Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические аспекты чувствительности и резистентности к генерализованной стафилококковой инфекции (Экспериментальное исследование)

РГб ол

На правах рукописи

АВЕРБАХ Михаил Михайлович

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ГЕНЕРАЛИЗОВАННОЙ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

(Экспериментальное исследование) 14.00.36— аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова Академии медицинских наук РФ и Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Академии медицинских наук РФ.

Научные консультанты: доктор биологических наук А. С. Апт, доктор медицинских наук В. Ф. Салов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Л. И. Краснопрошина доктор биологических наук, профессор Б. В. Втюрин доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН А. Н. Чередеев

Ведущая организация — Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи

Защита состоится « » 199 г. в часов

на заседании специализированного совета Д 001.3801 при Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова Академии медицинских наук РФ по адресу: 103064, Москва, пер. Мечникова, д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова Академии медицинских наук РФ.

Автореферат разослан « » 1995 г.

Ученый секретарь

специализированного ученого совета кандидат медицинских наук

Н. Г. Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Заболевания стафилококковой природы широко распространены среди населения и патогенный стафилококк является причиной возникновения разнообразных нагноителъных процессов, носящих в большинстве случаев местный, очаговый характер. Вместе с тем, частота развития генерачизованных процессов с возникновением бактериемии и гнойных метастазов во внутренних органах также достаточно велика н составляет 21-32% (Кузин М.И. и со-авт. 1979; Агатов А.К., Зуева В.Ф., 1983; Holms S., 1932; Yerhoef J., Freez A.,1983).

Развитие и характер течения очаговых и генерализованных форм стафилококковой инфекции тесным образом связаны с состоянием иммунной системы вообще и специфического протквостафилококкового иммунитета в частности.Так, у постоянных носителей стафилококка отмечен слабый иммунный ответ на ряд микробных антигенов ( стафилококковый альфа-токсин, гиалуронидаза, столбнячный анатоксин и др.) по сравнению с неносителями. В крови постоянных носителей снижено содержание иммуноглобулинов M.G.A, а в секретах - содержание секреторного IgA. Последнее имеет решающее значение для колонизации стафилококком слизистых верхних дыхательных путей и кишечника (Бухарин 0.В.,1994; Усвяцов и соавт.,1994).

При обширных нагноителъных процессах стафилококковой этиологии выявлено снижение уровня различных субпопуляций лимфоцитов, часто сочетающееся с падением титра комплемента или нарушением антибактериальной активности фагоцитов (Белоцкий С.М. и соавт., 1987,1988).

Роль при этом генетических факторов организма хозяина в восприимчивости к инфекции изучена недостаточно. В небольшом числе работ сделаны попытки найти ассоциации между частотой стафилококковой инфекции и аллелями главного комплекса гистосовместимости человека. Так, 0.Kinsman et al.(1S83) установили, что носители стафилококка часто имеют повышенную частоту антигенов HLA-DR3 и HLA-DR5. Х.К.Султанов (1984), обследовав 250 детей больных пневмониями стафилококковой и нестафилококковой этиологии, показали, что при комбинации антигенов гистосовместимости HLA-B17 и HLA-B21 имеет место резкое уменьшение содержания Т и В клеток, уровня IgM и igG

- ° -л.

и крайне тяжелое течение стафилококковой пневмонии с летальностью в 40,7% случаев. У больных с HLA-B15 стафилококковая пневмония течет доброкачественно.

Среди огромного количества экспериментальных работ, в которых изучалась специфическая и неспецифическая резистентность к стафилококковой инфекции, доля иммуногенетических исследований крайне мала. И.Б.Семенова и А.К. Акатов (1990), резюмируя исследования по протективной активности стафилококкового анатоксина, указывают, что мыши линии C57BL/6 являются наиболее слабым продуцентом антител по сравнению с пятью другими линиями ».алией и для достижения протективного эффекта требуется их многократная иммунизация этим препаратом. T.Bremell et al.(1991), моделируя стафилококковый артрит и остеомиелит, отметили, что мыши Swiss являются наиболее пригодными для этих исследований. Изучая связь антигенов гистосовместимости класса I и II мышей с'иммунным ответом на энтеротоксин В, J.Callahan et al.(1990) и P. Marrack et al.(1990) показали, что мыши BIO.BR дают более высокий Т-клеточ-ный ответ, чем B10.A(4R), что, вероятно, связано с более эффективной презентацией знтеротоксина продуктом аллеля I-Ek по сравнению с I-Ak. Однако эти данные носят достаточно отрывочный характер и лишь в редких случаях связывают регуляцию иммунного ответа с развившимся патологическим процессом.

Роль различных медиаторов иммунитета при стафилококковых заболеваниях практически не изучена. Имеются отдельные исследования, изучающие продукцию ингерлейкинов, интерферона и фактора некроза опухоли в ответ на стимуляцию макрофагов и лимфоцитов мышей очищенными энтеротоксинами золотистого стафилокока (Addelno'ir A. .Tarkovski А'. ,1993; Litton M.J. et al.,1994), что опять-таки не вполне адектватно моделирует собственно инфекционный процесс.

Вместе с тем, в литературе отсутствуют данные о характере течения генерализованной формы стафилококковой инфекции у различных линий инбредных мышей, хотя бее подобных исследований невозможно выявить резистентные и чувствительные линии животных. В свою очередь сопоставление показателей клеточного и гуморального иммунитета, в том числе уровней синтеза основных медиаторов иммунитета, с характером течения генерализованной стафилококковой инфекции у оппозитных по чувствитгльности линий мышей необходимо для понимания природы различных форм инфекционного процесса, вы-

- з-

вываемого стафилококком. ' •

Цель исследования'.

В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования стало выявление иммунологических и морфологических особенностей развития и течения генерализованной стафилококковой инфекции у генетически различных инбредных мыией.

Задачи исследования.

1.Осуществить поиск высоко- и низкочувствительных к стафилококковой инфекции линий мышей.

2.Сравнить характер течения стафилококковой инфекции и морфологические изменения во внутренних органах у оппозитных линий мышей.

3.Выявить различия в специфическом клеточном и гуморальном иммунном ответе, в том числе в синтезе ннтерлейккнов, у оппозит-ных линий мышей.

4.Проанализировать способность Т клеток отвечать на антиген стафилококка в присутствиии антигенпрезентируюшлх клеток, взятых от оппозитных линий мышей.

б.ПроЕести начальный генетический анализ восприимчивости к стафилококковой инфекции у гибридов первого поколения и потомков возвратного скрещивания оппозитных линий мыией.

6.Охарактеризовать эффективность стимуляции иммунитета стафилококковой бесклеточной закциной, используя различия в чувствительности мышей к стафилококковой инфекции.

Научная новизна.

Впервые выявлены линии инбредных мышей', существенно различающиеся по уровню резистентности к генерализованной стафилококковой инфекции и высеваёмости стафилококка из внутренних органов.

Впервые установлено, что у чувствительных к стафилококковой инфекции мыией линии СЗНА при заражениивозникают гнойно-воспалительные изменения внутренних органов, характеризующиеся большей распространенностью и абсцедированием, чем у резистентной линии СБА.

Впервые показано, что резистентные и чувствительные линии

мышей имеют различия в пролиферативной активности лимфоцитов селезенки и лимфоузлов в ответ на цитоплазматический антиген стафи-локо:ска. Это выявлено как у интаткных так и у. инфицированных мышей. Доброкачественное течение инфекционного процесса у резистентной линии СВЛ сопровождается усилением специфической пролиферативной активности лимфоцитов, тогда как у чувствительной линии СЗНА отсутствуют динамические изменения этого показателя. Установлено, что интактные резистентные и чувствительные мыши имеют достаточно высокий уровень специфических противостафилококковых антител классов М и б, при этом титр (основной вид опсонинов при стафилококковой инфекции) выше у резистентной линии. После заражения впервые 10 дней межлинейных различий в титрах специфических антител не обнаружено.

Впервые показано, что низкий пролиферативный ответ у чувствительной линии мышей СЗНА определяется функциональной неполноценностью популяции Т клеток, а не дефектом антигенпрезентирукщих клеток, поскольку Т клетки•интактных и инфицированных мышей СЗНА одинаково слабо пролиферируют в присутствии антигенпрезентирующих клеток, взятых от резистентной или чувствительной Н-2 совместимой линии мышей, в отличие от Т клеток мышей лпнии СБА.

Впервые показаны различия в выработке интерлейкина 2 у оппо-зитных линий мышей. Чувствительность к стафилококковой инфекции сопровождается низкой продукцией интерлейкина 2 в ответ на стафилококковые антигены как у интактных так и у инфицированных животных.

Впервые показано, что гибриды П (СВАхСЗНА) наследуют признак чувствительности к инфекции по промежуточному типу и характеризуются промежуточными показателями пролиферативной активности лимфоцитов и выработки интерлейкина 2 по сравнению с родительскими линиями. Основываясь на результатах экспериментов по расщеплению признака чувствительности у потомков возвратного скрещивания гибридов П на чувствительную и резистентную линию можно предположить, что чувствительность к стафилококковой инфекции имеет полигенный характер наследования.

Практическая ценность.

Оппозитные по чувствительности к стафилококковой инфекции

линии мышей были использованы для изучения эффективности стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов и выработки интерлейкк-нов 1 и 2 в ответ на вакцинирование мышей стафилококковой бесклеточной вакциной, полученной в НИИВС им.И.И.Мечникова.

Показано, что стафилококковая бесглегочная вакцина является сильным стимулятором пролиферативной активности лимфоцитов и наработки интерлейкинов 1 и 2 in vitro у интактных мышей чувствительной и резистентной линий. . Синтез интерлейкина 1 возрастает в среднем в 2,4, а интерлейкина 2 - в 3,5 раза. Тем самым, стафилококковая бесклеточная вакцина активно стимулирует иммунный ответ как резистентных,так и чувствительных к инфекции жиготных что позволяет рассматривать ее 1сак средство фенотипической коррекции при нарушениях противостафилококкового иммунитета, даже при генетически детерминированной высокой чувствительности к стафилококку.

Положения, выносимые на защиту;

1.Инбредные линии мышей значительно различаются по чувствительности к стафилококковой инфекции. Заражение оппозитных по чувствительности линий мышей одинаковой дозой инфекта обнаруживает выраженные различия по выживаемости, высеваемости стафилококков из селезенки и морфологическим проявлениям инфекционного процесса,

2.Резистентность к стафилококковой инфекции ассоциирована с генетически обусловленным высоким уровнем пролиферации лимфоцитов и синтеза интерлейкинов 1 и 2.

3.Использование чувствительных и резистентных к стафилококковой инфекции линий мьшей перспективно для оценки эффективности действия на иммунитет новых противостафилококковых вакцин и имму-нопрепаратоз.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на: 3-м Всесоюзном съезде научного общества анестезиологов и реаниматологов в Москве (1983); на конференции "Адаптация и дисадаптация в патологии" в Москве (1989); на 8-м Всесоюзном съезде патологоанатомов в Тбилиси (1989) и на Всесоюзной конференции по актуальным вопросам сепсисологии в Тбилиси (1930). Фрагменты диссертации вошли в учебное пособие "Тесты программиро-

ванного контроля по частной патологической анатомии", Москва, 1986 г. и в серию слайдов "Морфофункциональные проявления иммунологических реакций в стенке кишечника", ВСНП0"Союзнаучпри-бор",1990.

Публикации. По теме диссертации опубликована 22 печатных работы.

Объем и структура диссертации.

Работа выполнена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, литературного обзора, главы "Материал и медо-ты", 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов,выводов, списка цитируемой литературы, сотоящего из 240 отечественных и зарубежных работ. Работа иллюстрирована И таблицами и 37 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследований.

Работа была выполнена в лаборатории цитоморфологии и оценки безвредности биопрепаратов НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН и лаборатории экспериментальной иммуногенетики (на базе питомника инбред-ных мышей) ЦНИИ туберкулеза РАМН.

Животные. Работа проведена на 12 инбредиых линиях мышей, большинство из которых поддерживается в питомнике ЦНИИТ РАМН в соответствии с общепринятыми правилами (Медведев Н.Н.,1968; Бландо-ва З.К. и соавт.,1973). Список линий, использованных в работе, приведен в таблице 1. Гибриды Пи потомки возвратных скрещиваний (ВС1) выращены в питомнике линейных животных ЦНИИТ самостоятельно.

В экспериментах использованы мши обоего пола, массой 18-20 гр., в возрасте 2-4 месяца. Общее число использованных животных около 1200.

Микроорганизмы. В работе были использованы 9 вирулентных штаммов золотистого стафилококка, полученных из микробиологических коллекций НИИ скорой помощи (2 штамма, выделенные от больных с раневой инфекцией), ЦНИИ туберкулеза (2штачма, выделенные от больных с гнойным плевритом), НйИШ им.Н.Ф.Гамалеи (штаммы 0-15 и Б-243), НИИВС им.и.И.Мечникова (штамм 1968), НИИ питания (пташ 739) и ГИСК им.Л.А.Тарасевича (штамм 600). Все. использованные штаммы образовывали коагудазу, гигауронидазу, фибринолизин, и яв-'

лились активными продуцентами альфа-токсина.

Заражение мышей. Для заражения мьппей применяли 18-24 часовую культуру золотистого •стафилококка, выращенную на кровяном агаре. Концентрацию микробных клеток в суспензии определяли по методу

Таблица 1. Инбредные линии мышей .использованные в работе.

Название Сокращенное Генетические Происхождение линии обозначение особенности

1.С57ВЬ/6 Вб Н-2Ь Из питомника

31 о АМН

"Столбовая"

2.ВАЬВ/с31;о С Н-2а

З.БВА/25Ьо ОВА/2 Н-2а

4.АК1?/31о АК1? ТЬу-1а Н-2 к

б.СВА/БЬо СВА Н-2к

б.СЗНАЛОТ СЗНА Н-2к Из питомника

НЙЛЗБМ АМН

7.А/БпС11 А Н-2а Питомник

ЦНИИТ РАМН

8.СВА/№ЛЬ СВА/М Х1с1,11-2к Из Бетезды

ШН (США)

Э.СЗН/НеЛСИ/ СЗН/Не] 1рэс1 ,Н-2к _ 1»_

Ю.^ВЮгг! Ь.В10221 _ М_

И.СХВЕ/ВуСИ СХВЕ Н-2Ь _ м_

12. БДОИ Н-2Ч _

* - Линии, обозначенные символом СИ, поддерживаются в питомнике ЦНИИТ.

А.К.Акатова (1969) п. оптической плотности на спектрофотометре: Брес^отот (Венгрия), с рутинной проверкой концентрации путем подсчета КОЕ. Использовались дозы стафилококка 10б,107 , от 0,5х108 до 5x10е,' а также 109 микробных тел.Культуру вводили в латеральную хвостовую рену в 0,5 мл физиологического раствора.

Высеваемость стафилококка из селезенки зараженных мышей. Ко-

- е -

личество стафилококков, Еысеваемых из селезенки проводили на 1 и 4 сутки после заражения мышей СБА и CGHA дозой 2,5х108 микробных тел. Селезенку гомогенезировали в физиологическом растворе, готовили серию 10-кратных разведений и наносили по 0,2 мл из 4 - 7 разведений на чашки Петри с кровянным агаром. Количество колоний учитывали черев 24 часа и пересчитывали содержание колоний на орган зараженной мыши.

Вакцинация и иммунизация. Для вакцинации мышей использовали стафилококковую бесклеточную вакцину,полученную группой аэрозольных вакцин НИИВС им.И.И.Мечникова. Вакцину вводили однократно в дозе 50 мкг/мышь, подкожно в область лопатки в 0,5 мл физиологического раствора.

Иммунизацию проводили путем введения в подушечку задней лапы цитоплазматического антигена в концентрации 50 мкг/мышь, эмульгированного в неполном здшваате Фрейнда (Sigma) в соотношении 1:1 по объему.

Получение суспензий клеток. Лимфатические узлы и селезенку продавливали тефлововым пестиком через сетку из нержавеющей стали в отмывочной среде 199 с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки, ЮмМ HEPES и антибиотиков. Эритроциты лизировали лизи-рующим раствором, однократно отмывали и суспензию клеток переводили в полную питательную среду RPMI-1640 с содержанием 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мМ HEFES, 2мМ L-глютамийа и антибиотиков. , подсчитывали число клеток и определяли жизнеспособность по окраске трипанозым синим.

Клетки перитонеального экссудата. Мьшам внутрибрюшинно вео-дшш 5 мл фосфатного буфера,рН - 7,2, содержащего 20 ед/мл гепарина. После массажа передней брюшной стенки отсасывали содержимое перитонеалыгок полости и суспензию клеток однократно отмывали отмывочной средой. В полученном содержимом присутствовало 25-30% макрофагов.

Удаление клеток, прилипающих к нейлоновой вате. Для получения клеток с высоким содержанием Т лимфоцитов использовали клетки селезенки, взятые после удаления из суспензии эритроцитов. Клетки дважды фильтровали через 10 мл колонки с 0,7 г нейлоновой ваты (Polyscience Inc.Warrington РА США). При этом наносили на колонку суспензию, содержащую 80-90 млн клеток и инкубировали 1 час при 37°С, затем неприлипшие клетки элюировали 10 мл теплой питатель-

кой срзды (Frizio D, Cudkiwicz Q.„1974). Полученные клетки концентрировали и процедуру повторяли второй раз.

Выделение клеток -с высоким содержанием Т лимфоцитов методом пеннинга. Суспензию клеток селезенки освобождали от эритроцитов, однократно отмывачи и наносили на пластиковые чашки Петри (с1-90мм) в количестве 60 млн в 10 »ал. После инкубации в термостате при 37°С, 5% С02 в течение 2 часов собирали неприлипииэ к пластику клетки и переносили на чашки Петри, предварительно обработанные козьими антителами к иммуноглобулинам мыши (ICN Bioche--micals.CSIA), в количестве 2х107 клеток, суспендированных в 4 мл фосфатного буфера с 0,27. БСА и инкубировали 45 мин при 4° С. По истечении срока инкубации клетки ресуспензировали и сливали в пробирку. В растворе находились Т клетки, полученные методом негативной селекции(Лимфоциты.Методы.Ред:Д.Клаус.Пер. с англ.,' М.Мир,1990 с.392).

Определение количества Т »меток в суспензии, полученных после пассажа через нейлоновую вату или методом пеннинга, проводили в цитотоксическом тесте. Для этого »слетки в концентрации 2х107/мл суспендировали в культуралыюй среде без эмбриональной телячьей сыворотки и инкубировали в смеси с гипериммунной сызороткой ¡шаей AKR против СБА в разведении 1:50 при 4°С 1 час. После осаждения клеток и однократного отмывания средой от избытка антител к суспензии добавляли низкотоксичный кроличьий комплемент (Cederlane Labs) в разведении 1:10 и смесь инкубировали 1 час при 37°С. Количество Т лимфоцитов в тестируемых суспензиях составляло 93-95Z.

Приготовление антигенпрезентирующих клеток (АПК). Клетки селезенки интактных или зараженных мышей освобождали от эритроцитов. Для отмены пролиферации клеток селезешси их обрабатывали ми-томицином-С (Sigma,США) в дозе 25 мкг/мл. Клетки отмывали и использовали в качестве АПК.

Определение селезеночного индекса. Мышей забивали, извлекали селезенку и взвешивали е'е. Селезеночный индекс (СИ) определяли по формуле: отношение массы селезенки к массе мыши х 100.

Антигены,использованные в иммунологических реакциях. В качестве антигена в экспериментах in vitro был использован цитоп-лазматичес»шх антиген стафилококка (ЦПА), любезно предоставленный В.Я.Прохоровым (лаборатория стафилококковых инфекций НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалея). В ряде экспериментов в качестве антигена была

использована стафилококковая бесклеточная вакцина, полученная в НИКВС им.И.И.Мечникова В.Н.Ефремовой и Н.Б.Егоровой. Оба антигена применялись In vitro в дозах 5 и 10. мкг/мл, которые были подобраны экспериментально. Сыворотки мышей, иммунизированных ЦПА и стафилококковой вакциной, перекрестно реагировали в тесте ИФА с указанными антигенами.

Определение пролиферативного ответа лимфоцитов. Клетки селезенки или лимфоузлов ресуспендировали в полной питательной среде и вносили по 400 тыс. клеток в объеме 200мкл в каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета (Nunc, Дания). Контрольные, и экспериментальные лунки группировали триплетами и в последние вьосили тестируемые антигены в выбранной концентраций. В случаях использования смеси различных клеток 200 мкл суспензии содержало 300 тыс. АПК и 100 тыс. обогащенных Т клеток. Планшеты с клетками культивировали в течение 72 часов в СОг-инкубаторе (Queue,США), добавляя на последние 16 часов культивирования по 37 МБк 3Н-тими-дина. Клетки собирали с помощью харвестера (Skatron, Норвегия) на фильтры из стекловолокна (Flow, Великобритания), высушивали и переносили во флаконы со сцинтиляционной жидкостью. Посчет проводили на сцинтиляционном - счетчике.Результаты выражали в виде индекса стимуляции, равного отношению количества импульсов в опыте к количеству импульсов в контроле.

Определение интерлейкина 1. Определение уровня синтеза ИЛ-1 проводили с использованием интерлейкин-1 зависимой линии Т меток хелперов D10.64, полученной из American type culture collection (Maryland, США). Культуру клеток D10.G4 выращивали в 24-луночных планшетах в полной питательной среде с использованием в качестве фидера клеток селезенки мышей СБА (1х10б/мл) с добавлением 200 мкг/мл кокальбумина (Sigma,США) и 10% .адсорбированного -метилман-нозидом (Sigma) супернатанта клеток селезенки, стимулированных Кон-А (2,5 мкг/мл). Через 10-12 дней культивирования культуру клеток D10.G4 помещали в 96-луночные планшеты б концентрации 2х104 на лунку и добавляли тестируемые образцы надосадочной жидкости культур перитонеальных макрофагов от интактных или зараженных мышей в разведении от 1/4 до 1/256 и 2,5 мкг/мл конканавалина А и затем культивировали в течение 62-65 часов в СОг инкубаторе, добавляя 37 МБк 3Н-тимидина на лунку на последние 16-18 часов (сультивирования. В качестве положительного контроля использовали

супернатант 24-часовых культур клеток- селезенки мьшей СВА, стимулированных Кон-А в дозе 2,5 мкг/мл. За условную единицу содержания ИЛ-1 принимали разведение, в котором включенная радиоактивность (количество импульсов) в 1 мин. составляла половину от максимального включения. В качестве отрицательного контроля использовали уровень радиоактивности культур клеток D10.G4, к которым не добавляли надосадочной жидкости перитонеальных макрофагов.

Определение интерлейкина 2. Определение уровня ИЛ-2 проводили с использованием ИЛ-2 зависимой линии Т клеток CTLL. Культуру клеток CTLL культивировали в 24-луночных планшетах в концентрации 5х103/мл с добавлением 10 ед/мл рекомбинантного интерлейкина 2. Для определения содержания ИЛ-2 в каждую лунку 96-луночного план шета добавляли клетки CTLL в концентрации 2х104/мл и последовательные разведения надосадочной жидкости 24-часовых культур кле-; ток селезенки мылей. Культуры инкубировали в СОг -инкубаторе в течение 48 часов, добавляя 37 МБкэН-тимидина на последние 18 часов культивирования. В качестве положительного контроля использовали последовательные разведения надосадочной жидкости культур клеток X63Ag8-635, трансфецированиых кДНК ИЛ-2. В качестве отрицательного контроля использовали клетки CTLL, к которым не добавляли надосадочной жидкости, содержащей ИЛ-2.

Определение интерлейкина 4. Определение уровня ИЛ-4 проводили о использованием ИЛ-4 зависимой, линии Т клеток CT.4S. Клетки CT.4S культивировали в 24-луночных планшетах в концентрации 5х104 /мл с добавлением 100 Ед/мл рекомбинантного ИЛ-4. Определение содержания ИЛ-4 проводили в 96-луночных планшетах. В каждую лунку добавляли 2х104 /мл клеток CT.4S и последовательные разведения надосадочной жидкости 48-часовых культур клеток селезенки мышей. Смесь культивировали з СОг-инкубаторе в течение,48 часов, добавляя 37 МБк3Н-тимидина на последние 18 часов- культивирования. В качестве положительного контроля использовали последовательные разведения надосадочной жидкости культур клеток X63Ag8-635, трансфецированиых кДНК ИЛ-;. В качестве отрицательного контроля использовали культуру клеток CT.4S, к которой не добавляли надосадочной жидкости, содержащей ИЛ-4.

Линии интерлейкин зависимых Т клеток CTLL и CT.4S, а также линии X63Ag8-635, были любезно предоставлены F.Melchers (Basel Inst. for.Immunology)(Karasuyama H..Melchers F.,1988).

Определение титра противостафилококковых антител в сыворотке крови мышей. Кровь от интактных или зараженных мышей получали из ретроорбитального венозного синуса. Определение противостафилококковых антител в сыворотке проводили в тесте иммуноферментного анализа по методу E.Engvar, P.Perlmer (1971) в полистироловых планшетах. Планшеты сенсибилизировали 100 мкл раствора ЦГ1А(10мкг/мл). Образцы исследуемых сывороток наносили на планшеты в разведении 1/100 - 1/1000, инкубировали 1,5 часа при 37°С, отмывали и вносили меченные пероксидазой козьи антитела против иммуноглобулинов M,Gl,G2a,G2b,G3 мыши (ICN.CUIA) в разведении 1/1000. Интенсивность реакции регистрировали на piwepe(Dynatec М!> 580,Великобритания) при длине волны 492 нм. Результаты выражали в виде отрицательных десятичных логарифмов титров антител.

Статистическая обработка материала. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя методы вариационной статистики. Для оценки значимости различий средних величин применяли Т-критерий Стъюдента, при исследовании генетического сцепления - метод^С2(Шюхинский Н.А., 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.Межлинейные различия чувствительности мышей к генерализованной стафилококковой инфекции.

В предварительных экспериментах мы провели внутривенное заражение мышей линии СБА штаммами золотистого стафилококка,взятыми нами из различных источников, в дозе 109 микробных тел с цел^ю выявления наиболее вирулентного из них для организма лабораторных мышей. Животные, зараженные разными штаммами, погибали в различные сроки. Средний срок жизни колебался от 8,5 ±0,5 до 14,6±1,4 дня. Для дальнейших исследований нами были выбраны штамм S.aureus Б-243 (получен из лаборатории стафилококковых инфекций НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалея) и штамм 1968 (получен от сотрудников группы аэро-озольных вакцин НИИВС им.И.И.Мечникова), как наиболее вирулентные для мышей. Кроме того, штамм Б-243 был использован сотрудниками лаборатории стафилококковых инфекций НИИЭМ (В.Я.Прохоров, К.Р.То-ловская) для получения цитоплазматического антигена.

Первым этапом создания модели для изучения чувствительности

и резистентности к генерализованной стафилококковой инфекции стало выявление межлинейных различий по этим параметрам. С этой цель было проведено- внутривенное заражение мышей различных инбредных линий S.aureus штамма Б-243 в дозе 109 микробных тел.Учитывали срок жизни каждой мыши и результаты обрабатывали статистически (таблица 2).

Было показано, что большинство линий мышей имели средний срок жизни после заражения в пределах 9-12 дней. Наиболее чувствительными оказачись линии СЗНА и L.Blozzl; линия A/Sn и AKR занимали промежуточное положение.

Несмотря на то, что заражение мышей дозой 109 микробных тел выявило различия в сроках жизни и .следовательно, в чувствительности этих линий к золотистому стафилококк, инфекция оказалась летальной для всех линий мышей. Поэтому нам представилось необхо-' димым снизить дозу заражения с целью выявить большие различия в сроках жизни или обнаружить не количественные, а качественные различия между линиями, что облегчило бы дальнейший анализ. Таблица 2. Выживаемость мышей различных инбредных линий после заражения золотистым стафилококком в дозе 109 микробных тел.

Линии мышей Число мышей Средний срок жизни

после заражения

BALB/c 11 11,4±1,1

AKR 10 7,2±0,5

CBA/N И 12,2±0,6

A/Sn 10 7,1±0,7

C3H/HeJ 8 10,3±1,1

DBA/2 15 10,8±0,7

СВА 35 8,8±0,5

СЗНА 32 4,3±0,3

СХВЕ 11 8,6±1,3

SWR 10 8,2±0,5

L.Blozsi 10 4,5±0,5

Для этих исследовгаий из числа тестированных линий были выбраны резистентные линии ВА1В/с,БВА/2 и СБА, и А/Зп и СЗНА. Мыши

1..В1о221 не использовались,. поскольку они являютсй не инбредной линией, а более или менее аутбредным стоком. Доза заражения для отобранных линий мышей была уменьшена до 2x10® микробных тел золотистого стафилококка.

Пятикратное уменьшение дозы заражения привело к появлению более выраженных различий в чувствительности мышей к стафилококковой инфекции. У резистентных линий СБА,ВАШ/с и ОВА/2 доля мышей, выживших после заражения составляла 90-94%, а у наиболее чувствительной линии СЗНА инфицирование указанной дозой приводило к гибели 100£ животных. Результаты экспериментов представлены в таблице 3.

Учитывая полученные результаты, для дальнейшего" анализа в качестве оппозитных по чувствительности к стафилококковой инфекции были взяты линии СБА (резистентная) и СЗНА '(чувствительная), поскольку обе линии имеют одинаковый гаплотип. МНС (Н-2к), что позволяло при анализе иммунного ответа на инфект проводить эксперименты по совместному культивированию клеток от чувствительной и

Таблица 3. ■

Выживаемость мышей резистентных и чувствительных линий после заражения золотистым стафилококком в дозе 2x10® микробных тел.

Линии мышей Число мышей Средний срок жизни после заражения Летальность BX

BALB/c 30 14,0±1,0 6,6

DBA/2 ' 20 12,5±1,5 10

СВА . 30 11,3±0,9 10

A/Sn 14 9,2±0,4 . 71.4

СЗНА 20 7,8±0,5 100 '

резистентной линий мышей.

Мы изучили высеваемость золотистого стафилококка из селезенки оппозитных линий мышей СВА и СЗНА на 1 и 4 сутки после заражения S.aureus дозой 2x1О8 микробных тел. Показано,что на 1 сутки обсемененность органа у чувствительной линии составляла 61±: 18 х 109 KOS на селезенку и в 1000 раз превышала этот показатель у резистентной линии (88±12 х 10® КОВ, Р<0,С01). На 4 сутки ксличест-

во КОВ на селезенку значительно уменьшалось у обеих линий мышей, но показатель у чувствительной линии достоверно превышал таковой у резистентной линии (25 ±10 х 105 КО0 у СЗНА и 36±12 X 103 КОВ у СВА; Р<0,05).

Для изучения характера наследования признака чувствительности к стафилококковой инфекции были получены гибриды первого поколения П(СВА х СЗНА) и потомки возвратного скрещивания ВС1 (СВА х П) и ВС1 (СЗНА х П). Заражение родительских линий и гибридов П дозой 2 х 108 микробных тел показало, что к 2 неделям после заражения выживаемость у резистентной родительской линии СВА составляла 94%, из мышей чувствительней родительской линии СЗНА не выжила ни одна особь, тогда как у гибридов П летальность равлялась 62,3% (таблица 4).

При этом следует подчеркнуть, что оставшиеся'38,77. мышей жили до конца срока наблюдения (также как и резистентная родительская линия СВА), хотя и имели макро- и микроскопические признаки имеющегося инфекционного процесса во внутренних органах.

Таблица 4.Выживаемость ¡алией олпозитных линий и гибридов П между ними после заражения 2 х 108 микробных тел золотистого стафилококка.

Линии мышей Число Средний срок жизни Летальность

мышей пссле заражения в%

СВА 45 11,0±1,0

СЗНА 40 7,4±0,3

П 32 7,3±0,4

(СВАхСЗНА)

Полученные данные указывают на то, что чувствительность к стафилококковой инфекции наследуется гибридами F1 по промежуточному типу. Учитывая, что' наблюдается гибель более 50% животныхП, можно принять рабочую гипот.ву, что чувствительность наследуется гибридами F1 как доминантный признак с пенетрантностыо около 60%.

Было проведено сопоставление реакции на заражение мышей СВА,СЗНА и гибридЬв F.1 по еще одному критерию - гиперплазии селезенки зараженных мышей. Оппозитные линии и их гибриды были инфе-цированы дозой 2х108 микробных тел S.aureus и на 5 сутки у этих

6,6 " 100 62,5

животных определяли селезеночный индекс. У чувствительной родительской линии СЗНА и гибридов F1 селезеночный индекс был одинаковым (0,7i0,0S и 0,7±0,14, соответственно), а у резистентной родительской линии СБА - существенно выше (1,05± 0,09,Р<0,01). Предполагаемая нами (и впоследствии подтвержденная - см. ниже) недостаточность иммунологических механизмов защиты у чувствительной линии СЗНА проявилась снижением селезеночного индекса по сравнению с резистентной линией СБА. Гот факт, что у гибридов F1 селезеночный индекс оказался таким же как у чувствительной родительской линии СЗНА, косвенно поодтверждает доминантное наследование чувствительности к инфекции.

Для дальнейшего анализа характера наследования'чувствительности и резистентности к стафилококковой инфекции гибридов первого поколения и потомков возвратного скрещивания инфицировали той же дозой 2x10е микробных тел S. aureus и регистрировали гибель животных в течение 2-х недель.

У гибридов F1, также как и в предыдущих экспериментах (табл. 4), летальность составила 65% (17 из 26 зараженных мишей) . Если предположить согласно представлениям классической мен-делевской генетики, что у гибридов F1 имеется доминантно проявляющийся аллель чувствительности с пенетрантяостью в гетерозиготе, равной 0,65, то в этом случае теоретически следует ожидать, что у потомков возвратного . скрещивания ЕСИСВА х F1) на резистентную линию выживаемость составит.67% (0,5+0,35 х 0,5=0,67). Выживаемость потомков возвратного скрещивания (СБА х F1) составила 62Х (36 из 58 мышей), что согласуется с теоретически ожидаемой величиной (Х2=0,7). У потомков возвратного скрещивания на чувствительную родительскую линию (СЗНА х F1) теоретически летальность . должна составить 82% (0,5+0,65 х 0,5=0,82). В наших экспериментах летальность равнялась 60% (9 из 15 мышей), что расходится с теоретически ожидаемой величиной 0<2=3,75). Вероятно, что характер наследования чувствительности к инфекции носит сложный характер и определяется несколькими, а не каким-либо одним геном.

2.Морфологические изменения внутренних органов мышей при генерализованной стафилококковой инфекции.

Патоморфологическое исследование мышей 11 инбредных линий

после заражения 109 микробных тел показало,что все животные имели видимые серовато-белые гнойные очаги в почках и, значительно реже,-в печени. Причем, если у мышей резистентных линий поражения печени встречались менее чем в 50% случаев, то у мышей чувствительных -линий (А/Бп, Ь. В10221 ,С311А) макроскопические очаги наблюдались уже в 76% случаев. У последних нами также отмечены в небольшом проценте случаев гнойные поражения легких (5,5%), сердца (3,8%), мягких тканей, преимущественно грудной клетки(8,9%), и у двух мышей линии СЗНЛ был выявлен гнойный гонит.

Микроскспичесое исследование внутренних органов мышей выявило характерные для гнойного воспаления морфологические изменения, степень выраженности которых варьировала у разных линий. Так у мышей резистентных линий в ткани печени мы в основном наблюдали полнокровие, отек и дистрофию гепатоцитов.Гнойные изменения в виде микроабсцессов с деструкцией гепатоцитов и очаговой инфильтра-' цией нейтрофилами ' и макрофагами не занимали значительной части паренхимы. У мьшей чувствительных линий поражения печени были большей частью диффузными, захватывали значительную часть парен-хиимы.

Поражения почек после заражения 10° микробных тел тшете варьировали от линии к линии. У мышей резистентных линий они были представлены диффузным интерстициальным нефритом. У мышей чувствительных линий воспалительные изменения были более выраженными и приобрели характер гнойного , абсцедирующего нефрита, в ряде случаев с массивными кровоизлияниями в зоне абсцедирования и явлениями гнойного пиелонефрита.

Мы проследили динамику развития воспалительных изменений во внутренних органах мышей оппозитных линий и гибридов П на 1, 3-5 тл 8-10 сутки после заражения в дозе 2х103 микробных тел.

Гистологическое исследование внутренних органов мышей резистентной линии показало, что на 3-5 сутки после заражения начальные признаки воспаления имелись в почках и печени и характеризовались очаговой инфильтрацией из нейтрофилов и мононуклеаров преимущественно вблизи сосудистого русла.

В отличие от резистентной линии СБА, у чувствительной линии СЗНА патологические изменения во внутренних органах на 3-5 сутки носили более выраженный характер. В почках, на фоне выраженного полнокровия часто встречались мелкие интерстициальные инфильтраты

из нейтрофилов и мононуклеаров и, в ряде случаев,'отмечено формирование мелких кортикальных абсцессов. В печени, на фоне отека и полнокровия ткани", встречались групповые некрозы гепатоцитов с появлением здесь непрофильной инфильтрации.

Среди гибридов П при гистологическом исследовании внутренних органов нами выявлены различные по выраженности патологические изменения от минимальных признаков тканевого ответа на заражение до развития гнойного воспаления, подобного таковому у родительской линии СЗНА.

На 8-10 сутки после заражения у небольшой части мышей резистентной родительской линии в печени и почках были выявлены воспалительные изменения в виде преимущественно очаговой инфильтрациии моноцитами и макрофагами. У мьшей чувствительной родительской линии СЗНА в почках и печени обнаружены явления гнойного воспаления с формированием в ряде случаев небольших абсцессов.

Нами также проведено сравнительное гистологическое исследование центральных (тимус) и периферических (селезенка и лимфоузлы) лимфоидных органов оппозитных линий мышей на 3-5 и 8-10 сутки после заражения в дозе 2х108 микробных тел.

В тимусе мышей линии СЗНА в первый срок исследования отмечена выракениал гипоплазия лимфоидной ткани вплоть до практически полной делимфатизации ткани у некоторых мышей. У мьшей линии СВА явления гипоплазии ткани тимуса носили значительно менее выраженный характер. К 8-10 суткам в тимусе мы наблюдали процесс восстановления лимфоидной ткани почти до исходного состояния у . мышей резистентной линии СВА и значительно в меньшей степени - у чувствительной линии СЗНА.

В селезенке и лимфатических узлах оппозитных линий мышей, на 3-5 сутки после заражения гистологические изменения были достаточно сходными и характеризовались некоторой редукцией тимус-зависимых зон и появлением зародышевых центров в фолликулах тимус- независмых зон этих органов. На 8-10 сутки в селеёенке и лимфоузлах резистентной линии СВА отмечено появление бластных и плазматических клеток в тимус-зависимых и тимус-независимых зонах а у мышей чувствительной линии СЗНА активность пролиферативных процессов в указанных зонах практически отсутствовала.

3. Показатели клеточного и гуморального иммунитета у 'оппо-зитных линий мышей и гибридов первого поколения при генерализованной стаифлококковой инфекции.

Изучение показателей клеточного и гуморального иммунитета было проведено у мышеи родительских линий (СВА-резистентная, СЗНА-чувствительная) и гибридов первого поколения П. интактных и зараженных золотистым стафилококком в дозе 1х108 микробных тел. Доза инфекта была снижена, чтобы исключить гибель мышей чувствительной линии и влияние атонального состояния на иммунологические показатели. Определяли следующие иммунологические показатели: пролиферативная активность клеток селезенки (спонтанная и в ответ на 5 мкг/мл ЦПА); пролиферативная активность популяции лимфоцитов селезенки, обогащенной Т клетками (спонтанная и в ответ на ЦПА); пролиферативная активность лимфоцитов регионарных лимфоузлов после иммунизации ЦПА в- псдушечку лапы (спонтанная и в ответ на ЦПА); синтез медиаторов иммунитета (интерлейкины 1,2 и 4); синтез специфических антител 1еМ, 1е01,1еС2а, 1ё(32Ь и 1^3.

3.1 Пролиферативный ответ клеток селезенки и лимфоузлов интактных и зараженных мышей.

Пролиферативный ответ клеток селезенки мышей родительских линий и гибридов П изучали у интактных мышей и на 5 и 9 сутки после заражения золотистым стафилококком. Результаты исследования' представлены на рис.1, из которого видно, что -интактные мыши родительских линий достоверно отличаются по индексам пролифераций клеток селезенки в ответ на ЦПА. Резистентная к инфекции линия СВА отвечает сильнее, чем чувствительная СЗНА (4,6*0,43 и 2,0±0,2б, соответственно, Р<0,01)...У гибривдов П первичный ответ индуцируется на промежуточном "уровне (3,1-0,41).

Заражение мышей позволило'выявить три разных' типа динамики ответа на ЦПА. К 5 суисач у мышей СВА, СЗНА и П не происходило достоверного изменения уровня пролиферации клеток селезенки по сравнен™ с интактными мышами (4,4±0,5; 1,8±0,23; 2,7±С,3 соответственно). К 9 суткам у мышей СВА отмечен достоверный подъем пролифератиЕНОй активности (6,0±0,34, Р<0,01), у мышей СЗНА индекс пролиферации оставался на прежнем уровне (1,440,2), а у гибридов П достоверно снижался по сравнению с 5 сутками (1,2±

0Д,Р<0,05), достигая уровня пролиферации лимфоцитов чувствительной лиши СЗНА.

Для изучения мэхлинейных различий в силе специфического иммунного ответа в условиях, когда на ответ, не влияют различил, обусловленные неодинаковы течением инфекции у мышей СБА и СЗНА, нами был исследован пролиферативный ответ клеток регионарных лимфоузлов мышей СБА,СЗНА и F1 после иммунизации их ЦПА в смеси с неполным адгювантом Фрейнда в подушечку лапы. Индекс пролиферации лимфоцитов на 14 сутки после иммунизации у чувствительной линия был достоверно ниже, чем у резистентной линии и гибридов Fl(7,l± 2,0;-15,041,8; 13,4±1,0 соответственно,Р<0,01).

Результаты изучения пролиферативной активности клеток селезенки и"лимфоузлов у интактных мышей оппозитных линий■и гибридов F1 указывают па генетически детерминированные различия в силе иммунного ответа на ЦПА. Сильный иммунный ответ у резистентной линии СБА после заражения проявляется в виде возрастания уровня пролиферации, а!слабый у чувствительной линии СЗНА - в отсутствии динамических изменений. Поскольку сила иммунного отьета на антигены регулируется Т клетками, то можно предположить, что у чувствительной родительской линии страдает Т- клеточное звено иммунного ответа.

3.2 Пролиферативный ответ обогащенной Т клетками копуляции лимфоцитов интактных и зараженных мышей.

. В предыдущих.разделах было показано, что лимфоциты селезенки и лимфоузлов интактных и зараженных мышей, оппозитных по чувствительности к ,S.aureus, обладают различной пролиферативной активностью при стимуляции ЦПА. Низкий пролиферативный ответ чувствительной линии СЗНА может быть обусловлен либо дефектом собственно Т клеток, либо неэффективной презентацией.антигена макрофагами, либо супрессией иммунного ответа макрофагальной или лимфоцитарной природы, возникающей в организме зараженных животных.

Для проверки этих возможностей была получена высокообогащен-ная популяция Т методом двукратного пассажа клеток селезенки через нейлоновую вату. Использовали клетки селезенки интактных мышей оппозитных линий СБА и СЗНА. Б качестве антиген-презентирую-щта братпт клетки селезенки интактных и зараженных мылтей • ОВД и

СЗИЛ и после обработки митомицином-С (25мкг/мл) смешивали с обогащенной популяцией Т клеток так, чтобы Т клетки каждой линии взаимодействовали с АПК интактных и зараженных мышей, чувствительной и резистентной линий. ' г

В результате проведенных исследований были выявлены различия в пролиферативной активности популяции, обогащенной Т клетками, в зависимости от происхождения Т клеток. Т клетки от интактных мышей линии СЗНА дают достоверно более низкий ответ при стимуляции ЦПА по сравнению с Т клетками мышей СБА вне зависимости от того, использованы' ли АПК от СБА' или СЗНА, от интактных или зараженных кашей. Уровень пролиферации Т клеток СЗНА практически не меняется при использовании АПК от интактных или зараженных, мьоей и не за-бисит от того, используются ли АПК от резистентной линии СБА или чувствительной линии СЗНА (таблица 5).

Т клетки от интактных мышей СБА дают одинаковый пролифера-Таблица 5. Индексы пролиферации обогащенной популяции Г клеток интактных мшей СБА и СЗНА в присутствии антиген-представлящих клеток интактных и зараженных мышей

Антиген-представляющие Отвечающие Т клетка .

=.————-— СБА СЕНА

М ± ш n М ± ш п

СБА иптактные 1,7±0,1 4 1,2±0,.15* 4 .

СБА зараженные 2,840,2** 3 1,4±0,4* 3

СЗНА «нтактные - v 1,8±0,15 4 1,0+0.3* 4

СЗНА зараженные ' 2,4±0,3 3 1,3±0,3* 3

* Р<0,05 при сравнении линий СВн и СЗНА

**Р<0,01 по сравнению с показателем интактных шшей гой же линии

тивный ответ независимо от АПК, взятых от СБА или СЗНА. Индексы пролиферации при использовании АПК от зараженных мышей выше, чем при использовании АПК от интактных, что мгакет быть связано с дополнительными сигналами, обеспечиваемыми активированными АПК за-

раженных мышей.

Полученные результаты указывают на то, что межлинейные различия в пролиферативной активности Т клеток мышей СВА и СЗНА связаны с природой самих Т клеток, а не с антиген-представляющей способностью клеток селезенки этих оппозитных линий. Различия связаны именно с дефектом Т клеток линии СЗНА, поскольку были использованы Т клетки от интактных, а не зараженных мышей, что исключает наличие специфичеких индуцированных супрессоров иммунного ответа.

^

3.3 Синтез•Специфических антител у интактных и зараженных

мышей.

Титры специфических антител классам и 6 (01,(]12а,(32Ь,и (33) были определены у интактных и инфицированных мышей в сроки 1,5 и 10 дней после заражения золотистым стафилококком.

Титры специфических антител класса М не различались у интактных мышей родительских линий СВА и СЗНА и гибридов П(10~3,6, 1С"3*6 и Ю-3,8 соответственно).На первые сутки после заражения животных титры практически не менялись (Ю-3*6, Ю-3*9 и 10~3'5). Выраженные межлинейные различия отмечены на 5 сутки после инфицирования, причем титр 1£М возрастал лишь у резистентной линии СВА ■ (10~4"5) и превышал показатели у СЗНА и Р1 ( 10~3-.8 и Ю-3*5, Р<0,05„ и Р.<0,01 по сравнению с СВА).К десятым суткам показатели титров 1гМ у родительских линий и гибридов П возвращались к уровню интактных мышей (рис. 2)'.

Титры специфических антител 1^1 (рис.3), в отличие от 1бМ, имели выраженные различия у интактных мышей резистентной и чувствительной линий (СВА-10"3'4и СЗНА-10"2'9,Р<0,001). У гибридов П титр 1^(31 был такой же как у резистентной родительской линии и достоверно превышал титр чувствительной линии (Р<0,05).После заражения животных на 1 сутки у родительских линий отмечен достоверный подъем 1ев1 (Ю-4*1 и Ю-3-7, Р<0,001 по сравнению с ин-тактными мышами), а у гибридов Р1, наоборот,достоверное снижение (Ю-3*1,^<0,001)'.Дальнейшее определение титров антител подкласса 1д61 показало, что к 5 суткам они возвращались к уровню интактных мышей как у родительских линий,так и у гибридов Р1, к в дальнейшем не менялись. '." '.'

СВ4 св//Л Г*

» * Э »55 в У 3

Рис.1. Пролиферативиая активность меток селезенка интактных з зараженных швей. . .

По оса абсцисс: дни после зарааежм По оси ординат: щДека стйлуляцпа пролгфзрадиз .

оооевсад

аввеЕ езн* 1ЬЛШ П (СЕЛхСЗНА)

Рио»2* Титри специфических антител у интяхяшх и зарахен-. них мышей родительских линий и гибридов первого поко- ; ления.

По оси абсплсс: дни после заражения

По оси ординат: отрицательные десятичные логарифьи

титров антител

еаеео сад

ВВВОВ СЗНА _ ДЛЛЛАР1 (СВАхСЗНА)

Рис.3. Титры специфических антител у штактиых и вара-кешых мышей родительских линий и гибридов первого поколения.

По оси абсцисс: дни после заражения До оса ординат: отрицательные десятичные логарифмы титров антител.

. овввосвл > оеаво сзна .

1 . • лвйвЛГ) (СВАхСЗНА)

Рио.4. Титры специфических антител интактных в зарааеш

. них мышей родительских линий и гибридов первого поко/ ления. .

По оси абсциссг дни после заражения

По оси ординат: отрицательные десятичные логарифм таг

ров антител

Титры специфических антител подкласса не различались у

интактных мышей оппозитных родительских линий и их гибридов П. Заражение мышей не привело к каким-либо выраженным изменениям в тиграх 1д132а на протяжении всех сроков'наблюдения.

Титры специфических антител (рис.4) также не отличались

у мышей родительских линий и гибридов И. Инфицирование привело к тому, что у резистентной линии СБА и гибридов Р1 титры антител подкласса 1йС2Ь практически не менялись в течение всего срока наблюдения (Ю-3,2 и Ю-3-5 на 10 сутки). У чувствительной линии СЗНА происходил достоверный подъем титрсв в первые два срока (1 сутки-10~4-4, 5 сутки-Ю-4-9.' Р<0,05) и снижение до уровня интактных мышей к концу наблюдения (Ю-3-1).

Титры специфичеких антител 1^63 также как и 1§02а и не отличались у интактных мышей родительских линий и гибридов П (СВА-10~Э* 4,СЗНЛ-10~3'1 и Р1-10-3,3) .У оппозитных родительских линий они практически не изменялись в течение всего срока наблюдения , у гибридов И мы наблюдали достоверный подъем титров 1^3 на 5 сутки (Ю-4,1,Р<0,01 по сравнению с СВА -10"3-6 и СЗНА-10"3*3) и снижение до уровня интактных мышей к концу наблюдения.

3.4 Показатели продукции интердейкшов 1,2 и.4 у интактных и зараженных мыией.

Нами было проведено определение уровня спонтанного и ЦПАсти-мулированного синтеза ИЛ-1, ИЛ-2 и ИЛ-4 клетками интактных и за1 раженных- мышей ( 5 сутки после инфицирования)-у мышей-оппозитных линий и гибридов П. Супернатантн клеток перитонеального.экссудата или селезенки мышей добавляли в. последовательных разведениях к ИЛ-1- зависимому Т клеточному .-клону 010.64, к ИЛ-2 зависимой ,Т клеточной линии СТИ и к ИЛ-4 зависимой Т клеточной линии СТ.43.

Уровень спонтанной продукции ИЛ-1 у интактных мышей родительских линий и гибридов П не отличался между собой (табл.б). ЦПА-стимулированная продукция ИЛ-1 клетками перитонеального экссудата превышала спонтанную продукцию у мышей СВА,СЗНА и Р1 соответственно в 2,6, 4,5 и 2,4 раза. Заражение привело к увеличению ЦПА-стимулированной продукции ИЛ-1 и она по-прежнему превышала спонтанную продукцию у мышей СВА в 2, у мышей СЗНА в 2,4 II у гибридов Р1 в 2,3 раза.

Таблица 6. Показатели спонтанной и антиген-стимулиро-ванной продукции интерлейкина 1 у интактных к зараженных мышей (Ед/мл).

Линии Интакткые Зараженные

Спонтанная АГ-стиму- Спонтанная АР-стимулированная лированная

СБА 3,8+0,2 10,2±0,7 7,5±1,4* 14,9+0,9*

СЗНА 2,6±б,8 И ,7±1,1 6,6+2,1 15,8+0,1*

И .2,610,4 6,8±0,9 4,2±0,3 9,8+0,9*

* Р<0,05- по сравнению с интактными мышами ■ Уровень спонтанной продукции ИЛ-2 был одинаковым у интактных мышей оппогитных линий и гибридов П(табл.7). Продукция ИЛ-2 под воздействием ЦПА'была в несколько раз выше спонтанной (у СБА в б раз, у СЗНА в 2,5 раза и у П в 3,6 раза), при этом.была выявлена достоверная разница между оппозитными линиями СБА и СЗНА (4,2±0,7 .. и 1,2*0,2,Р<0,01), а показатель гибридов Р1 занимал промежуточное положение (2,2±0,53).

У зараженных животных не выявлено возрастания уровня спон- -тачной продукции ИЛ-2 по сравнению с интактными мышами. ЦПА-сти-мулированный . синтез ИЛ-2 у резистентной линии оставался на прежнем уровне. У чувствительной линии он возрастал в 2 раза-по отношению к интактным мышам,но все же оставался достоверно ниже, чем у резистентной линии. У гибрвдов П он по-прежнему занимал промежуточное 'положение. .

Нами не выявлено на 5 сутки после инфицирования сколько-нибудь ЕЫраженной продукции ИЛ-4 у интактных и зараженных мышей оп- . позитных линий и гибридов Р1.

Подводя итог этому разделу следует отметить, что наличие межлинейных различий в пролиферации клеток селезенки на ЦПА у интактных мышей СБА (высокий ответ) по сравнению с СЗНА (низкий ответ) . После заражения уровень пролиферативного "ответа возрастает у резистентной линии, а у чувствительной не меняется. Гибриды П имейт изначально промежуточный показатель пролиферации, на 5 сутки после- зараженин-он-вшгёгг 'чеыу ЧуВВтеютЕсЙГ')айЩ7'а ^ 9" "

Таблица 7.Показатели спонтанной и антиген-сгимулирован-ной продукции интерлейкина 2 у интактных и зараженных мьшей. (Ед/мл).

Линии Интактные Зараженные

мышей

Спонтанная АГ-стиму- Спонтанная АГ-стимулированная лированная

СВА 0,7+0,2 ' 4,2±0,7* 0,9+0,1 4,4+0,5** СЗНА 0.,4+0,1 1,2±0,2 0,Б±0,2 2,6+0,3 П 0,6+0,2 2,2±0,5 0,7+0,2 ' 3,0±0,5

* Р<0,01 по сравнению с линией СЗНА

** Р<0,05 по сравнению с линией СЗНА сутком снижается до ее уровня. Совместное культивирование популяции лимфоцитов, обогащенной Т клетками, взятыми от интактных мышей СВА и СЗНА, с АПК, полученными от интактных и зараженных'мышей этих линий, показало, что Т клетки чувствительной линии СЗНА вне зависимости от характера фидерных клеток практически не отье-чают на антигены стафилококка, тогда как Т клетки резистентной линия СВА пролиферируют даже при'презентации антигенов возбудите--ля АПК чувствительной линии СЗНА.

При изучении титроБ специфических антител- у интактных мышей оппозитных линий выявлены лишь различия по подклассу ДО! (основные опсонины при с т афило кот сков о й инфекции): у резистентной линии СВА уровень этих антител достоверно выше. После заражения на 1 сутки наблйдается подъем антител при сохранении отличий между СВА и СЗНА. На более поздний сроках инфекции межлинейные различия отсутствовали. Изучение титров специфических антител ■ 1е(32а, 1е(32Ь и ДОЗ у интактных и зараженных мышей на еыявило четких межлинейных различий в продукции этих иммуноглобулинов.

Уровень продукции ИЛ-1 не различается у интактных мышей СВА и СЗНА. После заражения он достоверно возрастает, но межлинейные различия не выявляются.

Продукция ИЛ-2, наоборот, различалась у мыгей оппозитных линий. У чувствительной линии ска была в 3.5 раза ниже, чем у ре-

зистентчой. После заражения уровень продукции ИЛ-2 не менялся по сравнению с таковым у пнтактных мышей и у чувствительной линии был по-прежнему ниже. Показатели синтеза ИЛ-2 у гибридов Fl занимали промежуточное положение, что напоминает картину различий показателей пролиферации клеток селезенки у интактных и зараженных мышей.

4. Пролиферативкый ответ лимфоцитов и синтез интерлейкинов 1 и 2 у оппозитных линий мышей.вакцинированных стафилококковой бесклеточной вакциной.

Стафилококковая бесклеточная вакцина получена методом водной экстракции из культур золотистого стафилококка (Ефремова В.Н.

Егорова Н'.Б, ,1978).

Мы исследовали стимуляцию зтой вакциной пролиферативной активности лимфоцитов селезенки и синтеза ИЛ-1 и ИЛ-2 у интактных и однократно вакцинированных мышей СВА и СЗПА.Вакцинацию производили подкожно в дозе 50 мкг/мышь и животных использовали в опыте .через неделю после инъекции.Для реакции in vitro в качестве антигена применяли стафилококковую вакцину в дозе 5 мкг/мл.

Изучение .пролиферативной активности лимфоцитов селезенки показало, что индекс пролиферации у интактных мышей СВА в ответ на стафилококковую „вакцину, составил 4.5±0,5 и превышал индеек мышей • СЗНА- 2,0±0,4(Р<0,01). Через неделю после вакцинации индекс пролиферации, B03PQC у мышей СВА до 9,9±1,07 (Р<0,01), а у мышей. СЗНА до 10,3±0,7 (Р<0,001) (табл.8).

Изучение продукции ИЛ-1 у'интактных мышей СВА и СЗНА показало, что ■ его ■ спонтанная продукция достоверно не отличается (4,5±0,7-- и 2,8±1,0, соответственно).. Стимулированный вакциной, езятой в качестве антигена, синтез ИЛ-1 у мышей СВА превышал таковой у СЗНА (17.8±2,1 и 10,3±2,5, Р<0,05Ь

Однократная вакцинация привела к значительному увеличению спонтанной и антиген-стимулированной продукции ИЛ-1. У мышей СВА спонтанная продукция возрастала в 3,3 раза (15,0*2,3, Р<0,С01), а антиген-стимулированная - в 1,7 раза (30*,8±1,5, Р<0,001). У мышей СЗНА. спонтанная продукция возрасла в 4,5 раза- ( 12,5±1,8, Р<0,001), а антиген-стимулированная-в 2,4 раза (25,4±2,6, Р<0,01). Мелышнейные различия в продукции ИЛ-1 нами выявлены лишь в показа-

телю-антигешчзтимулироввийогсг синтеза-т5тспхпяедиатора~у "йггамя-

Таблица 8. Индексы пролиферации лимфоцитов селезенки интактных и вакцинированных мышей.

Линии СВА СЗНА

Ингактные 4,5±0,5 2,0±0,45

Вакцинированные 9,9±1,0** 10,3*0,7**

**Р<0,001 по сравнению с интактньми животными, ных мышей и после однократной вакцинации эти различия ниЕзлирсйа-лись(табл.9).

Спонтанная продукция ИЛ-2 не отличалась у интактных мьагей СВА и СЗНА (табл.10). Стимулированная вакциной продукция у идей СБА превышала тасовую у СЗНА (7,0+0.2 и 3,8*0,4, Р<0,001) в 1,8 раза.

Вакцинация привела к значительному увеличению спонтанной и

Таблица 9.Продукция интерлейкинз 1 у интактных и бакии-нированных мышей.

СВА США

Спонтанная АГ-стимули- Спонтанная. АГ-стимулированная - рованная

Интйктные 4,5±0,7 17,8±2,1 2.8*1,0 10,3+2,5* Вакцинированные' 15,0*2,3** 30,011,5*** 12,5*1,8** 26,442,6**

* - Р<0,05 по сравнении с линией СВА

**- р<0,01 по сравнению с иятактььии мылами

*** - Р<0,001 по сравнению с иштахтшм мышами, антиген-стимулированной продукции ИЛ-2. У мышей СБА спонтанная продукция возр.зстзла в 20 pas (16,0*2,8, Р<0,001)и антиген-стпму-лированная - в 3,4 раза (23,542,1. Р<0,001). У мьпсей СЗНА спонтанная продукция возрастала в 9,3 раза (6,7iO,3 Р<0,001), а ан-тигеп-стимулированная - в 3,6 раза (13,8*1,8, Р<0,001). Несмотря

Таблица 10. Продукция интерлейкина 2 у интактных и вакцинированных мышей.

СВА

СЗНА

Спонтанная' АГ-стимули- Спонтанная АГ-стимули-

рованная

рованная

Интактныэ 0,8±0,1 7,0±0,2 0,7+0,02 3,8+0,4 Вакцикиро- -,

ванные 16,0+2,8* 23,6+2,1* 6,7+0,8* 13,8+1,3*

-Ч:

* - Р<0,001 по сравнению с интактными мышами **- P<0,0i

на значительное усиление после вакцинации синтеза ИЛ-2 клетками мышей чувствительной линии, она все же оставалась ниже, чем индуцированная вакцинацией продукция ИЛ-2 клетками мышей резистентной линии СВА.

Поскольку нами отмечено возрастание после однократной вакцинации индексов пролиферации клеток селезенки и увеличение продукции ИЛ-1 и ИЛ-2 у резистентной и чувствительной к стафилококковой инфекции линий мышей, то для оценки эффекта вакцинации на протек-тивный .иммунный ответ мы заразили вакцинированных мышей оппозит-ных линий S. aureus е дозе 109 микробных тел. Средний срок жизни у мышей СВА составил 10,3±1,4,' а у .СЗНА - 8,5±0,5~ дней. Если сравнить ■ эти■ данные с результатами заражения невакцинированных животных-- (СВА - 8,8±0,5; СЗНА - 4,3±0,3), то можно отметить увеличение. выживаемости чувствительной линии и отсутствие эффекта вакцинации у резистентной линии мышей. По-видимому, для получения эффекта вакцинации и создания выраженного протективного иммунитета у резистентной линии необходимы иные дозы Еакцины, чем для чувствительной линии мышей. Важность проблемы "индивидуализации" вакцинации рассматривалась в- работах -Р.В.Петрова (1982,1984), A.M.Мороза и соавт.'(1983), Q.Mitchell et al (1984) и-других исследователей, и эти авторы указывают, что для достижения успеха вакцинации у чувствительных и резистентных к инфекции особей необходимо дифференцирований сроков вакцинации и ■ ревакцинации, и

величины вакцинной дозы.

ВЫВОДЫ.

1. Мыши разных инбредных линий существенно отличаются по восприимчивости к заражению вирулентным штаммом золотистого стафилококка Б-243. Мьши линии СБА (резистентные) и линии СЗНА (чувствительные) при заражении одинаковой дозой S. aureus обнаруживают выраженные различия по выживаемости, зысеваемости стафилококка из селезенки, морфологической картине воспаления внутренних оргэксз и показателям клеточного и гуморального иммунитета.

2. Течение стафилококковой инфекции у чувствительных мышей 'линии СЗНА по сравнению с резистентной линией СБА отличает раннее развитие морфологических признаков гнойного воспаления и наличие еы-раженных воспалительных изменений во внутренних органах, сопровождающихся абсцедированием и кровоизлияниями.

3. Для интактных мышей резистентной к стафилококковой инфекции линии СБА, в отличии от чувствительной линии СЗНА«характерен еы-согай уровень пролиферации лимфоцитов и синтез интерлейкина' 2 в первичном ответе на цитоплазматический антиген стафилококка и высокий титр противостафилокскксвого опсонизирующего иммуноглобулина G1.

4. Зараженных мышей резистентной' к стафилококковой инфекции линии СБА отличает высокий уровень пролиферативной активности лимфоцитов и синтеза интерлейкинов 1 и 2 в ответ на цитоплазматический антиген .стафилококка.

5. Иммунный ствет Т клеток на цитоплазматический антиген, в тем числе их пролиферация и синтез ими интерлейкина 2 , у чувствительной к -стафилококковой инфекции линия СЗНА характеризуется Низкими значениями как до, так и после заражения. •

В. Гибриды первого поколения (CBAxCSHA)Fl наследуют восприимчивость к стафилококковой инфекции, способность лимфоцитов пролиФе-рировать и вырабатывать иктерлейкин 2 в реакции на цитоплазматический антиген по промежуточному типу (неполное доминирогзние). 7. Анализ выживаемости потомков возвратного скрещивания гибридов F1 с чувствительной и резистентной родительскими линиями указывает на полигенный характер наследования чувствительности к стафилококковой инфекции.

8. Бесклеточная стафилококковая вакцина симулирует in vitro пролиферацию лимфоцитов селезенки и выработку интерлейкинов 1 и 2 у интактных шеей.Показатели этих реакций у резистентных к стафилококковой инфекции мышей линии СВА достоверно выше, чем у мышей чувствительной линии СЗНА.

9. Однократная вакцинация мышей бесклеточной стафилококковой вакциной приводит к значительному усилению пролиферации клеток селезенки и выработки ими интерлейкинов 1 и 2, особенно у чувствительной к заражению линии СЗНА. Вакцинация увеличивает в 2 раза срок жизни мызей этой линии при заражении высокой дозой (109) S.aureus.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.Lindner'D. Р., Pobery I; А., Averbakh М.М.Morphologic characteristics of acute functional tension and "occidental" involution of the thymus.// 2 National congress of normal and pathological morphology. Bucharest.-1977.-P.167

2.Авербах М.М..Линднер Д.П..Поберий И.А., Сравнительное изучение патологических изменений в лимфоидных органах при различных формах воспаления-//Сб.: Патологическая анатомия тканевого метаболизма. М. 197В.- С.132-135

3. Линднер Д.П., Авербах М.М., Стеценко О.Н.,Поберий И. А. Динамикаструктурных'изменений органов иммунитета у кроликов при остром экспериментальном аппендиците.// Архив анатомии, гистологии И эмбриологиию-1979.-N7 .-С.58-65.

4. Авербах М.М., Переверзез А.И.Структура органов иммунитета при зкеперименатльном локализованном туберкулезе у кроликов. Сб. 2-я Всесоюзная научная конференция медицинских вузов по иммунологии туберкулеза.//М.1979.-С.113.

5.Галкин Ю.М., Авербах М.М. Операции тимэктомии и спленэкто-мии с использованием циакрилатного клея.// Бюлл.зкспер.би-ол..-1983.-N5.-C!103.

6.Гологорский. В.А., Гельфанд Б.Р., Авербах М.М. Почечно-пе-ченочный- синдром как компонент полиорганной недостаточности при инфекционно-токсическом шоке.// Сб.: Материалы 3 Всесоюзного съезда научного общества анестезиологов,реаниматологов. М. 1983.-С. 154-156.

7-Гологорский В.Д., Багдатьев В.Е., АЕерабх М.М. Почечио-печеночный синдром как комплексная полиорганнал недостаточность у больных с инфекцконно-токсическим коком. // Анестезиология и реаниматология. -1985. -N3. -С. 76-79.

З.Авербач М.М., Чижова Н.В. Морфологические изменения тимуса мышей при экспериментальной стафилококковой инфекции в условиях лечение иммунопрепаратами.// Сб. научых трудов 2 МЭЛГМИ им.Н.И.Пирогова"Патанатомия циркуляторных расстройств и нарушений .' тканевого гомеостаза".-1987.-С.73-76.

9.Чижова. Н.В., Авербах М.М. Морфологические .изменения лимфоузлов мышей при лечении экспериментального стафилококкового сепсиса иммунопрепаратами. Сб: 50 конференция молодо ученых Дагестана по медицине. Махачкала.-1988.- С. '50-51.

Ю.Авербах М.М., Апт А.С. Межлинейные различия в чувСтвл-тельности мышей к стафилококковой инфекции. Сб.трудов МОШКИ: Морфологические основы процессов адаптации и дисадапташи. М.1989.-С.137-139.

11.Авербах М.М., Миинев О.Д. Течение стафилококкового сепсиса на фоне экспериментальных иммунодефицитных состояний умы-шей.// 8 Всесоюзный съезд патологоанатомов. Тезисы докладов. Тбилиси. -1989.-С. 145.

12.Apt A.S. .Averbakh М.М. Strain variations in susceptibility to S.aureus.// 7-th International congress of immunology.Eer-. lln.-1989.-Ref.-H 1076.

13.Авербах М.М. Морфологические изменения внутренних органов мыпей, зараженных золотистым стафилококком на фоне неспецифеской блокады макрофагальной системы каррагиначом.// Всесоюзная конференция по сепсису.тезисы докладов.Тбилиси.-1990.-Т.1.-С.31-32.

М.Авербах ММ., Апт А.Стечение экспериментального стафилококкового сепсиса у оппозитных линий »алией и гибридов' первого поколения . //ЗНМЭИ. -1991, -И9. - С. 68-70.

15. "Мороз A.M., Никоненко Б.В., Авербах М.М. Врожденные имму-нодефицитные состояния у мыле Г: и возможности моделирования инфекционных заболеваний и болезней крови.// Сб. трудов института детской гематологии. М.-1993.-С.120-122.

16. Авербах М.М., Сапов В.<1>., Прохоров В.Я., Толоескзя К. Р., Апт А.С. Пролифератизный ответ на антигены золотистого стафилококка лимфоцитов мышей с оппознтной чувствительностью к стзфилс-

кокковой инфекции.// ЖМЭИ.-1995.-N1.-С.66-69.

17.Авербах М.М., Садов В.Ф., Прохоров В.Я., Демьяненко Н.В., Апт А.С. По;<азатели продукции интерлейкинов 1,2 и 4.и титры спе-цифичеких антител у мышей с опповитной чувствительностью к стафилококковой инфекции.// ЖМЭИ.-1906.-N2. - С.

13.Авербах М.М., СаловВ.Ф., Ефремова В.Н., Егорова Н.Б. Влияние стафилококковой бесклеточной вакцины на пролиферативную активность лимфоцитов.// ЖМЭИ.-1936.-N6.-реферат.

19. Авербах М.М., Садов В.Ф.. Агачьцова С.И., Прохоров В.Я., Апт А.С. Специфический пролиферативный ответ Т клеток селезенки мышей с оппозитной чувствительностью к стафилококкозой инфекции.// ЖМЗИ.-1996.-N6.- реферат.

■ 20.Азербач М.М., Апт А.С., Мороз A.M. Стафилококковая беск-леточнаэ вакцина как. потенциальное средство для иммунотерапии опухолей кроветворной системы.// Гематология и трансфузиоло-гия.-1996.-N2.-.реферат.

21. Averbakh M.M.Jr, Salov V.F..Avdienko V.S., Apt A.S. Manifestation of and immune responsiveness to systemic Staphylococcus aureus infection in genetically susceptible and resistant . H-2-matched mbuse strains.// Immunology.& Infect.Dis. in press.

22. Авербах М.М., Салов В.Ф. Структура ткани тимуса при специфическом и банальном воспалении' легких.// Молекулярные ochoeu ' патогенеза и диагностики туберкулеза и другой легочной патологии. Те&исы Докладов конференции Московского НИИ фтизиатрии МЗ РФ, 21-22 ноября 1995 г.- Москва.-,1995.-С.