Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Исследование механизмов нейропротекторного действия пролинсодержащих дипептидов

На правах рукописи

ВУКОЛОВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ДИПЕПТИДОВ (НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПАРКИНСОНИЧЕСКОГО СИНДРОМА)

14.00.16 - Патологическая физиология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2003

Работа выполнена в лаборатории общей патофизиологии нервной системы Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор академик Российской АМН

Г.Н. Крыжановский

доктор биологических наук

В.К. Луценко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Р.Н. Глебов Т.А. Воронина

Ведущее учреждение:

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится « 18 » декабря 2003 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, Балтийская ул., 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « п » ноября 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат медицинских наук Л.Н.Скуратовская

¿006-4 4 7&ZO

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Проблема апоптоза или программированной клеточной смерти играет важную роль не только в нейрональном развитии (Oppenheim R.W. et al., 2001), но и при различных нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера (Stefanis et al., 1997). Несмотря на многочисленные исследования, молекулярные механизмы клеточной смерти при этих нейрональных расстройствах до конца не изучены.

Из наиболее часто встречающихся форм патологии мозга у людей пожилого возраста является болезнь Паркинсона (БП), характеризующаяся повреждением и дегенерацией значительной части пула дофаминергических нигростриатных нейронов, приводящее к дефициту тормозного нейротрансмитгера дофамина (ДА) в стриатуме (Огеллин В.А., Арушанян Э.Б., 1989; Burns R.S. et al., 1983; Birkmayer W., Riederer P., 1983; Heikkila R.H. et al., 1984; Barbeau A., 1986, Hornykiewicz О., Kish S.J., 1986; Wooten G.F., 1987; Jellinger K.A., 1994), структуры которого регулируют моторную активность и мышечный тонус.

При болезни Паркинсона используется только заместительная терапия, например, предшественник дофамина (ДА) Ь-3,4-дигидроксифенилаланин (L-ДОФА), потому что ДА не проникает через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Длительное применение леводопа-содержащих препаратов приводит к возникновению двигательных нарушений и тяжелых побочных эффектов (дискинезий, деменций, и др.). Недостаточность данных о нейрохимических и патофизиологических механизмах, лежащих в основе дегенерации дофаминергических нигростриатных нейронов препятствует разработке эффективной патогенетической терапии при БП. Это делает актуальным поиск химических соединений, которые бы вмешивались в сам процесс нейродегенерации.

В настоящее время проблема нарушения, памяти становится все более актуальной по мере старения населения планеты и роста различных форм патологии мозга, вызываемых травматическими, токсическими, лекарственными воздействиями, а так же при боли, стрессе, нарушении сна, алкоголизации и т.д. Нарушение когнитивных функций - распространенный симптом различных заболеваний нервной системы, прежде всего нейродегенеративных болезней (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и другие) - наиболее общая причина деменции у взрослых. Нарушения памяти имеют место у 65 % больных с ишемических повреждением мозговых структур (Островская Р.У., 1998).

Для терапии указанных заболеваний перспективно использование соединений,

сочетающих свойства нейропротекгоров и усилетелей процессов памяти.

Соединениями с подобными свойствами являются ноотропы. К их числу относятся

пирацетам и высокоэффективные пролинсодержащие ¡пептидаг--сишазированные

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА -С. Петербург 200рР К

Т.А. Гудашевой и сотр. (1985-2002) в ГУ НИИ фармакологии РАМН. Ноотропы усиливают процессы запоминания и памяти, противодействуют амнезии, вызываемой самыми разными формами патогенных воздействий: ишемией, гипоксией, нарушением холинергической передачи, электрошоком, травмой и старением (Гудашева Т.А. и др., 1985; Воронина Т.А. и Серединин С.Б., 1998; Sarter М., 1991; Pizzi М., 1993; Gouliaev А.Н. and Senning А., 1994; Островская Р.У. и др. 1999, 2001). Пролинсодержащие пептиды подобно синтетическим ноотропам обладают нейропротективным действием (Воронина Т.А., 1998; Андреева H.A. и др., 2000).

В физиологическом и патофизиологическом плане привлекательна гипотеза о существовании собственной ноотропной системы мозга. Эндогенными лигандами которой могли быть пролинсодержащие пептиды, а экзогенными - пирацетам и другие рацетамы. Недавно Т.А. Гудашева и сотр. (1996) обнаружили в мозге -циклопролилглицин (ЦПГ), структура и фармакологический спектр действия которого оказались сходными с таковыми, как и у пирацетама. Мембранные и клеточные механизмы действия эндогенного ноотропа не были известны.

Представляет научный интерес исследование клеточных механизмов ноотропного и нейропротекторного действия пролинсодержащих эндогенных соединений и их синтетических производных, имеющих клиническую перспективу.

Цель настоящего исследования состояла в выяснении особенностей изменений мембранного потенциала синаптонейросом и ионного кальциевого гомеостаза в культуре нейронов стриатума при действии пролинсодержащих пептидных ноотропов, а также изучение нейропротективного действия пролинсодержащего пептида ТГС-79 на модели МФТП- индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома.

Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать влияние пролинсодержащих нейропептидов на мембранный потенциал синаптонейросом (СНС) и изучить ионную основу этих эффектов.

2. На модели МФТП - индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома изучить возможное нейропротективное действие пролил-тирозинового аналога активной последовательности нейротензина.

3. Измерить сдвиги внутриклеточных концентраций Са2+ - общего конечного пути действия патогенов на клетку при действии пролинсодержащих дипептидов с помощью анализа изображений.

Научная новизна исследования определяется её основными результатами. Настоящее исследование является поисковым и представленные в нём результаты оригинальны.

Впервые показано, что эндогенный ноотроп циклопролилглицин (ЦПГ), пролин, и другие исследуемые пролинсодержащие соединения (ГВС-111 (ноопепт), ТГС-20, ТГС-79) вызывают изменения мембранного потенциала синаптонейросом (СНС). ЦПГ И ГВС-111 вызывают деполяризацию и гиперполяризацию. Оба ответа

подавляются блокаторами калиевых каналов. Сказанное согласуется с предположением об участии ионов К* в генерации обнаруженных сдвигов мембранного потенциала.

Впервые показано, что нейропротективные эффекты ГВС-111 и ТГС-79 обусловлены нормализацией кальциевого гомеостаза в нейронах стриатума. Предложен вариант метода получения первичной культуры нейронов стриатума.

Впервые показано нейропротективное действие пролин-содержащего пептида ТГС-79 на модели МФТП-индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома у мышей.

Теоретическое значение. Описание электрогенных свойств некоторых пролинсодержащих пептидов наводит на мысль о существовании эндогенной ноотропной системы. Она может быть мишенью действия коротких фрагментов регуляторных пептидов - ЦПГ, пироглутаминовой кислоты и экзогенных синтетических ноотропов. Мнестические и нейропротекторные эффекты пролинсодержащих ноотропов обусловлены модуляцией активности ионных каналов. Пролилтирозиновый дипептид соответствующей активной последовательности нейротензина может предотвращать развитие МФТП -индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома у мышей. Результаты дают основание предполагать, что пролилтирозиновые дипептиды вероятно вмешиваются в сам процесс нейродегенерации.

Практическое значение настоящей работы состоит в том, что в ней изучены возможные механизмы действия ГВС-111 (ноопепт) на нейроны теплокровного животного, который синтезирован в ГУ НИИ фармакологии РАМН. Недавно успешно завершилась первая и частично вторая фаза клинических испытаний ноопепта, как ноотропного препарата. Обнаруженная нами способность активной последовательности нейротензина препятствовать развитию экспериментального паркинсонического синдрома может оказаться принципиально новым подходом в терапии паркинсонизма.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Впервые исследованы клеточные механизмы дипептидного ноотропа ЦПГ. Описаны сдвиги мембранного потенциала, дозовая зависимость и показано участие калиевых каналов в наблюдаемых мембранных эффектах.

2. ГВС-111 - мощный нейропротектор в экспериментах на синаптонейросомах вызывает качественно сходное с ЦПГ изменение мембранного потенциала СНС. Нейропротекторное действие ГВС-111 может быть объяснено, как изменением мембранного потенциала, так и блокадой входа кальция в нейроны стриатума через потенциал-чувствительные кальциевые каналы.

3. Описаны клеточные механизмы действия пролина (амнестическое вещество и эксайтотоксин) и ТГС-20 (производное ноотропа пироглутаминовой кислоты).

4. Показана способность пролинсодержащего активного участка нейротензина защищать нейроны от гибели и предотвращать развитие МФТП-

индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома у мышей. Защитное действие обусловлено способностью ТГС-79 предотвращать кальциевую перегрузку, ведущую к апоптозу и некрозу нейронов при паркинсонизме. Данные с ТГС-79 являются экспериментальным обоснованием принципиально нового подхода к терапии паркинсонизма.

Адообапия работы

Основные результаты проведенных исследований были доложены на:

2-ом Российском конгрессе по патофизиологии "Экспериментальные и клинические аспекты" (Москва, 2000); 4-ой конференции Чешского Нейронаучного Общества с международным участием (Прага, Чехия, 2001); совместном митинге Физиологического общества Великобритании с Физиологическим Обществом Италии, Университет Ливерпуля (Ливерпуль, Великобритания, 2002); 2-ом Съезде Российского Научного Общества Фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии" (Москва, 2003); 3-м конгрессе Федерации Европейских Физиологических Обществ (Ницца, Франция, 2003).

Структура диссертации. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация проиллюстрирована i таблицей! и 37 рисунком. Список литературы содержит 232 отечественных и зарубежных источников.

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Работа выполнена при поддержке грантов Российского Фонда Фундаментальных исследований (проект № 02-04-06617), the Wellcome Trust, the FEBS Fellowship.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Исследование выполнено на 85 белых беспородных крысах массой 100-120 г, на 27 шестидневных крысах-самцах линии Sprague-Dawley и на 65 мышах линии C57BL/6 возрастом 3, 5 и 14 месяцев. В работе использовали реактивы фирм "Serva" (Германия), "Sigma" (США), "Merck" (Австрия, ФРГ) и BDH Anala-R (Англия).

Пролинсодержащие дипептиды были предоставлены руководителем отдела химии ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова, д.б.н. Т.А. Гудашевой.

Экспериментальной паркинсоиический синдром (ПС) у мышей линии C57BL/6. вызывали посредством многократного внутрибрюшинного (в/б) введения 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТИ). Исследование проводилось под руководством ведущим научным сотрудником лаборатории общей

патофизиологии нервной системы, д.м.н. В.Г. Кучеряну. В первой серии опытов 5-ти мес. мышам МФТП вводили в/б в дозе 30 мг/кг дважды в сутки с интервалом 12 ч в течение 14 дней. Во второй серии использовали 3-х мес. мышей, но доза МФТП, вводимая по той же схеме, была уменьшена до 25 мг/кг. Доза ТГС-79 была равна 2 мг/кг. Контрольной группе мышей вводили физраствор (0,9% NaCl). Все препараты вводили в/б в объёмах ОД - 0,3 мл в одно и то же время. В каждом опыте использовали одинаковое количество (в основном 10 - 12) опытных и контрольных животных.

О развитии ПС судили по выраженности мышечной ригидности и олигокинезии, которую оценивали по изменению двигательной активности животных и количества вертикальных движений (стоек). Для автоматического измерения параметров двигательной активности животных использовали тест «открытое поле», применяя систему Opto-Varimex-3 ("Columbus instruments", США). Ригидность оценивали по симптому "горбатости" и выражали в баллах, характеризующих укорочение расстояния от шеи до основания хвоста: отсутствие -0; укорочение расстояния от шеи до основания хвоста до 1 см -1; более 1 см - 2.

Исследования проводили до, спустя 7 и 14 суток от начала введения МФТП и ТГС-79 в одно и то же время суток, через 1 ч после введения препаратов.

Выделение синаптояейросом (СНС) и измерение мембранного потенциала с помощью DiS-C2-(5) (Molecular Probes, Inc., USA) проводилось по методу (Akerman К.Е.О. et al., 1987; Heinonen E. et al., 1989). СНС выделяли из коры головного мозга и стриатума. Ткань гомогенизировали в среде выделения (мМ): NaCl -137; КС1 - 5,4; MgCl2x6H20 - 1,2; КН2Р04-0,5; NaHC03 - 4,2; TES - 20; доведенный до рН=7,51 с 1N NaOH. Полученную суспензию фильтровали через два слоя синтетической ткани с диаметром пор <1=133ц, а затем через фильтры LCWP 04700 (фирмы Millipore Corp.) с диаметром пор с1=8-10ц. Центрифугировали дважды в центрифуге К-24 (Германия) при 6.000 об/ мин в течение 30 минут. Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури.

Для измерения мембранного - потенциала (МП) осадок СНС ресуспендировали в 2 мл среды инкубации, которая была такой же как и среда выделения, плюс 2 мкМ DiS-C2-(5) и 10 мМ глюкозы, и переносили в термостатируемую при 37°С кювету. В зависимости от задачи исследования содержание Са* в среде инкубации было равно 0 (без Са2+) или 1,2 (норма) мМ. Поглощение зонда измеряли при двух длинах волн 590 нм и 646 нм, используя либо двухлучевой спектрофотометр Hitachi-320 (Япония), либо двухволновой спектрофотометр Hitachi-557 (Япония). Hitachi-557 был предоставлен вед. науч. сотр. лаборатории патофизиологии сердца НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, д.б.н. Т.А. Сазонтовой. Каждая серия измерений завершалась добавлением 2 мкМ грамицидина, устранявшего МП, поэтому разница между начальным отсчётом и таковым после его добавления принималась за величину МП покоя, и все эффекты добавляемых веществ оценивались в % от величины грамицидинового ответа.

Эксперименты на культуре нейронов стриатума были выполнены с помощью сотрудников лаборатории фармакологии Университетского Колледжа Лондона под руководством профессора D.A.Brown, FRS (Laboratory Head).

Первичную культуру нейронов получали выделением стриатума из мозга 6-ти дневных крыс Sprague-Dawley, с последующем суспендированием в небольшом объёме сбалансированного солевого раствора Гея (GBSS, Gibco-TM) и дважды инкубированием в трипсине типа XI (1 мг мл"1 в течение 30 минут), с дальнейшей механической фильтрацией и центрифугированием. Нейроны наносились на покровные стекла, покрытые поли-Ь-лизином, и выращивали при 37°С при атмосфере 5 % С02 в среде: нейробазальная среда + (нейробазальная среда с добавлением 5 % сыворотки новорожденных телят и 0,5 мМ глутамином) + В-27. Среда менялась 2 раза в неделю. Реагенты фирмы Gibco; а поли-Ь-лизин, коллагеназа, трипсин и сыворотка новорожденных телят (Sigma).

Эксперименты по измерению внутриклеточной концентрации ионов кальция ([Caî+]i) нейронов стриатума проводили с помощью анализа изображения, используя 340/380-нм возбуждение и 520-нм эмиссию длин волн, при помощи стандартного флюоресцентного микроскопа. Клетки загружались 30 минут при комнатной температуре Fura-2AM (5мкМ, Molecular Probes, Eugene, OR) и 0.005% Pluronic в их первоначальную среду с NB+ 5%NCS. Нейроны стриатума постоянно суперфузировались средой, содержащей (мМ) NaCl - 135; KCl - 3; СаС12 - 2; MgS04 хТН20 - 2; КН2Р04-1,25; глюкоза - 10; Hepes - 10 (доведенный до рН=7,4 с 1N NaOH).

Для измерения токов через потенциал-управляемые Са2+-каналы

использовался стандартный метод фиксации потенциала на целой клетке, как описано (Caulfield et al., 1994) на 14-ти дневной первичной культуре нейронов стриатума.

Статистическая обработка полученных результатов. Достоверность различий оценивали согласно t-критерию Фишера-Стьюдента и однофакторному дисперсионному анализу (ANOVA). Различия считались достоверными при Р<0,05. Данные представлены в виде М±м. Статистическая обработка данных проводилась, используя программы "Primer", "Microsoft Excel", "Origin 6.0 Professional" и программного обеспечения pClamp 8 (Axon Instruments).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изменение мембранного потенциала, вызванного пролин-содержащими

динептидами

Внутриклеточный калий играет важную роль в контроле метаболических процессов регуляции клеточного объема и торможении апоптотических энзимов в цитозоле и ядрах. Цитоплазматические К+ концентрации в основном регулируются

К+ захватом с помощью Na+- К+-АТФазы и К+ выходом через К+ каналы в плазматической мембране. Его потеря вследствие увеличения выхода через плазмалемные К+ каналы приводит к клеточному сжатию, главной характеристике апоптоза (Bortner C.D. et al., 1997), и активации каспаз, играющих определяющую роль в апоцтозе (Perregaux D. and Gabel С.А., 1994; Walev I. et al., 1995; Hughes F.M. et al., 1997; Thomberry N.A. and Lazebnik Y., 1998). Поэтому изучение мембранного потенциала (МП), являющегося главным образом калиевым диффузионным потенциалом, было бы полезным для понимания механизмов нейропротективного действия пролинсодержащих пептидов. Удобной моделью для обнаружения сдвигов МП, обусловленных изменением ионной проницаемости мембраны и метаболическими нарушениями являются синаптонейросомы (СНС) из-за значительно большего, чем у нейронов отношения поверхность/объём.

В предварительной серии опытов были отработаны методические приемы, связанные с измерением сдвигов МП с помощью зонда DiS-C2-(5). Также как в опытах К.Е.О. Акермана и сотр. (1987, 1989) добавление суспензии СНС в кювету вызывало уменьшение разницы полощения при 590-646 нМ (отклонение пера прибора вниз (рис.1). На рис.1 показана методологическая сторона проведенных экспериментов. О качественных характеристиках ответов можно судить по приведенным ниже копиям оригиналов записей.

Рис. 1. Сдвиги оптической плотности зонда 1Н8-С2-(5), вызванные добавлением ГВС-111 (1 мкМ). Среда инкубации без Са2+. Потенциалзависимая разница поглощений при \~590 и Х.=646 нм. Калибровка изменений оптической плотности зонда ГМ8-С2-(5) и скорость развёртки (сек) приведены внизу справа. Здесь и на последующих рисунках деполяризация соответствует отклонению вверх, гиперполяризация - вниз. Передний фронт ответов - смещение пера после включения записи. Конечная концентрация зонда в кювете равна 2 мкМ. Концентрации белка СНС в пробах 250 мкг/мл.

Пролин, ЦПГ, ГВС-111 вызывали увеличение поглощения зонда при двухволном способе регистрации, то есть деполяризовали мембрану СНС. Результаты подсчетов сдвигов МП в процентах к грамицидиновуму ответу (разнице в величинах поглощения зонда между минимумом поглощения после добавления СНС и максимальным поглощением после добавления грамицидина в конце опыта) представлены в таблице 1. Из таблицы 1 следует, что эффективность деполяризации снижается в ряду КС1>ГВОЦПГ>глутамат. Поскольку ГВС и ЦПГ являются пролинсодержащими соединениями, и именно пролин играет решающую роль во влиянии ноотропов на процессы памяти, мы включили в исследование и влияние пролина на МП СНС. Из рис. 2 следует, что все три соединения в одной и той же концентрации 1 мкМ, вызывают увеличение поглощения оптического зонда (деполяризацию), причем на медленно затухающий ответ накладываются быстрые колебания МП.

Таблица 1.

Сопоставление деполяризующиго действия исследуемых соединений в % от величины максимального потенциал-зависимого ответа. М-средняя арифметическая, а м - стандартная ошибка. Разница между 2 и 3, р<0,05.

№ п/п Название Концентрация Число М + м

химического в кювете, М наблюдений

соединения

1 ЦПГ 3x10° 13 7,0+0,5

2 ЦПГ Ю-6 6 3,2+0,8

3 ГВС Ю-6 5 10,3+1,8

4 Глутамат 5x10"5 4 6,7+1,1

5 КС1 23x1 (Г1 3 28,1±5.15

Рис.2. Сдвиги оптической плотности зонда Ш8-С2-(5), вызванные добавлением пролина (А), ЦПГ (Б), ГВС (В) и ЦПГ (Г) (все концентрации 1 мкМ). Среда инкубации без Са2+. Концентрации белка СНС в пробах Л, Б, В равны 288 мкг/мл, для Г - концентрация белка в пробе 17 мкг/мл.

В ряде случаев ответ на добавление препарата, особенно пролина, заключался в появлении быстрых ритмичных колебаний оптической плотности (рис.2). На рис.3 представлены ответы, вызванные пролином, ЦПГ, ГВС. Их эффективность была такой же, как на рис.2 и таблице 1 (ГВС-111 > ЦПГ > пролин). Медленное изменение поглощения зонда на рис.3 обусловлено физико-химическим состоянием самого зонда, проявляющееся и в отсутствии СНС, а не изменением МП СНС. При двухлучевом способе регистрации, когда зонд присутствует в обеих кюветах, измерения показывают стабильность МП СНС в течение времени, занимаемого опытом. Взаимодействие ЦПГ и ГВС было скорее конкурентным, чем аддитивным. Так, ЦПГ, добавленный на фоне ответа к ГВС (и глюкозе) устранял сдвиг МП СНС, вызванный ГВС-111 (рис.3). Еще более чёткое уменьшение поглощения зонда после добавления ЦПГ выражено в записи на рис.4. По-видимому, этот эффект обусловлен конкуренцией веществ за одну и ту же мишень, поскольку не только ЦПГ уменьшал МП после пролина, но и добавленный после ЦПГ ГВС-111 устранял его действие.

Рис.3. Взаимодействие пролина, ГВС-111 и ЦПГ в концентрациях 10 мкМ. Среда инкубации без Са2+. Конечная концентрация зонда в кювете равна 2 мкМ. Концентрация белка СНС равна 290 мкг/мл.

А Д. 1 Ч . л 1 Л л.

\ ЩГ1!

Рис.4. Конкурентные отношения между пролинсодержащими соединениями во влиянии на мембранный потенциал СНС. Пролин, ЦПГ и ГВС-111 в концентрациях 10* М. Концентрация белка СНС равна 288 мкг/мл.

. 30 с .

I]

В опытах А.В. Прихожана и Г.И. Ковалёва (1986) пирацетам подавлял действие пролииа на секрецию медиатора нервными окончаниями. Показанные на рис.4 конкурентные отношения между пролином и ЦПГ можно объяснить пирацетамоподобным действием. Небольшая величина ответов пролина скорее всего связана с использованием его в низких концентрациях 10"6 в наших опытах, поэтому его концентрация в суспензии могла эффективно понижаться с помощью системы захвата пролина. Более высокая эффективность ГВС-111 могла быть обусловлена величиной молекулы или изменениями молекулами обеспечивающее её более длительное пребывание на рецепторе. Первоначально разработчики препарата ГВС-111 рассматривали его в качестве транспортной формы для ЦПГ, в который он превращается после проникновения через ГЭБ. В таком случае действие ГВС-1 И было бы более медленным из-за временного гидролиза и не превосходило бы эффекта ЦПГ, взятого в эквимолярном количестве. В действительности ответ СНС к ГВС-111 появлялся быстро и был больше такового для ЦПГ. Ослабление эффекта ГВС-111 после добавления ЦПГ видно и на рис. 6.

Эффекты ЦПГ и ГВС были дозозависимыми и насыщаемыми (рис.5, таблица 1). Утрата ответа на дальнейшее увеличение концентрации ЦПГ в пробе не устраняло действия других деполяризаторов (например, 4-аминопиридина на рис. 5). Ионы Ва2+ (2 мМ), 4-аминопиридин и в особенности КС1 (20 мМ) вызывали большую деполяризацию мембраны СНС, чем пролинсодержащие соединения. Подобная зависимость наводит на мысль о рецептор-опосредуемом характере реагирования ЦПГ на СНС.

Рис.5. Зависимость доза - ответ для ЦПГ. По оси ординат - деполяризация мембраны в % от величины грамицидинового ответа (потенциала покоя СНС). Концентрации ЦПГ в кювете после добавления препарата показаны на рисунке. Концентрация 4-аминопиридина 1 мМ. Концентрации белка СНС в пробе 290 мкг/мл.

%

От-

ГРЛМ

50-

1004

12$ J

ГВС

№ добавки

Рис.6. Сдвиги МП СНС, вызванные ГВС-111 и ЦГТГ в концентрации 10'5 в среде с 3 мМ Са2+. Конечные концентрации KCl в кювете после первого и второго добавления соответственно 20 и 40 мМ. Значения оптической плотности зонда: перед добавлением препаратов - 100% МП, «0» - после добавления грамицидина (полностью деполяризованные СНС). Концентрации белка СНС в пробе 290 м кг/мл.

В нашей работе впервые было показано, что при действии на СНС ЦПГ вызывает сдвиги МП. Ответы СНС на ЦПГ и ГВС-1 И в Са2+ - содержащей среде отличались от таковых в среде без ионов Са2+ присутствием гиперполяризационной составляющей. Добавление ГВС-111 в кювету после KCl не гиперполяризовало, а деполяризовало СНС (рис.6). В среде без Са2+ и достаточно высокой концентрации СНС обычным типом ответа на добавление ЦПГ и ГВС-111 была деполяризация мембраны (рис.2 а, б, в). Гиперполяризационный ответ в среде без Са2+ был приходящим и более надежно регистрировали в случае увеличения концентрации Са2+ (рис.6). Первый эффект очевидно Са2+-зависим, а второй регулярно воспроизводится в среде без Са2+. Аналогичное различие в чувствительности двух видов ответов к присутствию ионов Са2+ наблюдали при действии, например, брадикинина на нейроны. В экспериментах (Higashida Н., Brown D.A., 1986) пребывание препарата в среде без Са2+ приводило к исчезновению гиперполяризационных ответов нейронов на воздействие брадикинина уже через несколько минут, хотя деполяризационные ответы в среде без ионов Са2+ сохранялись (Higashida Н., Brown D.A., 1986). Это можно было бы объяснить действием пролинсодержащих соединений на рецепторы, запускающими фосфоинозитидный каскад. Поэтому в некоторых опытах мы попытались блокировать распад ИФ-3 с помощью ионов лития и тем самым усилить воздействие наших соединений на мембрану.

Деполяризационные сдвиги МП СНС были обнаружены нами также при воздействии ТГС-20 (рис.9) и ТГС-79. Было получено, что ТГС-79 (1мкМ) деполяризует СНС на 31,3±6 % от грам. ответа. Но после действия калиевой деполяризации ТГС-79 деполяризовал мембрану СНС только на 10,48±0,33 % от грам. ответа

2. Взаимодействие пролинсодержащих соединений с блокаторами К1

каналов

Изменения МП СНС под влиянием ЦПГ могло быть связано с воздействием ЦПГ на К* каналы. Так, повышение калиевой проводимости должно вызывать гиперполяризацию, а блокада К+ каналов - деполяризацию нейрональной мембраны СНС. В электрофизиологическом эксперименте Солнцевой Е.И. и сотр. на нейронах виноградной улитки (1996), пептид ГВС-111, структурно близкий гомолог ЦПГ блокировал высокопороговые К* каналы, что могло быть причиной деполяризующего действия ГВС в наших опытах на препарате СНС теплокровного животного. Вряд ли речь идет об одних и тех же 1С" каналов, поскольку в наших опытах К4 каналы должны были быть открытыми при потенциале покоя, тогда как для открывания К* каналов в опытах Е.И. Солнцевой и др. требовалась сильная деполяризация нейрональной мембраны.

Для установления роли К4 каналов в генерации наблюдаемых ответов были использованы блокаторы К4 каналов ионы Ва2+ и тетраэтиламмоний (ТЭА) и 4 -аминопиридин, которые как и в опытах К.Е. Аккерамана также вызывали деполяризацию мембраны СНС (Нетопеп Е., Акегтап К.Е.О., 1989). Было получено, что ТЭА вызывает чёткий деполяризационный сдвиг МП СНС, который был в значительной степени подавлен в результате добавления ЦПГ (рис.7А). Если эффекты обоих соединений обусловлены воздействием на одну и ту же мишень, следует ожидать ослабления ответа одного соединения в присутствии другого. Это подтверждается на рис.7Б, что деполяризующее действие ТЭА в присутствии ЦПГ оказывается полностью подавленным (рис.7Б). Любопытно, что плохой деполяризатор ЦПГ способен уменьшать развивающийся эффект ТЭА, возможно, из-за взаимодействия с его местами связывания (рис.7А). Как показано, на рис.7В гиперполяризующее действие ЦПГ на СНС было полностью подавлено добавлением в кювету ионов Ва2+. Конкурентные отношения отмечены не только при взаимодействии ТЭА с ЦПГ, но и при взаимодействии ЦПГ с ионами Ва2+. На рис. 8 А показана зависимость величины Ва2+ деполяризации на фоне деполяризационного ответа, вызываемого ЦПГ. Видно, что чем больше деполяризационный ответ, вызываемый ЦПГ, тем меньше сдвиг МП, вызываемого воздействием на мембрану СНС ионов Ва2+.

На рис.8 Б показано ослабление эффекта пролина на фоне Ва2+ деполяризации.

Рис.7. А,Б - взаимодействие блокатора К^-каналов - тетраэтиламмоиия (1мМ) и ЦПГ (ЗхЮ'5 М). В - ионы Ва2+ полностью подавляют гиперполяризационный ответ, вызванный ЦПГ. Последовательные записи в одном опыте (разные пробы). Концентрация белка СНС в пробах одинаковая 26,5 мкг/мл.

ЦПГ ВаСЦ

Рис.8. А- Зависимость Ва2+ деполяризации от величины предшествующего ЦПГ ответа. По оси ординат величина Ва2+ (2мМ) деполяризации после добавления ЦПГ. По оси абсцисс деполяризующий ответ, вызываемый ЦПГ. 8. Б- Зависимость деполяризационного эффекта пролина от величины предшествующей Ва2+ деполяризации. По оси ординат деполяризационный ответ, вызванный пролином. По оси абсцисс величина деполяризации после добавления пролина. Деполяризующие эффекты выражены в % от грам. ответа.

Выше отмечалось, что ноотропными свойствами обладает также пироглутаминовая кислота (2-оксипролин). Его пептидное производное Ь-пироглутамил-Е)-аланинамид (ТГС-79, синтезированный Т.А. Гудашевой и др.) оказывал благотворное влияние на когнитивные функции у крысят, нарушенные в

результате пренаталыюй гипоксии и алкоголизации. В связи с этим мы исследовали влияние ТГС-20 на МП СНС и связь наблюдаемой деполяризации с калиевой проводимостью мембран СНС. Предполагалось возможное участие фосфоинозитидного каскада в модуляции активности К+ каналов. С этой целью был использован LiCl в концентрации 2 мМ, блокирующий распад ИФ-3, который не вызывал сдвигов МП и не изменял ответа СНС к ТГС-20. Действие ВаС12 (2мМ) после ТГС-20 было полностью подавлено (рис.9Б), а ответ ТГС-20 после Ва2+ был резко ослаблен (рис.9В). Блокада К* каналов ТГС-20 объясняет его способность усиливать долговременную потенциацию синаптических ответов в гиппокампе LTP как саму по себе так и в случае её ослабления в результате пренатальной гипоксии и алкоголизации (Chepkova et al., 1995).

Эксперименты были выполнены со средами, содержащими ионы Са2+ или без них (большинство опытов). Поскольку ЦПГ деполяризовал мембрану СНС в обоих случаях содержание ионов Са2+ в среде не является абсолютно необходимым для возникновения ответа на ЦПГ. В одном из опытов мы блокировали хлорные каналы пикротоксином, однако эта блокада не влияла на величину деполяризации, вызываемой ЦПГ. Сказанное означает, что влияние исследованных соединений, содержащих пирролидиновое кольцо (пролин, ЦПГ, ГВС-111, ТГС-20, ТГС-79), на МП СНС обусловлено блокадой К+ каналов. Влияние на К* каналы объясняет способность исследуемых пролиновых соединений усиливать мнестические процессы. Хорошо известно, что блокаторы К+ каналов усиливают мнестические процессы. Например, блокада К+ каналов тетраэтиламмонием способна вызывать долговременную потенциацию в миндалине крыс (Wang S., 1997). Гиперполяризационное действие ЦПГ и ГВС-111 скорее всего обусловлено увеличением К+ проводимости.

г

Б

i

ТГСи+ВаГ*

С

ч

U+Trv во*

Рис.9. Конкурентные отношения ТГС-20 (1мкМ) и ионов Ва2+. Концентрации ВаС12 (2мМ) и LiCI (2 мМ).

В отношении открывателей К4 каналов давно известно, что они в значительной степени ослабляют эксайтотоксичность, вызванную, например, блокадой клеточного дыхания (Abele A.F. and Miller R.J., 1990; Green J.G. and Greenamyre J.T., 1996, Lauritzen1997). Открыватель К* каналов хромакалим предотвращает смерть нейронов в первичной культуре гиппокампа, вызванную лишением глюкозы, кислорода или высокими концентрациями глутамата (ЮОмкМ), а также подавляет позднюю фазу увеличения внутриклеточной концентрации Са2+, связанную с эксайтотоксическим действием глутамата. Предотвращает процесс апоптоза (Lauritzen I., De Weille J.R et al., 1997). Избирательное влияние ЦПГ на процесс ввода информации может быть связано со слабым тормозным влиянием на нейрональную возбудимость мембраны, обеспечивая анксиолитический эффект ЦПГ.

3. Дипептидный аналог активного участка нейротензина препятствует

развитию экспериментального паркинсоннческого синдрома у мышей

В настоящей работе предложен совершено новый подход к терапевтическому вмешательству в процесс нейродегенерации при паркинсонизме. Хорошо известно, что нейротензин - тридекапептид является эндогенным регулятором ДА-ергической синаптической передачи в мозге (Hökfelt et al. 1984; Woulfe and Beaudet 1992; Boudin et al 1996). Предполагается, что HT деполяризует и повышает возбудимость холинергических и не-холинергических MS/vDB нейронов (которые участвуют в гиппокамп-зависимой памяти и процессах обучения). Действие HT возможно постсинаптическое и опосредуется действием на НТ-1 рецепторы. Деполяризация скорее всего вследствие увеличения мембранного сопротивления и уменьшения Са2+-зависимых К* токов (Matthews R.T., 1999). Исследования последних лет показали, что HT обладает антипсихотическими свойствами, играет важную роль в нейропсихиатрических заболеваниях, таких как шизофрения и БП; а также попытки синтезировать пролинсодержащие пептидные - антипсихотики, которые превосходили бы ныне существующие, например сульперид по эффективности (Dobner P.R. et al., 2003).

Недавно в НИИ фармакологии РАМН была синтезирована группа дипептидных аналогов активного участка HT с ДА-негативными (антипсихотики) и ДА-позитивными свойствами (Гудашева Т.А., 1998). Наиболее активный из дофаминомиметиков - ТГС-79 потенцировал апоморфиновую вертикализацию, резко увеличивал двигательную активность крыс, вызываемую L-ДОФА и ослаблял галоперидоловую каталепсию (Середенин С.Б. и др., 1995). ДА-позитивные свойства ТГС-79 могли оказаться полезными при терапии паркинсонизма, симптомы которого обусловлены дефицитом ДА. Для проверки этого предположения мы использовали 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП), разрушающий ДА-ергические нейроны чёрной субстанции (Ricaurte G.F. et

al., 1985; Tipton K.F., Singer T.P., 1993), и исследовали влияние ТГС-79 на развитие МФТП-индуцированного паркинсонического синдрома у мышей.

В первой серии опытов с МФТП (30 мг/кг) сравнили изменение поведения у мышей контрольной, опытной и леченной ТГС-79 групп. Животные, получавшие только МФТП в дозе 30 мг/кг, уже через несколько дней становились чрезвычайно вялыми, малоподвижными и все погибли на 7 сутки (рис.10). Их вскрытие выявило признаки токсического поражения: увеличение и изменение цвета печени. Введение физиологического раствора контрольным мышам и комбинации МФТП (30 мг/кг) с ТГС-79 (2 мг/кг) леченной группе в течение двух недель не привело к гибели животных в этих группах (рис.Ю). Таким образом, ТГС-79 защитил мышей от гибели (Ртмф < 0,025).

Во второй серии опытов оценили влияние ТГС-79 не на выживание, а на предотвращение развития МФТП-индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома у мышей. С этой целью дозу вводимого МФТП уменьшили до 25 мг/кг и использовали более молодых 3-х месячных мышей, поскольку они более устойчивы к нейротоксину (рис.11). Спустя 7 дней после введения МФТП возникала мышечная ригидность, выраженность которой была одинакова у опытных и леченных ТГС-79 животных, а к 14 дню она возросла в этих группах, однако у леченных ТГС-79 мышей её проявление было почти в два раза меньше (Р < 0,05, рис.11 А). На 7 сутки, когда действие МФТП только начинает проявляться, показатели двигательной активности у мышей были минимальны, а различия между группой опытных и леченных ТГС-79 животных практически отсутствовали (рис. 11 Б, В и Г). К 14 дню появились бесспорные доказательства возникновения олигокинезии в группе мышей, которым вводили МФТП. Общая двигательная активность (рис.11 Б) и число стоек (ориентировочно-исследовательская активность (рис.11Г) у мышей опытной группы были достоверно ниже (Р < 0,05), а время пребывания в неподвижном состоянии достоверно выше, чем в контроле (рис. 1 IB, Р < 0,05).

TTC- 79, вводимый одновременно с МФТП, предупреждал развитие всех исследованных моторных нарушений, возникающих в результате двухнедельного введения пронейротоксина (рис.11Б). Важно подчеркнуть, что спустя неделю, когда собственный эффект МФТП ещё не проявлялся в полной мере, не заметно и влияния ТГС-79. Спустя 2 недели совместного введения МФТП и ТГС-79 соответствующие показатели моторной активности оказались выше по сравнению с таковыми у мышей опытной группы, но почти не отличались от таковых в контрольной группе. Необходимо также отметить, что вес животных опытной группы был ниже, чем у контрольных и леченных животных.

Ж О

Э ю-| 2 2 х

Э в х

в г

I

6-

- Фиэ рр

-ТГС79СМФТП -МФТП

10

12

Дни

Рис.10. Влияние ТГС-79 на выживание мышей линии C57BL/6 при хроническом введении физиол. раствора, МФТП, и МФТП в сочетании с ТГС-79. Ртмф < 0,025.

В следующей серии опытов получены непрямые доказательства нейродегенерации нигростриатных нейронов. Как известно гибель которых приводит к увеличению числа рецепторов денервированных мембран и усиленному функциональному ответу нейронов с разрушенными синаптическими входами к ДА (денервационный синдром). Мы проверили это предположение в двух опытах на СНС, выделенных из стриатума мышей после двухнедельного введения МФТП. Оказалось, что сдвиги МП СНС (выделенных из этих мышей) вызываемые добавлением ДА [10"*М], были почти в два раза больше по сравнению со сдвигами МП СНС (выделенных у контрольных мышей) (гиперчувствительность). Ответы СНС к ДА, выделенных у животных, леченных ТГС-79, не превышали таковых в контроле (данные не приводятся).

Если допустить, что ТГС-79 является общим блокатором транспорта моноаминов, то можно объяснить предварительные данные об его антидепрессантных свойствах. По-видимому, он может вмешиваться в механизм токсичности МФТП, что объясняет защиту мышей от гибели в первой серии опытов. Известно, что в мозге МФТП превращается МФГГ с помощью моноаминоксидазы Б, который блокирует захват ДА транспортером и митохондриальный комплекс 1, уменьшая образование АТФ и увеличивая продукцию свободных радикалов (Przedborski S. and Jackson-Lewis V., 1998), подавляя окисление НАДН дегидрогеназы коэнзимом Q. Это приводит к разобщению митохондриального окисления НАД^-связанных субстратов и окислительного фосфорилирования. В мозге МФГГ помимо дофаминергических разрушает также норадренергические, серотонинергические и глутаматергические нейроны, которые не имеют ДА транспортёра. Это происходит потому, что вызываемая МФГГ блокада комплекса 1 лишена клеточной специфичности и имеет место при действии токсина на митохондрии разных клеток, в том числе печени (Кучеряну В.Г., 1999).

Рис.11. Влияние ТГС-79 на симптоматику экспериментального паркинсонического синдрома: А- выраженность мышечной ригидности, Б- общая двигательная активность, В- время, в течение которого животные оставались без движения, Г- ориентировочно-исследовательская активность у мышей с хроническим введением МФТП в дозе 25 мг/кг. О, 7 и 14 на всех рисунках обозначают сутки после введения растворов: физраствора (контроль, белые столбики), МФТП (опыт, чёрные столбики) и МФТП + ТГС-79 (леченные, белые полосатые столбики). Р < 0,05 по сравнению с группой контроля; + - Р <0,05 по сравнению с опытной группой.

Нельзя исключить и лечебного, а не только нейропротективного эффекта ТГС-79, обусловленного непрямой стимуляцией функции ДА нейронов. Следует отметить, что в отличие от нейротензина, способного вызывать каталепсию, ТГС-79 не обладает каталептогенными свойствами. Напротив, введение НТ приводит к устранению нарушений поведения, обусловленных дефицитом ДА, то есть он действует как ДА-миметик.

4. Влияние пролинсодержащих соединений на Са2+ гомеостаз в нейронах

стриатума

Са2+ перегрузка - стандартный механизм повреждения нейронов при самых различных патогенных воздействиях (Вегпс^е МЛ. е1 а!., 1998). Учитывая универсальность Са2+ звена в нейродегенерации представляло интерес выяснить не связано ли нейропротективное действие пролинсодержащих соединений с вмешательством в Са2+ гомеостаз. Для изучения были выбраны ГВС-111 (ноопепт) и ТГС-79, представляющие наибольший интерес в плане клинической перспективы. В наших исследованиях внутриклеточные концентрации кальция ([Са2+],) в нейронах составили 60-100 нМ, что свидетельствует об их хорошем физиологическом состоянии и способностью поддерживать низкие концентрации Са2+. Было показано, что нейроны при суперфузии отвечают на добавление в среду КС1. Причем увеличение продолжительности К+ деполяризации приводит к возрастанию как амплитуды, так и продолжительности увеличения [Са2+],.

Для оценки вклада потенциал-управляемых Са2+ каналов в ответ на эти два воздействия был использован их блокатор - ионы Сс12+. Как это видно на рис.12 ионы Сё2+ (100 мкМ) блокировали эффект К+-деполяризации, тогда как подъём [Са2+]|, вызванный глутаматом существенно не изменялся. Это означает, что увеличение [Са2+]„ вызванное ЬС1"-деполяризацией, обусловлено входом кальция через потенциал-управляемых Са2+ каналы (№теЙ11. й а1, 2003).

Приведенные доказательства ослабления потенциал-управляемого Са2+ тока нейрональной мембраны под влиянием ГВС-111 качественно и количественно согласованы с результатами работы Е.И. Солнцевой и др. (1996), несмотря на существенные различия условий экспериментов. В наших опытах мы использовали нейроны стриатума теплокровного животного (крысы), с помощью флюоресцентной микроскопии оценивали [Са2+], при деполяризации нейронов избытком ионов К+ (а не сдвигом МП). Последнее существенно, поскольку неясно каков конечный результат увеличения входа Са2+ в результате блокады К* каналов (деполяризации) или прямого частичного блока Са2+ входа через потенциал-управляемые каналы.

[Са2+], не изменялись ни при секундном введении, ни при длительной суперфузии нейронов ГВС-111 (1мкМ) (рис.13). Однако уменьшение [Са2+^ при К+-деполяризации в присутствии ГВС-111 оказалось достоверно более низким на 33%, чем у ответов, зарегистрированных после отмывки от ГВС-111 (рис.13).

[Ca'l,

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2

среда

+Cd

It I I

KCl Глу KCI Глу

—i-*-1-■-r~

t t KCI Глу

400 800 1200 Время, сек.

1600

2000

Рис.12. Увеличение ГСа2+1„ вызванное калиевой деполяризацией (40 мМ) и глутаматом (10 мкМ). Ионы Сё2 ' избирательно подавляют вход Са2+ через потенциал-управляемые Са2+ каналы. Продолжительность действия веществ 10 секунд. 22-ти дневные нейроны (п=12).

[СаП,

F.„/F...

0,75 п

0,70

0,65

0,60

0,55

0,50

0,45

0,40

0,35

0,30

0,25

0,20

40 мМ KCI

40 мМ KCI

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Время, с о к.

Рис.13. Изменения [Са2+], при действии ГВС-111 (1мкМ) в покое и при калиевой деполяризации в 12-ти дневных нейронах (п=12). Для К+ деполяризации использовали КС1 (40 мМ) в течение 10 сек. Увеличение [Са2+], после отмывки от ГВС-111 достоверно выше, чем при его присутствии. * - Р < 0,05.

[Са*], м

ов

ffA »

FjFm го-

«ai зооо зав «во эта aooo

Цмцск

1,8 1Л-

1,4 «

И W M M 02-

JV

МФП"

500 «00 ют эооо 2bd0 зов

В>ж«|,оис

Рис.14. Увеличение [Са2+], при постоянной суперфузии МФП+ (100мкМ) на нейроны стриатума А- 13 дней в культуре (п=12), Б- 20 дней в культуре. (п=15). Воздействие глутамата (10 мкМ) в течение 10 сек.

Группы Группы

Рис. 16. Изменение [Са2+], в нейронах при действии: 1-контроль - белые столбики в полоску (п=15), 2- МФГГ (100 мкМ)- серые столбики в полоску (п=16), 3 - TTC (1 мкМ) + МФП+ (100 мкМ) - чврные столбики в полоску (n=12). А - до добавления препаратов, Б - спустя 1 час после добавления препаратов. Исходные [Са2+], в каждой группе приняты за 100%. (20-22 дней в культуре). *-р<0,05 по сравнению с контролем, +-по сравнению с МФП*.

Поскольку ЦПГ и ГВС-111 являются производными пролина нами было исследовано изменение [Са2+], при действии пролина (рисунки не приводятся). Получено, что [Са2+]; при действии пролина в низких концентрациях 1 и 10 мкМ не изменялись (п=19). Известно, что для получения фармакологических эффектов пролина используют миллимолярные концентрации. В наших опытах пролин (1мМ) вызывал резкое увеличение [Са2+], в 1,44 раза и в 2,14 раза. Известно, что при гиперпролинемии в мозге появляются локусы гиперактивности, а впоследствии и очаги некроза. Вероятно именно нейрональная гиперактивность, вызываемая пролином превращает его в амнестический фактор более мощный, чем электрошок (Островская Р.У. и др., 1985).

В нашей работе паркинсонический синдром получали в/б введением стандартного пронейротоксина МФТП, который в мозге превращается в МФГГ. Поэтому для изучения [Са2+], в нейронах был использован нейротоксин МФГТ. На рис.14 показано непрерывное увеличение [Са2+], в нейронах при суперфузии МФГТ (100 мкМ), которое спустя час было больше в несколько раз по сравнению с контролем. Эти данные согласуются с результатами других исследователей, но они измеряли только конечное увеличение [Ca2+]i после 1 часа инкубации с МФГТ* (Leist М. et al., 1998). Используя наши данные, можно проследить динамику увеличения [Са2+],. Повышение [Са2+], зависело от возраста нейронов в культуре: в 13-дневных нейронах оно происходило с большим латентным периодом и нарастало медленнее, чем в 20-ти дневных (рис.14 А, Б). Как видно на этих рисунках Са2+ перегрузка завершалась гибелью нейронов. Известно, что МФГТ вызывает гибель нейронов в первичной культуре CGN (Du Y. et al., 1997), вентральном мезенцефалоне ДА-ергических нейронов (Dodel R.C.et al., 1998), и нейрональных клеточных линиях (Choi W.S. et al., 1999; Fall C.P. and Bennett J.J., 1999; Leist M. et al., 1998).

В следующей серии опытов исследовали изменения в Са2+ гомеостазе, вызываемые при совместном действии МФГТ и ТГС-79 (рис.15). Как показано на рис.15 суперфузия ТГС-79 практически полностью предотвращала увеличение [Са2+]„ вызванное МФГТ. Предотвращение кальциевой перегрузки хорошо объясняет нейропротективное действие ТГС-79.

Способность ТГС-79 предотвращать повышение [Са2+]ь вызванного МФГТ могло быть связано с его действием на потенциал-управляемые Са2+ каналы. Блокада МФГТ клеточного дыхания вызывает деполяризацию нейрональной мембраны и таким образом ведет к активации кальциевой проводимости. В нескольких экспериментах, используя стандартный метод фиксации потенциала на целой клетке на нейронах стриатума крысы было установлено, что ТГС-79 в концентрации 1мкМ и 10 мкМ не оказывает заметного влияния на Са2+- токи через потенциал-управляемые Са2+ каналы. Следовательно, для защитного действия ТГС-79 следует искать другое объяснение.

выводы

1. Дипептидный эндогенный ноотроп ЦПГ и синтетические пептидные ноотропы (ГВС-111, ТГС-20 и ТГС-79) вызывают изменения мембранного потенциала при непосредственном действии на синаптонейросомы, выделенные из коры головного мозга крыс.

2. Действие ЦПГ на мембранный электрогенез было дозозависимым и насыщаемым. ЦПГ ослаблял мембранные эффекты ноопепта при их совместном применении в концентрации Ю-* М.

3. Обнаружены два типа ответов при воздействии ЦПГ и ГВС-111 (ноопепта) на синаптонейросомы коры головного мозга крыс и исследована их ионная зависимость. Гиперполяризация зарегистрирована преимущественно в Са2+-содержащей среде. Для возникновения деполяризационного ответа присутствие в среде ионов Са2+ необязательно.

4. Блокаторы 1С1" каналов (ионы Ва2+ и тетраэтиламмоний) подавляют как гиперполяризационные, так и деполяризационные ответы пролинсодержащих соединений, что указывает на участие К4" каналов в их генерации.

5. Ноопепт не оказывал влияния на внутриклеточную концентрацию Са2+ в нестимулированной первичной культуре нейронов стриатума. Вызванное калиевой деполяризацией усиление входа Са2+ в нейроны было в значительной степени подавлено ноопептом.

6. Хроническое введение мышам линии C57BL/6 пролинсодержащего пептида ТГС-79 - активного участка нейротензина (эндогенного регулятора ДА-ергических процессов в мозге) предупреждало гибель животных и препятствовало развитию МФТП-индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома.

7. Суперфузия первичной культуры нейронов стриатума средой, содержащей нейротоксин МФГТ (действующее начало МФТП), приводит к Са2+ перегрузке и гибели нейронов, которые устраняются в присутствиии ТГС-79.

8. Использование стандартного метода фиксации напряжения на целой клетке показывает, что нормализация Са2+ гомеостаза в присутствии ТГС-79 не связана с блокадой поступления Са2+ в нейроны из внешней среды через потенциал-управляемые Са2+ каналы.

9. Результаты проведенного исследования механизмов действия пролинсодержащих дипептидов и данных литературы позволяют предположить, что нейропротекторное действие препаратов обусловлено гиперполяризацией нейронов и нормализацией Са2+ гомеостаза, тогда как усиление когнитивных функций, вероятно, обусловлено блокадой К+ каналов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРАТЦИИ

1. Вуколова М.Н. Влияние эндогенного ноотропа цикпопролилглицина на мембранный потенциал синаптонейросом из мозга крыс. // 2-ой Российский конгресс по патофизиологии.-М., 2000.-С.15.

2. Луценко В.К., Вуколова М.Н. Влияние фрагментов нейропептидов на мембранный потенциал синаптонейросом. // 2-ой Российский конгресс по патофизиологии.-М., 2000.-С.29.

3. Vukolova M.N., Lutsenko V.K., Gudasheva Т.А. Proline-containing dipeptide nootropics modulate membrane potential of rat brain synaptoneurosomes. // Abstracts of 4th conference of the Czech Neuroscience Society with international participation. Prague, 2001.-P.39.

4. Voukolova M.N., Lutsenko V.K., Kucheryanu V.G., Gudasheva T.A., introduced by Brown D.A. Behavioral effects of prolyl-tyrosin-containing dipeptide in C57BL/6 mice following MPTP administration. // Abstracts of Joint Meeting of the Physiological Society with the Society Italiana di Fisiologia. University of Liverpool.-Liverpool, 2002.-P.22P.

5. Вуколова M.H., Кучеряну В.Г., Луценко B.K., Гудашева Т.А. Нейропротективные эффекты дипептидного аналога нейротензина // 2-й съезд Российского научного общества фармакологов.-Сборник тезисов.-Часть 2.-М., 2003.-С.109.

6. Вуколова М.Н., Луценко В.К., Гудашева Т.А. Ионная зависимость сдвигов мембранного потенциала синаптонейросом, вызываемых пролинсодержащими соединениями. // 2-й съезд Российского научного общества фармакологов.-Сборник тезисов.-Часть 2.-М., 2003.-С.110.

7. Vukolova M.N., Marsh S., Brown D.A., Lutsenko V.K, Gudasheva T.A. The influence of the neurotoxin MPP+ and dipeptide TGS-79 on the intracellular calcium levels. // 3rd Federation of European Physiological Societies Congress.-Abstract book.-Acropolis.- France.-Nice, 2003.-P.87.

8. Луценко B.K., Вуколова M.H., Гудашева T.A. Циклопролилглицин и пролинсодержащий препарат ноопепт вызывают два вида ответов мембранного потенциала синаптонейросом. // Бюл. эксперим. биол. и мед.-2003.-Т.135.-№6.-С.656-659.

9. Луценко В.К., Вуколова М.Н., Кучеряну В.Г., Гудашева Т.А. Дипептидный аналог активного участка нейротензина препятствует развитию экспериментального паркинсонического синдрома у мышей. // Бюл. эксперим. биол. и мед.-2003.-Т. 136.-№10.-С.399-402.

РЫБ Русский фонд

2006-4 17280

'* <г \ « \

W

fí'fttR 7001

Актуальность исследования.

Проблема апоптоза - программированной клеточной смерти играет важную роль не только в нейрональном развитии (Oppenheim R.W. et al., 2001), но и в различных нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона, Гентингтона и Альцгеймера (Stefanis et al., 1997). Несмотря на многочисленные исследования, молекулярные механизмы клеточной смерти требуют более глубокого изучения при этих нейрональных расстройствах.

Из наиболее часто встречающихся форм патологии мозга людей пожилого возраста является болезнь Паркинсона (БП), характеризующаяся повреждением и дегенерацией значительной части пула дофаминергических нигростриатных нейронов, приводящее к дефициту тормозного нейротрансмиттера дофамина (ДА) в стриатуме (Отеллин В.А., Арушанян Э.Б., 1989; Burns R.S. et al., 1983; Birkmayer W., Riederer P., 1983; Heikkila R.H. et al., 1984; Barbeau A., 1986, Hornykiewicz O., Kish S.J., 1986; Wooten G.F., 1987; Jellinger K.A., 1994), структуры которого регулируют моторную активность и мышечный тонус.

При болезни Паркинсона используется только заместительная терапия. Например, предшественник дофамина (ДА) Ь-3,4-дигидроксифенилаланин (L-ДОФА), потому что ДА не проникает через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Длительное применение леводопа-содержащих препаратов приводит к возникновению двигательных нарушений и тяжелых побочных эффектов (дискинезий, деменций, и др.). Недостаточность данных о нейрохимических и патофизиологических механизмах, лежащих в основе дегенерации дофаминергических нигростриатных нейронов, препятствует разработке эффективной патогенетической терапии при БП. Это делает актуальным поиск химических соединений, которые бы вмешивались в процесс нейродегенерации.

В настоящее время проблема нарушения памяти становится все более актуальной по мере старения населения планеты и роста различных форм патологии мозга, вызываемых травматическими, токсическими, лекарственными воздействиями, а так же при боли, стрессе, нарушении сна, алкоголизации и т.д. Нарушение когнитивных функций - распространенный симптом различных заболеваний нервной системы, прежде всего нейродегенеративных (болезнь Альцгеймера, Паркинсона и другие) - наиболее общая причина деменции у взрослых. Нарушения памяти имеют место у 65 % больных с ишемических повреждением мозговых структур (Островская Р.У., 1998).

Для терапии указанных заболеваний перспективно использование соединений, сочетающих свойства нейропротекторов и усилителей когнитивных функций. Соединениями с подобными свойствами являются ноотропы. К их числу относятся пирацетам, а также высокоэффективные пролинсодержащие пептиды, синтезированные Т.А. Гудашевой и сотр. (19852002) в ГУ НИИ фармакологии РАМН. Ноотропы усиливают когнитивные процессы, противодействуют амнезии, вызываемой самыми разными формами патогенных воздействий: ишемией, гипоксией, нарушением холинергической передачи, электрошоком, травмой и старением (Гудашева Т.А. и др., 1985; Воронина Т.А. и Серединин С.Б., 1998; Sarter М., 1991; Pizzi М., 1993; Gouliaev А.Н. and Senning А., 1994; Островская Р.У. и др. 1999, 2001). Пролинсодержащие пептиды подобно синтетическим ноотропам обладают нейропротективным действием (Воронина Т.А., 1998; Андреева Н.А. и др., 2000; Островская Р.У., 2002).

В физиологическом и патофизиологическом плане привлекательна гипотеза о существовании собственной ноотропной системы мозга. Эндогенными лигандами которой могли быть пролинсодержащие пептиды, а экзогенными - пирацетам и другие рацетамы. В 1996 г. Т.А. Гудашева и сотр. обнаружили в мозге - циклопролилглицин (ЦПГ), структура и фармакологический спектр действия которого оказались сходными с таковыми, как и у пирацетама. Мембранные и клеточные механизмы действия эндогенного ноотропа не были известны.

Научный интерес представляет исследование клеточных механизмов нейропротекторного и ноотропного действия пролинсодержащих эндогенных соединений и их синтетических производных, имеющих клиническую перспективу.

Цель настоящего исследования состояла в выяснении особенностей изменения мембранного потенциала синаптонейросом и ионного кальциевого гомеостаза в культуре нейронов стриатума при действии пролинсодержащих дипептидов, а также изучение нейропротекторного действия пролинсодержащего дипептида ТГС-79 на модели МФТП - индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома.

Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать влияние пролинсодержащих нейропептидов на мембранный потенциал синаптонейросом и изучить ионную основу этих эффектов.

2. На модели МФТП - индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома изучить возможное нейропротекторное действие пролил-тирозинового аналога активной последовательности нейротензина.

3. Измерить сдвиги внутриклеточных концентраций кальция - общего конечного пути гибели клеток, при действии пролинсодержащих дипептидов.

Научная новизна исследования определяется её основными результатами. Настоящее исследование является поисковым, и представленные в нём результаты оригинальны.

Впервые показано, что эндогенный ноотроп циклопролилглицин (ЦПГ), пролин, и другие исследуемые пролинсодержащие соединения (ГВС-111 (ноопепт), ТГС-20, ТГС-79) вызывают изменения мембранного потенциала синаптонейросом (СНС). ЦПГ И ГВС-111 вызывают деполяризацию и гиперполяризацию мембраны СНС. Оба ответа подавляются блокаторами калиевых каналов, обуславливая участие ионов К+ в генерации обнаруженных сдвигов мембранного потенциала СНС.

Впервые показано нейропротекторное действие пролин-содержащего дипептида ТГС-79 на модели МФТП-индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома у мышей линии C57BL/6.

Впервые показано, что нейропротекторные эффекты ГВС-111 и ТГС-79 обусловлены нормализацией кальциевого гомеостаза в нейронах стриатума. Предложен вариант метода получения первичной культуры нейронов стриатума.

Теоретическое значение. Описание электрогенных свойств некоторых пролинсодержащих дипептидов наводит на мысль о существовании эндогенной ноотропной системы. Она может быть мишенью действия коротких фрагментов регуляторных пептидов - ЦПГ, пироглутаминовой кислоты и экзогенных синтетических ноотропов. Нейропротекторные и мнестические эффекты пролинсодержащих ноотропов обусловлены модуляцией активности ионных каналов. Пролилтирозиновый дипептид соответствующей активной последовательности нейротензина может предотвращать развитие МФТП-индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома у мышей. Результаты дают основание предполагать, что пролилтирозиновый дипептид вероятно вмешивается в процесс нейродегенерации при экспериментальном паркинсоническом синдроме.

Практическое значение настоящей работы состоит в том, что в ней изучены возможные механизмы действия ГВС-111 (ноопепт) на нейроны теплокровного животного, который синтезирован в ГУ НИИ фармакологии РАМН. Недавно успешно завершилась первая и частично вторая фаза клинических испытаний ноопепта, как ноотропного препарата. Выявленные в нашей работе особенности влияния ноопепта на нейрональную мембрану СНС и взаимодействия с эндогенным пролинсодержащим ноотропом, могут оказаться полезными для дальнейшего совершенствования препарата. Обнаруженная нами способность активной последовательности нейротензина препятствовать развитию экспериментального паркинсонического синдрома может оказаться принципиально новым подходом для разработки нового подхода в терапии паркинсонизма, направленного на предотвращение гибели нейронов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Впервые исследованы клеточные механизмы дипептидного ноотропа ЦПГ. Описаны сдвиги мембранного потенциала синаптонейросом, дозовая зависимость и показано участие калиевых каналов в наблюдаемых мембранных эффектах.

2. ГВС-111 - мощный нейропротектор вызывает качественно сходное с ЦПГ изменение мембранного потенциала синаптонейросом. Нейропротекторное действие ГВС-111 может быть объяснено, как изменением мембранного потенциала синаптонейросом, так и блокадой входа кальция в нейроны стриатума через потенциал-управляемые кальциевые каналы.

3. Описаны клеточные механизмы действия пролина (амнестическое вещество и эксайтотоксин) и ТГС-20 (производное пироглутаминовой кислоты).

4. Показана способность пролинсодержащего активного участка нейротензина защищать нейроны от гибели и предотвращать развитие МФТП-индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома у мышей линии C57BL/6. Защитное действие обусловлено способностью ТГС-79 предотвращать кальциевую перегрузку. Данные с ТГС-79 являются экспериментальным обоснованием принципиально нового подхода для терапии паркинсонизма.

Апробация работы.

Основные результаты проведенных исследований были доложены на:

2-ом Российском конгрессе по патофизиологии "Экспериментальные и клинические аспекты" (Москва, 2000); 4-ой конференции Чешского нейронаучного общества с международным участием (Прага, Чехия, 2001); совместном митинге физиологического общества Великобритании с физиологическим обществом Италии, Университет Ливерпуля (Ливерпуль, Великобритания, 2002); 2-ом съезде Российского научного общества фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии" (Москва, 2003); 3-м конгрессе федерации европейских физиологических обществ (Ницца, Франция, 2003).

выводы

1. Дипептидный эндогенный ноотроп ЦПГ и синтетические пептидные ноотропы (ГВС-111, ТГС-20 и ТГС-79) вызывают изменения мембранного потенциала при непосредственном действии на синаптонейросомы, выделенные из коры головного мозга крыс.

2. Действие ЦПГ на мембранный электрогенез дозозависимо и насыщаемо. ЦПГ ослабляет мембранные эффекты ноопепта при их совместном применении в концентрации 10"6 М.

3. Обнаружены два типа ответов при воздействии ЦПГ и ГВС-111 (ноопепта) на синаптонейросомы и исследована их ионная зависимость. Гиперполяризация зарегистрирована преимущественно в Са2+-содержащей среде. Для возникновения деполяризационного ответа присутствие в среде ионов Са2+ необязательно.

2+

4. Блокаторы калиевых каналов (ионы Ва и тетраэтиламмоний) подавляют как гиперполяризационные, так и деполяризационные ответы пролинсодержащих соединений, что указывает на участие калиевых каналов в их генерации.

5. Внутриклеточная концентрация кальция в культуре нейронов стриатума не изменяется при действии ноопепта, но вызванное калиевой деполяризацией усиление входа Са2+ в нейроны значительно подавляется ноопептом.

6. Хроническое введение мышам линии C57BL/6 пролинсодержащего пептида ТГС-79 — активного участка нейротензина (эндогенного регулятора дофаминергических процессов в мозге) предупреждает гибель животных и препятствует развитию МФТП-индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома.

7. Суперфузия нейронов стриатума средой, содержащей нейротоксин МФГТ (действующее начало МФТП), приводит к кальциевой перегрузке и гибели нейронов, которые устраняются присутствием ТГС-79.

8. Методом фиксации напряжения на целой клетке показано, что нормализация кальциевого гомеостаза в присутствии ТГС-79 не связана с блокадой поступления Са2+ в нейроны из внешней среды через потенциал-управляемые кальциевые каналы.

9. Результаты проведенного исследования механизмов действия пролинсодержащих дипептидов позволяют предположить, что нейропротекторное действие препаратов обусловлено гиперполяризацией нейронов и нормализацией кальциевого гомеостаза, тогда как усиление когнитивных функций обусловлено блокадой калиевых каналов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Хочу выразить глубокую благодарность моим научным руководителям д.м.н., профессору, академику РАМН Г.Н. Крыжановскому и д.б.н. В.К. Луценко, оказавшим неоценимую помощь в ходе работе; Т.А. Гудашевой за предоставленные пролинсодержащие дипептиды; д.м.н., вед. науч. сотр. лаборатории общей патологии нервной системы НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН В.Г. Кучеряну за руководство и помощь в проведении экспериментов по экспериментальному паркинсоническому синдрому и за предоставленный прибор Hitachi-320 (Япония); д.б.н. вед. науч. сотр. лаборатории патофизиологии сердца НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН Т.А. Сазонтовой за предоставленный прибор Hitachi-557 (Япония).

Особую благодарность хочу выразить руководителю лаборатории фармакологии Университетского Колледжа Лондона (Лондон, Великобритания) профессору D.A.Brown, FRS (Laboratory Head) и всем сотрудникам этой лаборатории за помощь в проведении экспериментов на культуре нейронов стриатума, за предоставленные приборы и реактивы.

Работа выполнена при поддержке грантов Российского Фонда Фундаментальных исследований (проект № 02-04-06617), the Wellcome Trust, the FEBS Fellowship.