Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунорегуляция пролиферативного ответа и продукции иммуноглобулинов IN VITRO у больных с иммунодефицитами

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

ИННЕШКИНА Светлана Михайловна

ИММУНОРЕГУЛЯЦШ ПРОМФЕРАТИВНОГО ОТВЕТА И ПРОДУКЦИИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Ш УИТО У БОЛЬНЫХ С ИММУНОДЕФИЦИТ АШ

14. 00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории моделирования иммунологи- • ческих процессов Института иммунологии Минздрава СССР.

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор & Е Шнегин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б. Б. Першин доктор медицинских наук, профессор А. А. Ярилин

Еедущая организация - Ордена Трудового Красного Знамени Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АШ СССР

Защита диссертации состоится "...". . . . 1991 года в .. часов на заседании Специализированного Совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава СССР.

Автореферат разослан ".." . . . . 1991 года.

Ученый секретарь Специализированного. Совета, доктор биологических наук

А. В. Колобов

ЯЩ

. -.ir.íl

, .Л ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Изучение этиопатогенеза заболеваний крушением синтеза иммуноглобулинов и разработка методов им-экоррекции является актуальной задачей клинической иммуноло-ии.

Сейчас показано, что снижение содержания иммуноглобулинов ыворотке крови связано не только с уменьшением количества леток (Saiki 0. et al, 1982) или с понижением их функцио-ьной активности (De La Concha et al, 1977), но и с ушением функций Т-лимфощгсов: увеличением супрессорной ак-ности и/или снижением хелперной (Broom ЕС. et al, 1976; suya H., 1981; Siegál F.P. et al, 1978; Mayer L. et al, 4) и дисфункцией макрофагального звена (Eibl. M. M. .et al, 2; • Rozymska К.E. et al, 1989; Farrant J. et al, 1985), акже с уменьшением продукции различных цитокинов: йнтерлей-1-2 (Кондратенко И. К с соавт., 1989), Б-ростового фактора rrl R.T. and Velsdorf D. j., 1987) и т.д. и повышением сознания блокаторов: например, ингибитора интерлейкина-2 в каждом конкретном случае степень выраженности изменений и сочетания неодинаковы у разных больных с гипогаммаглобудшне-[ми, что требует тщательного исследования многих параметров [анного пациента - это необходимо для выявления звеньев пато-юза

В последнее время в иммунокоррекции и иммунотерапии широ-используются как природные, так и синтетические имыуномоду-"оры (ИЮ: гормоны тимуса, миелопептиды, интерфероны, рекомби-иный ИЛ-синтетические полипептиды - аналоги гормонов ти-:а и т. д. В том числе разрабатываются подходы их применения

при заболеваниях с различными нарушениями продукции иммуногло булинов. Но является общеизвестным, что при сходстве клинической картины и лабораторных показателей у разных пациентов од и тот же препарат может оказывает неоднозначное влияние. Поэт вопрос об обосновании назначения больному соответствующего Hf, остается актуальным в клинической иммунологии. Наиболее целее образным, вероятно, является индивидуальный подбор ИМ, основа ный на его способности оказывать in vitro тот или иной зффега лимфоидные клетки больного, что было использовано многими ав рами при назначении левамизола. Этот подход при подборе ИМ у больных с нарушениями синтеза иммуноглобулинов был впервые ис пользован Власенко р. я. (1S89). Для прогнозирования лечебногс эффекта ИМ необходимо оценить их влияние как на клеточное, i и на гуморальное звено иммунитета, в том числе на ыитоген-ин; цированую пролиферацию и синтез иммуноглобулинов in vitro npi стимуляции митогеном лаконоса. Одновременно немаловажно учил вать возможности модуляции иммунных реакций с помошыо иных ci налов in vitro для предвидения их воздействия in vivo - это свойства сыворотки пациента, поскольку во многих случаях отк: нения в ее качествах являются одним из компонентов нарушений (Waldman Т. R. et al, 1976).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явил« изучение особенностей пролиферативного ответа и продукции ш ноглобулинов in vitro и влияние на них некоторых иммуномодул; ров у больных с нарушением синтеза иммуноглобулинов.

Для достижения поставленной цели потребовалось решение i дующих эадач:

1. Изучение пролиферативного ответа лимфоцитов in vitro боль с нарушением синтеза иммуноглобулинов и возможности аллогенн клеток здоровых доноров восстанавливать пролиферативный отве

IX больных.

Определение в сыворотках больных с нарушением синтеза иммуно-)0улинов иммуносупрессорньи свойств.

Исследование влияния кратковременной инкубации с ИМ на ФГА-

¡лиферативный ответ лимфоцитов больных.

Изучение продукции иммуноглобулинов in vitro при стимуляции

■огеном лаконоса (МЛ) лимфоцитов больных.

Исследование воздействия инкубации с ИМ на индуцированную МЛ

|дукцию иммуноглобулинов in vitro.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Впервые у значительного числа ьных (как детского возраста, так и взрослых) с различными ушениями синтеза иммуноглобулинов были одновременно изучены оген-индуцированный пролиферативный ответ- и синтез иммуно-булинов in vitro при стимуляции МЛ лимфоцитов периферической ви, а также влияние на эти процессы ИМ. Показано, что преин-ация с ИМ шлют оказывать стимулирующее, ингибируищее влияние не оказывать эффекта на ФГА-пролиферативный ответ, причем ные ИМ оказывают неодинаковое влияние на клетки различных центов и выраженность воздействия тоже варьирует. Выявлено, изменение пролиферации не связано с индукцией хелперных супрессорный популяций лимфоцитов.

Впервые обнаружено, что аллогенные клетки здоровых доноров добавлении к лимфоцитам больных с нарушением синтеза иммуно-5улинов ряде случаев способны восстанавливать ФГА-пролифера-гый ответ.

Впервые показано, что сыворотка этих больных обладает раз-фазными иммуносупрессорными свойствами, причем чем грубее тления (агаммаглобулинемия у взрослых и врожденная гипогамма-¡улинемия у детей), тем более выражены эти отклонения. В ра> установлено, что наблюдается индивидуальная чувствитель-

лость к примененным ИМ у разных пациентов в тесте ироду един муноглобулинов in vitro при стимуляции лимфоцитов МЛ, приче! наиболее подвержены изменениям секреция IgM и IgG, не дате. i чительное увеличение продукции иммуноглобулинов под ьоздейс ем ИМ никогда не достигает уровня здоровых лиц.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Полученные в ра данные о влиянии миелопида, бурсактивина, тактивина и тимог на пролиферацию и синтез иммуноглобулинов in vitro лимфоцит периферической крови вносят вклад в понимание иммуиорегулят ных воздействий ИМ на клетки больных с различными нарушения продукции иммуноглобулинов. Примененные модели тестирования vitro чувствительности клеточного и гуморального иммунитете возможны для применения в клинической практике для выбора с мального лечебйого препарата, поскольку разнонаправленное« действия разных ИМ, неодинаковая степень выраженности и;ше1 ний позволяет определить не только наиболее действенный ИМ, и отклонить лечебные средства, которые способны подавлять i мунные реакции.

Выявленная разнородная иммуносупрессорная активность vitro сывороток больных позволяет объяснить нереализуемое^: гих иммунологических реакций в организме вследствие блокад ослабления определенных звеньев иммунного ответа ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Ш теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе статьи в центральной печати. Основные положения диссергаци докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых Москва (1887, 1990), на межлабор; горной конференции Ин,"ги иммунологии (1989), на Международном симпозиуме "Проблода нофармакологии" (Тбилиси, 1990) и II Международном симиоз! "Реабилитация иммунной системы" (Дагомыс, 1990).

Апробация работы проведена на секции N 3 Ученого Совета нсгитута иммунологии МЗ СССР.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа .члолена на 130 страницах машинописного текста, содержит 6 ри-унков и 19 таблиц. Список литературы включает 193 источника, з которых 40 отечественных и 153 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И }®ТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использованы дим-эциты периферической крови и сыворотка крови нескольких групп эльных с различными нарушениями синтеза иммуноглобулинов -реди них детей (возраст 2-16 лет) с диагноза},ж врожденная лпогаммаглобулинемия с дефицитом В-¡теток (ВГГ) - 17 пациен-зв, общая вариабельная гипогаммаглобулинемия (ОВГГ) - 11 патентов, агаммаглобулинемия с гипер-IgM - 7 пациентов, а так? взрослых больных (возраст 18-55 лет): 10 человек, страдающих 'аммаглобулинемией, и 8 человек, страдающих гипогаммаглобулине-1ей. Контрольную группу составили 40 здоровых доноров.

Для получения мононуклеаров периферической крови использо-1ЛИ центрифугирование в одноступенчатом градиенте "Ficoll-sque" ("Flow") по методу Bouym(1968).

Изучение влияния ИМ на пролиферативный ответ лимфоцитов.

Лимфоциты в концентрации 1 млн. /мл подвергали обработке йными дозами Ш миелопида, тактивина или тимогена в концент-щии 0,03 мкг/мл; 0,3 мкг/мл или 3 мкг/мл в течение 1 ч при '"С. Контрольные образцы обработке не подвергали. Далее клет-[ отмывали от Ж

5*

Культивирование лимфоцитов (1,3x10 /лунку) проводили в |углодонных 96-луночных планшетах "Nunclon" в среде RPMI-1640

-у

с добавлением 2 мМ Ь-глутамина, 10 М 2-меркаптозтанола, 50 мкг/мл гентамицина, 10 мМ НЕРЕЗ, 10% эмбриональной телячьей сыворотки - в полной ростовой среде (ПРО). В контрольные лунки добавляли ПРО до конечного объема 200 мкл, в опытные - ФГА (итоговая концентрация составляла 6 мкг/мл). Также определяли пролиферативную активность клеток на стимуляцию МЛ (4 мкг/мл).

Исследование влияния сывороток на ФГА-пролиферацию лимфоцитов. Сыворотки исследуемых лиц предварительно инактивировали 45 мин. при 56°с. сыеоротки добавляли в ФГА-стимулированную культуру лимфоцитов в концентрации 25Х и 57. от конечного объем; содержимого лунки. Применялось четыре различных системы тестир< вания: 1) изучение влияние сыворотки больных на собственные клетки (аутологичная система); 2) изучение влияния сыворотки больных на клетки здоровых доноров (аллогенная система); 3) из; чение влияния сыворотки здоровых доноров на собственные клетки (аутол. система) - контроль; 4) изучение влияния сыворотки на клетки других здоровых доноров (аллоген. система) - контроль-.

Оценка влияния аллогенных клеток на пролиферативную актив ность лимфоцитов. Аллогенные клетки (лимфоциты здоровых доноре в конц. 2 млн./мл облучали дозой 2000 Рад на установке "Стебел (источник излучения - ,л7Сз). В кругло донные 96-луночные плани ты к 100 мкл суспензии клеток исследуемого (конц. 1 млн./.мл) ^ бавляли 50 мкл суспензии облученных клеток и раствор ФГА (ито] вая концентрация 6 мкг/мл) или 50 мкл ПРО (соответственно опьг контроль'"

Исследование механизма действия ИМ (проводили в том слу чае, если ИМ оказывали выраженный (>50%) стимулирующий или икгиоирующий эффект на пролиферативный ответ лимфоцитов больного). Лимфоциты в конц. 1 млн./мл инкубировали 1 ч при 37°С с ИМ в конц. 3 мкг/мл. После этого клетки отмывали от №

с

Элучали в установке "Стебель" в дозе 2000 Рад и добавляли к аналогичным лимфоцитам, стимулированным ФГА (опыт). В контроле к утологичным лимфоцитам добавляли облученные клетки, не подверг-иеся преинкубации с

Оценка реакции бласттрансформации. Клетки культивировали 2 ч яри 37° С с 5% СОд в COt-инкубаторе. Пролиферативную актив-эсть оценивали по включению 5Н-тимидина. Индекс стимуляции иределяли по формуле: ИС=(имп./мин. с митогеном): (имп./мин гз митогена).

Определение продукции иммуноглобулинов и влияние на нее ИМ 10-суточных культурах лимфоцитов in vitro проводили с по-эщью твердофазного неконкурентного двухцентрового икмунофер-энтного анализа (Waldman Т.Д. et al, 1978)."

Изучение блокирующих свойств сыворотки в реакции ингибиции -розеткообразования проводили после предварительной обработки имфоцитов здорового донора сывороткой исследуемого лица в течепе 1 ч при 37еС и последующей отмывки от сыворотки. Далее роак-лю ставили по методу Elliott В. А. (1979).

Определение ингибитора 111-2 в сыворотке крови проводили с эмощыо ИЛ-2-зависимой линии CTLL-2 по методу P. Emery et al 1988).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводил с помощью критерия Стъюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пролиферативная активность лимфоцитов периферической зови у больных с различными нарушениями синтеза иммуноглобу-шов.

Пролиферативный ответ на ФГА и ИТ (тестирование проводить с использованием минимальных оптпм ллыилх доз данных уда-

- 10 -

тогенов) лимфоцитов здоровых доноров составлял 63,0±7,0 и 1б,9±3,4 соответственно. У больных пролиферативная активность клеток была понижена по сравнению с показателями здоровых ли наиболее резкое снижение ИО при стимуляции митогенами наблюда лось у детей, страдающих ОВГГ и агаммаглобулинемией с 1еМ, и у взрослых пациентов с агаммаглобулинемией (Рис.1). Степень нарушения пролиферативной активности была различна у разных пациентов: суммируя, у 47Х больных ИТ, 64% - ОВГГ, 86Х - ага маглобулинемией с 1еМ, 50% - агаммаглобулинемией и 50Х - гипо гаммаглобулинемией среди обследованных лиц пролиферация не до тигала нормы на использованную дозу ФГА. Однако среди всех групп больных встречались отдельные лица с очень высокими ИС Обычно у больных со слабой пролиферацией клеток на ФГА одновр менно снижен Иб на Ш1, но у некоторых пациентов с показателям бласттрансформации на ФГА в пределах нормы ответ клеток на Ш понижен.

• Пролиферативный ответ на ыитогены содержит интегральную формацию о состоянии лимфоцитов. Регистрация результатов стим ляции ФГА и МЛ лимфоцитов'через 72 ч после начала культивиров ния показывает состояние Т-клеточного звена иммунитета Поско ку пролиферация стимулированных антигеном Т-клеток является н обходимой для реализации всех функций Т-лимфоцитов, выявленна низкая пролиферативная активность при поликлональной стимуляц у ряда больных отражает нарушение потенциальных функциональны возможностей и взаимодействий Т-клеток данных пациентов.

2. Влияние аллогенных клеток на бласттрансформацию лимфо ■гов здоровых доноров и больных.

Пролиферативный ответ ФГА-стимулированных лимфоцитов здо вых доноров при добавлении аллогенных клеток, облученных при 2000 Рад, составил 78,2±6,5Х от пролиферативного ответа ФГА-с

к

аудированных лимфоцитов здоровых доноров без добавления аллоги кых клеток, т. е. облученные аллогенные клетки несколько подавляли пролиферативный ответ дамфсщиов :ia ФГА. При добавлении к лкуфоцитам донора облученных аллогеяных клеток ИС, как правило, составлял 2,3¿0,5,т. е. без ммтогена аллогенные клетки сколь-либо заметно не стимулируют пролиферацию клетох донора в трехсуточной культуре).

При. рассмотрении результатов у больных выявилось, что почти у 50% лиц в каждой группе диагнозов облученные аллогенные слетки здоровых доноров существенно повысили ФГА-индуцированный тролиферативный ответ. - У большинства из таких лиц наблюдались ¡ниженные или субнормальные ИС. В наибольшей степени увеличивать пролиферативная активность клеток у пациентов с очень низ-сими ИС. У 2/3 больных, у которых аллогенные клетки в значитель-[ой степени восстанавливали-пролиферативный ответ лимфоцитов на >ГА, было выявлено выраженное повышение содержание CDS+-клеток i инвертированный иммунорегуляторный индекс. Видимо, примененное оздействие увеличивало "хеллерный" потенциал клеточной культуры ольного за счет продуцируемых аллогекньтми клетками различных дтокинов. В этих случаях добавленные аллогенные клетки восста-авливали количественный дисбаланс иммунорегуляторных клеток, других же больных при нормальном содержании CD4+- и CD8+-леток, возможно, добавленные аллогенные лимфоциты изменяли ункциональный дисбаланс в клеточной культуре, что подтверждает ведения о том, что-у больных с нарушениями синтеза иимуноглобу-инов может быть повышенная супрессорная и/или сниженная хелпер-ая активности и при нормальном субпопуляционном составе т-лим-эцитов.

3. 'Изучение иммуносупрессорных свойств сывороток больных, ¿воротка здоровых доноров, добавленная е лунки в оОъеме 5Х или

100 80 60 40

20

0

1 2

пролиферация на ФГА

Рис. 1 Сравнительная характеристика уровней пролиферативной активности на ФГА и МЛ у больных. По оси абсцисс - диагнозы: 1 -ВГГ, 2 - ОВГГ, 3 • агаммаглобулиномия с (дети); 4 - агам-маглобулинемия, 5 - гипогаммаглобулинемия (взрослые). По оси ординат - пролиферативная активность (X): за 1002 принят уровен пролиферативной активности лимфоцитов здоровых лиц.

пролиферация на МЛ

Б%, ингибировала бласттрансформацию, вызванную ФГА, как в аути-огичной (в среднем на 19% и 54% соответственно), так и в алло-енной (в среднем на 28% и 60%) системах тестирования. У ольных подавление пролиферации клеток аутологичной сывороткой

Табл. 1 ВЛИЯНИЕ СЫВОРОТКИ НА ФГА-ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЛИМФОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ С ИММУНОДЕФИЦИТ АМИ.

аутологичная система ! аллогенная система

Диагноз

25% сыв-ки ! 57. сыв-ки I 25% сыв-ки ! 5% сыв-ки

;ети: ВГГ 14,9±2,5***

ОВГГ 37,б±9,3 гаммаглобу-

ин. с 16,2±3,7* Взрослые: 1гаммагло-

¡улин. 25,3±б,1* шогамма-

•лобул. 42,81:10.5

53,11:9,9* 45, 3±9,1 94,4±11,0

76,7±13,4 ■ 30,2±9,2 62,4±17,6

50,4±11,7* не опр. не опр.

55,9±11,0* 50,9±16,0 85,01:16,2

91,6115,8 50,2±10,3 81,0±13,4

Шоровые

Шоры 4б,4±5.5 81,41:5,6 39,1*5,7 71,6±5,6

к - Р<0,05; *** - Р<0.001

3 Табл. 1 данные представлены г, <1 от исходной '1Т'Л-пролиферации.

било выражено в большей степени: значительное снижение пролифе-ративного ответа лимфоцитов, достоверно отличающееся от контрольной группы, было установлено, у больных детей с ВГГ и агаммаглобулинемией с 1дМ, а также у взрослых с агаммаглобулинемией (именно у пациентов с этими диагнозами наблюдалось резкое пони-нижение содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови). Более того, среди этих групп встречались пациенты, у которых установлена ингибиция пролиферзтивной активности клеток 52 объемом аутологичной сьшоротки в 3 и более раза (подобных лиц среди здоровых доноров не было совсем).

В аллогенной системе тестирования сыворотки больных в меньшей степени проявляли кнгибирующие свойства на клетки здоровых доноров: ни для одного из рассмотренных диагнозов эти данные достоверно не отличались от контрольной группы доноров (Табл. 1), Но сыворотки отдельных пациентов (не более 1-2 в каждой группе) ингибировали пролиферацию клеток донора в 3 и более раза.

В вышеперечисленных экспериментах использовались сыворотки, прогретые при 56* С 45 мик, то есть у них были инактивированы ря; термолабильных субстанций. Так как ингкбитор ИЛ-2 является термолабильным (Пег-зсГтап .1.0. е1 а1. 1989), то способность сывороток больных оказывать ингибирующий эффект на ФГА-пролиферацию, по всей видимости, не связана с этим фактором. Тем не менее мы считали целесообразным проверить сыворотки больных с нарушением синтеза иммуноглобулинов, большинство из которых обладали наиболее выро-" иным супрессорным эффектом на ФГА-пролиферативный ответ, на активность в них ингибитора ИЛ-2. Наиболее высокое содержание ингибитора ИЛ-2 било показано у детей, страдающих агаммаглобулинемией с 1еМ, у взрослых больных агаммаглобулинемией и в отдельных случаях у пациентов с ВГГ.

Блокируюшдя активность, выявляемая в тесте ингибиции Е-ро-

зеткообразования, была обнаружена у 3 взрослых больных с гипо-гаммаглобулинемией, а также у детей: 1 больного БГГ и 1 с агаммаглобулинемией с 1дМ. В то л© время у 3 больных (2-х с ВГГ и 1-го с агаммаглобулинемией) сыворотка стимулировала Е-розетко-збразование (у этих же больных - высокий уровень пролиферации з реакции бласттрансформации при стимуляции ФГА).

Следует отметить, что попытка провести корреляцию между различными ингибиторными активностями сыворотки одного и того ш Сольного (т.е. степень подавления ФГА-бласттрансформации ! аутологичной и аллогенной системах, уровень ингибитора ИЛ-2 I блокирующая активность в тесте Е-розеткообразования), а также удержанием С04+- и СБ8+-клеток не привела к обнаружению какой-тбо закономерности. Ни у одного из пациентов не было выявлено |ДНовремеиио все три "блокирующих фактора", но у некоторых имеюсь сразу два из исследованных параметров сывороточной супрес-ии.

4. Влияние ИМ на бласттрансформацию лимфоцитов здоровых оноров и больных. На первом этапе работы была поставлена зада-а выбрать дозу ИМ, дающую максимальные и стабильные изменения ролиферативного ответа лимфоцитов. Для этого были использованы ри концентрации ИМ; 0,03 мкг/мл; 0,3 мкг/мл и 3 мкг/мл. Было становлено, что доза 0,03 мкг/мл практически не оказывает вли-ния на ФГА-пролиферацию лимфоцитов больных, при сравнении же реинкубации препаратов с клетками в дозах 0,3 мкг/мл и 3 мкг/мл ыло выявлено, что доза 3 мкг/мл оказывает более выраженный со-аправленный эффект в сравнении с дозой 0,3 мкг/мл или не ока-ывает достоверно отличного влияния, вследствие чего в дальней-;й работе использовалась доза 3 мкг/мл.

Предварительная обработка ИМ в большинстве случаев не ока-^вала влияния на пролифератлвкую активность клеток здоровых до-

норов.

При исследовании эффекта ИМ на пгсглферативньй ответ лимфоцитов больных установлено, -по он:;; могут усиливать, подавлять или не изменять проли:;эр£г;.ю клеток. Различные препараты оказывали неодинаковое действие ьа клетк.:-; одного и того же пациента: практически кадсый Зольной лмел свой профиль ответа на Ш (Отдельные примерь; лргзедег:^ в Табл. 2). Для оценки полученных результатов Еыхэле;:.:! 3 зарианта пролиферативного ответа клеток на •

ФГА после пгод^грителы-юй обработки клеток ИМ по сравнению с пролифератив:-::-:.: о^гэ^о;.: на ФГА клеток, необработанных Ж- уси-

ление (>:

г:о:;;с:эние (<50%), без изменений (в пределах

50-150%) (?абл. Е).

Таблица 2

ВЛИЯНИЕ ПР^&ЗГВАЦИИ С ЮМУ HOMO ДУ ЛЯГ ОРАМИ НА ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ОТВЕТ ЛИ&С^й'ОЗ БОЛЬНЫХ С НАРУШЕНИЕМ СИНТЕЗА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

ИС % от ИС на ФГА после преин-

Диагноз на кубации со следующими ИМ CD3 CD4 CDS ФГА --------------------------- .

миелопид тактивин тимоген

1. ВГГ 7,5 265,3 115,3 112,0 86 29 53

2. ОВГГ 10,5 98,1 130,5 . 53,4 85 45 19

3. Агаммаглоб. 13,3 96,2 1 30,8 31,6 ' 68 17, 58

4. Гипогамма-

глоб. 2,4 255,3 178,7 144,7 69 24 40

Наиболее стабильным стимулирующим эффектом на пролифератип-нии отпет лимфоцитов больных оказывал миелопид: при всех•наруак

ниях синтеза иммуноглобулинов как у детей, так и у взрослых, процент таких пациентов колебался от 20 до 35%.

Таблица 3.

влияние им на пролиферативный ответ лимооцитов здоровых доноров и больных

Грани- % от обследованных лиц с диагнозом

цы из- ----------------------------------------------

ИМ менений Агаммагло- Агамма- Гипогам

пролиф. ВГГ ОВГГ булинемия глобу- маглобу ответа с 1дМ линемия линемия

мле- >150?. 35.3% 30% 28, 5% 20% 25% 4,4%

ло 50- 64,7% 70% 01 г-5 70% 75% 91,2%

пид 150%

<50% 0% 0% 0% 10% 0% 4,4 %

гак- >150% 5,9% 20% 28.5% 30% 25% 8,8%

ги- 50- 94,1% 80% 71,52. 70% 75/~ 86,8%

вин 150%

'50% 0% 0% 0% 0% 0% 4,4%

ги- >150% 41,2% 30% 14.2% 10% • 12,5% 4,4%

мо- 50- 52,9% 50% 85,8% 80% 75%. 91.2%

ген 150%

-.50% 5,9% 20% 0% 10% 12,5% 4,4%

- Здоро-

вые

- доноры -

- 18 -

Как правило, стимулирующий эффект всех ИМ наблюдался у больных с низким пролиферативным ответом (ИС<15).' При ИС>15 им-муномодуляторы миелопид и тактивин эффекта на пролиферативный ответ не оказывали. Тимоген обладал способностью оказывать инп бирующий эффект, причем этот эффект не был связан с уровнем прс лиферагивиого ответа

Для выяснения механизма действия ИМ на пролиферацию был применен метод индукции субпопуляций иммунорегуляторных клеток. В этой серии экспериментов использовались лимфоциты 5 больных, на пролиферативный ответ которых ИМ оказывали значимое влияние. Добавление в соотношении 1:1 к культуре лимфоцитов аутологичныз клеток, обработанных по описанной схеме иммуномодулятором и затем облученных в дозе 2000 Рад, не изменяло пролиферации этих лимфоцитов, стимулированных ФГА. Это дает основание предположить, что измеле'ние пролиферативной активности на ФГА после обработки ИМ не было связано с активацией хелперных или супрессор ных клеток в тех случаях, когда предварительная обработка лимфоцитов ИМ давала соответственно выраженный стимулирующий или ингибиторный эффект. Вероятно, механизм данного зф^ккта связан с непосредственным изменением метаболизма клеток, в частности, с изменением уровня внутриклеточных циклических нуклеотидов.

5. Продукция иммуноглобулинов in vitro в культурах лимфоцитов у здоровых доноров и больных. Результаты экспериментов показали, что у больных выявлено резко выраженное снижение 'синтеза всех классов иммуноглобулинов в культуре лимфоцитов in vitro по сравнению со здоровыми донорами. У взрослых больных с агаммагло-булинемией уровень IgA, IgG и IgM в нестимулированный культурах составил <10, <25, <25 нг/мл, тогда как у доноров - 1034,01 ±218,4 нг/мл, 1566,3*498,8 нг/мл, 806,9*207,5 нг/мл соответственно. Стимуляция МЛ вызывала у доноров статистически значимое

возрастание продукции всех классов иммуноглобулинов (Табл.4). У вз^слых больных с агаммаглобулинеиией синтез и практически не менялся. Синтез 1дМ у 4-х больных этой группы возрастал в 2-16 раз, но продолжал оставаться значительно ниже, чем у доноров.

Сходные результаты'былм получены при изучении синтеза иммуноглобулинов у детей с различными нарушениями продукции иммуно-

Таблица 4

ПРОДУКЦИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ 1И У1ГЮ КУЛЬТУРАМИ ЛШГОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И ВОЛЬНЫХ (НГ/МЛ).

Патология ГеМ ¡йв 1гА

спонт. Ш1 спонт. МЛ спонт. МЛ

Дети: ВГГ 6,8±3,2 7,31:3,0 90,2*47,5 106,1±46,2 6,4±3,1 10,1±5,8

ОВГГ 14,0±7,9 15,61:6,6 36,01:9,7 53,4*19,8 5,'8±2,8 6,8±3,4

агамма- 220,7* 519,3± 73,3*25,6 76,3*19,8 21,3±7,б 18,8*6,9

глоб.с ,1еМ ±45,9 ±188,6

Взрослые: агамда-

ГЛО'). 10,8*2,3 67,6423,4 13,71:7,3 19,0*8,5 3,6±1,8 6,б±4,7

До- 806,9± 2828,9± 1566,3± 3838,5* 1034,01 4521,5* норы ¿207,5 1:500,2*** *498,3 ¿1049,2*** ±218,4 ±1182,9**

*** - Р< 000,1; ** - Р<00,

глобулинов: низкий уровень синтеза Ig в несткмулированных культурах и полное или почти полное отсутствие его стимуляции при воздействии МЛ. Данные по взрослым больным гипогаммаглобулине-мией разнородны: степень нарушений секреции Ig in vit.ro и возможность стимуляции МЛ очень варьирует у разных пациентов.

6. Влияние ИМ на продукцию иммуноглобулинов in vitro в культурах лимфоцитов здоровых доноров и больных, стимулированных

МЛ. У здоровых доноров ИМ могли повышать, понижать или не влиять на продукцию иммуноглобулинов (за изменение продукции иммуноглобулинов принято повышение или понижение содержания иммуноглобулинов в 2 или более раза). У одного и того же донора различные препараты влияли по-разному, причем один и тот же ИМ мог оказывать неодинаковое воздействие на синтез разных классов иммуноглобулинов: чаще всего изменялся синтез IgG, р§же всего - IgM. Наиболее "активными" были препараты Оурсактивин и тактивин, добавленные в начале культивирования. Реже воздействие оказывал миелопид. Стимулировали продукцию иммуноглобулинов in vitro чаще бурсактивин и миелопид, добавленный на 7ой день культивирования; ипгибиция же с большей частотой встречалась у тактивина и миелопида, добавленных в начале культивирования. Следует отметить, что часть культур клеток, подвергавшаяся изменению синтеза иммуноглобулиноз, составляла почти половину обследованных доноров.

Влияние ИМ на продукцию иммуноглобулинов in vitro в культурах лимфоцитов было изучено у 3 взрослых больных агаммаглобу-линемией, а также детей: 3 больных ЕГГ, 2 больных ОВГГ и 6 человек, страдающих агаммаглобулинемией с IgM (Отдельные примеры приведены в Табл. 5). В большинстве случаев клетки больных оказались ареактивны к воздействию ИМ. У 5 больных миелопид или бурсактивин оказывали стимулирующее действие на синтез одного

из классов; или IgG, или IgM. Значительное увеличение продукции иммуноглобулинов было лишь у одного взрослого больного агаммаглобулинемией - уровень IfrM поднялся с 8 нг/мл до 100 нг/мл под влиянием миелопида, добавленного в о"день, и у одного ребенка с диагнозом агаммаглобулинемия с IgM - содержание IgG поднялось с 50 нг/мл до 300 нг/мл (тоже под воздействием миелопида). Во всех

Таблица 5

ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ НА ПРОДУКЦИЮ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ IN VITRO В СТИМУЛИРОВАНИЙ МИТОГЕНОМ ЛАКОНОСА КУЛЬТУРАХ ЛИМФОЦИТОВ БОЛЬНЫХ.

Спонтан- Индуцй- Влияние на индуцированную МЛ Класс ная про- рованная продукцию

Диагноз дукция МЛ про- ---------------------------------

¡К 1е, дукция такти- миелопи- миелопи- бурсак-нг/мл вина да, доб. да, доб. тивина

нг/мл в 0° день на 7""день

Агамма- IgA 10 25 20 28 60 не опр.

глобу- IgG 25 35 25 40 56 60

линем. IgM 10 35 1 15 12 15 15

Агамма- IgA 8 8 10 12 13

глоб. с IgG 30 30 36 40 30

IgM -IgM 125 140 145 130 200

IgA 15 15 30 30 15 30

ЕГГ IgG 500 500 125 2000 2000 2000 IgM 20 20 20 25 25 25

случаях повышение содержания иммуноглобулинов не достигаю вели чин, свойственных здоровым лицам. Ингибирующие свойетга И!>! тас-гивина проявились на культуре« меток 2 больных, миелопида - то же у 2 пациентов и бурсактивина - у одного. Ранее Влб.с"ьл; Р. Я. (1990 г.) было показано, что тактивин и миелопид способны усили вать продукция иммуноглобулинов в культуре мононуклеаров больны с вторичными иммунодефицитами, и данный тест был применен для выбора оптимального курса лечения. Вероятно, применение тестирования in vitro чувствительности к ИМ полезно для индивидуального подбора лечения и для больных с нарушениями синтеза иммуноглобулинов. Исследования в этом направлении представляют большую значимость для клинической иммунологии.

ВЫВОДЫ.

1. У больных с нарушением синтеза иммуноглобулинов установлена значительная вариабельность пролиферативного отвеха лимфоцитов при стимуляции фитогемагглютинином (ФГА) и митогеном ла-коноса (МЛ). У части больных (более выражены эти отклонения у пациентов детского возраста) наб.яюдается снижение митоген-индуцированной пролиферации, чащз на М

2. Аллогенные клетки здоровых доноров, облученные 2000 Рад, при добавлении к лимфоцитам больных с нарушением синтеза иммуноглобулинов в 50% случаев способны восстанавливать митоген-инду-цированный пролиферативный ответ лимфоцитов больных, причем чаще у пациентов со сниженным пролиферативным ответом.

3. Сыворотки больных с различными нарушениями синтеза иммуноглобулинов обладают способностью ингибировать пролиферативный ответ аутологичных и аллогенных лимфоцитов на ФГА и интерлей-кин-2 зависимую пролиферацию клеток линии CTLL-2, причем чем

грубее нарушения продукции иммуноглобулинов (агаммаглобулинемия у взрослых и врожденная гипогаммаглобулинемия с дефицитом В-клеток у детей), тем более выражены эти отклонения.

4. Кратковременная инкубация (1 час) лимфоцитов больных с нарушением синтеза иммуноглобулинов с иммуномодуляторами (мие-лопидом, тактивияом или тимогеном) у части больных вызывает изменение митоген- индуцированной пролиферации клеток. Чаще эффект иммуномодуляторов является стимулирующим: иммуномодуляторы воздействуют на пролиферативную активность лимфоцитов больных с низким индексом стимуляции.

5. Спонтанная продукция иммуноглобулинов in vitro культурами лимфоцитов больных с нарушением синтеза иммуноглобулинов резко снижена по сравнению с продукцией культурами лимфоцитов здоровых доноров. Стимуляция МЛ практически не изменяет синтеза IgG и IffА, но несколько повышает синтез IgM.

6. Иммуномодуляторы (миелопид, тактивин, бурсактивин) влияют на проду;сдию иммуноглобулинов in vitro культурами лимфоцитов почти 50% здоровых доноров:' наибольшую чувствительность культуры клеток проявляют к бурсактивину.

?. Иммуномодуляторы изменяют продукцию иммуноглобулинов in vitro куль-г, |>лми лимфоцитов 42,9% больных с нарушением синтеза иммуноглобу ли нов: во всех случаях повышения продукции' иммуноглобулинов н>: д*-.читает величин, свойственных здоровым донорам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Инжеваткина С. М., Щульженко А.Е. Влияние иммуномодуля-торов на пролиферативный ответ лимфоцитов у больных с агамма-глобулинемиями и гипогаммаглобулинемиями. - Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и пато-

- 24 -

логических состояниях. Челябинск, 1990,.с. 184.

2. Инжеваткина С. М., Щульженка А. Е. Влияние иммун- v- ;уля-торов на пролиферативный ответ in vitro лимфоцитов периф , :"^-ской крови взрослых больных агаммаглобулинемиями и гипогаммагло-булинемиями. - Иммунология, 1990, N5, с. 58-59.

3. Пинегин ЕВ., Инжеваткина С. М. , Борисова А. М., 1!сл л'нко А. Е. , Алкеева А. Б. Разработка подходов к оценке эффекта иммуно-дуляторов при иммунологической недостаточности взрослых. Реабилитация иммунной системы. Цхалтубо, 1990, с. 16.

4. Пинегин Б. В., Инжеваткина С. 11 , Борисова А. М., Щульлжко А. Е. , Алкеева А.Б. Оценка эффективности лечебного действия естественных и синтетических иммуномодудяторов in vitro. - Имууно-модуляторы природного происхождения. Владивосток, 1990, с. г-; ■ 69.

5. Пинегин Б. Е , Инжеваткина С. It-, Кулаков A.R, Чини;,сов А. Д. Продукция иммуноглобулинов in vitro лимфоцитами ппрмИ.ппе-ской крови и влияние на нее иммуномодудяторов у больны? нарушениями антителообразования.- Иммунология, 1991, Nf , с.^ О-53,

6. Инжеваткина С. М., Еремина О. Ф., Свирщевская Б. В. ,

усов А. Д. Изучение иммуносупрессоряых свойств сывороток ■ .л,них с различными нарушениями антителоародукции. - Иммунологии, 1991, U , с. 55-5$.

7. Pinegin В. V. , Inzevatkina S. М., Borisova A. to. . t. \,va А. В., Schulzenko А. Е. Reseach of influence of immunomod ilators on production of immunoglobulins and proliferative je;;;nr3t. of lymphocytes in vitro. - Problems of Immunopharmacology. Tbilisi, 1990, p. 47.

участок множительной техники вонц амн ссср__

подп.. к печати ПЛ. 3i- заказ SI тираж /00 экз