Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Химиотерапия резистентных форм хронического лимфолейкоза с учетом результатов чувствительности опухолевых клеток in vitro

Направахрукописи

Катаева Елена Васильевна

Химиотерапия резистентных форм хронического лимфолейкоза с учетом результатов чувствительности опухолевых клеток in vitro

14.00.29 — Гематология и переливание крови 14.00.14. - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва 2004

Работа выполнена в Московском областном научно-] институте им. М.Ф. Владимирского

■исследовательском клиническом

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор А. К. Голенков

доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.Г. Ковалева

доктор медицинских наук, профессор С А. Маякова

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследовательский институт детской гематологии МЗ РФ

Защита состоится " "_2004 года в " " часов на заседании

диссертационного совета Д 001.042.01 в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр РАМН по адресу: 125167 г. Москва, Новый Зыковский проезд, 4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН

Автореферат разослан " "_2004г.

кандидат биологических наук

В.Д. Реук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Лечение резистентных форм хронического лимфолейкоза является актуальной проблемой для клинической гематологии.

Больные хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), как правило, отвечают на первичную терапию хлорамбуцилом, но через некоторое время становятся рефрактерными к лечению (Foon at al, 1990; Cheson V.D., 1995). С началом применения пуриновых аналогов в терапии ХЛЛ значительно улучшились результаты лечения больных. Однако, клиническая резистентность к флюдарабину отмечается у 22-30% первичных больных ХЛЛ (Bowen at al, 1999; Julliusson G., 1997). Установлено, что при терапии флюдарабином наблюдается высокая корреляция между ответом на химиотерапию (XT) и наличием предшествующего лечения: 83% ответивших среди первичных больных и только от 12 до 57% среди тех, кто уже лечился ранее (Montserrat E. and Rozman С, 1994).

В связи с этим, представляется важным поиск путей преодоления лекарственной резистентности. Один из вариантов связан с применением программной полихимиотерапии (ПХТ). Используются новые комбинации противоопухолевых препаратов такие, как флюдарабин, циклофосфан, митоксантрон (Laptalo at al, 2002; Schmitt at al, 2002; Bowen at al, 1999), флюдарабин с пентостатином ( Jajeh at al, 2002), хлорамбуцил с эпирубицином (Catovsky at al, 1998), сочетания цитостатических лекарств и моноклональных антител (Rossini at al, 1999; Del Poeta, 2002) или значительно увеличиваются дозы цитостатиков ( Weiss at al, 2002). Такое лечение ведет к усилению миелотоксичности и иммуносупрессии, способствует развитию инфекционных осложнений и нуждается в адекватной . сопроводительной терапии, значительно ухудшая качество жизни таких больных.

Другой путь - применение модуляторов резистентности, препаратов обладающих способностью подавлять механизмы, ответственные за развитие устойчивости, в частности, таких, как циклоспорин (Cabrelle at al, 2002), верапамил (Twentyman, 1997) и их аналоги. Однако, токсичность модификаторов резистентности ограничивает их широкое клиническое применение.

В связи с этим, особый интерес представляет изучение клинического значения -чувствительности опухолевых клеток к различным химиопрепаратам (ХП) in vitro MTT-методом с целью осуществления детерминированного подхода в лечении рефрактерных форм ХЛЛ. В литературе имеется немало сообщений о том, что МТТ-анализ позволяет выявить взаимосвязь между чувствительностью опухолевых клеток к ХП in vitro и клиническим ответом (Morabito at al, 1998; Silber, 1994). Это дает возможность использовать МТТ-метод как моделирующую систему для изучения действия различных цитостатиков на

клетки опухоли в культуре, как новых, так и широко неиспользуемых препаратов в терапии ХЛЛ (Pepper at al, 2003; De Vries at al, 2003; Bosanquet at al,2002).

Однако, многие вопросы изучения чувствительности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам в МТТ-тесте, клинической эффективности детерминированного лечения при рефрактерных формах ХЛЛ, остаются неосвещенными в литературе, что и послужило основанием для настоящего исследования.

Цель исследования: повысить эффективность лечения резистентных больных хроническим лимфолейкозом с использованием результатов чувствительности опухолевых клеток в МТГ-тесте in vitro.

Задачи исследования..

1. Провести скрининг чувствительности опухолевых клеток к цнтостатикам в МТТ-тесте in vitro у рефрактерных больных хроническим лимфолейкозом для выявления наиболее активных противоопухолевых препаратов.

2. Изучить фармакодинамические характеристики выбранных препаратов в культуре -опухолевых клеток для дальнейшего назначения оптимального лечения.

3. Провести клинический анализ результатов лечения резистентных форм хронического лимфолейкоза в соответствии с данными фармакодинамического моделирования in vitro.

Научная новизна..

В результате проведенного скрининга чувствительности опухолевых клеток резистентных больных хроническим лимфодейкозом к шггостатическим препаратам в МТТ-тесте in vitro выявлены препараты, проявляющие высокую противоопухолевую активность.

Изученные фармакодинамические характеристики наиболее чувствительных препаратов в культуре опухолевых клеток ( алкеран/сарколизин и флюдарабин) позволили установить дозозависимый эффект разной степени выраженности. Выделена клинически значимая величина концентрации цитостатического препарата, вызывающая гибель 50% опухолевых клеток в культуре МТТ (LD50), позволяющая прогнозировать клинический ответ на лечение.

Подтверждена информативность МТТ-теста в определении формирующейся резистентности при хроническом лимфолейкозе на основании установленных отношений чувствительны/исследованы у ранее не леченных и получавших химиотерапию до этого пациентов.

Установлено, что применение фармакодинамического моделирования в культуре позволяет оптимизировать назначение цитостатических препаратов, повысить их эффективность, улучшить качество и продолжительность жизни больных, снизить токсичность химиотерапии..

Научно-практическая ценность.

Полученные результаты фармакодинамического моделирования цитостатических препаратов в культуре опухолевых клеток in vitro содержат новые сведения, обосновывающие назначение конкретных противоопухолевых препаратов при резистентных формах хронического лимфолейкоза.

Практическая ценность работы заключается в том, что полученные результаты могут использоваться в непосредственной клинической практике для определения прогноза и назначения максимально эффективного лечения каждому рефрактерному больному хроническим лимфолейкозом..

Положения, выносимые на защиту.

1 .Чувствительность опухолевых клеток к ряду химиопрепаратов в МТТ-тесте in vitro ранее не леченных больных ХЛЛ выше чувствительности больных, получавших прежде химиотерапию.

2.Существует взаимосвязь между клиническим ответом на химиотерапию алкераном/сарколизином, флюдарабином и чувствительностью опухолевых клеток в МТТ-тесте.

3 .Химиотерапия в соответствии с детерминированным подходом по чувствительности опухолевых клеток в культуре в МТТ-тесте позволяет увеличить общую выживаемость резистентных больных ХЛЛ по сравнению с контрольной группой.

Внедрение.

Результаты исследования внедрены в практику отделения клинической гематологии и иммунотерапии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского и гематологических отделений центральных районных больниц Московской области.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Апробация

Диссертация обсуждена на научной конференции МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского с участием сотрудников отделения клинической гематологии и иммунотерапии, отделения гастроэнтерологии, клинической лаборатории, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерашш опухолей НИИ ЭД и ТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Материалы диссертации доложены на Российской научно-практической конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологиии" ( июнь 2000г., г. Санкт-Петербург), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Отечественные противоопухолевые препараты"( март 2003г., г. Москва) и Московском областном терапевтическом обществе ( ноябрь 2003г.).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста, иллюстрированного 19 таблицами и 12 рисунками. Состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов. Библиографический указатель включает 212 источников.

Работа выполнена в отделении клинической гематологии и иммунотерапии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф.Владимирского (руководитель -доктор медицинских наук, профессор AJC Голенков), в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭД иТО РОНЦ им. Н.Щ>лохина РАМН (руководитель - доктор медицинских наук, профессор AJEO. Барышников).

Содержание работы

Клиническая характеристика больных

В исследование включено 63 больных. У всех диагностирован В-клеточный хронический лимфолейкоз. В группе пациентов было 26 женщин и 37 мужчин в возрасте от 43 до 78 лет. У 3-х больных была диагностирована I стадия (4,8%), у 26 больных - П стадия (41,3%), у 12 пациентов - Ш (19,0%), у 22 - IV стадия (34,9%). Стадию заболевания устанавливали соответственно критериям Rai.

Критериями диагноза являлись данные цитологического исследования мазка периферической крови, аспирата костного мозга, результаты трепанобиопсии. Каждому больному было выполнено иммунофенотипическое исследование лимфоцитов крови, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, УЗИ органов брюшной полости и забрюшинного пространства.

У 14-х больных заболевание установлено впервые. Предшествующее химиотерапевтическое лечение проводилось у 49 больных на протяжении 15-166 месяцев и было представлено монотерапией лейкераном, циклофосфаном, преднизолоном, дексаметазоном или программной ПХТ (СОР, СИОРХУРР ). У этих больных была сформирована резистентность к проводимой ранее терапии.

Таблица № 1. Предшествующее лечение резистентных больных хроническим лнмфолейкозом (п=49)

Препараты и комбинации Количество больных Среднее количество курсов Период от начала -лечения до формирования резистентности, мес..

лейкеран 26 ( 53,1%) 10,5(3-20) 47,8(15-166)

циклофосфан • 10(20,4%) 6,2(3-8)

преднизалон 10(20,4%) 3,2(2-5)

дексаметазон 1(2,0%) 4

СОР 34 ( 69,4%) 6,5(2-15)

CHOP' 17(34,7%) 3,5(2-8)

LVPP 2(4,1%) 3,5 (3-4)

Оценку эффективности ответа проводили по критериям Национального института рака США (ЖХ).

Полную ремиссию (ПР) регистрировали при отсутствии лимфоаденопатии, гепато-или спленомегалии, симптомов интоксикации. Количество клеток: нейтрофилов больше 1,5хЮ'/л, тромбоцитов больше ЮОхКЛ/л, гемоглобин более Иг/дл, лимфоцитов менее 4,0хЮ'/л. Костный мозг нормальной клеточности; лимфоцитов менее 30%.

Частичную ремиссию (ЧР) отмечали при 50% редукции лимфоцитов крови и 50% редукции лимфоаденопатии и/или 50% редукции спленомегалии и/или гепатомегалии. Нейтрофилы более повышение от исходного уровня. Тромбоциты более

100x10'/л или 50% повышение от исходного уровня. Гемоглобин более 11,0 г/дл ( не связано с гемотрансфузиями) или 50% увеличение от исходного уровня.

Стабилизацию болезни (СБ) регистрировали при отсутствии полной ремиссии, частичного ответа или прогрессирования заболевания.

Прогрессирование болезни (ПБ) отмечали при наличии по крайней мере одного признака из перечисленного: более 50% увеличение в размерах по крайней мере 2 л/у или новые очевидные л/у; более 50% увеличение спленомегалии или гепатомегалии, или

появление их, если оно не были представлены; трансформация в более агрессивную гистологию (синдром Рихтера или пролимфоцитарная лейкемия); более 50% увеличение абсолютного числа циркулирующих лимфоцитов.

Методы исследования

Определение чувствительности опухолевых лимфоцитов к противоопухолевым препаратам методом МТТ-анализа.

Исследование чувствительности опухолевых лимфоцитов к цитостатикам проводили первичным больным до лечения, а больным, которые ранее получали терапию, не менее, чем через 2 месяца после последнего курса.

Взятие крови осуществляли из вены локтевого сгиба после соответствующей обработки кожи в стерильные пробирки с раствором гепарина ( 500 ед/мл) совместно с научным сотрудником Е.В. Трифоновой. Гепаринизированную кровь разводили в 2 раза средой 199 и наносили на Ficoll-Paque ( Harmacia, Sweden) с плотностью 1,0077 в следующих соотношениях: 3 объема лейкоцитарной массы на 1 объем фиколла и центрифугировали при 1500 оборотов в минуту 35-40 минут при комнатной температуре. Мононуклеарные клетки -собирали из интерфазы пастеровской или автоматической пипеткой. Клетки отмывали первый раз в среде 199 20 минут при 1500 об/мин, а затем еще 2 раза по 10 минут при 1000 об/мин при комнатной температуре. Подсчет клеток проводили в камере Горяева стандартным методом.

Для поддержания жизнеспособности выделенных опухолевых клеток готовили полную питательную среду RPMI-1640 (ICN Biomedicals, Inc.) из сухого порошка. Добавляли бикарбонат натрия по прописи, фильтровали с использование фильтровальной установки Millipor. В состав полной питательной среды входили 10% телячьей эмбриональной сыворотки (ГЭС) (Perbio-Hyclone, США), 2тМ/мл глютамина (Serva), 0,1мг/мл гентамицина. 1-2х105 живых клеток помещали в объеме 180 мкл полной среды KPMI-1640 в 96-луночные плоскодонные планшеты (Costar, USA). К ним добавляют 20 мкл цитостатических препаратов ( преднизалон, винкристин, винбластин, доксорубицин, рубомицин, лейкеран, мелфалан, вепезид, сарколизин, флударабин, цитарабин, блеомицин) в 5 концентрациях, каждую концентрацию в триплете. В контрольные лунки с клетками добавляли по 20 мкл чистой среды RPMI-1640. В качестве контроля среды использовали лунки, содержащие 180 мкл полной и 20 мкл чистой среды RPMI-1640.

Для расчета концентраций противоопухолевых препаратов использовали < теоретическую плазменную концентрацию (ТПК), которую получили на основе терапевтической дозы препарата. Использовали 10-кратную ТПК, 5-кратную ТПК, 1-кратную ТПК, 0,5-кратную ТПК, 0,1-кратную ТПК.

Таблица^ 2. Концентрации цитостатическихпрепаратов в МТТ-пробе (мкг/мл).

10ТПК 5ТПК 1ТПК 0.5 ТПК 0.1 ТПК

Преднизалон 250 31.25 3.9 0.48 0.06

Винкристин 50 12.5 3.12 0.74 0.19

Винбластин 13 4.32 1.44 0.48 0.16

Доксорубицин 8 2 0.5 0.125 0.03

Рубомицин 2 0.5 0.125 0.03 0.008

Лейкеран 31.25 6.25 1.25 0.25 0.05

Алкеран 'сарколизин) 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78

Вепезид 50 12.5 3.12 0.74 0.19

Флюдарабин 33.3 11.1 3.7 1.23 0.41

Цитарабин 10 2.5 0.63 0.16 0.04

В контроль добавляли 0,15 М NaCL Смесь инкубировали в течение 4-х дней при 37 градусах С и 5%СО2.

На заключительном этапе в каждую лунку добавляли 20 мкл тетразолиевой соли МТТ (3-[4,5-dimethyl-thiazol-2,5-diphenil] tetrazolium bromid) в концентрации 5 мг/мл и инкубировали в течение 5-6 часов при температуре 37 градусов С и 5% СО2. Центрифугировали 96-луночный планшет при 2000 об/мин 10 минут. Сливали над осад очную жидкость и добавляли 200 мкл среды ДМСО. Смесь инкубировали 5-7 минут при температуре 37°С, суспензировали каждую лунку и измеряли оптическую плотность на анализаторе иммуноферментных реакций "Униплан" АИФР-01 (Россия). МТТ метаболизируется жизнеспособными клетками, превращаясь в нерастворимый в воде фармазан, тем самым изменяя оптическую плотность раствора пропорционально количеству выживших клеток. Работа проводилась совместно с научным сотрудником лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭД и ТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН АЛ. Иншаковым.

Статистическую обработку полученных результатов проводили путем вычисления средней арифметической, суммы квадратов отклонения выборки от среднего значения, вероятность подсчитывали, используя t-тест по критерию Стыодента. Выживаемость больных определяли методом Kaplan-Meier в отделе компьютеризации ГНЦ РАМН (Б.В. Зиндерман).

Результаты исследования

Первым этапом нашего исследования было проведение скрининга чувствительности опухолевых клеток к различным ХП в культуре МТТ. Клетки опухоли считались чувствительными, если количество погибших клеток в культуре составляло не менее 50% (LD50) со

средней из пяти используемых концентраций препарата, которая рассчитывалась с помощью теоретической плазменной концентрации (ТПК).

Рассматривая скрининг чувствительностей опухолевых клеток к 12 противоопухолевым препаратам (доксорубицин, рубомицин, винкристин, винбластин, лейкеран, мелфалан, цитарабин, этопозид, флударабин, преднизолон, дексаметазон, блеомицин) в культуре у 14 ранее не леченных больных (рисунок №1), видно, что, у данной категории пациентов чувствительность находится на высоком уровне (от 72,7% до 92,9%).

В доксорубицин ^рубомицин ЕЗ винкристин g винбластин Цдсйкерая Щ алкран [¡Цэютюид Q цитарабин В преднизолон ¡2 дексаметазон И фшодарабин

И блеомицин Химиапрепареты

Рисунок № 1. Чувствительность опухолевых клеток ранее не леченных больных к химиопрепаратам (п=14)

У 49 клинически резистентных больных данные чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам в культуре МТТ оказались ниже, чем у ранее не леченных, что связано, по-видимому, с длительным лечением в течение 15-166 месяцев многими химиопрепаратами. Отмечено значительное снижение чувствительности опухолевых клеток к препаратам, которые больные получали ранее: к лейкерану чувствительны 27,3% пациентов, к преднизолону- 35%, к рубомицину - 43,6%. В то же время выявлена высокая чувствительность опухолевых клеток клинически резистентных больных к алкерану (71,7%) in vitro (рисунок № 2).

Химиопрепараты

Рисунок №2. Чувствительность опухолевых клеток резистентных больных к химиопре-паратам (п=49)

В ходе нашего исследования было выявлено, что лекарственная чувствительность в группе ранее не леченных достоверно выше (0,82±0,03), чем в группе рефрактерных больных (0,5±0,08) (табл. № 3). Можно сделать вывод, что это связано с длительным предшествующим лечением, в среднем 47,8 месяцев (15-166). Это подтверждают данные пониженной чувствительности опухолевых клеток к тем препаратам, которыми проводили предшествующее лечение рефрактерным больным (лейкеран, преднизолон, рубомицин). Таблица№3. Характер истикалекарственной чувствительности в культуре лимфоцитов уранее не леченных и рефрактерных больных ХЛЛ.

Пелеченные больные Рефрактерные больные

Отношение чувствительны/исследованы (М±т) 0,82±0,03 0,5±0,08

Достоверность <0,05

Результаты проведенного скрининга показали, что в группе рефрактерных больных была выявлена самая высокая чувствительность к алкерану 71,7%, в группе всех обследованных, включая первичных, она составила 82,4%. Эти данные послужили предпосылкой для проведения лечения рефрактерных больных сарколизином (аякераном).

Были получены положительные результаты лечения алкераном 21 рефрактерного больного ХЛЛ. Установлено, что у пациентов достоверно уменьшились лейкоцитоз с

76,5+18,0 до 27,3+11,3 тыс/мл, абсолютный лимфоцитоз 55,0+10,8 до 20,5+5,4 тыс/мл, размеры органомегалии, количество зон увеличенных лимфоузлов с 9,1+0,6 до 6,6+0,6 (табл. № 4).

Таблица № 4. Характеристика противоопухолевого эффекта алкерана у 21 рефрактерного больного хроническим лимфолейкозом.

Название признака Mim до лечения М±т после лечения Р

Лейкоциты крови(х109/л) 76,5±18,0 27,3±11,3 Р0.05

Абсолютный лимфоцитоз крови (хЮ'/л) 55,0±10,8 20,5±5,4 Р<0,05

Лимфоцитоз крови (%) 88,6±4,4 74,6±4,9

Размеры печени от края реберной дуги (см) 4,5±0,5 1,4±0,5 Р<0,01

Размеры селезенки от края реберной дуги (см) 10,2+1,7 4,1±1,5 Р<0,05

Кол-во зон увеличенных л/у для каждого больного 9,1 ±0,6 6,6±0,6 Р<0,005

Количество нешрофилов (хЮ'/л) 11,4±8,1 20,4±4,5

Гемоглобин (г/л) 101,б±4,6 112,5±1,8 Р<0,05

Положительная динамика клинического статуса выражалась в улучшении общего самочувствия и повышения качества жизни: до лечения сарколизином большую половину больных составляли тяжелые пациенты с Ш-ГУ степенью по шкале ЕСОО-БО3, после терашш-все больные имели только 1-П степени. Тяжесть состояния, определяемая по шкале Кашс^ку имела достоверные различия до (49,512,7 баллов) и после (72,4+2,0 баллов) лечения (табл. № 5).

Таблица № 5. Динамика клинического статуса в процессе печения сарколизином

Клинический статус До лечения После лечения

По шкале ЕССЮ-ВОЗ 1сгепень-1 б-й (5%) П степень-8 б-х (38%) Ш степень- И б-х (52%) IV степень-1 б-й (5%) I степень-6 б-х (29%) П степень -15 б-х (71%) Ш, IV степени -0 б-х

По шкале Катанку 49,5±2,7 баллов (30-80) 72,4±2,0 баллов (60-90)

Больше, чем у половины (58,2%) тяжелых рефрактерных больных достигнут ответ на ХТ в виде полной или частичной ремиссии ( табл. № б).

Таблица № б. Эффективность лечения сарколизином ( алкераном) рефрактерных больных ХЛЛ.

Количество больных Полная ремиссия Частичная ремиссия Стабилизация болезни Прогрессировав ие болезни

21 1 (4,8%) 11 (53,4%) 8 (38,1%) 1 (4,8%)

Важными результатами проведенного исследования является установление взаимосвязи между выявленной в культуре методом МТТ чувствительности к алкерану по LD 50 и клиническим ответом на химиотерапию этим препаратом. Так, среднее значение LD 50 у больных, ответивших на лечение, составило 2,1±0,7 мкг/мл, у неответивпшх — 7,2±2,0 мкг/мл, что было достоверно больше (р<0,05).

Таблица № 7. Сравнение клинического ответа и чувствительности опухолевых клеток к алкерану in vitro у 17рефрактерных больных ХЛЛ.

LD50 алкерана/сарколизина в культуре (мкг/мл) Р

Ответившие (ПР+ЧР) 2,1±0,7 <0,05

Неответивпше (ПБ+СБ) 7,2±2,0

Таким образом, исследование чувствительности в МТТ-пробе по ЬЭ 50 позволяет прогнозировать результаты терапии у каждого пациента.

Заслуживает особого внимания рассмотрение фармокодинамического действия алкера-на в культуре у каждого обследуемого больного. Для достижения полученных результатов мы разделили 17 больных, опухолевые клетки которых чувствительны к алкерану, на 2 группы: в первую группу вошли более чувствительные пациенты, у которых процент живых клеток оказался меньше 50% с ТПК сарколизина 3,12 мкг/мл (11 больных), во вторую - менее чувствительные, у которых процент живых клеток превысил барьер в 50% с этой концентрацией препарата (6 пациентов). У больных из группы более чувствительных в культуре ЬЭ50 достигалась на уровне 2,41±0,9 мкг/мл, у больных из группы менее чувствительных среднее значение ЬЭ50 было достоверно выше и составляло 8,3±2,1 мкг/мл (табл. № 8).

Таблица № 8. Зависимость жизнеспособности клеток от концентрации алкерана в кул ътуре МТТ.

Группы больных Среднее значение LD50 (мкг/мл) Концентрация алкерана в МТТ-пробе (мкг/мл )

0,78 1,56 3,12 6,25 12,5

Кол-во живых клеток (%)

Более чувствительные в культуре (п=11) 2,41±0,9 61,4±2,6 45,1±2,2 33,8±1,4 21,4±1,9 20,1±2,1

Менее чувствительные в культуре (п=6) 8,3±2,1 84,8±2,5 76,Ш,7 51,1±1,8 47,4±2,0 41,4±1,4

Достоверность, Р 0,01 0,03 0,002 0,0002 0,002 0,0003

При построении фармакодинамических кривых, отражающих зависимость жизнеспособных клеток от 5 возрастающих концентраций сарколизина (алкерана), у групп более и менее чувствительных к алкерану в культуре выявлено, что клинические результаты в этих группах различались (рис. № 3). В группе более чувствительных (п==11) эффективность противоопухолевого лечения была выше: достигнута 1 полная ремиссия, 6 частичных ремиссий, 4 стабилизации болезни (всего 63,6% ответивших). В группе менее чувствительных (п=6) получено 2 частичных ремиссии, наступило 3 стабилизации болезни, 1 прогрессирование болезни (33,3% ответивших). Эти данные указывают на взаимосвязь между количеством оставшихся жизнеспособных клеток после действия алкерана в МТТ-пробе (LD50) и клинической эффективностью алкерана: достижение LD50 на низких значениях алкерана/сарколизина in vitro соответствует большей клинической эффективности этого препарата.

Рисунок № 3. Фармакодинамика сарколизина в культуре опухолевых клеток in vitro у 17 рефрактерных больных ХЛЛ

При анализе фармакодинамических кривых четко виден дозозависимый эффект алкера-на, то есть при увеличении его концентрации, количество живых клеток уменьшается.

Токсичность лечения алкераном у чувствительных больных была невысокой. Наиболее часто встречались тошнота и рвота (23,8% больных). Осложнения со стороны гематологических показателей наблюдались у 19% больных, при этом дополнительного лечения не требовалось.

Медиана выживаемости от начала лечения рецидива алкераном ( сарколизином) составила 13 месяцев. При сравнении продолжительности жизни в двух группах: в группе резистентных больных, леченных стандартными программами ХТ, и в группе резистентных больных, леченных сарколизином получены различающиеся данные ( медиана выживаемости в группе лечения сарколизином составила 80,6 месяцев, в группе стандартного лечения -53,6 месяцев, р=0,19) (рис. № 4).

Рисунок № 4. Сравнение общей выживаемости рефрактерных больных ХЛЛ на стандартных программах XT и терапии алкераном/сарколизином

Следующим этапом нашего исследования было определение клинической значимости МТТ-анализа в культуре с флюдарабином. При скрининге чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину были получены результаты, демонстрирующие более высокую чувствительность опухолевых клеток ранее не леченных больных по сравнению с рефрактерными и согласующиеся с данными литературы.

По нашим данным, В-лимфоциты 37 больных (58,7%) оказались чувствительными, а 26 (41,2%) - резистентными к флюдарабину(рис. № 5).

Рисунок № 5. Скрининг чувствительности к флюдарабину всех исследованных больных хроническим лимфолейкозом(п=63)

Часть обследованных больных составили ранее не леченные -14 пациентов: в этой группе у 12 (85,7%) опухолевые клетки были чувствительны, у 2 (14,2%) - резистентны к действию флюдарабина в МТТ-тесте (рис.№ 6). У остальных 49 пациентов была выявлена клиническая рефрактерность к проводимому ранее лечению: опухолевые клетки 30 (61,2%) больных были чувствительны, 19 (38,7%) - устойчивы к действию флюдарабина in vitro (рис№ 7).

В дальнейшем, 35 больным ХЛЛ была проведена терапия флюдарабином. Противоопухолевый эффект этого препарата выражался в значительном и достоверном снижении лейкоцитоза с 140,7+23,5 до 16,9±3,8 тыс/мли абсолютного лимфоцитоза с 131±22,3 до 12,3±3,7 тыс/мл, уменьшении органомегалии, уменьшении зон увеличенных лимфоузлов с 10,&ь0,5 до 4,4+0,б, достоверном увеличении нейтрофилов с 7,9+1,2 до 41,9+4,6 тыс/мл, тромбоцитов с 179,1+6,5 до 214,9+13,8 тыс/мл и гемоглобина с 110,6+4,9 до 122,2+2,4 г/л (табл. № 9).

Таблица № 9. Характеристика противоопухолевого эффекта флюдарабина у 35 больных ХЛЛ.

Название признака М±т до лечения М±т после лечения Р

Лейкоциты крови(х10'/л) 140,7±23,5 16,9±3,8 <0,0001

Абсолютный лимфоцитоз крови (хЮ'/л) 131±22,3 12,3±3,7 <0,0001

Лимфоцитоз крови (%) 86±1,5 47,2±4,2 <0,0001

Размеры печени от края реберной дуги (см) 3,7±0,5 0,3±0,1 <0,0001

Размеры селезенки от края реберной дуги (см) 7,4±0,7 1,8±0,3 <0,0001

Кол-во зон увеличенных л/у для каждого бального 10,8±0,5 4,4±0,6 <0,0001

Количество нейтрофилов (хЮ'/л) 7,9±1,23 41,9±4,61 <0,0001

Гемоглобин (г/л) 110,6±4,9 122,2±2,4 <0,05

Тромбоциты ( х10*/л) 179,1±6,5 214,9±13,8 <0,05

Положительная динамика клинического статуса выражалась в улучшении общего самочувствия и повышения качества жизни. Из таблицы № 10 видно, что до лечения флюдарабином тяжелые больные с Ш-1У степенью составляли 38%, а после - их количество сократилось более, чем в 3 раза и составило всего 12%. Тяжесть состояния, оцениваемая по шкале Като!кку, до и после терапии флюдарабином имела достоверные различия (р< 0,0001).

Таблица № 10. Динамика клинического статуса 35 больных ХЛЛ в процессе лечения флюдарабином.___

Клинический статус До лечения После лечения

По шкале ECOG-BO3 I степень -6 б-х (17%) П степень -16 б-х (46%) Ш степень-10 б-х (29%) IV степень-3 б-х (9%) 0 степень-7 б-х (20%) 1 степень -14 б-х (40%) Пстепень -10 б-х (29%) Ш степень-2 б-х (6%) IV степень-2 б-х (6%)

По шкале Kamofsky 58,6±2,9 баллов (30-90) 78,9±3,3 баллов (50-100)

В результате проведенного лечения 35 больным ХЛЛ - 63% ответили на терапию, среди 28 рефрактерных больных более половины (57,1%) достигли полной (7 пациентов) и частичной ремиссии (9 пациентов), клинический ответ не зависел от стадии заболевания (табл. №11).

Таблица №11.Эффективность ответа на лечение флюдарабином больных ХЛЛ.

ПР ЧР СБ ПБ

ответившие неответившие

Все исследованные (п=35) 12(34,3%) 10(28,6%) 10(28,6%) 3 (8,6%)

Рефрактерные (п=28) 7(25%) 9(32,1%) 9(32,1%) 3(10,7%)

Выявлена взаимосвязь между результатами МТТ-теста и клинической эффективностью флюдарабина у больных ХЛЛ. Значения ЬЭ 50 в группах ответивших и неответивших пациентов имели достоверные отличия и составили 1,14:0,3 мкг/мл и 5,Ш,8 мкг/мл, соответственно (р<0,01) (табл. № 12).

Таблица №12.Сравнение клинического ответа и чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину in vitro у 33 больных ХЛЛ.____

LDS0 флюдарабина (мкг/мл) Р

Ответившие (ПР+ЧР) 1,1±0,3 <0,01

Неответившие (СБ+ПБ) 5,1±1,8

Лучший клинический результат достигался у больных, в МТТ-пробе которых ЬЭ50 был менее 2,5 мкг/мл.

В дальнейшем, по результатам жизнеспособности опухолевых клеток с различными концентрациями флюдарабина in vitro были выделены 2 группы более (15 больных) и менее чувствительных (8 больных) в МТТ-тесте (табл. № 13). ID 50 в этих группах достоверно различались, в группе более чувствительных среднее значение LD50 составило 0,5 мкг/мл, в группе менее чувствительных среднее значение LD 50 было 4,5 мкг/мл.

Таблица № 13. Зависимость жизнеспособности опухолевых клеток от концентрации флюдарабина в культуре МТТ.

Группы больных Средние значения LD50 (мкг/мл) Концентрация флюдарабина в культуре(мкг/мл)

0,41 1,23 3,7 11,1 33,3

Количество живых клеток

Средние значения (п=33) 2,6±0,8 56,1 44,9 37,5 31,4 26,5

Более чувствительные (п=15) 0,5±0,1 47,7±4,0 33,8±2,5 25,8±1,9 21,0±1,5 17,3±1,6

Менее чувствительные (п=18) 4,5±13 63,0±2,4 54,2±1,8 47,9±1,3 40,9±2,6 35,0±3,0

Р* <0,05 <0,05 <0,001 <0,001 <0,001 <0,00Ь

При анализе клинической эффективности в этих 2-х группах большая была выявлена в

группе более чувствительных больных (80% ответивших), чем в группе менее чувствитель-

концешр&цкя флкхшфабнна я хупътурс(нхг/ыл)

Рисунок № 8. Фармакодинамика флюдарабина в культуре опухолевых клеток in vitro у более (п=15) и менее (п=18) чувствительных в МТТ-тесте больных ХЛЛ и клинический ответ в этих группах.

Таким образом, МТТ-анализ может использоваться как достоверный тест в определении чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину in vitro. Он позволяет прогнозировать клиническую значимость препарата и, тем самым, избегать неоправданного назначения неэффективных препаратов. Учитывая высокую стоимость лечения флюдарабияом, применение МТТ-теста становится еще более актуальным и с экономической точки зрения.

В группах ответивших и не ответивших на лечение флюдарабином рассмотрены фар-макодинамические кривые жизнеспособности опухолевых клеток в зависимости от 5 концентраций флюдарабина в МТТ-пробе. При 3-х начальных концентрациях, включая ТПК, среднее количество живых клеток в группе ответивших достоверно меньше, чем у больных не ответивших на терапию флюдарабином. Эти данные подтверждают взаимосвязь между клинической эффективностью и количеством оставшихся живыми опухолевых клеток больного после воздействия флюдарабина в МТТ-тесте. При увеличении концентрации флюдарабина в культуре количество живых клеток уменьшается: прослеживается дозозависимый эффект. При достижении концентрации 11,1 мкг/мл количество живых клеток становится приблизительно одинаковым в обеих группах. Из этого можно сделать вывод, что увеличение концентрации более 11,1 мкг/мл не увеличивает дополнительно гибель клеток.

Таблица № 14. Зависимость клинического ответа от количества жизнеспособных опухолевых клеток с каждой концентрацией флюдарабина в МТТ-пробе у 33 больных ХЛЛ.

Клинический • Число Концентрации флюдарабина в культуре

ответ' больных 0,41 из 3,7 11,1 333

Количество • живых клеток

ПР+ЧР п=20 50±3,1 40,б±2,7 34,1±3,0 30,5±3,0 27,9±3.0

СБ+ПБ п=13 63,2+3,9 51,513,6 43,5±3,0 34±3,8 2б,1±3,7

достоверность Р <0,01 <0,05 <0,05

90

g 80 I

5 70

<B i

£ 60

0}

I

= 50 40 30 20

♦ Полная и частичная ■я (п=20) зга (п-13)

■ Нет отв

\

* ч. "»'»I

'"Винит,,, "'••mm,,.,,,,

......• • « i м i i 1111 ■»"я<|к.Я,|| .........

5 10 15 20 25

концентрация флюдарабина в культуре(мкг/мл)

30

35

Рисунок № 9. Фармакодинамика флюдарабина в культуре опухолевых клеток in vitro в группах ответивших (п=20) и неответивших (п=13) на терапию флюдарабином больных ХЛЛ

Токсичность лечения флюдарабином была следующей: у б больных (17,1%) наблюдалась гематологическая токсичность 1-П степени, не требующая вмешательства. У 7 больных (22,9%) возникли серьезные осложнения, которые удалось купировать в результате лечения. Однако, у одной пациентки (2,9%) наступил летальный исход из-за тяжести состояния, связанной с развитием двусторонней пневмонии, по поводу которой она получала адекватную терапию. С МТТ-анализом это было не связано.

При проведении анализа выживаемости больных ХЛЛ, получающих флюдарабин, выявлено, что больные наблюдались в течение 4-36 месяцев. Медиана выживания еще не достигнута. Выживаемость больных через 7 месяцев лечения флюдарабином составила 78%. Сравнение продолжительности жизни в двух рефрактерных группах больных ХЛЛ: в группе, получающих флюдарабин, и в группе, получающих стандартную XI-, показало достоверные различия( медиана выживания на флюдарабине 129,9 месяцев, на стандартной ХТ 53,6 месяцев). Кроме того, в группе получающих флюдарабин очень мало полных наблюдений, большее количество больных еще живы и продолжают лечиться или наблюдаться, что при получении положительных результатов может еще увеличить медиану выживаемости.

р < 0.005

Рисунок № 10. Сравнение общей выживаемости рефрактерных больных ХЛЛ на стандартных программах Ш- и терапии флюдарабином

Таким образом, фармакодинамическое моделирование in vitro алкерана (сарколизина) и флюдарабина позволило значительно улучшить результаты лечения резистентных форм хронического лимфолейкоза.

Выводы:

1. Скрининг чувствительности опухолевых клеток рефрактерных больных хроническим лимфолейкозом к 12 цитостатическим препаратам (доксорубицин, рубомицин, винкристин, винбластин, лейкеран, алкеран, этопозид, цитарабин, преднизолон, дексаметазон, флюдарабин, блеомицин) in vitro в МТТ-тесте по LD50 показал, что клетки -опухоли чувствительны к алкерану(сарколизину) в 71,7%, к флюдарабину в 61,2% случаев. К другим цитостатическим препаратам чувствительность была ниже/

2. Установлено, что у нелеченых больных хроническим лимфолейкозом в МТТ-скришшге in vitro по LD50 отношение чувствительные/исследованные к ряду химиопрепаратов достоверно выше (0,82+0,03), чем у рефрактерных больных (0,5+0,08) (р<0,05).

3. В группе больных более чувствительных к алкерану(сарколизину) в МТТ-тесте in vitro LD50 достигалась при концентрации препарата 2,4+0,9 мкг/мл, у менее чувствительных -при 8,3+2,1 мкг/мл, р<0,01.

4. В группе более чувствительных больных к алкерану (сарколизину) в МТТ-тесте in vitro выявлена большая клиническая эффективность препарата (63,6% ответивших) по сравнению с менее чувствительными пациентами (33,3% ответивших).

5. У более чувствительных к флюдарабину в МТТ-тесте in vitro больных LD50 достигалась при концентрации препарата 0,5+0,1 мкг/мл, у менее чувствительных значение LD50 было выше 4,47+1,3 мкг/мл, р<0,05.

6. Клинический анализ показал, что в группе более чувствительных больных к флюдарабину в МТТ-тесте in vitro выявлена большая противоопухолевая эффективность флюдарабина (80% ответивших) по сравнению с менее чувствительными пациентами ( 44,4% ответивших).

7. Лечение алкераном(сарколизином) и флюдарабином рефрактерных больных хроническим лимфолейкозом с использованием фармакодинамического моделирования в МТТ-тесте in vitro увеличивает общую выживаемость (Me) до 80 месяцев на алкеране/сарколизине, и до 129 месяцев на флюдарабине(р<0,005) по сравнению с контрольной группой (53,6 месяцев).

Списокработ, опубликованныхпо теме диссертации.

1. Голенков А.К., Трифонова Е.В., Катаева Е.В., Кильдюшевский А.В., Луцкая Т.Д.,. Дудина ГЛ., Зарядьева ЕЛ., Назарова И.Н., Заботила ТЛ , Иншаков А.Н., Барышников А.Ю. // Характеристика лекарственной устойчивости опухолевых клеток in vitro у больных множественной миеломой и хроническим лимфолейкозом с различным ответом на химиотерапию. Материалы Российской научно-практической конференции Актуальные вопросы гематологии и трансфузиолопо*\Санкт-Петербург, 2000, с.95-96.

2. Голенков А.К., Трифонова Е.В., Катаева Е.В., Кильдюшевский A3., Луцкая Т.Д., Зарядьева Е.А., Назарова И.Н, Лукашина М JL, Заботила ТЛ., Михайлова И.Н., Иншаков АЛ., Логачева Н.П., Барышников AJOM Характеристика лекарственной -устойчивости опухолевых плазмоцитов in vitro у больных множественной миеломой с различным ответом на химиотерапию. Терапевтический архив, 2000, Том 72, №8, с.38-41.

3.Катаева Е.В., Трифонова Е.В., Луцкая Т.Д., Митина ТЛ., Иншаков А.Н., Барышников А.Ю., Голенков А.К.// Лечение рефрактерных больных хроническим лимфолейкозом с учетом чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам в МТТ-пробе. Материалы симпозиума "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний", Москва, 2001, с.ЗЗ.

4. Катаева EJ3., Трифонова ЕВ., Луцкая ТД, Митина ТЛ., Иншаков А.Н., Евстропова И.В., Барышников А.Ю., Голенков A.KJ/ В-клеточный хронический лимфолейкоз: клинико-лабораторные сопоставления химиочувствительности in vivo и in vitro. Материалы симпозиума "Морфологические, иммунологические и молекулярно-биологические аспекты идентификации гемобластозов и родственных заболеваний". Адлер, 1999, с.28.

5. Катаева Е.В., Голенков А.К., Трифонова Е.В, Луцкая Т.Д., Кильдюшевский А.В., Иншаков АЛ., Логачева Н.П., Лысюк Е.Ю., Барышников А.Ю.// Сравнительный анализ данных МТТ-пробы у больных хроническим лимфолейкозом с различным ответом на химиотерапию. Российский биотерапевтический журнал, 2002, № 1, с.65-67.

6. Golenkov А.К., Kataeva E.V., Mitina ТЛ, Zaradieva ЕЛ., Inshakov A.N., LysukE.U. // Clinical evalution of CLL patients according to in vitro drug sensitivity ofblood lymphocytes.

Poster 071. Leukemia 2000 towards the cure, September 7-9,2000. Program and abstract book, p.63.

7. Golenkov A.K, Kataeva E.V., Trifonova E.V., Lutskaya T.D., Mitina TA., Logacheva N.P., Inshakov A.N., BaryshnikovA.Yu. // Clinical response and chemosensitivity tumor cells in vitro at the patients with lymphoproliferative diseases. Poster 38.4th International Symposium ofDrug Resistance in Leukemia and Lymphoma 7-10 March 2001, Amsterdam, The Netherlands. Leukemia, 2001.V.15, N3, p.504.

8. GolenkovAX, Kataeva E.V., OborotovaNA., Inshakov A.N., Baryshnikov A.Yu., Logacheva N.P. //Determined treatment with sarcolysin on sensitivity in vitro refiactory B-CLL patients. The Hematology Journal, 2002, V.3, SuppLl, p. 311. Abstracts for the 7th Meeting ofthe European Hematology Association, Florence, Italy, 6-9 June 2002.

Заказ №492. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06

Актуальность проблемы

Лечение резистентных форм хронического лимфолейкоза является актуальной проблемой для клинической гематологии.

Больные хроническим лимфолейкозом (XJTJI), как правило, отвечают на первичную терапию хлорамбуцилом, но через некоторое время становятся рефрактерными к лечению (Foon at al, 1990; Cheson V.D., 1995). С началом применения пуриновых аналогов в терапии ХЛЛ значительно улучшились результаты лечения больных. Однако, клиническая резистентность к флюдарабину отмечается у 22-30% первичных больных ХЛЛ (Bowen at al, 1999; Julliusson G., 1997). Установлено, что при терапии флю-дарабином наблюдается высокая корреляция между ответом на химиотерапию (XT) и наличием предшествующего лечения: 83% ответивших среди первичных больных и только от 12 до 57% среди тех, кто уже лечился ранее (Montserrat Е. and Rozman С., 1994).

В связи с этим, представляется важным поиск путей преодоления лекарственной резистентности. Один из вариантов связан с применением программной полихимиотерапии (ПХТ). Используются новые комбинации противоопухолевых препаратов такие, как флюдарабин, циклофосфан, ми-токсантрон (Laptalo at al, 2002; Schmitt at al, 2002; Bowen at al, 1999), флюдарабин с пентостатином ( Jajeh at al, 2002), хлорамбуцил с эпирубицином (Catovsky at al, 1998), сочетания цитостатических лекарств и моноклональ-ных антител (Rossini at al, 1999; Del Poeta, 2002) или значительно увеличиваются дозы цитостатиков ( Weiss at al, 2002). Такое лечение ведет к усилению миелотоксичности и иммуносупрессии, способствует развитию инфекционных осложнений и нуждается в адекватной сопроводительной терапии, значительно ухудшая качество жизни таких больных.

Другой путь - применение модуляторов резистентности, препаратов обладающих способностью подавлять механизмы, ответственные за развитие устойчивости, в частности, таких, как циклоспорин ( Cabrelle at al, 2002), верапамил (Twentyman, 1997) и их аналоги. Однако, токсичность модификаторов резистентности ограничивает их широкое клиническое применение.

В связи с этим, особый интерес представляет изучение клинического значения чувствительности опухолевых клеток к различным химиопрепа-ратам (ХП) in vitro МТТ-методом с целью осуществления детерминированного подхода в лечении рефрактерных форм XJIJI. В литературе имеется немало сообщений о том, что МТТ-анализ позволяет выявить взаимосвязь между чувствительностью опухолевых клеток к ХП in vitro и клиническим ответом (Morabito at al,l998; Silber, 1994). Это дает возможность использовать МТТ-метод как моделирующую систему для изучения действия различных цитостатиков на клетки опухоли в культуре, как новых, так и широко неиспользуемых препаратов в терапии XJIJI (Pepper at al, 2003; De Vries at al, 2003; Bosanquet at al,2002).

Однако, многие вопросы изучения чувствительности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам в МТТ-тесте, клинической эффективности детерминированного лечения при рефрактерных формах ХЛЛ, остаются неосвещенными в литературе, что и послужило основанием для настоящего исследования.

Цель исследования: повысить эффективность лечения резистентных больных хроническим лимфолейкозом с использованием результатов чувствительности опухолевых клеток в МТТ-тесте in vitro.

Задачи исследования.

1. Провести скрининг чувствительности опухолевых клеток к цитостати-кам в МТТ-тесте in vitro у рефрактерных больных хроническим лимфолейкозом для выявления наиболее активных противоопухолевых препаратов.

2. Изучить фармакодинамические характеристики выбранных препаратов в культуре опухолевых клеток для дальнейшего назначения оптимального лечения.

3. Провести клинический анализ результатов лечения резистентных форм хронического лимфолейкоза в соответствии с данными фармакодина-мического моделирования in vitro.

Научная новизна.

В результате проведенного скрининга чувствительности опухолевых клеток резистентных больных хроническим лимфолейкозом к цитостати-ческим препаратам в МТТ-тесте in vitro выявлены препараты, проявляющие высокую противоопухолевую активность.

Изученные фармакодинамические характеристики наиболее чувствительных препаратов в культуре опухолевых клеток ( алкеран/сарколизин и флюдарабин) позволили установить дозозависимый эффект разной степени выраженности. Выделена клинически значимая величина концентрации цитостатического препарата, вызывающая гибель 50% опухолевых клеток в культуре МТТ (LD50), позволяющая прогнозировать клинический ответ на лечение.

Подтверждена информативность МТТ-теста в определении формирующейся резистентности при хроническом лимфолейкозе на основании установленных отношений чувствительны/исследованы у ранее не леченных и получавших химиотерапию до этого пациентов.

Установлено, что применение фармакодинамического моделирования в культуре позволяет оптимизировать назначение цитостатических препаратов, повысить их эффективность, улучшить качество и продолжительность жизни больных, снизить токсичность химиотерапии.

Научно-практическая ценность.

Полученные результаты фармакодинамического моделирования ци-тостатических препаратов в культуре опухолевых клеток in vitro содержат новые сведения, обосновывающие назначение конкретных противоопухолевых препаратов при резистентных формах хронического лимфолейкоза.

Практическая ценность работы заключается в том, что полученные результаты могут использоваться в непосредственной клинической практике для определения прогноза и назначения максимально эффективного лечения каждому рефрактерному больному хроническим лимфолейкозом.

Положения, выносимые на защиту.

1. Чувствительность опухолевых клеток к ряду химиопрепаратов в МТТ-тесте in vitro ранее не леченных больных XJIJI выше чувствительности больных, получавших прежде химиотерапию.

2. Существует взаимосвязь между клиническим ответом на химиотерапию алкераном/сарколизином, флюдарабином и чувствительностью опухолевых клеток в МТТ-тесте.

3. Химиотерапия в соответствии с детерминированным подходом по чувствительности опухолевых клеток в культуре в МТТ-тесте позволяет увеличить общую выживаемость резистентных больных XJIJI по сравнению с контрольной группой.

Внедрение.

Результаты исследования внедрены в практику отделения клинической гематологии и иммунотерапии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского и гематологических отделений центральных районных больниц Московской области.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Апробация

Диссертация обсуждена на научной конференции МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского с участием сотрудников отделения клинической гематологии и иммунотерапии, отделения гастроэнтерологии, клинической лаборатории, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭД и ТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Материалы диссертации доложены на Российской научно-практической конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологиии" ( июнь 2000г., г. Санкт-Петербург), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Отечественные противоопухолевые препара-ты"( март 2003г., г. Москва) и Московском областном терапевтическом обществе ( ноябрь 2003г.).

Работа проведена в рамках Договора с Минздравом России № 005/081/004 от 17.11.2001г. "Разработка методов повышения эффективности противоопухолевой химиотерапии резистентных форм множественной миеломы и хронического лимфолейкоза с учетом устойчивости опухолевых клеток in vitro к цитостатическим препаратам", а также ФЦНТП: "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2004гг.(Договор №5 с ГНЦ РАМН от 4.04.2002г.).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста, иллюстрированного 23 таблицами и 15 рисунками. Состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов. Библиографический указатель включает 219 источников.

Выводы:

1. Скрининг чувствительности опухолевых клеток рефрактерных бол! ных хроническим лимфолейкозом к 12 цитостатическим препаратам (доке ору бицин, рубомицин, винкристин, винбластин, лейкеран, алке-ран, этопозид, цитарабин, преднизолон, дексаметазон, флюдарабин, блеомицин) in vitro в МТТ-тесте по LD50 показал, что клетки опухолх чувствительны к алкерану(сарколизину) в 71,7%, к флюдарабину в 61,2% случаев. К другим цитостатическим препаратам чувствительность была ниже.

2. Установлено, что у нелеченых больных хроническим лимфолейкоза в МТТ-скрининге in vitro по LD50 отношение чувствительные/исследи

7. Лечение алкераном(сарколизином) и флюдарабином рефрактерна

84 о;м : сзванные к ряду химиопрепаратов достоверно выше (0,82±0,03), чем у ^ фрактерных больных (0,5±0,08) (р<0,05).

3. В группе больных более чувствительных к алкерану(сарколизину) -------^

МТТ-тесте in vitro LD50 достигалась при концентрации препарата

2,4±0,9 мкг/мл, у менее чувствительных - при 8,3±2,1 мкг/мл, р<0,01

4. В группе более чувствительных больных к алкерану (сарколизинуТ----в хта

МТТ-тесте in vitro выявлена большая клиническая эффективность пр— парата ( 63,6% ответивших) по сравнению с менее чувствительными циентами (33,3% ответивших).

5. У более чувствительных к флюдарабину в МТТ-тесте in vitro болыil-тьтх

LD50 достигалась при концентрации препарата 0,5±0,1 мкг/мл, у ме~ чувствительных значение LD50 бьшо выше 4,47±1,3 мкг/мл, р<0,05.

6. Клинический анализ показал, что в группе более чувствительных больных к флюдарабину в МТТ-тесте in vitro выявлена большая про-игивоопухолевая эффективность флюдарабина (80% ответивших) по ср нению с менее чувствительными пациентами ( 44,4% ответивших). больных хроническим лимфолейкозом с использованием фармакодина-мического моделирования в МТТ-тесте in vitro увеличивает общую выживаемость (Me) до 80 месяцев на алкеране/сарколизине, и до 112 месяцев на флюдарабине (р<0,005) по сравнению с контрольной группой (53,6 месяцев).

Заключение

В последнее время в гематологии уделяется большое внимание проблеме лекарственной резистентности, так как именно с этим связана неэффективность программной химиотерапии.

Начальная терапия алкилирующими агентами ХЛЛ успешна в 60-80% случаев в течение первых нескольких лет. Позднее подавляющее большинство больных становятся резистентными к хлорамбуцилу [35, 66]. Клиническая резистентность к флюдарабину наблюдается у 22-30% первичных больных ХЛЛ [26, 100]. По мере лечения доля рефрактерных форм ХЛЛ возрастает, а эффективность противоопухолевой терапии значительно снижается. Установлено, что при терапии флюдарабином наблюдается высокая корреляция между ответом на XT и наличием предшествующей терапии: 83% ответивших среди первичных больных (75% полных ремиссий) и 12-57% (0-29% ПР) среди тех, кто получал предшествующую терапию [129].

В связи с этим, особенно важным представляется изучение клинического значения исследования чувствительности опухолевых клеток к различным ХП in vitro МТТ-методом. В литературе имеется немало сообщений о том, что МТТ-анализ позволяет выявить взаимосвязь между чувствительностью опухолевых клеток к ХП in vitro и клиническим ответом [130, 131, 185]. Это дает возможность использовать МТТ-метод как моделирующую систему для изучения действия различных цитостатиков на клетки опухоли в культуре, в том числе, новых или препаратов, которые традиционно не используются в терапии ХЛЛ [150, 50, 21, 185]. Кроме того, многим исследователям представляется важным изучить взаимные влияния различных препаратов на В-клетки ХЛЛ в культуре МТТ для того, чтобы усилить противоопухолевый эффект [12, 114, 167, 131].

Возможность прогнозировать резистентность к определенному препарату до лечения могла бы принести значительную клиническую и экономическую пользу. В связи с этим, появилась заинтересованность в изучении эффективности химиотерапевтического лечения рефрактерных форм XJIJI с использованием чувствительности опухолевых клеток in vitro методом МТТ.

Объектом нашего исследования стали 63 больных ХЛЛ, 49 из них были рефрактерны к проводимому ранее лечению, 14 пациентов были ранее не леченные. Диагноз устанавливали на основании стандартных исследований, принятых в гематологической клинике, включавших миело-грамму, трепанобиопсию, пункцию лимфоузлов, общий анализ крови, им-мунофенотипическое исследование лимфоцитов крови, а также рентгенологическое исследование органов грудной клетки и ультразвуковое исследование органов брюшной полости и забрюшинного пространства. Стадию заболевания больным определяли по Rai. Исследование чувствительности опухолевых лимфоцитов проводили путем 96-часовой инкубации с 5 концентрациями цитостатических препаратов и, на заключительном этапе добавляли тетразолиевую соль МТТ, которая метаболизируется жизнеспособными клетками, превращаясь в нерастворимый в воде фармазан. Дальнейшее измерение оптической плотности раствора, зависящей от количества живых клеток, проводили на спектрофотометре.

Первым этапом нашего исследования было проведение скрининга чувствительности опухолевых клеток к различным ХП в культуре МТТ. Клетки опухоли считались чувствительными, если количество погибших клеток в культуре составляло не менее 50% (LD50) со средней из пяти используемых концентраций препарата, которая рассчитывалась с помощью теоретической плазменной концентрации (ТПК). В литературе высказываются противоречивые суждения о лекарственной чувствительности у нелеченных и предварительно леченных больных. Одни авторы сообщают о том, что чувствительность к хлорамбуцилу у ранее нелеченных больных была выше, чем у тех кто получал этот препарат [185]. Другие исследователи не получили различий в чувствительности опухолевых клеток у первичных и ранее леченных пациентов [87]. В ходе нашего исследования было выявлено, что лекарственная чувствительность в группе ранее не леченных достоверно выше (0,82±0,03), чем в группе рефрактерных больных (0,5±0,08). Можно сделать вывод, что это связано с длительным предшествующим лечением, в среднем - 47,8 месяцев (15-166). Это подтверждают данные пониженной чувствительности опухолевых клеток к тем препаратам, которыми лечили рефрактерных больных (лейкеран, преднизолон, рубомицин)

Результаты проведенного скрининга показали, что в группе рефрак-трных больных была выявлена самая высокая чувствительность к алкера-ну 71,7%, в группе всех обследованных, включая первичных, она составила 82,4%. Эти данные послужили предпосылкой для проведения лечения рефрактерных больных сарколизином (алкераном).

Были получены положительные результаты лечения алкераном 21 рефрактерного больного ХЛЛ. Установлено, что у пациентов достоверно уменьшились лейкоцитоз с 76,5±18,0 до 27,3±11,3 тыс/мл, абсолютный лимфоцитоз 55,0±10,8 до 20,5±5,4 тыс/мл, размеры органомегалии, количество зон увеличенных лимфоузлов с 9,1±0,6 до 6,6±0,6. Положительная динамика клинического статуса выражалась в улучшении общего самочувствия и повышения качества жизни: до лечения сарколизином большую половину больных составляли тяжелые пациенты с IH-IV степенью по шкале EC0G-B03 (12 больных - 57%), после терапии- все больные имели только I-H степени (21пациент - 100%). Тяжесть состояния, определяемая по шкале Карновского до лечения составляла 49,5±2,7 баллов, после лечения - 72,4±2,0 баллов, что достоверно различалось. Больше, чем у половины (58,2%) тяжелых рефрактерных больных достигнут ответ на XT в виде полной или частичной ремиссии.

Важными результатами проведенного исследования является установление взаимосвязи между выявленной в культуре методом МТТ чувствительностью к алкерану по LD50 и клиническим ответом на химиотерапию этим препаратам. Так, среднее значение LD50 у больных ответивших на лечение составило 2,1±0,7 мкг/мл, у неответивших - 7,2±2,0 мкг/мл, что было достоверно больше (р<0,05). Таким образом, исследование чувствительности в МТТ-пробе по LD50 позволяет прогнозировать результаты терапии у каждого пациента до получения клинического ответа.

Проведенное исследование демонстрирует, что противоопухолевая эффективность алкерана (сарколизина) не зависит от стадии заболевания, что подтверждается равномерным распределением больных по стадиям в группах ответивших и не ответивших на лечение, и достижением полной ремиссии у больного с IV стадией.

При построении фармакодинамических кривых, отражающих зависимость жизнеспособных клеток от 5 возрастающих концентраций сарколизина (алкерана), у групп более и менее чувствительных к алкерану в культуре выявлено, что клинические результаты в этих группах различались. В группе более чувствительных эффективность противоопухолевого лечения была выше: достигнута 1 полная ремиссия, 6 частичных ремиссий, 4 стабилизации болезни. В группе менее чувствительных получено 2 частичных ремиссии, наступило 3 стабилизации болезни, 1 прогрессиро-вание болезни. Эти данные указывают на четкую зависимость между количеством оставшихся жизнеспособных клеток после действия алкерана в МТТ-пробе и клинической эффективностью алкерана (сарколизина). При анализе фармакодинамических кривых ясно виден дозозависимый эффект алкерана, то есть при увеличении его концентрации, количество живых клеток уменьшается.

Токсичность лечения алкераном у чувствительных больных была невысокой. Наиболее часто встречались тошнота и рвота (23,8% больных). Осложнения со стороны гематологических показателей наблюдались у 19% больных, при этом дополнительного лечения не требовалось.

Медиана выживаемости от начала лечения рецидива алкераном ( сар-колизином) составила 13 месяцев. При сравнении продолжительности жизни в двух группах: в группе резистентных больных, леченных стандартными программами XT, и в группе резистентных больных, леченных сарколизином получены различающиеся данные ( медиана выживаемости в группе лечения сарколизином составила 80,6 месяцев, в группе стандартного лечения — 53,6 месяцев, р=Ю,19).

Следующим этапом нашего исследования было определение клинической значимости МТТ-анализа в культуре с флюдарабином. При скрининге чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину были получены результаты, демонстрирующие более высокую чувствительность опухолевых клеток ранее не леченных больных по сравнению с рефрактерными и согласующиеся с данными литературы [24]. В дальнейшем, 35 больным ХЛЛ была проведена терапия флюдарабином.

Противоопухолевый эффект флюдарабина выражался в значительном и достоверном снижении лейкоцитоза с 140,7±23,5 до 16,9±3,8 тыс/мл и абсолютного лимфоцитоза с 131±22,3 до 12,3±3,7 тыс/мл, уменьшении ор-ганомегалии, уменьшении зон увеличенных лимфоузлов с 10,8±0,5 до 4,4±0,6, достоверном увеличении нейтрофилов с 7,9±1,2 до 41,9±4,6 тыс/мл, тромбоцитов с 179,1±6,5 до 214,9±13,8 тыс/мл и гемоглобина с 110,6±4,9 до 122,2±2,4 г/л. Положительная динамика клинического статуса выражалась в улучшении общего самочувствия и повышения качества жизни. В результате проведенного лечения 35 больным ХЛЛ 63% ответили на терапию, среди 28 рефрактерных больных более половины (57,1%) достигли полной (7 пациентов) и частичной ремиссии (9 пациентов), клинический ответ не зависел от стадии заболевания.

Выявлена взаимосвязь между результатами МТТ-теста и клинической эффективностью флюдарабина у больных ХЛЛ. Значения LD 50 в группах ответивших и неответивших пациентов имели достоверные отличия и составили 1,1±0,3 мкг/мл и 5,1±1,8 мкг/мл, соответственно (р<0,01). Лучший клинический результат достигался у больных, в МТТ-пробе которых LD50 был менее 2,5 мкг/мл.

В дальнейшем, по результатам жизнеспособности опухолевых клеток с различными концентрациями флюдарабина in vitro были выделены 2 группы более (15 больных) и менее чувствительных (8 больных) в МТТ-тесте. LD 50 в этих группах достоверно различались, в группе более чувствительных среднее значение LD50 составило 0,2 мкг/мл, в группе менее чувствительных среднее значение LD 50 было выше 3,6 мкг/мл. При анализе клинической эффективности терапии флюдарабином в этих 2-х группах большая была выявлена среди более чувствительных больных (80% ответивших) по сравнению с менее чувствительными (44,4% ответивших).

Таким образом, МТТ-анализ может использоваться как достоверный тест в определении чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину in vitro. Он позволяет прогнозировать клиническую значимость препарата и, тем самым, избегать неоправданного назначения неэффективных противоопухолевых агентов. Учитывая высокую стоимость лечения флюдара-?! бином, применение МТТ-теста становится еще более актуальным и с экономической точки зрения. При концентрации флюдарабина в МТТ-тесте по LD50 менее 2,5 мкг/мл можно прогнозировать вероятность достижения 80% полной или частичной ремиссии у резистентного больного XJIJI.

В группах ответивших и не ответивших на лечение флюдарабином рассмотрены фармакодинамические кривые жизнеспособности опухолевых клеток в зависимости от 5 концентраций флюдарабина в МТТ-пробе. При 3-х начальных концентрациях, включая ТПК, среднее количество живых клеток в группе ответивших достоверно меньше, чем у больных не ответивших на терапию флюдарабином. Эти данные подтверждают взаимосвязь между клинической эффективностью и количеством оставшихся живыми опухолевых клеток больного после воздействия флюдарабина в МТТ-тесте. При увеличении концентрации флюдарабина в культуре количество живых клеток уменьшается: прослеживается дозозависимый эффект. При достижении концентрации 11,1 мкг/мл количество живых клеток становится приблизительно одинаковым и у ответивших, и у неответивших больных. Из этого можно сделать вывод, что увеличение концентрации более 11,1 мкг/мл не увеличивает дополнительно гибель клеток.

Токсичность лечения флюдарабином была следующей: у 6 больных (17,2%) наблюдалась гематологическая токсичность I-П степени, не требующая вмешательства. У 8 больных (22,9%) возникли серьезные осложнения в виде грибкового стоматита и пневмоний, которые удалось купировать в результате лечения. Однако, у одной пациентки (2,9%) наступил летальный исход из-за тяжести состояния,связанного с развитием двусторонней пневмонии, несмотря на адекватную терапию. С исследованием чувствительности опухолевых клеток в МТТ-тесте это было не связано.

При проведении анализа выживаемости больных XJIJI, получающих флюдарабин, выявлено, что больные наблюдались в течение 4-36 месяцев. Медиана выживания еще не достигнута. Выживаемость больных через 7 месяцев лечения флюдарабином составила 78%. Сравнение продолжительности жизни рефрактерных больных ХЛЛ: в группе, получающих флюдарабин, и в группе, получающих стандартную XT, показало достоверные различия (медиана выживания на флюдарабине 112 месяцев, на стандартной XT 53,6 месяцев). Кроме того, в группе получающих флюдарабин очень мало полных наблюдений, большее количество больных еще живы и продолжают лечиться или наблюдаться, что при получении положительных результатов может еще увеличить медиану выживаемости.

Таким образом, внедрение детерминированного подхода в лечении резистентных больных ХЛЛ, основанного на предварительном определении чувствительности опухолевых клеток к цитостатическим препаратам лабораторным путем, позволило оптимизировать назначение ХП, повысить их эффективность и снизить при этом миелотоксичность, а соответственно, уменьшить осложнения, обусловленные лекарственной цитопе-нией.