Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характеристика цитокинового статуса и регуляторных Т-клеток при физиологической беременности и гестозе

003052953

На правах рукописи

ДУДАРЕВА Алла Витальевна

ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИТОКИНОВОГО СТАТУСА И РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ ИГЕСТОЗЕ

О

14.00.36 — Аллергология и иммунология 14.00.01 — Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск—2007

003052953

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Елена Рэмовна Черных

доктор медицинских наук, профессор

Наталья Михайловна Пасман

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Ирина Анатольевна Орловская Галина Александровна Скосырева

Ведущая организация:

Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (г. Томск)

на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 при ГУ НИ институте клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИ института клинической иммунологии СО РАМН (630099, г.Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14)

Автореферат диссертации разослан «_»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Ольга Тимофеевна Кудаева

Защита состоится «_

»

2007 г. в

часов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Гестоз является одним из наиболее тяжелых осложнений беременности, занимает 2-3 место в структуре материнской смертности и обусловливает наиболее высокий процент перинатальных осложнений (Кустаров В.Н., 2000; Репина М.А., 2005). Несмотря на пристальное внимание к данной проблеме, пусковые механизмы гестоза остаются до сих пор невыясненными. В силу многообразия клинических проявлений данное осложнение не всегда диагностируется вовремя, а существующие методы прогнозирования, профилактики и лечения гестоза недостаточно эффективны (Серов В.Н., 2001; Сидорова И.С., 2003; Сотникова Н.Ю., 2005). Вместе с тем своевременная и правильная диагностика, оценка степени тяжести гестоза имеют принципиальное значение для исхода беременности и родов.

Согласно современным представлениям важную роль в развитии патологии беременности отводят иммунным нарушениям. Известно, что физиологическое течение беременности ассоциировано с формированием иммунологической толерантности к аллоантигенам плода. Одним из механизмов формирования толерантности является щггокин-опосредованная супрессия, которая обусловлена доминированием Th2/Th3 цитокинов. В то же время доминирование Thl цитокинов сопряжено с патологическим характером гестации, в частности преждевременным прерыванием беременности (Maksheed М.,2001; Raghupathy R., 2001). Повышенный уровень Thl цитокинов отмечается и при гестозе (Сухих Г.Т., 2005; Darmochwal-Kolarz D., 1999). Вместе с тем, рядом авторов показано, что течение гестоза может быть сопряжено не только с увеличением Thl цитокинов, но и повышенной продукцией Th2 цитокинов, а также с одновременным возрастанием уровня ТЫ и Th2 цитокинов (Rein D.T., 2002; Marzni М., 1996; Omu А.Е., 1999). Таким образом, данные, характеризующие продукцию различных цитокинов при осложненном течение беременности, носят неоднозначный характер.

Наряду с цитокинами, важное значение в формировании и поддержании иммунологической толерантности могут иметь регуляторные Т-клетки с супрессорной активностью. Среди них особый интерес представляют естественные супрессорные С04+С025+Т-клетки. В последние годы их роль широко обсуждается в контексте подавления трансплантационных реакций при пересадках аллогенных органов и тканей (Kuniyasu Y., 2002; Fehervari Z., 2004; Sanchez-Frueyo A., 2002). В то же время сведения о данной популяции Т-клеток при физиологической беременности у человека, а тем более при поздних осложнениях беременности, практически отсутствуют.

Одной из важных задач является разработка эффективных методов профилактики и лечения гестоза, которые на сегодняшний день представляют исключительно симптоматическую терапию. Известно, что развитие гестоза ассоциировано с неполноценной лютеиновой фазой (НЛФ) в результате не-

достаточной продукции прогестерона (Сидорова И.С., 2003). НЛФ является также причиной самопроизвольного прерывания беременности, которое успешно корригируется назначением аналога прогестерона — дюфастона (Сидельникова В.М., 2002; Сидорова И.С., 2005; Овсянникова Т.В., 2004). Поскольку эффект дюфастона во многом связывают с его способностью индуцировать ТЫ—>ТЬ2ЛЪЗ переключение (МакяЬеес! М., 2001), можно полагать, что данный препарат в силу иммуномодулирующего эффекта может предотвращать в последующем и развитие гестоза. Однако исследование влияния дюфастона на уровень цитокинов во второй половине беременности и частоту развития гестоза у беременных из группы риска по прерыванию беременности до сих пор не проводилось.

Все вышесказанное определило цель и задачи исследования.

Цель исследования:

На основе исследования баланса ТЬ1ЛЪ2 цитокинов и регуляторных Т-клеток изучить клеточно-молекулярные механизмы иммуносупрессии при физиологической и осложненной гестозом беременности.

Задачи исследования:

1. Оценить биологическую активность сывороток крови и содержание ТЫ/ТЪ2 цитокинов в супернатантах КонА-стимулированных клеток цельной крови при физиологической беременности и гестозе.

2. Охарактеризовать количественное содержание С04+С025+ и

Т-лимфоцитов в периферической крови у беременных в исследуемых группах и оценить сопряженность показателей с тяжестью гестоза.

3. Исследовать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в культурах анти-СБЗ-стимулированных клеток, а также уровень спонтанного и индуцированного апоптоза Т-клеток у беременных с физиологическим и осложненным течением гестации.

4. Исследовать уровень продукции ТЫЛЪ2 цитокинов и частоту развития гестационных осложнений (угрозы прерывания беременности, фетопла-центарной недостаточности, гестоза) в группах беременных, применявших и не использовавших гестаген дидрогестерон (дюфастон).

Научная новизна исследования

В результате комплексного исследования цитокинового статуса расширены представления о спектре ТЫ/ТЬ2 цитокинов и их суммарной биологической активности при физиологической и осложненной гестозом беременности. Полученные результаты свидетельствуют о выраженной супрессорной активности сывороток крови и доминировании ТЬ2-цитокинов при физиологической беременности. У беременных с тяжелым гестозом в периферической циркл-ляции регистрируется повышение продукции как ТЬ1, так и тЬ2-цитокинов. При этом оценка супрессорной активности сыворотки крови и соотношения отдельных ТЫЛЪ2 цитокинов указывают на снижение содержания факторов/цитокинов с супрессорной активностью при развитии гестоза.

Впервые показано, что физиологическая беременность сопряжена не только с изменением баланса цитокинов, но и увеличением в циркуляции естественных регуляторных СТ)4+С025"ьТ-клеток, в том числе с высокой экспрессией С025 молекул (С04+С025МгЬ'), причем возрастание численности С04+СЛ25+ Т-клеток характерно именно дня физиологической беременности и не регистрируется при беременности, осложненной гестозом. На основе анализа уровня пролиферативного ответа и апоптоза Т-клеток в а-СОЗ-стимулированных культурах МНК охарактеризовано состояние функциональной активности Т-клеток при различных вариантах течения беременности.

Выявленные новые данные об обратной корреляционной зависимости между супрессорной активностью сыворотки крови и содержанием СБ4+СБ25+/ С04+С025ЬпгЫ Т-клеток со степенью тяжести гестоза подтверждают важность нарушения гестационной иммуносупрессии в развитии поздних осложнений беременности.

В результате исследования цитокинового статуса у женщин, принимавших дюфастон, впервые показано, что иммуномодулирующее влияние дю-фастона во второй половине беременности проявляется нормализацией продукции цитокинов и восстановлением функциональной активности Т-клеток у беременных из группы риска по развитию гестоза и невынашиванию беременности.

Теоретическая и практическая значимость

На основании изучения особенностей цитокинового баланса и характеристики естественных регуляторных СЮ4+СБ25+ Т-клеток при беременности сделано заключение о важной роли иммуносупрессии в процессе физиологической гестации и нарушении клеточно-молекулярных механизмов иммуносупрессии при гестозе.

Проведенные исследования позволили выявить новые иммунологические маркеры, которые могут служить дополнительным критерием степени тяжести гестоза. Изучение иммуномодулирующего эффекта гестагена дюфастон на продукцию ТЫ/ТЪ2 цитокинов позволило разработать принципиально новый подход к профилактике гестоза в группах высокого риска, что имеет большое практическое значение для предотвращения репродуктивных потерь — снижения перинатальной и младенческой смертности, обусловленной хронической внутриутробной гипоксией плода, развивающейся на фоне гестоза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Физиологическая иммуносупрессия второй половины беременности ассоциирована с преобладанием в сыворотке крови факторов с супрессор-ным действием, доминированием ТЬ2/противовоспалительных цитокинов и увеличением относительного содержания естественных регуляторных клеток с фенотипом СБ4+С025+, в том числе с высокой экспрессией СЮ25 молекул (С04+С025ь"®ы).

2. Развитие гестоза сопряжено со снижением супрессорной активности сыворотки крови, усилением продукции Thl- и Th2 цитокинов и уменьшением содержания естественных регуляторных Т-клеток.

3. Применение дюфастона у женщин с угрозой самопроизвольного прерывания беременности характеризуется выраженным иммунокорригиру-ющим эффектом и приводит к снижению частоты развития гестоза в результате нормализации цитокинового баланса.

Объем и структура диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 117 страницах машинописного текста, включающего 18 таблиц и 3 рисунка. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 222 литературных источника, в том числе 121 иностранных.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях врачей «Актуальные вопросы медицины» (Новосибирск, 2004; Новосибирск, 2005), республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005),VI-VII Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2005-2006).

Апробация работы состоялась на расширенном семинаре ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН 21 ноября 2006 г. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 тезисов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационная работа основана на результатах клинико-лабораторного и иммунологического обследования 185 женщин с физиологической и осложненной гестозом беременностью, которые наблюдались на базе женской консультации детской специализированной клинической больницы №5, родильного дома ГКБ №1 и родильного дома №4 г. Новосибирска. Обследование включало: сбор соматического и акушерско-гинекологического анамнеза, ультразвуковое исследование (УЗИ) плода, доплерометрию, кардиотоко-графию (КТГ), лабораторные (общий анализ крови, мочи), биохимические и микробиологические исследования. Степень тяжести гестоза оценивалась по совокупности клинических и лабораторных показателей, данных УЗИ, КТГ и доплерометрии с использованием разработанных в 1990 году и дополненных в 1996 году критериев тяжести гестоза (Пасман Н.М., 1996).

Иммунологическое обследование. Венозную кровь для изучения иммунных показателей получали путем венепункции после информированного согласия. Забор крови у беременных осуществляли во II-III триместре бе-

ременности. На момент забора крови беременные не имели хронических заболеваний в стадии обострения, острых инфекционных заболеваний и эндокринной патологии. Все иммунологические исследования проводились на базе лаборатории клеточной иммунотерапии Института клинической иммунологии СО РАМН.

В иммунологическое исследование были включены 76 женщин с физиологической беременностью (1-я группа) и 109 женщин с гестозом различной степени тяжести (2-я группа). Контрольную группу составили 58 женщин — здоровых доноров крови репродуктивного возраста. Сформированные группы беременных были сравнимы по возрасту, срокам гестации, отсутствию эндокринной патологии и тяжелых соматических заболеваний. Средний возраст обследуемых в группах составил, соответственно, 25,1 ± 0,7 (1-я группа), 23,3 ± 0,4 (2-я группа) и 27,8 ± 0,7 лет (контроль). Сроки гестации в 1-й группе варьировали от 29 до 37 (в среднем 32,8 ± 0,7) недель, во 2-й группе — от 28 до 36 (в среднем 32,0 ± 0,7) недель.

Сыворотку и мононуклеарные клетки (МНК) из венозной цельной или гепаринизированной крови выделяли стандартными методами. МНК в концентрации 0,1х106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в полной культуральной среде RPMI-1640 (Sigma) при 37 °С в С02-инкубаторе. Для стимуляции клеток применяли конканавалин А (КонА, 15 мкг/мл, Sigma) или анти-С03 моноклональные антитела (анти-СБЗмАТ, 1мкг/мл, «Медбиоспектр», Москва). В отдельной серии экспериментов использовали рекомбинантный IL-2 (50 ME/мл, препарат Ронколей-кин, «Биотех», С-Пб). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению ЗН-тимидина (1 цКю/лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования.

Определение субпопуляции CD4+CD25+ Т-клеток проводили методом проточной цитофлюориметрии (FACSCalibur, Becton Dickinson), используя Fll'C-меченные анти-С04 антитела и РЕ-меченные анти-С025 антитела (Phar-Mingen, San Diego, США). Процентное содержание апоптотических лимфоцитов также рассчитывалось с помощью метода проточной цитофлюориметрии по одномерной гистограмме оранжевой флуоресценции клеток (FL-2), отнесенных к лимфоцитарному региону. Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик при окрашивании пропидиум иодидом (Sigma, 50 мкг/мл).

Сыворотку беременных женщин получали из венозной крови. Наличие в сыворотке супрессорной активности определяли по степени снижения КонА-индуцированной пролиферации МНК доноров (п = 3) в присутствии 10% ин-тактной сыворотки обследуемых женщин (опыт) в сравнении с уровнем ми-тогенного ответа в присутствии 10% интактной сыворотки доноров (контроль). Полученные результаты выражали в виде индекса супрессорной ак-

тивности (ИСА), рассчитанного по следующей формуле: ИСА = О -г К. Значения ИСА менее 0,85 расч.ед. свидетельствовали об иммуносупрессорной активности регуляторных факторов.

Для оценки продукции цитокинов гепаринизированную венозную кровь разводили 1:4 средой RPMI-1640, дополненной 100 мкг/мл гентамицина, и стимулировали конканавалином А (Кон A, Sigma) в концентрации 15 мкг/мл в течение 24 ч. Содержание цитокинов оценивали методом проточной флюориметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 9-Р1ех (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной и непараметрической статистики с использованием программы «STATISTICA 5,0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Баланс ТМ/провоспалительных иТк2/противовоспалительных цитокинов при физиологической и осложненной гестозом беременности.

Для изучения баланса цитокинов при физиологической и осложненной гестозом беременности на первом этапе в качестве интегрального показателя супрессорных факторов была исследована супрессорная активность сывороток крови беременных в исследуемых группах. Супрессорную активность сывороток крови определяли по их способности ингибировать КонА стимулированную пролиферацию МНК здоровых доноров и выражали в индексе супрессорной активности (ИСА). В контрольной группе здоровых небеременных женщин супрессорная активность в сыворотках крови не выявлялась. В то же время у женщин с физиологической беременностью сыворотки крови обладали выраженной супрессорной активностью, о чем свидетельствует достоверное снижение среднего значения ИСА (рис. 1).

В группе женщин с гестозом супрессорная активность сывороток крови была достоверно снижена. При этом анализ индивидуальных значений показал, что если при физиологической беременности супрессорная активность выявлялась у подавляющего большинства женщин, то при гестозе — только у половины беременных. Соответственно частота встречаемости беременных с наличием супрессорной активности сыворотки крови в группе женщин с гестозом была достоверно ниже, чем у женщин с физиологической беременностью (Р^2 = 0,004).

Исследования в группах беременных с различной степенью тяжести гес-тоза показало, что по мере нарастания степени тяжести наблюдалось прогрессирующее снижение супрессорной активности, как на уровне средних

значений, так и на уровне индивидуальных показателей (табл. 1). Так, лри гестозе легкой степени суирессорная активность выявлялась у 65% женщин, тогда как при гестозе тяжелой степени в 2 раза реже.

Небереыенные Фиэ беременность

Рис. 1. Показатели супрессорной активности сыворотки крови (ИСА)

в исследуемых группах. * — Ри < 0,05 достоверность различий с группой небеременных; и — критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Таблица 1

Показатели суирессорной активности сыворотки крови при физиологической и осложненной гестозом беременности

Группы беременных ИСА (расч. ед.) Частота всгречаемости беременных с наличием супрессориой активности (%)

Физиологическая беременность (п=41) 0,67 ± 0,02 (0,7-0,9) 85% (35/41)

Гестоз (общая группа) (п=б0) 0,79 ±0,03* (0,7-0,93) 53% (32/60)

Гестоз легкой степени (п=20) 0,77 ±0,03* (0,7-0,86) 65% (13/20)

Гсстоз средней степени (п=24) 0,81 ±0,06* (0,73-0,9) 58% (14/24)

Гестоз тяжелой степени Мб) 0,87 ± 0,03* (0,8-0,93) 31% (5/16)

Примечание: * — Рц < 0,05 — достоверность различий в иодгруштах беременных по сравнению с группой женщин с физиологической беременностью (У — критерий Вилкоксона-Манна-Уитни); п — число наблюдений.

Чтобы выяснить, насколько полученные различия супрессорной активности сыворотки крови связаны с изменением баланса цитокинов, далее была исследована продукция ТЫ и ТЫ цитокинов в супернатантах Кон-А стимулированных клеток цельной крови (табл. 2).

Таблица 2

Уровень продукции цитокинов в супернатантах КонА-стимулированных клеток цельной крови при физиологической беременности

Цитокины (пкг/мл) Контроль (п = 14) (небеременные) Группа 1 (п = 37) (физиологическая беременность)

ЮТ-а 265 ±63 244 ±135

1Ш-у 183 ±58 149 ±41*

1Ь2 131 ±48 140 ±74

ГЬ-12 9,0 ±1,5 17,8 + 2,1

ОМ-СЗБ 14 ±1,5 14,6 ±4,9

1Ь-4 6,5 ± 0,4 9,6 ± 5,9

ПЛО 70 ±11,6 78,3 ±25

1Ь5 5,7 ±0,8 8,0 ±2,0

ПЛЗ 5,4 ±1,0 12,7 ± 9,2

1Ш-у/ПЛЗ 62 ±11 23 ± 5,9*

Примечание: * — Р < 0,05 — достоверность различий между группами небеременных (контроль) и женщинами с физиологической беременностью (и — критерий Вилкоксона-Манна-Уитни); п — число наблюдений.

Как видно при физиологической беременности регистрировалось достоверное снижение ШЯ-у и тенденция к снижению ТМР-а. В то же время концентрация 1Ь-13 была повышенной и выявлялась тенденция к усилению продукции 1Ь-5 и 1Ь-10. В результате при физиологической беременности отмечалось смещение баланса в сторону преобладания ТЬ2- цитокинов. Наиболее ярко это проявлялось в изменении индекса соотношения 1НЧ-7ЛЬ-13, средний уровень которого у беременных был в 3 раза ниже, чем у небеременных женщин. При гестозе характер продукции цитокинов был совсем иным (табл. 3). В частности, по сравнению с физиологической беременностью наблюдалось выраженное увеличение продукции ЮТ^у (в среднем в 2,8 раза) и Т№-а (в 1,9 раза). При этом анализ индивидуальных значений выявил выраженное повышение продукции ПТ^-у (выше верхней квартили диапазона значений при физиологической беременности) у 57% беременных, а Т№-а у 62% беременных.

Содержание Thl/провоспалительных и ТЬ2/противовоспалнтельных цитоки-нов в супернатантах МНК в группах беременных

Цитокины (пкг/мл) Физиологическая беременность (группа 1; n= 37) Беременные с гестозом (группа 2; п = 30) Ри1-2

TNF-a 244+135 416 ± 100 Р1-2 < 0,05

IFN-Y 149 + 41 364 ±142 Р1-2 < 0,05

JL-2 140±74 164 ±82

IL-12 17,8 ±2,1 10,6 ± 1,7

GM-CSF 14,6 ±4,9 20,1 ±5,0

IL-4 9,6 + 5,9 20,1 ± 8,5 Р1-2 < 0,01

IL10 74,6 ±25 123+47 Р1-2 < 0,05

IL13 12,7 ± 9,2 34,0 +12 Р1-2 < 0,05

Ib5 8,0 + 2,0 14,6 ±4,5

Примечание: Pu — достоверность различий между группами 1 и 2 (U — критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Примечательно, что продукция ТЬ2/противовоспалительных цитокинов при гестозе была также повышена. Так, концентрация 1Ь-13 в супернатантах клеток цельной крови беременных с гестозом практически в 3 раза превышала таковую у женщин с физиологической беременностью, а средний уровень 1Ь-4 и 1Ь-10 был повышен в 2 раза. Причем выраженное усиление продукции 1Ь-13 и 1Ь-4 выявлялась в 50% случаев, а П_-10 — у каждой третьей женщины. При анализе индексов соотношения отдельных ТЫ/ТЪ2 цитокинов у беременных с гестозом значимых различий по сравнению с физиологической беременностью выявлено не было. Тем не менее, женщины с гестозом характеризовались тенденцией к возрастанию индекса соотношения 1Ш-уЛЬ-13 (33,0 ± 5 У5 22,9 ± 5,9), что в совокупности с данными о снижении супрессорной активности сыворотки крови указывало на более выраженное доминирование ТЫ - цитокинов.

Характеристика СБ4*СВ25* регуляторных Т-клеток при физиологической и осложненной гестозом беременности.

Наряду с цитокинами важную роль в развитии гестационной супрессии могут играть регуляторные Т-клетки с супрессорной активностью, в частности СБ4+С025+ Т-клетки, способные контролировать ответ на аллоантиге-ны. Поэтому следующий этап был посвящен исследованию количества С04+С025+ Т-клеток при физиологической и осложненной беременности. Учитывая, что супрессорная активность опосредуется минорной субпопуляции СВ4+ клеток с высокой экспрессией СБ25 молекул, помимо общего

количества СБ4+СБ25+ Т-клеток определяли количество так называемых СБ4+СВ25ЬпгЬ( клеток.

Таблица 4

Относительное содержание естественных регуляторных Т-клеток в исследуемых группах

Показатель Контрольная группа (п = 27) Физиологии, беременность (п = 23) Беременные с гестозом (п = 33) Ри

1 2 3

СВ4+С1)25+ (%)

М ± Э.Е. 4,9 + 0,4 9,9 ±0,9 5,6 ± 0,6 Р1-2 < 0,05

1Х>и<з 3,4 -6,1 5,3 -12,6 3,4-8,2 Р2-3 < 0,05

МесЛап 5,6 11,0 4,3

С1УМШ5Ъл011(%)

М ± 8.Е. 0,88 ± 0,09 1,0 ±0,1 0,59 ± 0,08 Р2-3 < 0,05

0,77 -1,0 0,72-1,45 0,32-0,89

МесЦап 0,86 0,99 0,47

Примечание: Ри—достоверность различий между группами (и — критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Как видно из данных таблицы 4, содержание СЮ4+СЮ25+ Т-клеток при физиологической беременности в среднем в 2 раза превышало аналогичный показатель у небеременных. В то же время при гестозе увеличения СБ4+С025+ Т-клеток не наблюдалось. Поэтому относительное содержание этих клеток было достоверно ниже, чем при физиологической беременности. При анализе СБ4 Т-лимфопитов с высокой экспрессией С025 молекул достоверного увеличения относительного содержания СЛ}4+С025Ьг^ы клеток при физиологической беременности не обнаруживалось. Тем не менее, при гестозе их количество было достоверно снижено. При этом важно отметить, что дефицит регуляторных Т-клеток усиливался по мере нарастания тяжести гестоза. Действительно, корреляционный анализ выявил тесную обратную взаимосвязь между степенью тяжести гестоза и содержанием СБ4+С025+-клеток (гБ = -0,48; р = 0,00017) и С04+(Л)25ЫЕ1л-кпеток (гв = = -0,6; р = 0,00016).

Таким образом, помимо изменения цитокинового баланса, течение физиологической беременности сопряжено с увеличением в периферической циркуляции регуляторных Т клеток с супрессорной активностью. При гестозе этого не происходит, т.е. дефицит СЕН регуляторных Т-клеток при гестозе является еще одним механизмом нарушения гестационной иммуносупрессии.

Функциональная активность Т-лимфоцитов при физиологической и осложненной гестозом беременности.

Для того чтобы оценить, насколько реализуется эффект цитокинов и ре-гуляторных Т-клеток при физиологической и осложненной беременности, мы исследовали уровень пролиферации лимфоцитов в исследуемых группах (табл. 5).

Таблица 5

Пролиферативная активность Т-клеток в исследуемых группах

Интенсивность пролиферации (имп./мин)

Показатель Контрольная группа (п = 16) Физиол. беременность (п = 30) Беременные с гестозом (п=18) Ри

1 2 3

Спонтанная пролиферация 618±177 621±54 496±92

11^2- стимулированная пролиферация 1373±154 1354±220 2001±330 Р1-3 <0,05 Р2-3 <0,05

Анти-СЮЗ- 34713±6419 27776±1919 23639+2311 Р1-3 <0,05

стимулированная пролиферация Р1-2 <0,05

Примечание: Ру— достоверность различий между группами (Л — критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Уровень спонтанной пролиферации у небеременных и беременных из оппозитных групп был сопоставим. В то же время при гестозе отмечалось усиление пролиферативного ответа МНК на 1Ь-2. Учитывая, что экспрессия рецепторов к 1Ь-2 усиливается после активации Т-клеток, можно полагать, что осложненное течение беременности ассоциировано с увеличением в циркуляции активированных Т-клеток. Интенсивность анти-СБЗ-стимулированной пролиферации при физиологической беременности была снижена, что могло отражать повышенный уровень иммуносупрессивных цитокинов и регуляторных СБ4+СР25+ Т-клеток. При гестозе, в условиях дефицита регуляторных Т-клеток и отсутствия супрессорной активности в сыворотке крови, пролиферативный ответ Т-лимфоцитов, казалось бы, должен был быть повышенным. Однако, вопреки этому, пролиферативная активность Т-клеток при осложненной гестозом беременности оказалась сниженной. Причем снижение пролиферативного ответа Т-клеток выявлялось в 2 раза чаще, чем при физиологической беременности (62 уб 25%).

Поскольку течение гестоза ассоциировалось с признаками активации лимфоцитов, и именно активированные лимфоциты при стимуляции подвергаются апоптозу, выявленное угнетение пролиферативного ответа Т-клеток могло быть обусловлено программированной гибелью Т-лимфоцитов. Дей-

ствительно, исследование показателей апоптоза лимфоцитов выявило усиление при гестозе спонтанного апоптоза лимфоцитов и активационного апоптоза Т-клеток.

Таблица б

Уровень спонтанного и активационного апоптоза лимфоцитов у женщин с физиологической беременностью и гестозом (%)

Физиологическая беременность (1 группа, п = 23) Беременные с гестозом (2 группа, п = 13) Ри

Нестимулированные культуры МНК 6,18 ±0,9 (1,5-9,5) 9,8 + 1,1 (7 -13,5) Р1-2 < 0,05

аСБЗ-стимулированные культуры МНК 8,4 ±1,2 (2,2-11,4) 11,0 ±1,4 (9,2-14,0) Р1-2 <0,05

Примечание: МНК культивировали в отсутствие и присутствии a-CD3 в течение 24 час и определяли относительное содержание апоптотических лимфоцитов. Ри — достоверность различий между группами 1 и 2 (U — критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Возрастание апоптоза может быть обусловлено усилением продукции Thl и Th2 цитокинов, ряд из которых обладает выраженной апоптоз-индуцирующей активностью в отношении активированных Т-лимфопитов. Полученные нами результаты хорошо согласуются с данными о том, что одним из характерных признаков гестоза является абсолютная и относительная лимфопения, коррелирующая с тяжестью гестоза. Следовательно, можно полагать, что повышенный уровень активационного апоптоза Т-клеток, не является чисто культуральным феноменом, а реализуется in vivo, являясь одной из причин снижения в циркуляции количества лимфоцитов.

Влияние дюфастона на функциональную активность Т-клеток и развитие гестационных осложнений у женщин с угрозой невынашивания и развития гестоза.

Согласно данным литературы, осложнения второй половины гестации во многом обусловлены иммунными дисфункциями, развивающимися на фоне снижения прогестерона, способного индуцировать Thl—>Th2/Th3 переключение. Назначение прогестерона или его аналогов, например, дюфастона, в первой половине беременности при угрозе невынашивания позволяет сохранить беременность. Учитывая полученные выше данные о нарушении цито-киновго баланса при гестозе, можно полагать, что коррекция цитокиновго статуса на ранних стадиях гестации может предотвращать развитие поздних осложнений, в частности, гестоза. Исходя из вышесказанного, последний раз-

дел работы был посвящен исследованию частоты развитая гестадионных осложнений и функциональной активности Т-клеток у женщин с риском самопроизвольного прерывания беременности и развития гестоза в подгруппах беременных, получавших и не получавших лечение дюфастоном.

Чтобы оценить частоту развития гестационных осложнений были сформированы 2 группы беременных с наличием угрозы прерывания беременности в 1 триместре и высоким риском развития гестоза (более 18 баллов по шкале риска развития гестоза). В основной группе беременные принимали для сохранения беременности препарат дюфастон с ранних сроков до 16-20 нед. в дозе 20-40 мг в сутки. Во второй (контрольной) группе дюфастон не принимался, но, несмотря на это, беременность сохранилась. Этим беременным в критические сроки (как и женщинам из основной группы) назначалась профилактическая терапия с использованием дезагрегантов, антиок-сидантов, энтеросорбентов и актовегина.

Всем беременным проводилось общеклиническое, ультразвуковое исследование в I, II и III триместрах, доплерометрия и кардиотокография в III триместре гестации. Беременные основной и контрольной групп были сопоставимы по возрасту, паритету, срокам беременности. При анализе гинекологического анамнеза (табл. 7) обращает внимание тот факт, что у пациенток основной группы выявлялась более высокая частота встречаемости гинекологической патологии, в частности, воспалительных заболеваний органов малого таза, наличия бесплодия в анамнезе, нарушения овариаль-но-менструального цикла (аменорея, гипоменструальный синдром, гипер-полименорея), замершей беременности в анамнезе. Однако за исключением последнего случая, различия в частоте встречаемости этих осложнений проявлялись только в виде тенденций и не были достоверны.

Таблица 7

Особенности гинекологического анамнеза у пациенток основной и контрольной групп

Заболевания и осложнения Основная группа (Дюфастон+) (и = 43) Контрольная группа (Дюфастон-) (п = 32)

п % п %

Воспалительные заболевания органов малого таза 11 25,6% 5 15,6%

Бесплодие 10 23,6% 3 9,4%

Нарушение овариально-менструального цикла 6 13,9% 2 6,3%

Замершая беременность в анамнезе 12 27,9%* 0 0%

Анализируемые группы были также достаточно однородны по наличию экстрагенитальной патологии, которая у 51% пациенток основной и у 43, 8% беременных контрольной групп выявлялась в виде 2-4 экстрагениталь-ных заболеваний (табл. 8). Первое место среди экстрагенитальной патологии по частоте встречаемости в обеих группах занимала вегето-сосудистая дистония по гипотоническому типу, второе — заболевания почек, третье — эндокринопагии (заболевания щитовидной железы).

Таблица 8

Частота экстрагенитальной патологии у беременных основной и контрольной групп

Заболевания Основная группа (Дюфастон+) (п = 43) Контрольная группа (Дюфастон-) (п=32)

п % п %

Вегето-сосудистая: дистония по гипотони- ческому типу 26 60,4% 12 43,8%

Заболевания почек (хрон. пиелонефрит) 12 27,9% 6 21,8%

Ожирение 7 16,2% 4 12,5%

Патология щитовидной железы 5 11,6% 4 12,5%

Хронический холецистит 6 13,9% 5 15,6%

Хронический гастрит 2 4,7% 1 3,1%

Течение беременности у пациенток двух групп в I, II и III триместрах осложнилось угрозой прерывания беременности, частота которой значительно превысила таковую в общей популяции, что обусловлено их отягощённым акушерско-гинекологическим анамнезом, и составила в I триместре в 1 группе 37,2%. Во второй группе пациенток, не принимавших дюфастон, показатель угрозы прерывания беременности был в 1,8 раза выше по сравнению с основной группой и составил 65,6% (р < 0,05). Во втором триместре беременности в контрольной группе частота угрозы прерывания беременности вдвое превысила показатели основной группы, составив 56,3% против 27,9%, в третьем триместре, соответственно, 50% и 20,9%.

Полученные результаты доказывают высокую эффективность дюфасто-на в профилактике и лечении угрозы прерывания у беременных с отягощённым акушерско-гинекологическим анамнезом и НПФ. На эффективность дюфастона указывают также (табл. 9) показатели преждевременных родов у пациенток основной и контрольной групп, соответственно составившие 4,7% и 12,5% и синдрома задержки развития плода (СЗРП): данное осложнение не диагностировано ни у одного ребенка, родившегося у женщин основной группы и выявлено у 3 детей (9,37%) контрольной группы.

Частота осложнений беременности у пациенток основной и контрольной групп

Основная группа Контрольная группа

Осложнения (Дюфастон +) (п = 43) (Дюфастон -)(п = 32)

п % п %

Гестоз (общая группа) 7 16,3%** 16 50%

Гестоз лёгкой ст. 7 16,3% 4 12,5%

Гестоз средней степени 0 0%** 7 21,9%

Гестоз тяжёлой ст. 0 0% * 5 15,6%

Хроническая ФПН 9 20,9% * 14 43,8%

Преждевременная отслойка 6,25%

нормально расположенной 1 2,3% 2

плаценты

Синдром задержки разви- 0 0 3 9,37%

тия плода

Преждевременные роды 2 4,6% 4 12,5%

Примечание: * — рп < 0,05; ** — ри < 0,01.

Особый интерес представляют результаты анализа частоты развития гестоза. В основной группе данный показатель был существенно ниже, чем в контрольной (16,3% уя 50%). Причём если в основной группе диагностировались только лёгкие формы гестоза, то в контрольной — преобладали гес-тозы средней и тяжелой степени, а клинические и лабораторные проявления гестоза сохранялись до родоразрешения и у 14 родильниц (43,8%) после родоразрешения. Высокая частота гестоза средней и тяжелой степени позволяет объяснить больший процент такого осложнения, как преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты у пациенток контрольной группы. Неполноценная плацентация в I триместре у женщин с отягощенным анамнезом позволяет объяснить высокую частоту хронической ФПН, достигающий 43,8% в контрольной группе по сравнению с 20,9% основной группы женщин, получавших дюфастон.

Течение родов у пациенток двух групп (табл. 10) также имело отличительные особенности, хотя выявленные различия проявлялись только в виде тенденций. Так в контрольной группе относительное количество абдоминальных родоразрешений, количество экстренных операций кесарева сечения и количество патологических кровопотерь при самопроизвольных родах было выше.

Чтобы выяснить, насколько клинический эффект обусловлен иммуно-корригирующим действием дюфастона, было проведено иммунологическое исследование в 3 группах — у женщин с физиологической беременностью; женщин с риском невынашивания и развития гестоза, и принимавшим в связи с этим дюфастон, и беременных с гестозом тяжелой степени, имевших в анамнезе угрозу невынашивания, но не принимавшие дюфастон.

Особенности течения родов у рожениц основной и контрольной групп

Осложнения родов Основная группа (Дюфастон +) (п = 43) Контрольная группа (Дюфастон-) (п = 32)

п % п %

Слабость родовой деятельности 3 6,9% 5 15,6%

Прогрессирующая ФПН и гипоксия плода 0 0 2 6,25%

Патологическая кровопотеря 0 0 2 6,25%

Оперативные роды (Кесарево сечение), из них экстренное 11 1 25,6% 9,1% 12 4 37,5% 33,3%

Как видно из данных таблицы 11, у женщин с развившимся гестозом, уровень продукции ТИБ-а в III триместре был в 2,5 раза выше, чем при физиологической беременности. Аналогичные изменения регистрировались в отношении ОТЧу.

Таблица 11

Продукция ТМ/провоспалительных и ТЬ2/противовоспалительных цитокинов в культурах клеток крови

Цигокины (пкг/мл) Контроль (п=11) Группа 1 (Дюфастон +) (п = 9) Группа 2 (Дюфастон -) (п = 10) Ри

1 2 3

ЮТ-ос 308 ±98 469 +155 765 + 100

132 340 755 Р1-3 < 0,01

1Ш-у 331 ±60 436 ±141 780 ±142 Р1-3 < 0,01

151 389 823

1Ь2 382 ± 59 224 ±74 466 ±82 Р2-3 < 0,05

361 96 417

ПЛ2 11,2+1,4 11,3 ±2,1 11,9 ±1,7

11,4 11,4 11,9

аМ-С8Б 26 ±6,1 19,9 ±4,9 28,4 ±5,0

25,8 17,6 24,4

1Ь5 9,2 ±2,4 8,4 ±2,0 16,3 ±4,5 Р2-3 < 0,05

6,0 4,7 12,4

ГЬ-4 16,4 ± 6,3 22,7 ±5,9 43 ±8,5 Р1-3 < 0,01

10,2 15,9 38,1 Р2-3 < 0,05

Цитокины (пкг/мл) Контроль (п=Щ Группа I (Дюфастон +) (п = 9) Группа 2 (Дюфастон -) (п=10) Ри

1 2 3

Ш-10 101 ±19 82,5 ± 25,3 273 ± 47 Р1-3 < 0,01

111 51,5 294 Р2-3 < 0,01

ПЛЗ 23,6±10,6 26,9 ± 9,2 57 ±12 Р1-3 < 0,05

5,57 19,9 50

В то же время у женщин, принимавших дюфастон, усиление продукции Т№а и №N4 проявлялось только в виде тенденций, и не было статистически достоверным. Беременные с развившимся гестозом характеризовались также существенным повышением продукции ТТй/противовоспаиительных цитокинов, тогда как в группе беременных, принимавших дюфастон, достоверного усиления продукции Ш-10, ГЬ-4. Г1_-13 не наблюдалось.

Иммуномодулирующее влияние дюфастона отчетливо видно на рисунке 3, где концентрации отдельных цитокинов представлены в виде цроцентно-го выражения от средних значений при физиологической беременности. При гестозе продукция большинства цитокинов повышена, В группе беременных, принимавших дюфастон, уровень цитокинов практически сходен с нормативными показателями.

Прием дюфастона также приводил к нормализации пролиферативной активности МНК. Как следует из данных таблицы 12, у беременных, принимавших дюфастон (группа 1), функциональная активность анти-СОЗ-стимулированных МНК была сопоставима с таковой при физиологической беременности и значимо превышала аналогичный показатель во второй группе.

|_-5

1_-5

вм-сз?

X /

пмрэ^----11-12

| Гастоз

| Контроль

ИД юфасгон

|Контрогь

Рис. 3. Показатели содержания цитокинов в группах женщин с 1-естозом (слева) и беременных, принимавших дюфастон (справа), представленные в процентном выражении от нормативных значений в ко тральной группе, принятых за 100%.

Таблица 12

Пролиферативная активность Т-клегок в подгруппах беременных

Условия культивирования Интенсивность пролиферации (имп/мин) Ри

Контроль (п=1б) 1 группа (Дюфастон +) (и =12) 2 группа (Дюфастон-) (п = 9)

1 2 3

Спонтанная пролиферация МНК 389,2 ±53,9 391,1 ±81,1 395,1 ±90,1

аСБЗ-стимулированная пролиферация МНК 29330±2903,9 26691±2б67,1 18087 ±2209 Р1-3 < 0,05 Р2-3 < 0,05

Таким образом, из представленных данных следует, что беременные с гестозом, имевшие в анамнезе риск невынашивания, но не принимавшие дюфастон, характеризуются развитием иммунных дисфункций в виде усиления продукции ТОТ-а, ГОЧ-у, 1Ь-4,1Ь-10 и 1Ь-13 и снижения пролифера-тивной активности Т-клеток. В группе беременных, имеющих риск развития гестоза и принимавших в связи с угрозой невынашивания дюфастон, достоверных изменений в уровне продукции ТЫ/про- и ТЬ2/противо-воспалительных цитокинов и пролиферативной активности Т-клеток не выявляется, что указывает на иммуномодулирующий эффект дюфастона, сохраняющийся до позднего периода гестации. При этом коррекция иммунных дисфункций ассоциирована с достоверным снижением частоты развития и тяжести как ранних (самопроизвольное прерывание беременности), так и поздних (гестоз) осложнений.

ВЫВОДЫ

1. Доминирование в сыворотке крови регуляторных факторов с супрес-сорной активностью в сочетании со смещением баланса в сторону ТЪ2/противовоспалительных цитокинов и увеличением содержания регуляторных СБ4+С025+ Т-лимфоцитов во второй половине гестации свидетельствует о супрессорной реорганизации иммунной системы при физиологической беременности.

2. Развитие гестоза сопряжено с нарушением гестационной иммуносу-прессии, на что указывает снижение продукции сывороточных супрессор-ных факторов, дисбаланс продукции цитокинов, проявляющийся повышенным содержанием ТЫ- и ТЬ2-цитокинов, а также снижение содержания СБ4+СБ25+ и С04+СВ25Ьпг1й Т-клеток при осложненной беременности.

3. Наличие обратной корреляционной зависимости степени тяжести гестоза с супрессорной активностью сыворотки и содержанием циркулирующих С04+СБ25+ и СЮ4+С025ЬпгЬ' Т-клеток указывает на сопряженность нарушения иммунных механизмов супрессии с тяжестью заболевания.

4. Нормализация продукции цитокинов и пролиферативной активности Т-клеток у женщин с угрозой невынашивания, принимавших в первой половине беременности аналог прогестерона дюфастон, свидетельствует об иммунокорригирующем влиянии дюфастона на параметры иммунитета у беременных во второй половине гестации.

5. Совокупность клинической эффективности дюфастона, проявляющаяся снижением частоты развития тяжелых форм гестоза, и его иммуно-модулирующего действия позволяет использовать дюфастон в качестве профилактического препарата при угрозе развития гестоза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки нарушений гестационной иммуносупрессии, приводящей к развитию гестоза, целесообразно во II- триместре беременности проводить исследование биологической активности сыворотки крови. Повышение индекса супрессорной активности в период, предшествующий клинической манифестации осложнения, свидетельствует о высокой вероятности развития гестоза и диктует необходимость проведения мероприятий по его диагностике и профилактике.

2. Оценка содержания регуляторных CD4+CD25+ Т-клеток во II триместре беременности у женщин с гестозом позволяет оценить степень его тяжести для назначения адекватной терапии.

3. Для профилактики тяжёлых форм гестоза у пациенток с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, недостаточностью лютеиновой фазы следует назначать аналог прогестерона дюфастон в следующей дозировке: до 16 недель 20-40 мг в сутки, с 18 до 20 недель — 20 мг в сутки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хонина H.A., Дударева A.B., Тихонова М.А., Пронкина Н.В., Кожевников B.C., Дробинская А.Н., Демина С.Г., Пасман Н.М., Останин A.A., Черных Е.Р. Особенности продукции цитокинов и характеристика моноцитов при осложненной гестозом беременности // Иммунология. — 2005. — Т. 26, № 3. — С. 156-161.

2. Черных Е.Р., Семенова Н.В., Пасман Н.М., Хонина H.A., Дударева A.B., Дробинская A.B. Особенности иммунного статуса и диагностическая ценность определения некоторых показателей иммунитета при гестозе // Вестник НГУ. — 2004. — Том 2, №4. — С.82-89. (Обзор)

3. Серов В.Н., Пасман Н.М., Черных Е.Р., Останин A.A., Хонина H.A., Дробинская А.Н., Дударева A.B. Интенсивная терапия критических состояний в акушерско-гинекологической клинике с использованием эфферент-

ных иммунокорригирующих методов // Вестник НГУ. — 2004. — Т. 2, № 2.

— С. 63-65.

4. Пасман Н.М., Черных Е.Р., Останин A.A., Дударева A.B., Дробинская А.Н., Хонина H.A., Опарина М.П., Семенова Н.В. Роль дидрогестерона в профилактике гестационных осложнений // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. — 2004. — Т. 3, № 3. — С. 21-25.

5. Хонина H.A., Дударева A.B., Тихонова М.А., Легшина О.Ю., Останин A.A., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Нарушение механизмов активной иммуно-супрессии при беременности, осложненной гестозом // Бюллетень СО РАМН. — 2003. — № 3. — С. 73-76.

6. Дударева A.B., Хонина H.A., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Нарушение цитокинового баланса при беременности, осложненной гестозом // Мат.тез. 14-й научно-практической конференции. Новосибирск. — 2004. — Т.2. — С.5-6.

7. Хонина H.A., Дударева A.B., Тихонова М.А., Демина С.Г., Пронкина Н.В., Кожевников B.C., Пасман Н.М., Останин A.A., Черных Е.Р. Дисфункции моноцитарного звена иммунитета при гестозах // Материалы Всерос. научно-практич. конференции с межд. участием «Метаболические механизмы иммунореактивности». — Красноярск, 2004 — С.75.

8. Хонина H.A., Дударева A.B., Тихонова М.А., Демина С.Г., Дробинская А.Н., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Иммунные дисфункции как возможные причины патогенеза гестоза // Материалы Всерос. научно-практич. конференции с межд. участием «Метаболические механизмы иммунореактивности». — Красноярск, 2004. — С.74.

9. Хонина H.A., Дударева A.B.,Тихонова М.А., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Субпопуляция регуляторных CD4+CD25+ Т-клеток при физиологической и осложненной гестозом беременности //Russian journal of immunology.

— 2005 — Vol.9. — №2. — P. 183. Материалы конференции «Иммунология репродукции» — Иваново, 11-14 апреля 2005 г.

10. Хонина H.A., Тихонова М.А., Дударева A.B., Дробинская А.Н., Пасман Н.М.,Черных Е.Р. Баланс цитокинов при физиологической и осложненной гестозом беременности // Тез докладов конференции «Дни иммунологии в Сибири». — Красноярск, 2005. — С. 118.

П.Черных Е.Р., Останин A.A., Хонина H.A., Дробинская А.Н., Пасман Н.М., Безменова С.И., Дёмина С.Г., Никонов С.Д. Экстракорпоральная ан-тибиотикотерапия и иммунотерапия в лечении хронических персистирую-щих урогенитальных инфекций у гинекологических больных // Вестник НГУ, серия: биология, клиническая медицина. — 2005. — Т. 3, № 2. — С. 111-115.

Соискатель Дударева A.B.

Подписано в печать 28.12.06 г. Формат 60 х 84/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Изд. № Зп/07. Заказ № 9п

Оригинал-макет изготовлен издательством «Сибмедиздат» НГМУ г. Новосибирск, ул. Залесского, 4 Тел.: (383) 225-24-29. E-mail: sibmedisdat@rambler.ru

Отпечатано в типографии НГМУ г. Новосибирск, ул. Залесского, 4. Тел.: (383) 225-24-29

Актуальность исследования.

Гестоз является одним из наиболее тяжелых осложнений беременности; J занимает 2-3 место в структуре материнской смертности и обусловливает

I наиболее высокий процент перинатальных осложнений [24, 53, 69, 86, 87].

Несмотрянапристальное внимание к данной проблеме, пусковые механизмы

J гестоза остаются до сих пор невыясненными. В силу многообразия

1 клинических проявлений данное осложнение не всегда диагностируется

I вовремя; а существующие методы прогнозирования, профилактики и лечения гестоза недостаточно эффективны [11, 13, 29, 65; 67, 77, 81]. Вместе с тем своевременная и правильная диагностика, оценка степени тяжести гестоза имеют принципиальное значение для исхода беременности и родов [58; 13, 14, 77, 96, 97].

Согласно современным представлениям важную роль в развитии« патологии беременностиютводят иммунным нарушениям [5,16, 53; 63, 64., 82, 85]; Известно, что физиологическое течение беременности ассоциировано с формированием иммунологической толерантности к аллоантигенам плода. Одним из механизмов формирования толерантности является цитокин-опосредованная супрессия, которая обусловлена доминированием Th2/Th3 лимфоцитов; продуцирующих цитокины с иммуносупрессорной активностью: интерлейкин 4 (EL-4), интерлейкин 10- (IL-10) и трансформирующий; фактор I роста (TGF-j3) [165,166, 167, 188, 189]. Феномен Thl->Th2/Th3 переключения

Г 1 , представляется чрезвычайно важным, поскольку доминирование продукции î . ■ j ТЫ цитокинов сопряжено с патологическим характером гестации; в частности преждевременным прерыванием беременности [167, 169; 188];

Повышенный уровень Thl цитокинов отмечается и при гестозе [52, 82, 83,

123, 121, 195]. Причем преобладание продукции Thl/провоспалительных цитокинов задолго предшествует его клинической манифестации [129].

Вместе с тем, рядом авторов показано, что течение гестоза может быть сопряжено не только с увеличением ТЫ цитокинов, но и повышенной продукцией Th2 цитокинов, а также с одновременным возрастанием уровня ТЫ и Th2 цитокинов [214]. Таким образом, данные, характеризующие продукцию различных цитокинов при осложненном течении беременности, носят неоднозначный характер

Вместе с тем, ни у кого не вызывает сомнений, что цитокиновый дисбаланс оказывает непосредственное влияние на характер течения беременности. Поэтому комплексное исследование в периферической крови уровня Thl/Th2 цитокинов и их суммарной биологической активности при физиологической беременности и различных формах гестоза имеет принципиальное значение для понимания патогенеза гестоза, поиска иммунологических маркеров его прогноза; профилактики и лечения.

Наряду с цитокинами, важную роль в формировании и поддержании иммунологической толерантности могут играть регуляторные Т-клетки с супрессорной активностью. Среди них особый интерес представляют естественные супрессорные Т-клетки; (CD4tCD25+) - Trn. В последние годы их роль широко обсуждается в литературе в контексте подавления трансплантационных реакций при пересадках аллогенных органов и тканей. В экспериментальных исследованиях на мышах показано, что перенос CD4+CD25+-KneTOK от здоровых беременных мышей BALB/ самкам с угрозой невынашивания (DBA/2J) предотвращает у них выкидыши и способствует сохранению беременности. При этом, как выяснилось, ведущее значение в развитии выкидышей у DBA/2J мышей имеет дефицит CD4+CD25+-KneTOK в тимусе [113, 115]. Имеются единичные сообщения об увеличении содержания CD4+CD25+-клеток при гестации у человека [189, 190, 191]. Тем не менее, значение естественных регуляторных Т-клеток в развитии физиологической беременности, и ее позднего осложнения - гестоза у человека остается практически не изученным.

Одной из важных задач является разработка эффективных методов профилактики и лечения гестоза, которое на сегодняшний день представляет исключительно симптоматическую терапию. Развитие гестоза ассоциировано с неполноценной лютеиновой фазой (НЛФ) в результате недостаточной продукции прогестерона [77, 73, 88, 95, 260]. Следует отметить, что НЛФ является также причиной самопроизвольного прерывания беременности, которое успешно корригируется назначением аналога прогестерона -дюфастона [74, 75, 72]; Поскольку эффект дюфастона во многом связывают с его способностью индуцировать ТЫ—>ТЬ2/ТЪЗ переключение [166, 167], можно полагать, что данный препарат в силу иммуномодулирующего эффекта может предотвращать в последующем развитие гестоза. Однако исследование влияния дюфастона на уровень цитокинов во второй половине беременности и частоту развития гестоза у беременных из группы риска по прерыванию беременности до сих пор не проводилось.

Исходя из вышесказанного, была сформулирована цель настоящего исследования:

Цель исследования:

На основе исследования баланса ТЫ/ТЬ2 цитокинов и регуляторных Т-клеток изучить клеточно-молекулярные механизмы иммуносупрессии в течении физиологической и осложненной гестозом беременности. Для достижения поставленной; цели, были сформулированы следующие задачи:

1. Оценить биологическую активность сывороток крови и содержание ТИ1/ТЬ2 цитокинов в супернатантах КонА-стимулированных клеток цельной крови при физиологической беременности и гестозе.

2. Охарактеризовать количественное содержание СВ4+ СЭ25+ и С04+ Т-лимфоцитов в периферической крови у беременных в исследуемых группах и оценить сопряженность показателей с тяжестью гестоза.

3. Исследовать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в культурах анти-СЭЗ-стимулированных клеток, а также уровень спонтанного и индуцированного апоптоза Т-клеток у беременных с осложненным и физиологическим течением гестации.

4. Исследовать уровень продукции Thl/Th2 цитокинов и частоту развития гестационных осложнений (угрозы прерывания беременности, фетоплацентарной недостаточности, гестоза) в группах беременных, применявших и не использовавших гестаген дидрогестерон (дюфастон).

Научная новизна исследования.

В работе охарактеризованы особенности цитокинового баланса и естественных регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью при физиологическом и осложненном течении беременности, что позволило сделать заключение о роли механизмов иммуносупрессии в процессе гестации и их нарушении при гестозе.

В результате комплексного исследования цитокинового статуса расширены представления о спектре Thl/Th2 цитокинов и их суммарной биологической активности при физиологической и осложненной гестозом беременности. Полученные результаты свидетельствуют о выраженной супрессорной активности сывороток крови и доминировании Th2-цитокинов при физиологической беременности. У беременных с тяжелым гестозом в периферической циркуляции регистрируется повышение продукции как Thl, так и ТЬ2-цитокинов. При этом оценка супрессорной активности сыворотки крови и соотношения отдельных Thl/Th2 цитокинов указывают на снижение содержания факторов/цитокинов с супрессорной активностью при развитии гестоза.

Впервые показано, что физиологическая беременность сопряжена не только с изменением баланса цитокинов, но и с увеличением в циркуляции естественных регуляторных CD4+CD25+T-KneTOK, в том числе с высокой экспрессией CD25 молекул (CD4+CD25bright), причем возрастание численности CD4+CD25+ Т-клеток характерно именно для физиологической беременности и не регистрируется при беременности, осложненной гестозом.

Выявленные новые данные об обратной корреляционной зависимости между супрессорной активностью сыворотки крови, содержанием циркулирующих 1-клеток и степенью тяжести гестоза подтверждают важность нарушения гестационной иммуносупрессии в развитии осложненной гестозом беременности.

На основе анализа уровня пролиферативного ответа и апоптоза Т-клеток в а-СБЗ-стимулированных культурах МНК охарактеризовано состояние функциональной активности Т-клеток при различных вариантах течения беременности.

В ркзультате исследования цитокинового статуса у женщин, принимавших гестаген дюфастон, впервые показано, что иммуномодулирукяцее влияние дюфастона во второй половине беременности; проявляется нормализацией продукции цитокинов и восстановлением функциональной активности Т-клеток у беременных из группы риска по невынашиванию гестации.

Практическая значимость.

На основе клинико-иммунологического анализа выявлены новые иммунологические маркеры, которые могут служить дополнительным; критерием при оценке степени тяжести гестоза. Характеристика иммунных дисфункций при гестозе является основой для разработки новых подходов к коррекции осложненного течения беременности. Изучение иммуномодулирующего эффекта гестагена дюфастон на продукцию ТЫЛЪ2 цитокинов позволило разработать принципиально новый подход к профилактике гестоза в группах высокого риска, что имеет большое практическое значение для предотвращения репродуктивных потерь -снижения перинатальной и младенческой смертности, обусловленной хронической внутриутробной гипоксией плода, развивающейся на фоне гестоза.

Основные положения, выносимые на защиту.

Физиологическая иммуносупрессия второй половины беременности ассоциирована с преобладанием в сыворотке крови факторов с супрессорным действием^ доминированием Т112/противовоспалительных цитокинов и увеличением относительного содержания естественных супрессорных клеток с фенотипом СБ4+С025+, в том числе с высокой экспрессией СБ25+ молекул (СБ4+С025+Ь"8М).

2.Развитие гестоза сопряжено со снижением супрессорной активности сыворотки крови, усилением продукции ТЫ- и ТЬ2 цитокинов и уменьшением содержания естественных супрессорных Т-клеток (СВ4+С025+,С04,С025Ь"8Ь1).

3. Применение дюфастона у женщин с угрозой самопроизвольного прерывания беременности характеризуется выраженным иммунокорригирующим эффектом и приводит к снижению частоты развития гестоза в результате нормализации цитокинового баланса.

Объем и структура диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов: Материал изложен на 117 страницах машинописного текста, включающего 18 таблиц и 3 рисунка. Прилагаемая; библиография содержит ссылки на 222 литературных источника; в том числе 121 иностранных. Апробация работы.

ВЫВОДЫ:

1. Доминирование в сыворотке крови регуляторных факторов с супрессорной активностью в сочетании со смещением баланса в сторону Т112/противовоспалительных цитокинов и увеличением содержания регуляторных СБ4+С025+ Т-лимфоцитов во второй половине гестации свидетельствует о супрессорной реорганизации иммунной системы при физиологической беременности.

2.Развитие гестоза сопряжено с нарушением гестационной иммуносуперссии, на что указывает снижение продукции сывороточных супрессорных факторов, дисбаланс продукции цитокинов, проявляющийся повышенным содержанием ТЫ- и ТЬ2-цитокинов, а также снижение содержания С04+С025+ и С04+СБ25Ьп^1 Т-клеток при осложненной беременности.

3.Наличие обратной корреляционной зависимости степени тяжести гестоза с супрессорной активностью сыворотки и содержанием циркулирующих С04+С025+ и С04+СШ5Ьп§111 Т-клеток указывает на сопряженность нарушения иммунных механизмов супрессии с тяжестью заболевания.

4.Нормализация продукции цитокинов и пролиферативной активности Т-клеток у женщин с угрозой невынашивания, принимавших в первой половине беременности аналог прогестерона -дюфастон, свидетельствует об иммунокорригирующем влиянии дюфастона на параметры иммунитета у беременных во второй половине гестации.

5.Совокупность клинической эффективности дюфастона, проявляющаяся снижением частоты развития тяжелых форм гестоза, и его иммуномодулирующего действия позволяет использовать дюфастон в качестве профилактического препарата при угрозе развития гестоза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Для оценки нарушений гестационной иммуносупрессии, приводящей к развитию гестоза, целесообразно во II- триместре проводить оценку биологической активности сыворотки крови. Повышение индекса супрессорной активности (до проявления клиники осложнения) свидетельствует о высокой вероятности развития гестоза и диктует необходимость проведения мероприятий по его диагностике и профилактике.

2. Оценка содержания регуляторных Т - клеток СЭ4+ С025+ во II триместре беременности у женщин с гестозом позволяет оценить степень его тяжести для назначения адекватной терапии, а также эффективность проводимого лечения.

3. Для профилактики тяжёлых форм гестоза у пациенток с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, недостаточностью лютеиновой фазы следует назначать аналог прогестерона - дюфастон в следующей дозировке: до 16 недель 20-40 мг в сутки, с 18 до 20 недель-20мг в сутки.