Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунохимические и термодинамические свойства мышиных моноклональных антител



На правах рукописи

покидько

Юрий Николаевич

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЫШИНЫХ МОНОКЛОИАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997 г.

Работа выполнена в Научно-техническом Научный руководитель:

центре "Лекбиотех" АО "Биотехнология".

доктор биологических наук,

профессор

Р. Г. Василов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н. И. Дризе

доктор медицинских наук,

профессор

Л. П. Алексеев

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится 23 апреля 1997 г. в 14 час на заседании диссертационного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава России по адресу:

115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава России.

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л. С. Сеславина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Моноклональные антитела (мкАт) и их фрагменты широко используются как в качестве компонентов диагностических тест-систем, так и в виде лекарственных препаратов. Постоянному расширению их применения в значительной степени способствует всестороннее исследование структуры и свойств мкАт (Ес1. А. РасИап, 1994), а также комплексов мкАт-антиген (Я. М. МасСаИит и соавт., 1996).

Накопление новых знаний о структуре мкАт требует соответствующего переосмысления и углубления биофизического и физико-химического понимания процессов взаимодействия мкАт с антигенами. В общем виде современное представление о процессе взаимодействия было изложено отечественной биофизической школой еще в бСИ-70-х годах (М. В. Волькенштейн, 1981). Однако, кроме чисто теоретических аспектов, оно не нашло в то время применения и не получило в нашей стране дальнейшего развития. В настоящее время под взаимодействием, при общем его рассмотрении, понимают энергетически выгодное сближение стерически и электростатически комплементарных поверхностей, находящихся в строго определенном конформационном состоянии. Последнее, в свою очередь, определяется взаимодействием соответствующей физико-химической пространственной структуры с водной средой. При детальном рассмотрении процесса взаимодействия, его динамики, необходимо также учитывать и индуцирование сгерического и электростатического соответствия, т.е. взаимное влияние при сближении взаимодействующих компонентов и прилегающих к ним молекул водной среды (молекул воды и ионов).

При взаимодействии комплементарные эпитоп антигена и паратоп антитела притягивают друг друга на расстоянии в несколько нанометров и вступают в первичное связывание. Первичное связывание эпитоп-паратоп переходит к окончательному, обычно более сильному, вторичному связыванию в результате многоэтапного процесса. Энергия первичного связывания антиген-антитело может быть измерена по изменению энергии системы, достаточном для того, чтобы предотвратить связывание антитела с антигеном. Энергию вторичного связывания антиген-антитело можно считать эквивалентной энергии, которая необходима для диссоциации комплекса антиген-антитело. Методически трудно

определить, где заканчивается первичное связывание антигена с антителом и начинается вторичное (van Oss С. J., 1995).

В значительной мере эти трудности преодолеваются с помощью метода изотермической титрационной микрокалориметрии. Этот метод позволяет в одном динамическом эксперименте непосредственно измерить тепловые эффекты взаимодействия мкАт-антиген, рассчитать вклад термодинамических компонент в свободную энергию взаимодействия, оценить роль тех или иных сил в этом взаимодействии и образующиеся связи между взаимодействующими молекулами (D. R. Bundle, В. W. Sigurskjold, 1994). Важность расчета свободной энергии связывания заключается в том, что она, как термодинамический параметр, определяет течение процессов в системах с постоянной температурой и постоянным давлением. Именно таким системам, в наибольшей степени, соответствуют биологические системы. Система с постоянными температурой и давлением моделируется в рабочей ячейке изотермического титрационного микрокалориметра. Следовательно, метод изотермической титрационной микрокалориметрии является одним из немногих методов прямого изучения тонких механизмов и детальной энергетики процесса взаимодействия (I. Jclesarov и соавт., 1996).

В последнее время сформулированы также теоретические концепции по общим принципам функционирования белковых молекул, как кибернетических элементов живых клеток. По современным представлениям для функционирования белковьк контуров биологических систем необходимо два типа зависимостей "вход-выход": гиперболическая и сигмоидальная (D. Bray, 1995). Для молекулы иммуноглобулина "сигналом на входе" можно считать общую молярную концентрацию конкретного антигена, а "сигналом на выходе" является, по своей сути, тепловой эффект при изотермическом титровании (G. Bains, Е. Freire, 1991).

Гетерогенный иммуноферментный анализ (ИФА) связывания мкАт со специфическими антигенами и их структурными аналогами, в сочетании с точечным мутагенезом в антигенсвязывающем центре молекулы мкАт, позволяет качественно оценить влияние тех или иных групп атомов, как паратопа мкАт, так и эпитопа антигена, на связывание антиген-мкАт. В сочетании с изотермической титрационной микрокалориметрией можно оценить это влияние и количественно. Проведение точечного мутагенеза в антигенсвязывающем центре мкАт позволило повысить (в 1230 раз) константу

аффинности, за счет снижения константы скорости диссоциации (но не ассоциации), только в самое последнее время (R. Schier и соавт., 1996).

Однако, несмотря на огромный экспериментальный материал и оригинальные теоретические разработки, многие аспекты структурных и функциональных свойств молекулы мкАт остаются неясными.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состоит в изучении иммунохимических и термодинамических свойств мышиных моноклональных антител к низкомолекулярным антигенам для оптимизации их использования в диагностических тест-системах и в качестве детоксицирутощих медицинских препаратов.

В соответствии с намеченной целью в процессе работы предполагалось решение следующих задач:

1. Разработать комплекс иммунохимических и термодинамических методов исследования тонких механизмов и детальной энергетики взаимодействия мышиных моноклональных антител с низкомолекулярными антигенами.

2. Исследовать процесс специфического взаимодействия антитеофиллиновых мышиных мкАт 2G3, изотип IgG2a, с теофиллином, который широко применяется при лечении бронхиальной астмы (М. Weinberger, L. Hendeles, 1996).

3. Исследовать процесс специфического взаимодействия антидигоксиновых мышиных мкАт D18, изотип IgGl, и D22, изотип IgGl, с дигоксином, который широко применяется при лечении хронической сердечной недостаточности (The Digitalis Investigation Group, 1997).

4. Разработать подходы к оптимизации использования охарактеризованных термодинамически и иммунохимически мкАт при конструировании диагностических тест-систем и при создании детоксицирутощих медицинских препаратов.

Научная новизна.

Проведены исследования всего комплекса тепловых процессов, сопровождающих взаимодействие мышиных мкАт с ннзкомолекулярными антигенами, для мышиных мкАт

двух изотипов, IgGl и IgG2a, и для двух разных по химической структуре и физико-химическим свойствам низкомолекулярных антигенов, дигоксина и теофиллина.

Выявлены и представлены кинетическими моделями три различных механизма взаимодействия мышиных мкАт с низкомолекулярными антигенами: связывание по двум центрам (мкАт 2G3 с теофиплином), связывание по кривой Хилла с коэффициентом положительной кооперативное™, равным 2.56 ± 0.16 (мкАт D18 с дигоксином); линейно регрессионное связывание с образованием слабодиссоциирующего комплекса (мкАт D22 с дигоксином).

Обнаружено, что взаимодействие мкАт с низкомолекулярными антигенами представляет собой два процесса: собственно связывание низкомолекулярного антигена с антигенсвязывающим центром мкАт и конформационные изменения молекулы мкАт, которые индуцированы связыванием одного из антигенсвязывающих центров с низкомолекулярным антигеном.

Показано, что наблюдаемая в гетерогенном ИФА температурная зависимость эффекта усиления связывания мкАт с иммобилизованным антигеном при повышении концентрации свободного антигена ("hook-эффект") определяется направлением теплового процесса, отражающего конформационные изменения молекулы мкАт, которые индуцированы связыванием одного из антигенсвязывающих центров молекулы мкАт с низкомолекулярным антигеном.

Впервые на экспериментальном материале выявлено возможное функциональное значение наличия у молекулы мышиного мкАт класса G двух одинаковых антигенсвязывающих центров.

Прастическая значимость.

Проведенные исследования позволили дать конкретные рекомендации относительно того, какие из мкЛт к низкомолекулярным антигенам являются более пригодными по своим термодинамическим и иммунохимическим особенностям для разработки диагностических тест-систем, а какие - для разработки детоксицирующих препаратов.

Выявленные термодинамические и иммунохимические особенности мышиных мкАт значительно облегчили разработку иммуноферментной тест-системы для определения концентрации дигоксина и способствовали проведению лабораторных испытаний

медицинского препарата для снятия токсических эффектов высоких концентраций дигоксина.

Положения, выносимые на защиту:

1. Современный комплекс иммунохимических и термодинамических методов исследования динамического процесса взаимодействия мкАт с низкомолекулярными антигенами.

2. Детальный механизм и тонкая энергетика процесса образования иммунного комплекса антиген-антитело.

3. Оптимальное использование иммунохимических и термодинамических особенностей мкАт при разработке диагностических тест-систем и при создании детоксицирующих препаратов.

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы и 1 принята к печати. Материалы диссертации представлялись на 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических иммунологов, г.Москва, 1997 г.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, указатель цитируемой литературы. Содержит 8 таблиц и 28 рисунков. Библиография состоит из 198 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Мышиные мкАт продуцируются гибридомными линиями 2G3, D18 и D22, полученными в нашей лаборатории. Гибридомная линия 2G3 продуцирует высокоспецифичные мкАт к лекарственному веществу теофиллину, гибридомные линии D18 и D22 продуцируют высокоспецифичные мкАт к сердечному гликозиду дигоксину (N. P. Danilova,

1994). Ранее было показано, что антитсофиллиновые мкАт 2G3 относятся к изотипу IgG2a (N. P. Danilova, R. G. Vasilov, 1991), а антидигоксиновые мкАт D18 и D22 относятся к изотипу IgGl (H. П. Данилова и соавт., 1993).

Выделение и очистку мышиных мкАт проводили из асцитиой жидкости мышей линии BALB/c с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650М. Для мкАт 2G3 оптимальным был выбран солевой градиент NaCl 0:-300 мМ, для мкАт D18 и D22 - 0-5-100 мМ. Чистота всех выделенных мкАт контролировалась электрофорезом в 7.5% полиакриламвдном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Константы аффинности мкАт были определены ранее по методике Beatty (J. D. Beatty, 1987). Для мкАт 2G3 к теофиллину величина константы аффинности составила 2*10ю л/моль (N. P. Danilova, R. G. Vasilov, 1991), для mkAtD18 к дигоксину - 5*10® л/моль, для мкАт D22 к дигоксину - 9* 109 л/моль (Н. П. Данилова и соавт., 1993).

Конъюгирование мкАт с ферментом пероксидазой хрена проводили по единой схеме: 1мг псроксидазы хрена растворяли в 0.1 мл дистиллированной воды и добавляли 1 мг периодага натрия в 25 мкл дистиллированной воды. Смесь инкубировали 30 мин. в темноте при 25°С, пропускали через 0.5 см слой сефадекса G-25 и смешивали с 4 мг антител в 0.1 M карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9.5. Смесь инкубировали 3 часа при слабом перемешивании при 25°С, затем добавляли 0.1 мг боргидрида натрия, инкубировали 60 мин. при слабом перемешивании при 25°С и диализовали полученный конъюгат против забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР) в течение 2 часов при 4°С. Добавляли равный объем глицерина и хранили при -20°С до дальнейшего использования.

Иммунохимические свойства мкАт исследовали по температурной зависимости кривых ингибирования свободным антигеном связывания мкАт с сорбированным антигеном в гетерогенном ИФА. Готовили 10-кратные разведения антигена в ЗФР из

концентрированного раствора (1 мкг/мл). В лунки планшета с сорбированным конъюгатом антиген - бычий сывороточный альбумин (БСА) вносили по 20 мкл пробы с известным содержанием антигена. Конъюгат мкАт с пероксидазой хрена разводили в соотношении 1:10000 в ЗФР с добавлением 0.2% БСА и 0.05% Твин-20 и затем многоканальной пипеткой разливали в лунки планшета по 130 мкл в лунку. После инкубации в течение 60 мин раствор конъюгата мкАт удаляли, твердую фазу промывали дистиллированной водой и в каждую лунку добавляли по 150 мкл субстратного раствора, содержащего тетраметилбензидин и перекись водорода в натрий-цитратном буфере, рН 5.6. Через 10 мин реакцию останавливали добавлением в лунки по 150 мкл 4.8% серной кислоты и измеряли ферментативную активность спектрофотометрически по оппгческой плотности при 450 им.

Fab-фрагменты мкАт D18 получали методом ферментативного гидролиза папаином. К 0.5 мл раствора 20 мг/мл мкАт в 200 мМ фосфатном буфере, рН 7.4, добавляли цистеин до конечной концентрации 20 мМ и ЭДТА-натриевую соль до конечной концентрации 1 мМ. К полученной смеси прибавляли папайи из расчета 1 мг фермента на 100 мг мкАт и подвергали гидролизу при 37°С 3 часа при слабом перемешивании. Реакцию останавливали добавлением раствора иодуксусной кислоты до ЮмМ при 0°С. Результаты пиролиза определяли электрофорезом в 7.5% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. В качестве маркеров использовали тяжелые и легкие цепи антител. Конъюгировали с ферментом пероксидазой хрена аналогично нативным мкАт. Иммунохимические свойства исследовали, как у нативных мкАт.

Термодинамические свойства мкАт изучали методом изотермической титрационной микрокалориметрии. Исследование проводили путем изотермического титрования раствора мкАт раствором соответствующего низкомолекулярного антигена на микрокалориметре Thermal Activity Monitor (ТАМ) LKB 2277 (Thermometric, Швеция), калиброванном по стандартной химической реакции с известным тепловым эффектом. При методе изотермической титрационной микрокалориметрии в рабочей ячейке микрокалориметра поддерживается постоянство температуры с точностью до 10"4 "С. Это позволяет регистрировать происходящие в рабочей ячейке микрокалориметра тепловые процессы, как экзотермические, так и эндотермические, по количеству отводимой или подводимой теплоты к рабочей ячейке для поддержания в ней изотермических условий. Изотермическое титрование раствора мкАт раствором антигена выполнялось в двух сериях

экспсриментов: в первой серии использовался порционный режим подачи раствора антигена (30 мкл и 50 мкл), во второй - динамический режим непрерывной подачи раствора антигена со скоростью 0.2 мкл/с. Подача титрующего раствора антигена в первой серии экспериментов осуществлялась при помощи микронасоса Hamilton MicroLab (Thermometric, Швеция), во второй - насоса Minipulst (Setaram, Франция). Регистрация мощности, как скорости теплового потока, P3Kcn(t), мкВт=мкДж/с, и теплового потока Q3Kcn(t), мДж (мДж по причине использования 300-кратного усиления регистрируемого микрокалориметром сигнала), проводилась с частотой опроса 1 регистрация в секунду, сплайсинг не применялся. Расчет молярных концентраций мкАт и антигена проводили с учетом разбавления. Время включения насоса при динамическом титровании корректировали по времени начала регистрации сигнала, превышающего уровень шума на 50%, с последующей экспоненциальной аппроксимацией. Скорость работы насоса при динамическом титровании принимали за постоянную величину, калибровку насоса проводили по объему.

Расчет моделей зависимости экзотермического теплового эффекта собственно связывания от общей концентрации добавленного антигена проводили методом нелинейного регрессионного анализа по термограммам порционного изотермического титрования. Применяли стандартный метод расчета теплового эффекта по мощности теплового потока: тепловой эффект равен суммарной площади под кривой регистрируемой мощности теплового потока после добавления очередной порции раствора антигена, усреднение проводили по линейной регрессии начальной и конечной базовых линий. Качество модели определяли по сумме квадратов отклонений, значению R2 (0<R2^1, R2 =1 при абсолютной функциональной зависимости), устойчивости остатков при изменении направления аппроксимации (число "run''-тестов и соответствующее ему значение уровня значимости), величине F-критсрия Фишера. Оценку параметров выбранной модели проводили статистически (с вероятностью 95%) по методу нелинейного регрессионного анализа с получением асимптотических интервальных оценок. Данный подход является в настоящее время самым распространенным для строгого статистически обоснованного выбора модели и расчета ее параметров. Сравнение моделей проводили без предварительных допущений и предположений относительно исследуемой системы, общепринятую иерархию статистических критериев выбора наилучшей из моделей с разным числом параметров не изменяли.

Термодинамические параметры связывания - изменение свободной энергии связывания (AG), ее энтальпийной (АН) и энтропийной (AS) составляющих - рассчитывали (С. J. van Oss., 1995) по полученным значениям параметров модели связывания в предположении о равенстве значения константы ассоциации значению измеренной константы аффинности.

Детоксицнрукнцее действие антидигоксиновых мкАт D22 исследовали in vitro на изолированной полоске миокарда лягушек-самцов Rana temporaria и in vivo на морских свинках-самцах.

Эксперименты in vitro проводили на полукольце поперечного среза миокарда желудочка, фрагменты миокарда раздражали полем с помощью электростимулятора через 2 серебряных электрода. Длительность прямоугольных импульсов - 5 мс, амплитуда в 1.5-J-2 раза выше пороговой, базовая частота следования 0.5 Гц. Эксперименты проводили при комнатной температуре в условиях непрерывной перфузии фрагмента миокарда раствором Рингера. Сократительную активность изолированных полосок миокарда регистрировали в режиме, близком к изометрическому, с помощью механотрона 6-МХ1С. Обработке подвергались следующие параметры сократительного ответа: амплитуда сокращения, продолжительность фазы сокращения и расслабления, измеренная на 100% и на 50% уровнях от напряжения покоя, максимальная скорость сокращения и расслабления. Дигоксиновую интоксикацию вызывали добавлением в перфузирующий раствор юЛм дигоксина. После 60 мин добавления дигоксина в перфузирующий раствор добавляли 10~f'M антидигоксиновых мкАт D22. При статистической обработке полученные результаты нормировали по значениям соответствующих параметров сократительного ответа в контроле (величины всех измеряемых параметров сократительного ответа в контроле принимались за 100%). Сравнение проводили по t-критерию Стьюдента.

При экспериментах in vivo наркоз животного вызывали внутрибрюшинным введением нембутала в дозе 40 мг/кг веса животного, Дигоксиновую интоксикацию оценивали по изменению электрокардиограммы (ЭКГ) во II стандартном отведении с помощью электрокардиографа ЭК1К-01. ЭКГ записывали на ленте, движущейся со скоростью 50 мм/с. Изменения ЭКГ регистрировали на 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30 мин. Активность мкАт оценивали по их способности предотвращать характерные для дигоксиновой интоксикации изменения ЭКГ. Дигоксин вводили в бедренную вену в дозе 0.5

мг/кг веса животного в виде 0.025% раствора. Антидигоксиновые мкАт вводили в

бедренную вену на 5-й минуте после введения дигоксина: первой группе животных - 3 мг в 0.5 мл физиологического раствора (210'8М); второй группе - 12 мг в 0.5 мл физиологического раствора (8Ю"8М). Концентрацию свободного дигоксина в сыворотке крови опытных животных определяли методом гетерогенного ИФА после опыта и сравнивали с концентрацией дигоксина в сыворотке крови контрольных животных.

Результаты исследований и их обсуждение.

Температурную зависимость иммунохимических свойств мкАт исследовали по кривым ингибирования в гетерогенном ИФА при трех температурах инкубации: 4°С, 25°С, 45°С. Для мкАт 2G3 температурной зависимости не наблюдалось. Для мкАт D18 и D22 наблюдали обратную зависимость между измеренной оптической плотностью и температурой (рис.1) с оптимумом при 25°С. Для мкАт D18 и D22 наблюдали так называемый "hook-эффект" (усиление связывания с иммобилизованным на твердой фазе антигеном при увеличении концентрации свободного антигена). "Hook-эффект" был значительно более выражен для мкАт D18 и наблюдали его прямую температурную зависимость, для мкАт D22 наблюдали слабую обратную температурную зависимость выраженности "hook-эффекга" (рис.1).

Качественное рассмотрение полученных термограмм взаимодействия антитело-антиген, общая кинетическая схема которого представлена на рис.2.

Термограммы взаимодействия антитеофиллиновых мышиных мкАт 2G3, изогип IgG2a, с тсофнллнном (рис.3 и рис.6) свидетельствовали о резком отличии первого пика от последующих при порционном титровании (рис.3). Аналогичный результат был получен и при динамическом титровании (рис.б). Термограммы динамического титрования характеризовались на начальном этапе подачи раствора антигена плавным увеличением скорости тепловыделения. Это свидетельствовало об экзотермическом характере процесса взаимодействия мкАт 2G3 с теофиллином при значительном превышении общей молярной концентрации мкАт в сравнении с общей молярной концентрацией теофиллина. Этот участок соответствовал низкой насыщенности мкАт антигеном. При дальнейшем увеличении концентрации антигена, как при порционном (рис.3), так и при динамическом

--0-- (при 4 С) —О— (при 25 °С) л. .. (при 45 °С)

°°4V/"—1 ■ 1 ■

ООО« 0.001 00«

Рис.2. Общая схема кинетики связывания антитела (Ат) и антигена (Аг). к12 и к23 -константы скорости ассоциации комплексов АтАг и Ат(Аг)2, соответственно; к21 и к32 -константы скорости диссоциации комплексов АтАг и Ат(Аг)2, соответственно.

концентрация дигоксина, нг/мл

Рис.1. Температурная зависимость иммунохимических свойств

мышиных мкАт D18 (а) и D22 (б) в гетерогенном ИФА.

титровании (рис.6), скорость теплового потока резко изменялась после того, как отношение общей молярной концентрации теофиллина к общей молярной концентрации мкАт 203 достигало определенного значения. Для подтверждения этого эксперименты динамического титрования были выполнены при разных начальных концентрациях мкАт в ячейке микрокалориметра и антигена в системе микронасоса, а также при разной скорости подачи раствора антигена. При проведении химической калибровки по стандартной химической реакции с известным тепловым эффектом было показано, что скорость реакции микрокалориметра на изменение теплового потока превышает скорость стандартной химической реакции, а, следовательно, и скорость взаимодействия антиген-антитело.

Па основании полученных термограмм сделали вывод, что резкое изменение скорости теплового потока вызвано протекающим в ячейке микрокалориметра процессом взаимодействия молекул мкАт 2вЗ с молекулами теофиллина. Профиль термограмм соответствовал профилю алгебраической модели для независимых идентичных центров связывания на молекуле мкАт в области эквимолярных концентраций. В этой области в модели для связывания с высокой константой скорости ассоциации происходит

время от начала зксперимента по титрованию, с

Рис.3. Изотермическое порционное титрование антитеофиллиновых мкАт 203,раствором теофиллина при температуре 25°С (а) и развернутое изображение участка, отмеченного пунктирной линией (б). Стрелками отмечены моменты подачи порций раствора теофиллина.

время от начала эксперимента по титрованию, с

Рис.4. Изотермическое порционное титрование антидигоксиновых мкАт D18, IgGl, раствором дигоксина при температуре 25°С. Стрелками отмечены моменты подачи порций раствора дигоксина.

е

g 20.

0 20000 40000 GOOOO 80000 100000

время от начала эксперимента по титрованию, с

Рис.5. Изотермическое порционное титрование антидигоксиновых мкАт 1)22, 1ёСг1, раствором дигоксина при температуре 25°С. Стрелками отмечены моменты подачи порций раствора дигоксина.

0 12 3 4

otmoujw«« общих мспцлък жмцЕИтрацй теофилгам и иАт

Рис.6. Изотермическое динамическое титрование антитеофиллиновых мкАт 2G3, IgG2a, раствором теофиллина при температуре 37°С.

Iе: \

* \ I \

* -40 - \

I -60-

-«о- ^

0 0 0 5 1.0 1.5 2 0 2 5 имиви сйцих игяц*ы< К;>»г>ди-сжсмв и мкАт

Рис.7. Изотермическое динамическое титрование антидигоксиновых мкАт D18, IgGl, раствором дигоксина при температуре 37°С.

16 -

Рис.8. Изотермическое динамическое титрование антидигоксиновых мкАт D22, IgGl, раствором дигоксина при температуре 37°С.

огюиюми* с&цк* моляркь« И0Н1|№Г9М»*« дигоксина и мкАт

"переключение" скорости реакции с лимитирования одним исходным компонентом на лимитирование другим исходным компонентом. Однако, в экспериментальных термограммах изотермического титрования мкАт 203 теофиллином это наблюдалось при общих молярных концентрациях теофиллина приблизительно в 10 раз ниже эквимолярных. Кроме того, данный профиль был характерен для второго и последующих (до области зквимолярности) пиков при порционном титровании. Это свидетельствовало о том, что переключение процесса взаимодействия мкАт 2вЗ с теофиллином происходило: 1) независимо от исходных концентраций, скорости подачи антигена, разбавления мкАт; 2) при определенном насыщении молекул мкАт молекулами антигена; 3) при возобновлении подачи раствора антигена после достижения системой мкАт-антиген квазистационарного состояния. Эго позволило сделать вывод, что мкАт 203 взаимодействуют с теофиллином по одному связывающему центру, а когда концентрация комплексов мкАт 203-тсофшшин (рис.2) достигает определенного уровня, более предпочтительным становится взаимодействие свободного антигена по второму, свободному, антигенсвязывающему центру на комплексе мкЛт 203-теофиллин с образованием комплекса 203-(теофиллин)2. Это происходит несмотря на присутствие молекул свободных мкАт 2СЗ. Квазистационарное состояние при порционном титровании устанавливается в условиях преобладания концентраций свободных мкАт 203, свободного теофиллина и комплексов мкАт 203-(теофшшин)2 над концентрацией комплекса мкАт 203-теофиллин. При возобновлении подачи раствора антигена наблюдаемый экзотермический процесс отражает связывание вновь поступающего свободного антигена со свободными мкАт 203. Концентрация комплекса мкАт 203-теофиллин увеличивается до определенного значения, при котором происходит аналогичное переключение процесса взаимодействия, что и регистрировалось микрокалориметром (рис. 3). Эго наблюдалось, пока общая молярная концентрация антигена в ячейке была меньше общей молярной концентрации мкАт. После области эквимолярносги при дальнейшем увеличении общей концентрации антигена на термограмме регистрировался только экзотермический процесс, что свидетельствовало о продолжении связывания и увеличении равновесных концентраций комплексов мкАт 203-антиген (увеличение концентрации свободного теофиллина в условиях обратимости взаимодействия антиген-антитело смещало реакцию (рис.2) в сторону образования конечных соединений - комплексов мкАт 2вЗ с теофиллином).

При динамической подаче раствора теофиллина также наблюдалось несколько переключений (рис. 6). В этом случае они были связаны с тем, что взаимодействие свободного теофиллина и комплекса мкАт 203-теофиллин, в результате чего образовывался комплекс мкАт 203-(теофиллин)2, приводило к снижению концентраций комплекса мкАт 203-теофиллин и свободного теофиллина (рис.2). Снижение концентрации комплекса мкАт 203-тсофиллин в результате этого взаимодействия, с одной стороны, и увеличение концентрации свободного теофиллина за счет его подкачки, с другой стороны, приводило к переключению на взаимодействие свободного теофиллина со свободными мкАт 2G3. В результате этого происходило увеличение концентрации комплекса мкАт 203-теофиллин с последующим переключением на взаимодействие комплекса мкАт 203-теофиллин по второму связывающему центру со свободным теофиллином. Процессы такого типа наблюдаются в системах с отрицательной обратной связью. В данном случае она реализуется наличием: промежуточного переключателя - комплекса мкАт 203-теофи;ишн; контролирующего соединения - свободного теофиллина; непрерывную подачу которого можно рассматривать как своего рода переключатель (М. В. Волькенштейн, 1981).

Термогряммы взаимодействия антидигоксиновых мкАт D18, изотип IgGl, с дигоксином (рис.4 и рис.7) свидетельствовали о том, что взаимодействие мкАт D18 с антигеном, как и для мкАт 2G3, являлось экзотермическим процессом. Такой характер взаимодействия наблюдался до точки эквимолярности общих концентраций антигена и мкАт (рис.4). В точке эквимолярности накладывался еще один, эндотермический по характеру, процесс, однако профиль термограмм был отличен от профиля термо1рамм взаимодействия мкАт 2G3 с теофиллином (рис.3). Было высказано предположение о том, что на начальном участке изотермического порционного титрования антидигоксиновые мкАт D18 взаимодействуют с дигоксином по одному связывающему центру (рис.4), после чего в системе мкАт-антигеп происходит эндотермический процесс (рис.4). Интегральная кривая взаимодействия (рис.7) внешне сходна с сигмоидальной зависимостью (называется также кривой Больцмана и является дифференциалом кривой распределения Больцмана), характерной для кооперативных процессов взаимодействия. При дальнейшей подаче порций раствора дигоксина наблюдалось снижение теплового эффекта взаимодействия до полного слияния с "белым шумом" микрокалориметра (рис.4).

На термограммах динамического титрования (рис.7) наблюдались колебания скорости теплового эффекта взаимодействия антидигоксиновых мкАт D18 с дигоксином. Профиль колебаний резко отличался от наблюдаемого при взаимодействии антитеофиллиновых мкАт 203-теофиллин (рис.6). В случае антидигоксиновых мкАт D18 наблюдаемые колебания были вызваны неравномерностью скорости взаимодействия в реакционном объеме, поскольку перемешивание происходит с конечной скоростью и достигаемое в системе с перемешиванием равновесие является динамическим. Аналогичные колебания также наблюдались при регистрации теплового эффекта стандартной химической реакции и характерны как для химических, так и для биологических систем в целом.

Наличие в системе отрицательной обратной связи делает неустойчивую систему устойчивой (Волькенштейн, 1981). В системе, где взаимодействуют антидигоксиновыс мкАт D18 с дигоксином, отрицательной обратной связи нет. Наблюдались колебания скорости теплового эффекта, частота которых определялась скоростью перемешивания, и система периодически достигала неустойчивого динамического равновесия (рис.7). В системе же с отрицательной обратной связью, где с антигеном взаимодействовало два связывающих центра антитеофиллиновых мкАт 2G3, система стремилась достичь устойчивого равновесия (рис.6). Это объясняет сходство профилей скорости теплового эффекта взаимодействия при порционном и динамическом титровании, наблюдавшееся при взаимодействии антитеофиллиновых мкАт 2G3 с теофиллином (рис. 3 и рис. 6).

Термограммы взаимодействия антидигоксиновых мкАт D22, изотип IgGl, с дигоксином (рис.5 и рис.8) сходны с термограммами для мкАт D18 в точке эквимолярности (рис.4). При взаимодействии мкАт D22 с дигоксином регистрировавшийся тепловой эффект связывания с антигеном сопровождался другим экзотермическим процессом (рис.5 и рис.8). После взаимодействия с дигоксином по одному из антигенсвязывающих центров молекула мкАт D22 претерпевала структурные изменения, которые сопровождались выделением теплоты. Увеличение концентрации дигоксина в микрокалориметрической ячейке после достижения соотношения общих молярных концентраций дигоксин/мкАт, приблизительно равного 4:1, не сопровождалось тепловыми эффектами (рис.8), несмотря на смещение реакции связывания антитело-антиген (рис.2) в сторону увеличения концентрации комплексов. Экзотермический характер обеих составляющих процесса взаимодействия мкАт

D22 с дигоксином привел к затруднению процесса диссоциации образовавшихся комплексов мкАт Ш2-(дигоксин)з.

Подводя итог качественному рассмотрению микрокалориметрических результатов по тепловым эффектам взаимодействия трех различных мышиных мкАт с низкомолекулярными антигенами, можно сказать следующее:

Тепловой эффект взаимодействия мышиных мкАт с низкомолекулярными антигенами является отражением двух термодинамических процессов.

Первый термодинамический процесс определяется собственно связыванием антигенсвязывающих центров мкАт со специфическим низкомолекулярным антигеном. Во всех исследованных случаях - для мышиных иммуноглобулинов двух изотипов, IgGl и IgG2a, и для двух разных по химической структуре и физико-химическим свойствам низкомолекулярных антигенов, теофиллина и дигоксина, - он является экзотермическим, сопровождается выделением тепла и снижением внутренней энергии системы мкАт-антиген.

Второй термодинамический процесс различен по характеру для трех исследованных взаимодействий мкАт-антиген.

При взаимодействии антитеофиллиновых мышиных мкАт 2G3, изотлп IgG2a, с теофиллином процесс является эндотермическим и начинается при значительном превышении общей молярной концентрации мкАт по сравнению с общей молярной концентрацией теофиллина.

При взаимодействии антидигоксиновых мышиных мкАт D18, изотип IgGl, с дигоксином процесс также является эндотермическим, но наблюдается в области эквимолярного соотношения общих молярных концентраций мкАтШ8 и дигоксина.

При взаимодействии антидигоксиновых мышиных мкАт D22, изотип IgGl, с дигоксином процесс является экзотермическим и начинается при значительном превышении общей молярной концентрации мкАт D22 по сравнению с общей молярной концентрацией дигоксина.

Сравнение иммунохимических и термодинамических свойств мышиных мкАт

При сравнении результатов микрокалориметрического титрования и результатов гетерогенного ИФА было обнаружено, что температурная зависимость иммунохимических

свойств исследуемых мкЛт (рис.1) определяется направлением двух термодинамических процессов теплового эффекта взаимодействия антиген-мкАт. Экзотермический характер первого термодинамического процесса определяет наблюдаемую температурную зависимость связывания мкАт D18 и D22 с иммобилизованным airrarenoM (при 4°С выше, чем при 45°С, оптимум при 25°С), а характер второго термодинамического процесса определяет температурную зависимость выраженности наблюдаемого "hook-эффекта" (рис.1).

При взаимодействии мкАт 2G3 с теофиллином разнонаправлснность и синхронность термодинамических процессов взаимодействия обусловила температурную независимость связывания в гетерогенном ИФА и отсутствие "hook-эффекта". Следует также заметить, что устойчивость в гетерогенном ИФА является отражением наличия в системе взаимодействующих мкАт 2G3 и теофиллина отрицательной обратной связи.

Модели собственно связывания мкАт с антигеном

Выбранные по методу нелинейного регрессионного анализа модели и их параметрические уравнения представлены на рис.9-11. Для параметров моделей были рассчитаны статистические, на 95% доверительном интервале, оценки и критерии качества.

Модель связывания мкАт 2G3 с теофиллином (рис.9) описывает связывание по двум антигенсвязывающим центрам и характерна для систем, кинетическое равновесие в которых устанавливается между свободными мкАт, свободным антигеном и комплексом мкАт-(антиген)2 при стремящейся к нулю концентрации комплекса мкАт-(антиген)!. Модель связывания мкАт D18 с дигоксином (рис.10) описывает связывание по кривой Хилла с наклоном и свидетельствует о связывании по двум антигенсвязывающим центрам при наличии эффекта кооперативное™ (в данном случае положительной). Модель Хилла с положительной кооперативностыо предполагает, что при достижении общей концентрацией антигена некоторого "порогового" значения происходит резкое увеличение теплового эффекта связывания. По-видимому, это увеличение достигается за счет связывания молекул свободного дигоксина с комплексом мкАт DlS-дигоксин по второму дигоксин-связывающему центру с образованием комплекса мкАт Ш8-(дигоксин)г.

Модель связывания мкАт D22 с дигоксином (рис. 11) - уравнение линейной регрессии - свидетельствует об относительной независимости связывания мкАт D22 с дигоксином от

' + ^махс2 '

где X - общая концентрация теофиллина, Вмакс1 и Вмакс2 - тепловой эффект при максимальном связывании по первому и второму антигенсвязывающим центрам мкАт, соответственно, Кдисс1 и Кдисс2 -общие концентрации теофиллина, необходимые для достижения полумаксимального связывания по первому и второму антигенсвязывающим центрам мкАт, соответственно. Рис.9. Экспериментальная зависимость экзотермического теплового эффекта связывания мышиных мкАт 203 с тсофиллином от общей концентрации теофиллина (*), выбранная по методу нелинейной регрессии модель связывания (—) и уравнение модели.

макс ~ ^мин )_

25 50 75

общая концентрация теофиллина, нмоль/л

Q.

кДж/моль

401

30

20

10

+ ■

-&5

-&0

-75

-7.0

логарифм общей концентрации дигоксина.

1 + Х)*Н1ПХ1оре) '

где X - логарифм общей конце1гграции дигоксина, У - тепловой эффект, имеющий начало в Умин и продолжающийся сигмоидально до Умакс, ЕС50 - общая концентрация дигоксина, соответствующая полумаксималыюму тепловому эффету, НШБЬре - коэффициент Хилла, характеризующий степень кооперативности, равен 2.56 + 0.16.

Рис.10. Экспериментальная зависимость экзотермического теплового эффекта связывания мышиных мкАт D18 с дигоксином от общей концентрации дигоксина (*) и выбранная по методу нелинейной регрессии модель связывания (—) и уравнение модели.

У = а + Ъ-Х,

где У - тепловой эффект, X - общая концентрация дигоксина, а и Ь -соответствующие параметры уравнения линейной регрессии.

100 200 300

обща! концентрация дигоксина, нхопь/л

Рис.11. Экспериментальная зависимость экзотермического теплового эффекта связывания мышиных мкАт D22 с дигоксином от общей концентрации дигоксина (*) и выбранная по методу нелинейной регрессии модель связывания (—) и уравнение модели.

шменения общей концентрации дигоксина. Такая зависимость характерна для слабодиссоциирующих комплексов.

Термодинамические параметры связывания

Расчет термодинамических параметров связывания по параметрам полученных моделей для собственно связывания показал, что связывание мкАт 2G3 с теофиллином -смешанный процесс со значительным преобладанием энтропийной составляющей свободной энергии связывания, связывание мкАт D18 с дигоксином - смешанный процесс со значительным преобладанием энтальпийной составляющей свободной энергии связывания, связывание мкАт D22 с дигоксином - энтальпийно-зависимый процесс.

Сравнение кинетических и термодинамических особенностей взаимодействия мышиных мкАт с низкомолекулярпыми антигенами

При сопоставлении моделей связывания, выбранных методом нелинейного регрессионного анализа для собственно связывания (первого термодинамического процесса взаимодействия), со вторым термодинамическим процессом взаимодействия обнаружено:

1. экзотермический характер второго термодинамического процесса взаимодействия мкАт D22 с дигоксином определяет слабую способность к диссоциации образующегося комплекса мкАт 1)22-дигокснн и относительную независимость связывания от соотношения общих молярных концентраций дигоксина и мкАт D22;

2. эндотермический характер второго термодинамического процесса взаимодействия мкАт 2G3 с теофиллином и развитие процесса при значительном превышении общей молярной концентрации мкАт по сравнению с общей молярной концентрацией теофиллина вместе с полученной моделью связывания по двум центрам свидетельствуют о том, что вторая компонента является отражением информационных изменений молекулы мкАт 2G3. Конформационные изменения индуцированы связыванием с теофиллином по одному из связывающих центров мкАт и приводят к повышению связывающей способности второго, пока еще свободного, тсофиллин-связывающего центра мкАт 2G3 с теофиллином при значительном превышении общей молярной концентрации мкАт 2G3 по сравнению с общей молярной концентрацией теофиллина;

3. эндотермический характер второго термодинамического процесса взаимодействия

мкАт D18 с дигоксином и развитие процесса в области эквимолярных общих концентраций мкАт и дигоксина вместе с полученной моделью связывания по кривой Хилла с наклоном и положительной кооперативностью свидетельствуют о том, что второй процесс является отражением конформационных изменений молекулы мкАт D18. Конформационные изменения индуцированы связыванием с дигоксином по одному из связывающих центров мкАт и приводят к лавинообразному (HillSlope=2.56±0.16) связыванию по второму, пока еще свободному, связывающему центру мкАт с дигоксином в области эквимолярных общих концентраций мкАт и дигоксина. Сделанный вывод согласуется с результатами гетерогенного ИФА, и лавинообразность повышения связывания является причиной наблюдения "hook-эффекта" на кривых ингибирования свободным дигоксином связывания мкАт с иммобилизованным дигоксином (рис. 1).

Рекомендации практического характера

При использовании в гетерогенном ИФА Fab-фрагментов мкАт D18 "hook-эффект" не наблюдался. Следовательно, иммуноферментную тест-систему для определения концентрации дигоксина в сыворотке крови целесообразнее разрабатывать на основе Fab-фрагмеитов мкАт D18, чем на целых молекулах мкАт D18.

Особенность мышиных мкАт D22 образовывать с дигоксином слабодиссоциирующий комплекс позволяет разработать на их основе эффективный медицинский препарат для детоксикации при отравлениях дигоксином. Лабораторная часть такой разработки была выполнена в экспериментах in vitro на изолированных полосках миокарда лягушки и in vivo на целом животном (морские свинки). При экспериментах in vitro на фоне выраженного токсического эффекта, вызванного добавлением в перфузирующий раствор Ю^М дигоксина, введение мкАт D22 в концентрации Ю^М приводило к постепенному восстановленшо амплитуды сокращений полоски миокарда в среднем до 87.1 + 4.3 (в % от контроля, Р<0.05). Это сопровождалось возрастанием максимальной скорости сокращения и расслабления до 99.3 ± 4.5 и 96.0 ± 4.0 (в % от контроля), соответственно (Р<0.05). В экспериментах in vivo при введении, на фоне выраженного токсического эффекта дигоксина, 0.5 мл раствора с 3 мг мкАт D22 (2-10"8М) отмечалась тенденция к восстановлению частоты сердечных сокращений, исчезали единичные экстрасистолы, восстанавливалась проводимость и величина амшпггуды ST, форма комплекса QRS возвращалась к нормальной. Концентрация

свободного дигоксина в сыворотке крови морской свинки снижалась после введения мкАт с 0.2-Ю.4 мкг/мл до 0.015-^0.03 мкг/мл. Полученные результаты показали высокую эффективность дегоксицирующего действия мкАт Т)22.

Все основные выявленные иммунохимические и термодинамические свойства исследованных мышиных мкАт к низкомолекулярным антигенам, особенности их взаимодействия с соответствующими низкомолекулярными антигенами и рекомендации практического характера представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица А. Иммунохимические и термодинамические свойства исследованных мышиных

мкАт к низкомолекулярным антигенам.

мкАт Изотвл Антиген Влияние температуры на характер кривой ингибирования в гетерогенном ИФА Собственно связывание

характер процесса модель связывания характер свободной энергии связывания

203 дога теофиллин "Ьоок-эффскт" вс наблюдается экзотермический по двум цсшрам смешанный с преобладанием энтропийной составляющей

018 дигоксин прямая зависимость выраженности "Ьоок-эффекга" экзотермический кривая Хилла с наклоном, неоперативность положительная смешанный с преобладанием эпталышйной составляющей

022 ДИГОКСИП обратная зависимость выражеииосги "Ьоок-эффскта" экзотермический линейно-регрессионная энталышйно-зависимый

Таблица 2. Особенности взаимодействия исследованных мышиных мкАт с соответствующим!

низкомолекулярными антигенами и рекомендации практического характера.

мкАт Конформадионные изменения молекулы мкАт, индуцированные связыванием с антигеном (Аг) Общие особенности мкАт в процессе взаимодействия с Аг Возможное функциональное значение особенностей молекулы антитела (Ат) Рекомендации практического характера

характер процесса зависимость от общих молярных концентраций

2ЭЗ эндотермический наблюдаются пра [мкАт|»[Аг] отрицательная обратная связь, "работают по возмущению" поступающий Аг осуществляет отбор Ат с наивысшей константой скорости ассоциации диагностические тест-системы

эндотермический, "лавинообразный" наблюдаются при [мкАт]»[Аг] принцип "все-или-ничего", "работают по отклонению" Ат поддерживают эквимолярное равновесие с имеющимся Аг РаЬ-фрагмепгы в диагностических тест-системах

Ш2 экзотермический наблюдаются при [мхАт| »[Аг] "работают только в одном направлении" Ат связываются с Аг с образованием слабодиссоциирующего комплекса детоксицируюгцие препараты

-23 -ВЫВОДЫ

1. Разработан комплекс термодинамических и иммунохимических методов исследования тонких механизмов и детальной энергетики взаимодействия моноклональных антител с низкомолекулярными антигенами. Установлена последовательность событий на уровне конформационных изменений молекулы моноклоналыюго антитела, которые могут носить как экзотермический, так и эндотермический характер. Происходящие конформационные изменения определяют дальнейшую кинетику связывания моноклонального антитела с низкомолекулярным антигеном.

2. При взаимодействии теофиллина с антитеофиллиновыми моноклональными антителами 2G3, IgG2a, конформационные изменения, эндотермические по характеру и протекающие при преобладании общей молярной концентрации антител над общей молярной концентрацией теофиллина, приводят к повышению константы скорости ассоциации второго антигенсвязывающего центра молекулы антитела. Это определяет кинетику связывания по двум антигенсвязывающим центрам.

3. При взаимодействии дигоксина с антидигоксиновыми моноклональными антителами D22, IgGl, и D18, IgGl, конформационные изменения имеют экзотермический и эндотермический характер, соответственно. Экзотермический характер конформационных изменений, которые протекают при преобладании общей молярной концентрации антител над общей молярной концентрацией дигоксина, определяет образование слабодиссоциирующего комплекса антитело 022-дигоксин. Эндотермический характер конформационных изменений, которые протекают при приблизительном равенстве общих молярных концентраций антител и дигоксина, определяет кинетику связывания моноклональных антител D18 с дигоксином по кривой Хилла. Коэффициент положительной кооперативности равен 2.56 ± 0.16. Высокая положительная кооперативность отражается на кривых ингибирования в гетерогенном ИФА в виде "hook-эффекта".

4. Использование Fab-фрагментов моноклональных антител D18 в иммуноферментной тест-системе для определения дигоксина в сыворотке крови вместо целых антидигокешювых антител D18 позволяет избежать "hook-эффекта" на кривых ингибирования при гетерогенном ИФА. Наиболее эффективна по термодинамическим и иммунохимическим свойствам для конструирования диагностических тест-систем целая молекула моноклоналыюго антитела 2G3, IgG2a, связывающаяся с теофиллином по двум

теофиллин-связывающим центрам, что способствует повышению стабильности и чувствительности тест-системы.

5. Моноклональные аититела В22, образующие с дигоксином слабодиссоциирующий комплекс, наиболее эффективны по термодинамическим и иммунохимическим свойствам для создания детоксицирующих препаратов. Лабораторные испытания моноклональных антител Э22 по снятию токсических эффектов высоких концентраций сердечного гликозида дигоксина показали возможность разработки на их основе высокоэффективного детоксицирующего медицинского препарата.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Микрокалоримстрическое исследование связывания антидигоксиновых мышиных моноклональных антител 1)22 с дигоксином. - Вестн.Моск.Ун-та. сер.16. Биология. 1996. №3. с.13-17 (соавт. Кондратьева И. А., Василов Р. Г.).

2. Взаимодействие моноклональных антидигоксиновых антител и их фрагментов с иммобилизованным антигеном. - Сборник трудов 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических иммунологов, Москва, Россия. 28-31 января. 1997. с.295 (соавт. МнасинаЕ. Е., Василов Р. Г.).

3. Взаимодействие мышиных с низкомолекулярными антигенами: кинетика и термодинамика. - Сборник трудов 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических иммунологов, Москва, Россия. 28-31 января. 1997. с.306 (соавт. Мнасина Е. Е., Василов Р. Г.)

4. Гетерогенный иммуноферментный анализ дигоксина с использованием Ь'аЬ-фрагментов моноклональных антител. - Хим.-фарм.журнал (принято к печати) (соавт. Мнасина Е. Е., Данилова Н. П., Василов Р. Г.).