0,9* D,47i 0,02

Примечание:.* -Р<0,05 ; ** -Р<0,01

Экспрессия указанных рецепторов при 3-дневном культивировании усиливалась более чем на 80%, обусловлено, в первую очередь, его способностью влиять не на количественные - показатели в субпопуляционном составе лимфоцитов, а на их активность о чем свидетельствует повышение экспрессии рецептора к интерлейкину-2 (СО 25+). Следует отметить отсутствие влияния бактериального лизата на экспрессию рецепторов В-лимфоцщш (СБ 19+).

у •

В последующем исследовании определяли фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов у здоровых доноров. (Таблица 10) по методу

18

И.В. Нестеровой (1992г). В качестве тест объекта использовали музейный штамм золотистого стафилококка Staph. Aureus 209 Р. Критерием умерщвления фагоцитированных микроорганизмов являлись их фрагментация и изменения тинкториальных свойств (появление эозинофилии) при окраске азур-эозином по методу Романовского-Гимза.

Для регистрации фагоцитарной активности использовали световой микроскоп Ampüval (Carl Ceiss Jena), маслянистая иммерсия (90x10x1,5).

Показано, что как поглотительная, так и бактерицидная функции микрофагов (нейтрофилы) под влиянием бактериального лизата активируются. Так, фагоцитарная активность лейкоцитов стимулируются. Этот эффект хорошо иллюстрируется по данным индекса бактерицидное™, который увеличивается более, чем в 2,5 раза. При этом не наблюдается дозовой зависимости эффекта. Фагоцитарное число, фагоцитарный индекс и процент бактерицидности повышается более чем в 1,2-1,3 раз по сравнению с контролем. Таблица 10 - Фагоцитарная активность клеток крови здоровых доноров при 30-минутном и 2-х часовом культивировании (М±ш)

Показатели Группы Процент фагоцитоза Фагоцитарное число Фагоцитарный индекс Процент бактерицидности Индекс бактернцнд-ностн

% % % % %

Контроль (б добавления гидрлизата ЕЗ 61,57±3,06 3,8±0,31 2,27±0,09 56,53±2,08 1,28±0,08

30 мни. культивирование 10 мкл 62,02±2,29 3,85±0,37 2,38±0,09 56,72±2,11 1,35±0,09

50 мкл 62,37±2,38 3,86±0,28 2,41±0,О8 59,66±2,55 1,42±0,10

2-часовое культивирование 10 мкл 67,9±3;12 4,54±0,34 3,09±0,09 68,88±2,37 2,13±0,10'

50 мкл 68,3±3,23 5,12±0,29 4,14±0,12 69,62±2,21 . 2,43±0,11

Таким образом, иммунотропные эффекты лизата бактерий в значительной степени обусловлены повышением фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов по сравнению с контролем.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработана методика ферментативного гидролиза поливидовой закваски БК-Углич-№4, позволяющая получать гидролизат, обладающий иммуномодулирующей активностью.

2. Изучен химический состав полученного биологически активного гидролизата и установлено, что:

- в нём присутствуют 9 высших жирных кислот, в том числе олеиновая, линолевая, линоленовая, гондоиновая, эйкозодиеновая.

- микроэлементный состав гидролизата представлен 1 Элементами, среди которых преобладают калий, натрий, фосфор;

- содержание компонентов, реагирующих с нингидрином, составляет 7,41%, антиоксидантов - 3,45 % з пересчете на глутаминовую кислоту и углеводов-2,03% в пересчете на галактозу;

- в исследуемом гидролизате обнаружено 26 компонентов пептидной природы.

3. Определены показатели качества гидролизата и установлено, что в условиях естественного хранения данная субстанция стабильна в течение месяца. В качестве консервирующего компонента рекомендуется использовать нипагин в концентрации 0,5 г/л.

4. Осуществлена валидация методик количественного определения компонентов, чувствительных к нингидрину и галактозы. Результаты исследований свидетельствуют,' что использованные в работе методики обеспечивают необходимую правильность и воспроизводимость результатов, что позволяет их использовать в количественном анализе исследуемых компонентов гидролизата.

5. Определена антиоксидаптная активность гидролизата, которая по-видимому, в первую очередь, обусловлена такими аминокислотами, как метионин, тирозин фенилаланин, пролин глутаминовая кислота.

6. Установлено, что бактериальный гидролизат стимулирует экспрессию рецепторов (СБ 3+, СО 4+, СБ 16+ и особенно СО 25+ ) при 3-дневном культивировании более, чем на 80%. Под действием бактериального гидролизата фагоцитарная активность лейкоцитов стимулируются. Этот эффект хорошо иллюстрируется по данным индекса бактерицидное™, который увеличивается более, чем в 2,5 раза. Фагоцитарное число, фагоцитарный индекс и процент бактерицидности повышается более, чем в 1,2-1,3 раз по сравнению с контролем.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I .Гараняп, Г.С. Аминокислотный и микроэлементный состав гидролизата поливидовой закваски БК-Углич №4 / Г.С. Гаранян //Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009.-Вып. 64. -С. 404-406.

2.Гаранян, Г.С.Исследование влияния бактериального лизата на экспрессию in vitro рецепторов лимфоцитов доноров / Г.С. Гаранян //Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 20Ю.-Вып. 65-С. 443-443.

3.Гаранян, Г.С. Современные аспекты применения пробиотиков в фармации /Г.С. Гаранян.- Пятигорск, 2010- 22с.-Деп. ВИНИТИ РАН 24.02.10, № 100-В-2010.

4.Гаранян, Г.С. Хроматография пептидных компонентов образца бактериального лизата / Г.С. Гаранян // Современные проблемы науки и образования.-2010. - №6.-С.4 .

5.Гаранян, Г.С. Содержание антиоксидантов в биологически активном гидролизате иа основе культур молочнокислых бактерий / Г.С. Гаранян // Современные проблемы науки и образования. - 2010.- №6.-С.5 .

6.Гаранян, Г.С. Химическое и биологическое исследование гидролизата на основе культур молочнокислых бактерий/ Г.С. Гаранян, P.A. Ханферян, Э.Т. Оганесян// Хим.-фармац. журн.- 2010.-Т.44, № 8. - С. 46 -49. '

7. Гаранян, Г.С. Иммунотропная активность гидролизата на основе культур молочнокислых бактерий/ Г.С. Гаранян, Э.Т. Оганесян, P.A. Ханферян //Рос. алерг. журн.- 2010.-№6.- С.31-33.

Гаранян Гаянэ Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПО СОЗДАНИЮ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА НА ОСНОВЕ КУЛЬТУР МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 11 января 2011г. Формат 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ « ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНСТВА ПО ЗДАРВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ»

357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11 23

Механизм профилактического действия микробных препаратов является многогранным и обусловлен не только высоким содержанием жизнеспособных клеток, но и синтезом внеклеточных метаболитов. Экзометаболиты молочнокислых бактерий подавляют рост патогенной микрофлоры, обладают радиопротекторными, противоопухолевыми и иммунокоррегирующимими свойствами. Важно также отметить, что молочнокислые культуры обладают устойчивостью или малой чувствительностью к антибиотикам, что указывает на их способность функционировать в ЖКТ человека при приёме данных препаратов. Это свидетельствует о перспективности изучения прокариот, как источников биологически активных субстанций, для создания на их основе пробиотических продуктов нового поколения.

Биологически активные соединения бактериальных клеток, а именно белки, пептиды, незаменимые аминокислоты, органические кислоты, и др. могут быть получены гидролитическими методами и часто использоваться как для парентерального питания, так и в медицинских целях.

Как известно, большинство аминокислот в белках животного и растительного происхождения представлены в Ь-форме. Поэтому все аминокислоты, образующиеся при гидролизе природных белков в условиях, исключающих рацемизацию, способны включаться в биохимические процессы животного организма.

Эубиотические препараты, для получения которых используют молочнокислые бактерии, находят широкое применение в медицине.

Практика показывает, что использование этих бактерий в нативном состоянии часто малоэффективно из-за их инактивации под действием ферментов желудочного сока. Очевидно, и это показывает практика, что более целесообразно использование гидролизатов молочнокислых бактерий, 4 поскольку они легче усваиваются и легче вовлекаются в биохимические процессы.

Иммуностимулирующие действие молочнокислых бактерий, в первую очередь, связано с присутствием в их клеточной стенке пептидогликанов и тейхоевых кислот. Особую ценность представляют собой пептидогликаны, содержание которых варьирует от 10% у грамотрицательных до 70% у грамположительных бактерий.

Известно, что продукты расщепления протеогликанов - гликопептиды, характеризуются иммуномодулирующим действием, что и является обоснованием для их применения в медицинской практике. Эти соединения являются макромолекулами сложного состава.

Ряд лекарственных препаратов, используемых в качестве иммуномодуляторов, представляют собой лизаты различных микроорганизмов. Например, «ИРС-19», представляет собой лизаты молочнокислых бактерий; «Имудон» - содержит лизаты микроорганизмов, составляющих основную микрофлору полости рта; «Бронхо-мунал» -лиофилизированный лизат бактерий симбионтов слизистой оболочки дыхательных путей.

В нашей стране аналогов данным препаратам не существует. Это связано с отсутствием эффективных способов получения гидролизатов бактерий, а также валидированных методик их анализа.

В настоящее время имеются публикации, посвященные разработке способов получения, методик анализа основных биологически активных веществ гидролизатов молочнокислых бактерий, стандартизация и первичная фармакологическая оценка лекарственного препарата на основе гидролизата бактерий Lactobacillus acidophilus.

Известно, что для закваски при производстве сыров и молочнокислых продуктов, чаще всего используются не индивидуальные штаммы, а их смеси. Например, при производстве мягких и рассольных сыров с низкой температурой второго нагревания используется поливидовая закваска БК5

Углич-№4, представляющая собой концентрат включающий ЬасШсоссш ЬасЙБ зиЬэр. 1асйз, ЬасШсоссиэ Ьасйэ БиЬзр. сгешопэ, ЬасШсоссиэ Ьасйэ эиЬзр. <11асей1ас11з, ЬеисопоБШс 1ас^з. Необходимо отметить, что указанная закваска выпускается отечественной микробиологической промышленностью и широко доступна.

В связи с этим актуальным является проведение исследований по разработке способов получения биологически активной субстанции на основе гидролизатов молочнокислых бактерий, а также изучение их качественного и количественного состава, стабильности и биологической активности.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является получение биологически активного гидролизата на основе поливидовой закваски БК-Углич №4 и исследование его химического состава, а также антиоксидантных и иммунотропных свойств.

Для реализации поставленной цели предполагается решение следующих задач:

- экспериментально изучить оптимальные условия гидролиза закваски БК-Углич-№4 ферментативным способом;

- исследовать качественный и количественный состав компонентов гидролизата;

- исследовать антиоксидантную активность

- осуществить исследования, с целью выявления влияния гидролизата на показатели иммунитета.

Научная новизна. Впервые для получения биологически активного гидролизата предлагается использовать мезофильную закваску БК-Углич-№4, представляющая собой сумму тест культур.

Разработана методика ферментативного получения биологически активного гидролизата путем ферментативного гидролиза поливидовой закваски БК-Углич-№4, заключающегося в том, что субстрат предварительно кипятят в растворе хлороводородной кислоты в течение 30 б минут после чего охлаждают, добавляют фермент, инкубируют 6 часов и ценрифугируют и получают целевой продукт.

С целью характеристики состава полученного гидролизата изучено качественное и количественное содержание свободных аминокислот, моносахаридов, а также макро- и микроэлементов, а также высших жирных кислот.

Установлена антиоксидантная активность гидролизата, что обусловлено комплексом БАВ.

Выявлено стимулирующее влияние гидролизата поливидовой закваски БК-Углич-№4 на некоторые показатели иммунитета.

Практическая значимость работы. Разработан способ получения гидролизата, определены его антиоксидантные свойства, а также проведены предварительные исследования на наличие иммунотропной активности.

В результате химического и биохимического исследования доказана возможность и перспективность использования гидролизата мезофильной закваски БК-Углич-№4 в качестве биологически активного компонента для кисломолочных продуктов.

Положения, выдвигаемые на защиту:

- экспериментальные данные по разработке условий получения биологически активного гидролизата на основе поливидовой закваски БК-Углич-№4;

- качественный и количественный состав биологически активных компонентов гидролизата;

- результаты исследования антиоксидантной активности

- материалы по предварительному изучению влияния гидролизата на иммунную систему.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научноисследовательской работы (НИР) ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, а также в соответствии с планом о выполнении НИР между Федеральным 7 агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (номер государственной регистрации 01200805781).

Внедрение в практику. По материалам диссертации составлено информационное письмо «Обоснование применения биологически активных гидролизатов на основе культур молочнокислых бактерий в качестве иммуномодулирующей субстанции», которое передано в ЗАО Тбилисский МСЗ для дальнейших совместных исследований

Апробация и публикации результатов исследований.

Основные положения диссертационной работы изложены на 64-й и 65-й научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2009-2010 гг.), 1-ая межрегиональная конференция «Актуальные проблемы фармации» (Владикавказ 2010г.)

По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 119 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы и 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 150 источников, в том числе 36 иностранных; содержит 40 таблиц, 10 рисунков и приложения.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработана методика ферментативного гидролиза поливидовой закваски БК-Углич-№4, позволяющая получать гидролизат, обладающий иммуномодулирующей активностью.

2. Изучен химический состав полученного биологически активного гидролизата и установлено, что:

- в нём присутствуют 9 высших жирных кислот, в том числе олеиновая, линолевая, линоленовая, гондоиновая, эйкозодиеновая.

- микроэлементный состав гидролизата представлен Пэлементами, среди которых преобладают калий, натрий, фосфор;

- содержание компонентов, реагирующих с нингидрином, составляет 7,41%, антиоксидантов - 3,45 % в пересчете на глутаминовую кислоту и углеводов - 2,03% в пересчете на галактозу;

- в исследуемом гидролизате обнаружено 26 компонентов пептидной природы.

3. Определены показатели качества гидролизата и установлено, что в условиях естественного хранения данная субстанция стабильна в течение месяца. В качестве консервирующего компонента рекомендуется использовать нипагин в концентрации 0,5 г/л.

4. Осуществлена валидация методик количественного определения компонентов, чувствительных к нингидрину и галактозы. Результаты исследований свидетельствуют, что использованные в работе методики обеспечивают необходимую правильность и воспроизводимость результатов, что позволяет их использовать в количественном анализе исследуемых компонентов гидролизата.

5. Определена антиоксидантная активность гидролизата, которая по-видимому, в первую очередь, обусловлена такими аминокислотами, как метионин, тирозин фенилаланин, пролин глутаминовая кислота.

6. Установлено, что бактериальный гидролизат стимулирует экспрессию рецепторов (СО 3+, СБ 4+, СЭ 16+ и особенно СЭ 25+ ) при 3-дневном культивировании более, чем на 80%. Под действием бактериального гидролизата фагоцитарная активность лейкоцитов стимулируются. Этот эффект хорошо иллюстрируется по данным индекса бактерицидности, который увеличивается более, чем в 2,5 раза. Фагоцитарное число, фагоцитарный индекс и процент бактерицидности повышается более, чем в 1,2-1,3 раз по сравнению с контролем.