Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Исследование механизмов регуляции гена MDR1 и Р-гликопротеина в популяциях опухолевых клеток

На правах рукописи УДК 618.14-006-092.9

РГ5 СД 1 8 ФЕВ 2002

Ктиторова Ольга Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНА МОЯ1 И Р-ГЛИКОПРОТЕИНА В ПОПУЛЯЦИЯХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

(Специальность 14.00.14)

Автореферат диссертации на соискание умеион степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2001

Работа выполнена в НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина директор НИИ Канцерогенеза - член-корреспондент РАМН Д.Г. Заридзе директор РОНЦ РАМН им H.H. Блохина - академик [H.H. Трапезников!

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, проф. A.A. Ставровская

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Б.П. Копнин

доктор медицинских наук, проф. Е.Б. Владимирская

Ведущая организация:

Институт Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится « ^п «» 200&.

на заседании специализированного Ученого Совета (К.001.17.01) при РОНЦ РАМН

(Москва, 115478, Каширское ш., 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ РАМН.

Автореферат разослан « <г » « »200&

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета доктор медицинских наук, профессор B.C. Турусов.

Еочо.яь, о

О..

Общая характеристика работы.

1. Актуальность проблемы.

Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток (МЛУ) -интенсивно исследуемое в данное время явление, заключающееся в невосприимчивости клеток и клеточных популяций к широкому спектру химиотерапевтических препаратов, различающихся по строению и механизму действия на клетку. МЛУ представляет собой серьезное препятствие на пути успешного лечения злокачественных новообразований. Одним из основных механизмов формирования МЛУ является активация Р-гликопротеина (Pgp) - трансмембранного белка, транспортирующего различные вещества из клетки. Цель настоящей работы - исследование регуляции Pgp и кодирующего его гена MDR1.

Активация гена MDR1 в опухолевых клетках происходит при весьма разнообразных воздействиях: под влиянием цитостатнков, агентов, вызывающих дифференцировку, стимуляторов и ингибиторов протеннкнназы С, облучения, теплового шока, различных цитокинов (Chaudhary, Roninson, 1993; Chin et al., 1990; Uchiumi et al., 1993; Bertilsson et al., 2001), а также ряда генов: p53, ras, c-raf, c-fos, c-jun, генов рецепторов ретиноевой кислоты и др. Тем не менее, пути сигнальной трансдукцни, участвующие в регуляции экспрессии гена MDRI и активности Pgp, изучены недостаточно. Исследования сигнальных путей, участвующих в регуляции пролиферации, дифференцировки и программируемой гибели клеток, являются одной из центральных задач современной биологии и медицины. Систематическое изучение их роли в регуляции гена MDRI и активности Pgp, могут открыть новые подходы к решению таких актуальных проблем как преодоление МЛУ, опосредованной Pgp и разработка новых противоопухолевых препаратов и схем химиотерапии.

К началу нашей работы в литературе отсутствовали сведения относительно возможного участия сфингомиелинового сигнального пути в регуляции гена MDRI и Pgp. Этот путь активно изучается в последние годы, поскольку он вовлекает сфинголипиды

клеточной мембраны в передачу сигналов клеточной дифференцнровки, пролиферации и апоптоза. Его роль в формировании МЛУ оставалась неисследованной. Между тем, некоторые химиопрепараты, используемые при терапии опухолей, вызывают повышение уровня внутриклеточного церамида (БепсЬепкоу е1 а1., 2001) и их цитотоксический эффект, по-видимому, вызван активацией сфингомиелинового сигнального пути. Кроме того, в последнее время исследователи связывают роль Р§р в клетке не только с его транспортной функцией, но также с такими процессами, как дифференцировка и апоптоз. Поэтому исследование роли сфингомиелинового пути сигнальной трансдукции в регуляции активности МСШ/Т^р представляет интерес не только с точки зрения практической онкологии, но и с точки зрения понимания механизмов координированной регуляции важнейших процессов жизнедеятельности клетки.

2. Цели и задачи исследования.

Целью данной работы явилось исследование возможного участия пути сигнальной трансдукции, вовлекающего сфинголипиды клеточной мембраны, в регуляции активности гена МОЯ! и Pgp и выяснение роли этого сигнального пути в координированной регуляции активности р и одного из важнейших биологических процессов -

программируемой гибели клетки, апоптоза. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать модели исследования (культуры клеток) и детально охарактеризовать их с точки зрения экспрессии и функциональной активности Л/£Ш/Р§р, а также чувствительности к химиотерапевтическим препаратам и сфинголипидам.

2. Выяснить, является ли С2-церамид, растворимый синтетический аналог внутриклеточного церамида, субстратом Р§р.

3. Выяснить, участвует ли сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукции в регуляции активности АЮМ/Р^р и определяется ли это участие клеточным контекстом.

4. Выяснить, осуществляется ли координированная регуляция гена МОК1 и апоптоза через сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукции.

5. Изучить участие гена Яа/-1, компонента сигнального пути, активируемого сфинголипидами, в регуляции активности гена МОИ!, Рёр и апоптоза в исследуемых клетках.

3. Научная новизна и практическая значимость работы.

В работе впервые показано, что синтетический растворимый аналог внутриклеточного церамида, С2-церамид, активирует экспрессию гена КЮЯ1 в культивируемых клетках лейкозов человека разных типов дифференцировки. Эти данные впервые свидетельствуют в пользу того, что вторичный мессенджер церамнд и, следовательно, сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукции, вовлечены в регуляцию гена АЯ5Л/. Показано, что С2-церамид не является субстратом Pgp. Впервые показано, что влияние С2-церамида на экспрессию гена МйЯ1 зависит от дозы препарата, времени воздействия и от клеточного контекста. Обнаружено, что другой синтетический сфинголнпид, О-сфиигозин, не вызывает активацию гена МОЛ/, что свидетельствует о специфичном для церамида механизме регуляции активности этого гена. Показано, что влияние химиопрепаратов (адриабластина и 1-Р-0-арабинознлцитозина (АраС)), активирующих сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукции, на степень экспрессии гена АЮЯ1 зависит от типа клеток. Впервые показано, что прерывание сфингомиелинового сигнального пути введением в клетки К562 доминантно-негативного мутанта гена Яа/-1 (Яа/-С4) отменяет как повышение экспрессии гена МОК/, вызванное С2-церамидом, так и апоптоз, вызванный обоими сфииголнпндами, что свидетельствует в пользу общего начального этапа регуляции апоптоза и экспрессии гена МйЮ в популяциях опухолевых клеток системы кроветворения.

Результаты проведенной работы способствуют пониманию механизмов регуляции экспрессии гена MDR1, обнаруживают механизмы связи активации этого гена с процессами апоптоза в опухолевых клетках и зависимости индуцибельности гена MDR1 от клеточного контекста. Эти результаты могут быть полезными при разработке новых методов лечения злокачественных новообразований.

4. Апробация работы.

Апробация диссертационной работы была проведена 12 сентября 2000 года на совместной научной конференции лабораторий генетики опухолевых клеток, цитогенетики, механизмов канцерогенеза и биохимии опухолей НИИ канцерогенеза РОНЦ РАМН.

Основные материалы диссертационной работы были представлены на XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Россия, Санкт-Петербург, 1999 г.), международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Россия, Санкт-Петербург, 2000 г.), и международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Россия, Санкт-Петербург, 2001 г.).

5. Публикации.

По материалам диссертации опубликованоЮработ

6. Структура н объем диссертации

Материал диссертации изложен на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и выводов. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 8 таблицами. Библиографический материал включает в себя ссылки на 185 источников литературы, в том числе 11 отечественных.

Содержание работы

Результаты и обсуждение

1. Исследование экспрессии н функциональной активности Pgp в клетках линий К562, 1(562/1-59 я 119. Определение чувствительности клеток к хнмиотерапевтическим препаратам и синтетическим сфннголипндам.

Для работы были выбраны линии клеток лейкозов человека разных типов дифференцировки: Т-клеточного (Н9) и миелоидного (К562). Этот выбор связан с литературными данными, показывающими, что в данных клетках четко выявляется активация гена МйЯ1 химиопрепаратами (СЬашШагу, Коптзоп, 1993). При помощи полуколнчественного метода ЯТ-РСЯ (Ктиторова и др., 2000) мы нашли, что в клетках К562 и Н9 ген МОЯ] не экспрессирован. С применением окраски клеток антителами 111С2 к внутреннему эпитопу белка для определения экспрессии Pgp и РАСЯсап-амализа интенсивности выброса из клеток флуоресцентного субстрата Р§р Родамина 123 для исследования активности Pgp (Egudina е1 а!., 1993) было показано, что в клетках Н9 Pgp не экспрессирован и неактивен, а в клетках К562 присутствует в небольшом количестве и проявляет невысокую активность. В клетках с введенным геном МОЯ! сублинии К562/1-89 обнаружена высокая степень экспрессии гена МО/?/, экспрессии и активности Pgp. В дальнейшем клетки К562Л-59 использовали как «положительный контроль» в опытах по исследованию экспрессии активного Pgp и гена МБЯ1.

Обобщенные результаты опытов по исследованию чувствительности использованных в работе клеточных линий к цитостатнкам и сфинголипидам представлены в таблице 1.

Таблица 1. Чувствительность клеток линий Н9, К562 и K562/i-S9 к адриабластину, I-P-D-арабинозилцитозину (АраС), С2-церамиду и D-сфингозину.

Культура ЛД-50, мкМ*

Адриабластин АраС С2-церамид D-сфингозин

Н9 0,08±0,005 0,004±0,002 11,712,2 5,2510,25

К562 0,4± 0,07 0,002510,005 15,0±1,0 6,310,89

K562/i-S9 1,67±0,56 0,001510,001 5,7512,25 5,0

* - ЛД-50 - доза препарата, от которой погибает 50% клеток. Приведены обобщенные результаты нескольких экспериментов (не менее трех).

Чувствительность всех типов клеток к АраС (веществу, которое не относится к субстратам Pgp) оказалась практически одинаковой, гиперэкспрессирующие Pgp клетки линии K562/i-S9 были даже несколько более чувствительными к этому препарату, чем клетки линии К562. В то же время субстрат Pgp, адриабластин, обладая существенно меньшей токсичностью для клеток K562/i-S9, чем для клеток Н9 и К562. Популяцш клеток К562 оказалась в 5 раз резистентнее к адриабластину, чем клетки Н9, что може: быть связано с большей функциональной активностью Pgp в клетках К562. Это совпадае-с данными по экспрессии белка и с результатами родаминового теста. Различия i чувствительности клеточных линий к адриабластину могут также объясняться тем, чт клетки К562 несут сливной белок BCR/ABL, а гиперэкспрессия этой протеинкиназь отменяет в клетках некоторые виды апоптоза. Было показано, что клетки линии К56: резистентны к некоторым цитостатикам, и что введение аитисмысловы последовательностей ДНК к гену ABL снимает эту резистентность (McOahon et al, 1994 1997; Rowley etal., 1999).

Чувствительность клеток всех использованных в работе линий к D-сфингозин практически одинакова, а С2-церамид оказался несколько более токсичным для клето

линии К562Л-59. Таким образом, экспрессия Рур не препятствует цитотоксическому эффекту сфинголипидов, так же, как и в случае АраС. Очевидно, использованные синтетические сфинголипиды не являются субстратами Рдр. Для подтверждения этого предположения было проведено исследование чувствительности к С2-церамиду других клеточных линий с разной степенью экспрессии Pgp, характеризующихся иной тканевой и видовой принадлежностью, рыли использованы фибробласты джуигарского хомячка линии ДМ-15 и их резистентные варианты ДМ7" и ДМ!0" (уровни устойчивости к колхицину 707 и 4400, соответственно) и фибробласты сирийского хомяка линии НЕТ-БК-28С-1ЛШ и их резистентные варианты 2БС/20-1 и 28С/20-2 (уровни устойчивости к колхицину 23 и 23,7, соответственно). Результаты этих экспериментов приведены в таблице 2.

Таблица 2. Чувствительность к С2-церамиду клеток линий НЕТ-5К-25С-1.ММ, 25С/20-1, 25С/20-2; ДМ-15, ДМ7" и ДМ50", значения ЛД-50.

Культура НЕТ-811-25С-ЬКМ (исходные клетки) 28С/20-1 (уровень уст-и 23) 25С/20-2 (уровень уст-и 23,7)

ЛД-50, мкМ 5,0 5,0 5,0

Культура ДМ-15 (исходные клетки) ■ ДМ"1 (уровень уст-и 707) ДМ (уровень уст-и 4400)

ЛД-50, мкМ 12,0 12,0 12,0

Эти опыты показали, что резистентные варианты клеток всех использованных линий обладают такой же чувствительностью к С2-церамиду, что и родительские клетки, независимо от уровня лекарственной устойчивости и степени экспрессии и активности РёР- Эти эксперименты подтверждают предположение о том, что С2-церамид не является субстратом Pgp.

Таким образом, в выбранных нами моделях - клетках линий Н9 и К562 - не обнаружена конститутивная экспрессия гена КЮИ1. Эти клетки несколько различаются по экспрессии и активности Р^р. В клетках линии К562/1-59 и ген, и белок экспрессированы и активны, что позволяет использовать их как положительный контроль. С использованием клеток разной тканевой и видовой принадлежности показано, что исследуемые ,в работе синтетические сфинголипиды не являются субстратами Pgp.

2. Исследование влияния сфинголипндов н цитотоксических препаратов на степень экспрессии гена МОЛУ.

Одной из задач нашей работы было выяснить, возникает ли изменение экспрессии гена МОЯ/ в клетках линий К562 и Н9 под действием цитостатиков и сфинголипидов. Результаты репрезентативных экспериментов по определению экспрессии гена ММ/ с помощью модифицированного нами метода ЯТ-РСЯ, приведены на рис.1 и 2. Данные денситометрической оценки интенсивности флуоресцентного сигнала продуктов КТ-РСИ. этих экспериментов (объединены результаты не менее четырех опытов для каждой

4

культуры) приведены на рис. 3.

1 2

1а 16 2а 26 За 36 4а 46 1а 16 2а 26 За 36 4а 46

Рис.1. Экспрессия гена ЛЮД/ в клетках К562 (1) и Н9 (2) после обработки популяции С2-церамидом и О-сфингозином в течение 18 часов, а - продукт амплификации гена ЛЮД/, б -продукт амплификации гена Р2-микроглобулина; 1 - контроль, 2-10 мкМ О-сфингозина, 3-25 мкМ С2-церамида, 4 - положительный контроль (РНК клеток К562Л-Б9).

Рнс.2. Экспрессия гена М0Я1 в клетках Н9 (I) и К562 (2) после обработки популяции АраС и адриабластином в течение 18 часов. 1 - контроль, 2-25 мкМ АраС, 3 -5 мкМ адриабластина, 4 -положительный контроль (РНК клеток К562Л-89), 5 - отрицательный контроль.

Рис.3. Изменение уровня экспрессии гена Л/ОД/ в культурах клеток К562 и Н9 под юздействием 25 мкМ С2-церамида (1), 10 мкМ О-сфкнгознна (2), 25 мкМ АраС (3) и 5 мкМ |дриабластина (4). По оси ординат - уровень экспрессии гена Л/ОД/, рассчитанный относительно сонтроля, контроль принят за единицу (результаты денситометрии).

Эти опыты показали, что обработка клеток С2-церамидом приводит к увеличению 'ровня экспрессии гена МйЯ! в клетках К562 и Н9 в среднем в 2 раза. Сфингозин не (ызывает существенного увеличения уровня экспрессии \1DRI ни в одной культуре. В лучае же использования цитостатиков обработка клеток как адриабластином, так и АраС | выбранных концентрациях повышает уровень экспрессии гена МОИ! в клетках Н9 в реднем в 3 раза и не приводит к изменению количества мРНК этого гена в клетках К562.

Возможно, это также связано с активностью протеиикиназы ВСИ/АВЬ в клетках этой линии.

Определение дозовой и временной зависимости активации экспрессии гена МОЛУ при обработке клеток С2-церамидом показало, что характер ответа клеточной популяции зависит от типа клеток: количество мРНК гена МОЛУ увеличивается уже через 6 часов после добавления этого препарата в концентрации 25 мкМ к культуре клеток Н9 и только через 18 часов после добавления к культуре клеток К562. При обработке клеток Н9 С2-церамидом в концентрации 10 мкМ (что равно ЛД-50) мы обнаружили, что экспрессия гена МОДУ в клетках Н9 возникает уже при концентрации 10 мкМ и носит непостоянный характер: возникая через 6 часов, она существенно снижается к 12 часам и исчезает через 18 часов после инкубации клеток в среде, содержащий С2-церамид.

Данные, полученные рядом авторов (см., например, СЬаидЬагу, Лоптзоп, 1993), показывают, что обработка клеток веществами, усиливающими экспрессию гена ЛЮДУ, в том числе и АраС, может приводить к увеличению активности Р§р. Наши опыты не обнаружили изменений активности Р%р в клетках линии К562 и Н9 после обработки их 25 и 50 мкМ С2-церамида, 15 мкМ О-сфингозина и 50 мкМ АраС в течение 18 часов, несмотря на активацию гена МОДУ. Нельзя исключить, что Pgp в данном случае может выполнять в клетках иную функцию, не связанную с транспортом химиопрепаратов.

Таким образом, в этой части работы было показано, что растворимый аналог внутриклеточного церамида, С2-церамид, активирует экспрессию гена МИШ в клетках разных типов дифферен11ировки, этот эффект зависит от времени воздействия препарата и от его концентрации, а также, очевидно, от клеточного контекста. Другой растворимый сфинголипид, й-сфингозин, не увеличивает экспрессию гена МОИ1 в клетках использованных линий. Химиопрепараты адриабластин и АраС повышают экспрессию гена МЛШ только в клетках линии Н9, но не К562, что демонстрирует зависимость этого явления от клеточного контекста.

3. Исследование влияния ЛраС, С2-церамида и П-сфнигозшта па

апоптотическую гибель клеток.

Известно, что химиотерапевтические препараты обычно вызывают гибель клеток путем апоптоза, и в этот процесс может быть вовлечен сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукцин (БепсЬепкоу е( а1., 2001). Следующей задачей работы было исследовать способность химиопрепарата АраС и растворимых сфинголипидов П-сфингозина и С2-церамида вызывать апоптоз в популяциях клеток К562 и Н9 с целью сравнить способность этих веществ индуцировать апоптоз с их влиянием на экспрессию гена МйЯ1. В экспериментах этой части работы были использованы те же концентрации веществ и то же время инкубации с ними, что и в предыдущем разделе. При помощи двух методов анализа апоптоза (светомикроскопнческое исследование морфологии ядер и окраска клеток йодистым пропидием с дальнейшим РАСБсап-анализом) было показано, что при 18-часовом времени воздействия С2-церамида в концентрации 25 мкМ и П-сфингозина в концентрации 15 мкМ наблюдается заметный прирост числа апоптотических клеток в обеих культурах. На рис. 4 приведены результаты РАСБсап-анализа одного из опытов, а на рис. 5 - обобщенные результаты экспериментов (не менее трех для каждой культуры). С2-церамид вызывает увеличение числа апоптотических клеток по отношению к контролю в среднем в 2 и 1,5 раза (клетки К562 и Н9, соответственно), а О-сфингозин - в 3,3 и 2,8 раза (клетки К562 и 119, соответственно). Исследование временной и дозовой зависимости увеличения уровня апоптоза в клетках К562 и Н9 после воздействия препаратов показало, что обработка клеток линий К562 и Н9 25 мкМ С2-церамида и 15 мкМ О-сфингозина в интервале времени от 1 до б часов не вызвает увеличения числа апоптотических клеток, либо прирост их числа незначителен. Добавление в культуры клеток К562 и Н9 на 18 часов препаратов в разных концентрациях (С2-церамид- 15; 25 и 50 мкМ, О-сфингозин - 2,5; 10 и 15 мкМ и АраС-1; 2,5; 10; 25 и 50 мкМ) показало, что С2-церамид вызывает примерно одинаковый прирост

апоптотических клеток, независимо от использованной концентрации, тогда. как повышение концентрации Р-сфингозина и АраС заметно увеличивает уровень апоптоза в популяциях обеих клеточных линий.

" 10.3% д

а ** » * пм V

| '24.4% Б |

|

^ 3 ; • т. .О

" 25.2% I в

Ш ¡7*ПН

Рис.4. Изменение числа клеток в фазе клеточного цикла суб-ОО в популяции клеток К562 при воздействии 25 мкМ (Б) и 50 мкМ (В) С2-церамида и 15 мкМ О-сфингознна (Д) в течение 18 часов. А и Г - контроль (необработанная популяция). На гистограммах представлено распределение клеток с определенной интенсивностью флуоресценции после окраски йодистым пропидием. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции клеток, по оси ординат - количество клеток. Часть популяции, вошедшая в апоптоз, находится на гистограмме под линией М1. Исследовали 10 ООО событий. Цифровые значения количества апоптотических клеток представлены в верхнем левом углу на каждой гистограмме.

Рис.5. Увеличение количества апоптотических (в фазе суб-GO) клеток в популяциях К562 и Н9 под действием 25 мкМ С2-церамида (сег), 15 мкМ D-сфингозина (sph) и 25 мкМ (для К562) и 50 мкМ (для Н9) АраС (ara с) в течение 18 часов. Данные представлены как отношение количества апоптотических клеток в обработанных препаратами пробах к контролю (необработанная популяция); контроль принят за единицу. Приведены обобщенные данные минимум трех экспериментов.

Сопоставляя ответ клеток обеих линий (К562 и Н9) на воздействие сфинголипидов и АраС, можно заметить, что использованные препараты индуцируют апоптоз в обеих клеточных линиях. Клетки линии К562, вероятно, чуть более чувствительны к воздействию сфинголипидов, чем клетки Н9, хотя эти различия не достоверны. При воздействии АраС картина обратная: 25 мкМ АраС вызывает более выраженный апоптоз (в 2,8 раза по отношению к контролю) в популяции Н9, чем в К562 (1,9 раза). Эффект, вызываемый сфннголипидами несколько различается: D-сфингозин индуцирует апоптоз в более низких концентрациях, чем С2-церамид, что совпадает с результатами экспериментов по исследованию цитотокснчности веществ и данными литературы (Алесенко, 1999).

Такгш образом, показано, что растворимые сфинголипиды С2-церамид и D-сфингозин, а также химиопрепарат АраС, вызывают апоптоз в клетках линий К562 и Н9, число апоптотических клеток в некоторых случаях зависит от концентрации препарата, времени его воздействия и от клеточного контекста. Сопоставляя эти данные с результатами предыдугцего раздела, можно заключить, что в использованных нами клетках существует корреляция между индукцией экспрессии гена MDRI и апоптозом, но она не является облигатной.

4. Эффекты, оказываемые мутантпым геном Raf-C4 с доминантно-негативным эффектом на чувствительность клеток К562 к препаратам, апоптоз, экспрессию и нндуцибелыюсть гена MDRI.

Известно, что продукт гена Raf-l участвует в передаче сигнала, обусловленного накоплением церамида в клетке (Huvvler et al., 1996, Mathias et al., 1998). В связи с этим следующей задачей работы явилось получение клеток линий К562 и Н9, трансфицированных доминантно-негативным мутантом этого гена, Raf-C4, и сравнение эффектов, оказываемых церамидом, в клетках дикого типа и трансфектантах.

Конструкция, содержащая доминантно-негативный мутант Raf-C4 и селективный ген puro (обеспечивающий резистентность к пуромицину) была создана на основе вектора pBabe (Kolch et al., 1991) и любезно предоставлена проф. Б.П. Копниным. Полученная конструкция была трансфицирована в амфотропные пакующие клетки Phoenix в капьциево-фосфатном преципитате, далее кондиционированную среду с клеток Phoenix собирали и добавляли в среду для культур К562 и Н9 в соотношении 1:1. Селекцию проводили на среде, содержащей 2 мкг/мл пуромицина. Клетки Н9, трансфицированные геном Raf-C4, получить не удалось. Возможно, это связано с тем, что продукт гена Raf-1, как известно, проводит митогенные сигналы, и экспрессия доминантно-негативного мутанта гена Raf-1 в клетках Н9 могла полностью прекращать их размножение. Нами получены три независимые сублинии K562/Raf и три независимые сублинии K562/Puro, несущие «пустую» плазмиду, стабильно размножающиеся на среде с 2 мкг/мл пуромицина. Самым надежным способом определения экспрессии гена Raf-C4 представляется недавно разработанная методика (Bondzi et al., 2000), основанная на использовании моноклональных антител к эффектору Raf-1, МЕК, которые связываются с ним только в случае его фосфорилирования Raf-1 по специфическим аминокислотным остаткам (Ser 217 и Ser 221). Поскольку в наших руках не было этих антител, были получены иные доказательства в пользу активности гена Raf-C4 в клетках К562:

а) все полученные сублинии росли на селективной среде, содержащей 2 мкг/мл пуромицина, в то время как родительские клетки при этой концентрации препарата погибали в течение двух суток;

б) скорость пролиферации клеток К562 и K562/Puro была примерно в два раза выше, чем скорость пролиферации клеток K562/Raf. Поскольку ген Raf-1 контролирует клеточное деление, торможение этого процесса в клетках, трансфицированных его доминантно-негативным мутантом, Raf-C4, косвенно подтверждает экспрессию трансгена;

в) в экспериментах со всеми тремя независимо полученными сублиниями клеток К562/Ка{", трансфицированных геном Иа/-С4, воспроизводились сходные результаты ;

г) результаты, полученные при использовании сублипий клеток К562/Риго, несущих пустую плазмиду рВаЬе-Риго без гена Яа/-С4, были сопоставимы с данными, полученными в экспериментах с родительскими клетками, но не с клетками К562/ЯаГ.

На рис.6 приведены результаты репрезентативного эксперимента по исследованию влияния С2-церамида на активацию экспрессии гена МОН1 в клетках К562 и в одной из трех полученных сублиний клеток К562/ЯаГ и К562/Риго.

1а 16 2а 26 За 36 4 5

Рис.6. Влияние 25 мкМ С2-церамида на экспрессию гена МОЮ в клетках К562, К562/Риго и К562/ИаГ (сублиння №2). 1 - клетки К562, 2 - клетки К562ЛЫ, 3 - клетки К562/Риго, 4 -положительный контроль (РНК клеток К562Л-59), 5 - отрицательный контроль; а - контрольная, необработанная популяция, б - популяция после обработки 25 мкМ С2-церамида. Приведены результаты одного из трех экспериментов.

Уровень конститутивной экспрессии гена М/5Я/ не изменился в клетках сублинии с введенной «пустой» плазмидой и геном На/-С4 (треки 2а и За). В клетках К562/Риго, как и в исходных клетках К562 экспрессия гена Л/Ш/ повышается под влиянием 25 мкМ С2-церамида (треки 16 и 36). В клетках, трансфицированных геном Яа/-С4, С2-церамид не вызвал изменений экспрессии гена Л/£)Л/ (трек 26). Сходные результаты наблюдались в опытах со всеми тремя независимо полученными сублиниями К562/ЯаГ и К562/Риго. Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия доминантно-негативного мутанта гена Яа/-

1, Ка/-С4, в клетках К562 препятствует активации экспрессии гена МОЯ1, опосредованной С2-церамидом.

Известно, что продукт гена Иа/-1 является одним из звеньев передачи про-апоптотического сигнала, вызываемого накоплением церамида в клетке (Уао, 1995; Ни\у1ег е! а1., 1996). В связи с этим было проведено исследование влияния введения мутантного гена Иа/-С4 на способность сфинголипидов индуцировать апоптоз. Уровень апоптоза в популяциях клеток определяли с помощью окраски клеток иодистым пропидием и последующего РАСБсап-анализа (см. рис. 7, приведены результаты трех независимых экспериментов).

Рис.7. Количество апоптотических (в фазе суб-GO) клеток в популяциях К562 и их сублиниях с введенными генами MDRI, Raf-C4 и пустой плазмидой (Puro) (сублиния №3). 25 и 50 мкМ С2-церамида (А) и 15 мкМ D-сфингозина (Б) добавляли на 18 часов. Данные представлены как отношение количества апоптотических клеток в обработанных препаратами пробах к контролю (необработанная популяция); контроль принят за единицу.

Результаты этих экспериментов показывают, что введение гена Raf-C4 в клетки К562 практически отменяет апоптоз, вызванный воздействием С2-церамида и D-сфингозина. По-видимому, экспрессия доминантно-негативного мутанта прерывает сигнальный путь, ведущий от накопления церамида в клетках к их программируемой гибели.

Результаты этой части работы показывают, что прерывание сигнального пути, в котором участвует белок Raf-1, отменяет влияние С2-церамида на экспрессию гена MDR1, а также апоптоз, вызванный С2-церамидом и D-сфингозином в клетках линии К562. Эти данные позволяют полагать, что один и тот же путь сигнальной трансдукции вовлечен как в регуляцию активности гена MDRI, так и в регуляцию апоптоза.

Таким образом, паши исследования впервые показали, что в регуляцию экспрессии гена MDRI вовлечен сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукции -один из важнейших сигнальных путей в клетках млекопитающих. Этот путь активируется в ответ на различные стрессовые воздействия, в том числе, и на обработку клеток химиопрепаратами, начинается с генерации внутриклеточного церамида и приводит к разнообразным клеточным ответам, включающим апоптоз, пролиферацию и дифференцировку клеток (Mathias et al., 1998). Нами было обнаружено, что как синтетический С2-церамид, так и химиопрепараты вызывают активацию гена MDRI и апоптоз в использованных нами клеточных линиях, причем в некоторых случаях в одни и те же сроки и в одних и тех же концентрациях. Полученные данные позволяют полагать, что регуляция двух исследованных процессов: активации MDR1 и запуска апоптоза может в определенных случаях осуществляться координированно. Прерывание сигнального пути, инициируемого церамидом, путем введения в клетки доминантно-негативного мутанта гена Raf-I (Raf-C4) отменяет как активацию гена MDRI, так и апоптоз, вызванные

сфинголипидами, что также подтверждает наличие общих этапов регуляции этих процессов. Использование клеточных линий разного происхождения позволило нам выявить зависимость регуляции экспрессии гена Л/Ой/ и апонтоза от клеточного контекста. Из результатов наших исследований следует, однако, что связь между индукцией апонтоза и возрастанием экспрессии гена МОИ! в популяциях опухолевых клеток не является облигатной. Например, й-сфингозин вызывал только анонтоз в исследованных клетках, тогда как С2-церамид активировал как аноптоз, так и экспрессию гена \1DR1. Поскольку известно, что популяции опухолевых клеток гетерогенны, нельзя исключить, что начальный этап клеточного ответа па стресс является общим для всех клеток в популяции, а далее часть их защищается от стрессового воздействия путем активации гена Л/Ой/, в то врел1я как другая часть, которая не в состоянии противостоять стрессу, гибнет путем апоптоза.

Выводы

1. Обработка клеток линий К562 и 119 С2-церамидом (растворимым синтетическим аналогом внутриклеточного церамида) в течение 18 часов приводит к увеличению количества мРНК гена Л/Ой/, что свидетельствует в пользу участия сфингомиелинового пути сигнальной трансдукции, вовлекающего церамид, в регуляции активности гена Л/ОД/ в малигнизированных клетках системы кроветворения разных типов дифференцировки.

2. Характер индукции экспрессии гена МОД/ зависит от времени воздействия С2-церамида, от его концентрации и от типа клеток.

3. Обработка клеток О-сфингозином не приводит к увеличению количества мРНК гена МОД/ ни в клетках К562, ни в клетках Н9, что свидетельствует в пользу того, что передача сигнала, активирующего ген МОД/, идет через путь, контролируемый церамидом, но не сфингозином.

4. Химиотерапевтические препараты адрнабластнм и АраС, которые вызывают апоптотическую гибель опухолевых клеток путем активации сфнигомиелинового пути сигнальной трансдукции, в исследованных концентрациях повышают экспрессию гена МйЯ1 в клетках линии Н9, но не в клетках линии К562, что демонстрирует зависимость активации гена \iDRl цитостатиками в лейкозных клетках от клеточного контекста.

5. С2-церамид и О-сфингознн индуцируют апоптоз в популяциях клеток К562 и Н9. Индукция апоптоза в клеточных популяциях и активация гена \fDRI не всегда происходят координирование: Р-сфингозин вызывает апоптоз исследованных клеток, но не повышает в них активность гена \fDRI.

6. Обработка клеток линии К562 С2-церамндом не приводит к повышению функциональной активности Р-гликопротеина, тестируемой по скорости выведения из клеток флуоресцентного красителя Родамина 123.

7. Церамид не является субстратом Р-глнкопротеина, поскольку клетки с гиперэкспрессией Р-гликопротеина не отличаются от клеток дикого типа по чувствительности к С2-церамиду.

8. Ингибированне функции белка ЯаС-1 путем введения в клетки К562 мутантного гена Raf-C4 с доминантно-негативным эффектом отменяет влияние С2-церамида на экспрессию гена MDR1. В клетках К562 с введенным геном Raf-C4 наблюдается также и отмена апоптоза, вызванного обработкой клеток С2-церамндом и О-сфингозином. Эти данные позволяют полагать, что один и тот же путь сигнальной трансдукции, включающий Яа/-1, вовлечен как в регуляцию активности гена М1Ж1, так и в регуляцию апоптоза.

Список публикаций по материалам диссертации

1. О.В.Ктиторова, Е.С.Какпакова, Е.Ю.Рыбалкина, Е.С.Захарова, Е.Н.Ильина, В.М.Говорун, Н.П.Логачева, А.Н.Иншаков, П.КИванов. Адаптация метода RT-PCR для клинической диагностики экспрессии гена MDR1 Клиническая и лабораторная диагностика, 2000, №4,16-20

2. A.A.Shtil, О. V.Ktitorova, E.S.Kakpakova, O.Holian. Differential effects of the MDR1 (multidrug resistance) gene-activating agents on protein kinase C: evidence for redundancy of mechanism of acquired MDR in leukemia cells. Leukemia and Lymphoma, 2000,40, 191-195

3. О.В.Ктиторова, Е.С.Какпакова, М.М.Виноградова, Е.Н.Илъина, В.М.Говорун, Т.Н.Заботина, П.К.Иванов, А.А.Ставровская, А.А.Штилъ. Связь между индукцией активности гена множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток MDR1 и апоптозом. Онтогенез, 2001, т. 32,295-301

4. О.В.Ктиторова, Е.Н.Ильина, Н.П.Логачева, Е.С.Какпакова, В.МТоворун, П.К Иванов. Использование RT PCR для определения экспрессии гена MDR1. Тезисы симпозиума "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей", Москва, 1999

5. А.А.Ставровская, Е.С.Какпакова, О.В.Ктиторова, Т.П.Стромская, Е.Ю.Рыбалкина. Некоторые вопросы регуляции активности Р-гликопротеина в клетках в отсутствии стрессовых воздействий. Цитология, 1999, т.41, №3/4,315

6. E.S.Kakpakova, O.V.Klitorova, M.M.Vinogradova, T.N.Zabotina, E.N.llyina, A.A.Stavrovskaya, A.A.Shtil. Signalling pathways that regulate apoptosis and the MDR1 gene activation are similar but not identical. Supplement to Clinical Cancer Research, 1999, V.5

7. E.Rybalkina, T.Slromskaya, T.Zabotina, O.Ktitorova, A.Stavrovskaya. RARa-induced differentiation, P-glycoprotein (Pgp) activity and apoptosis in the cultured blood cells, Tumor Biology, 2000 V. 21 (Suppl.l), P. 136.

8. Е.С.Какпакова, О.В.Ктиторова, М.М.Виноградова, Е.Н.Илыша, Т.Н.Заботина, А.А.Ставровская, А.А.Штилъ Исследование взаимосвязи между индукцией гена MDR1 и апоптозом в клетках. Цитология, 2000,42(3), 283-284.

9. O.V.Ktitorova, E.S.Kakpakova, M.M.Vinogradova, V.M.Govorun, E.N.llyina, T.N.Zabotina, A.A.Shtil, A.A.Slavrovskaya. Multidrug resistance of tumor cells: role of sphingomyelin transduction pathway in regulation of MDR1 gene and apoptosis. Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problem, 2000, V.4, № I, P. 182.

10. А.А.Ставровская, Е.С.Какпакова, О.В.Ктиторова, Т.П.Стромская, Е.Ю.Рыбалкина, А.А.Шпшчь. Изменение регуляции апоптоза опухолевых клеток и их множественная лекарственная устойчивость, опосредованная Р-гликопротеином. Цитология, 2001,43, 893.

:ток множительной техники РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Заказ 282 Тираж 100 экз.