Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Фотодинамическая терапия опухолей головного мозга крыс с использованием отечественных фотосенсибилизаторов

На правах рукописи

00461 "¿'¿"¿в

Ермакова Ксения Викторовна

ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ

Онкология - 14.01.12

1 8 НОЯ 2010

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2010

004613228

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН (директор- академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов)

Научные руководители:

кандидат медицинских наук И.Ю. Кубасова

доктор медицинских наук Т.К.Харатишвили

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор В.Б.Карахан

Доктор медицинских наук, профессор С.О.Подвязников

Ведущее научное учреждение:

ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития Росии.

Защита состоится «2 £ п А^^С2010 г. в /Ч часов на

заседании Диссертационного совета Д 001.017.01 при Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН. Автореферат разослан « » ОитсуА 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор

В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Первичные злокачественные опухоли головного мозга составляют около 1,52% от всех новообразований человека и характеризуются способностью к быстрой пролиферации, ангиогенезу и инвазивному росту. Глиомы составляют около 77% первичных злокачественных опухолей мозга и включают астроцитомы (астроцитома, анапластическая астоцитома, мультиформная глиобластома), олигодендроглиомы, эпендиомы и смешанные глиомы.

Лечение злокачественных глиом комбинированное и включает в себя хирургическое удаление опухоли, лучевую и химиотерапию. Основным ограничением нейрохирургии является плохая визуализация границ опухоли и особенности ее локализации. Радикальная резекция опухоли в большинстве случаев невозможна, т.к. иссечение здоровой ткани мозга с инфильтрирующими ее опухолевыми клетками не допустимо из-за высокой вероятности развития тяжелых неврологических осложнений. Поэтому мультиформные глиобластомы (глиомы IV степени злокачественности -классификация ВОЗ) рецидивируют в 100% случаев, чаще всего в пределах 2 см от места резекции первичной опухоли. Лучевая и химиотерапия применяются в основном в послеоперационном периоде с целью профилактики возникновения рецидивов.

Несмотря на современные достижения в области нейрохирургии, химиотерапии и лучевой терапии, прогноз для больных со злокачественными глиомами остается крайне неблагоприятным. Так, медиана выживаемости больных с мультиформной глиобластомой после частичной резекции опухоли составляет 8,8 месяцев, при радикальной резекции - 11 месяцев. После лучевой терапии медиана выживаемости не превышает 12 месяцев, при сочетании лучевой терапии и химиотерапии с темодалом - 15 месяцев. Повышение эффективности традиционных методов лечения глиом идет по разным направлениям. Главными из них являются поиск новых методов

терапии и совершенствование комбинированного лечения опухолей головного мозга.

Фотодинамическая терапия (ФДТ) является принципиально новым методом в лечении злокачественных опухолей головного мозга, основанным на способности фотосенсибилизаторов селективно накапливаться в ткани опухолей вследствие особенностей биохимии злокачественной клетки и при локальном воздействии лазерного облучения определенной длины волны генерировать образование синглетного кислорода и других активных радикалов, оказывающих цитотоксический эффект на опухолевые клетки. Эффективность фотодинамического повреждения сенсибилизированной клетки определяется внутриклеточной концентрацией сенсибилизатора, его локализацией в клетке и фотохимической активностью (квантовым выходом генерации синглетного кислорода или свободных радикалов), подводимой световой дозой лазерного облучения. Кроме прямого цитотоксического воздействия ФДТ на опухолевые клетки, важную роль в деструкции новообразования играют: нарушение кровоснабжения за счет повреждения эндотелия кровеносных сосудов опухолевой ткани; цитокиновые реакции, обусловленные стимуляцией продукции фактора некроза опухоли, активацией макрофагов, лейкоцитов и лимфоцитов.

В ряде экспериментов in vitro и in vivo, а также в клинических исследованиях, была подтверждена эффективность фотодинамической терапии опухолей головного мозга с использованием в качестве фотосенсибилизаторов Фотолона, Аласенса, Фотофрина, Гематопорфирина, Фоскана и некоторых других фотосенсибилизаторов. При использовании интра- и послеоперационной ФДТ медиана выживаемости достигает 21 мес. ФДТ имеет преимущества перед лучевой и химиотерапией при комбинированном лечении опухолей головного мозга. Во-первых, это локальная форма терапии, которая обладает низкой системной токсичностью. Во-вторых, к настоящему времени не получено данных о возможности развития устойчивости при повторном использовании ФДТ. В связи с

4

высокой поглощающей способностью сенсибилизированной ткани опухоли, свет проникает ограниченно, в связи с чем возможно многократное проведение ФДТ, что, вероятно, приведет к увеличению медианы выживаемости больных с опухолями головного мозга. Для достижения оптимального терапевтического эффекта лазерного облучения необходимо длительное облучение инфильтрирующих опухолевых клеток не удаленных во время резекции.

Одним из важных направлений повышения эффективности фотодинамической терапии является поиск фотосенсибилизаторов (ФС) с поглощением в спектральном диапазоне 700-800 нм, в котором собственное поглощение биологических тканей минимально. Использование таких ФС позволяет минимизировать потери на собственное поглощение ткани, увеличить глубину проникновения возбуждающего света и повысить терапевтическую эффективность. Цель исследования

Изучение эффективности ФДТ с использованием отечественных фотосенсибилизаторов Фотосенса и Тиосенса в монотерапии и при комбинированном лечении экспериментальных глиом. Задачи исследования

1. Оценить проницаемость ГЭБ для Фотосенса и Тиосенса по уровню и селективности накопления этих фотосенсибилизаторов в глиомах крыс.

2. Определить терапевтическую дозу фотосенсибилизаторов и разработать оптимальный режим лазерного облучения при ФДТ опухолей головного мозга крыс.

3. Оценить эффективность ФДТ с использованием Фотосенса и Тиосенса на глиомах крыс в монотерапии по критерию увеличения продолжительности жизни, медиане выживаемости и патоморфозу опухолей.

4. Оценить эффективность комбинированного лечения глиомы С6 и глиобластомы 101/8 крыс.

Научная новизна

Впервые в отечественной практике в эксперименте на моделях злокачественных глиом изучена эффективность фотодинамической терапии с применением новых фотосенсибилизаторов. Разработан оптимальный режим лазерного облучения и выявлена терапевтическая доза Фотосенса и Тиосенса для ФДТ экспериментальных глиом.

Впервые в отечественной практике в эксперименте изучена эффективность комбинированного лечения опухолей головного мозга с включением интраоперадионной ФДТ и последующей химиотерапии. Впервые в отечественной практике определен наиболее оптимальный порядок проведения ФДТ и химиотерапии при комбинированном лечении экспериментальных злокачественных опухолей головного мозга. Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований разработан и экспериментально обоснован комбинированный метод лечения злокачественных глиом человека, включающий хирургическое удаление первичного очага, использование ФДТ с отечественными фотосенсибилизаторами Фотосенсом и Тиосенсом и химиотерапии.

Составлен протокол клинических испытаний ФДТ с Фотосенсом при опухолях головного мозга. Апробация работы

Материалы приведенных в диссертационной работе исследований были представлены на следующих научных сообществах:

- Заседании Ученого совета НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН;

- IX Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения»;

- VI, VII, VIII и IX Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты»;

- III Евразийском конгрессе по медицинской физике;

- Совместной конференции подразделений НИИ ЭДиТО и НИИ КО РОНЦ

имени H.H. Блохина РАМН, 18 июня 2010 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ. Объем и структура диссертации

Диссертация содержит 151 страницу машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов и списка литературы, включающего 3 отечественных и 149 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 54 рисунками и 18 таблицами. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на половозрелых беспородных самцах крыс и самках крыс породы Wistar массой 200-220 грамм, которых получали из отделения лабораторных животных РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и содержали в виварии на обычном рационе питания.

Препараты. Для исследования использовали препарат Фотосенс (Фс), который представляет собой смесь натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия (от ди- до тетразамещенного), синтезированный во ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» (0,2% - 50 мл). В спектре поглощения этого фотосенсибилизатора наиболее интенсивная полоса находится в красной области спектра с максимумом в водном растворе в области 678 ± 2 нм. Препарат вводили однократно внутривенно в дозах 2 мг/кг, 3,5 мг/кг, 5,6 мг/кг и 10 мг/кг.

Тиосенс, представляющий собой тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия, не растворимый в воде, синтезирован во ФГУП «ГНЦ «НИОПИК». Липосомальную дисперсию Тиосенса (1,5 мг во флаконе), разработанную в лаборатории разработки лекарственных форм РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, вводили в/в в дозе 3 мг/кг.

Электронный спектр поглощения фотосенсибилизатора содержит два

7

максимума поглощения в красной и инфракрасной области спектра: 717 ± 4 нм, 648 ± 4 нм.

Уровень накопления Фотосенса и Тиосенса оценивали спектрально-флуоресцентным методом с использованием спектроанализатора "ЛЭСА-01-БИОСПЕК". Возбуждение флуоресценции Фотосенса осуществляли He-Ne лазером с длиной волны 632,8 нм, а Тиосенса - лазером "ЛФД-730-01-БИОСПЕК" с длиной волны 720 нм. Концентрация (уровень накопления) фотосенсибилизатора выражали в условных единицах (усл. ед.) и оценивали по интегральной интенсивности его флуоресценции путем сравнения ее с интенсивностью флуоресценции фталоцианин-содержащего полимерного образца с известной концентрацией фталоцианина, сопоставимой с терапевтической концентрацией, и оптическими характеристиками рассеивания, близкими к свойствам человеческих тканей. Селективность накопления Фотосенса и Тиосенса рассчитывали как отношение интенсивности флуоресценции препарата в опухоли и в здоровой ткани мозга и выражали в виде индекса селективности,

Темодал (Шеринг-Плау, США) вводили дважды per os в суммарной дозе 50 мг/кг.

Лизомустин вводили однократно внутривенно в дозе 80 мг/кг. Использовали лиофилизат для приготовления раствора (100 мг во флаконе, ООО «ГЛЭС», Москва)

Опухолевые модели. Глиома С6, классифицированная по гистологическому строению как астроцитома, которая имеет сходство с глиомой человека, поддерживалась in vitro как клеточная культура.

Глиобластома 101/8 имеет устойчивое строение изоморфной злокачественной глиобластомы. Ампулы с опухолевым материалом хранились в замороженном состоянии в жидком азоте (при -196°С). глиобластома получена из лаборатории экспериментальной гистопатологии ЦНС НИИ морфологии человека РАМН. Для экспериментальных

исследований опухоль поддерживали с помощью интрацеребрального пассирования на беспородных крысах.

Перед трансплантацией опухоли в мозг животных анестезировали хлоралгидратом (3,6 % раствор по 1,0мл/100г массы крысы) при внутрибрюшинном введении. Трансплантацию опухоли в мозг производили через трепанационное отверстие в теменной кости черепа на расстоянии 2-3 мм справа от сагиттального шва и 2 мм каудально от венечного шва, которое наносили зубоврачебным шаровидным бором диаметром 1,5 мм. При перевивке глиобластомы 101/8 размельченную ткань опухоли (1-2 млн. опухолевых клеток) подсаживали троакаром на глубину 3-4 мм в дно правого бокового желудочка (верхние отделы таламуса и хвостатого ядра). При перевивке глиомы С6 опухолевые клетки (400 х 103) в 5 мкл среды RPMI-1640 вводили шприцем «Hamilton» в мозг на ту же глубину. Прививаемость составляла - 90-100 %.

Лазерное облучение. При облучении использовали лазер ЛФТ-630/670-01-БИОСПЕК и ЛФД-730-01-БИОСПЕК для Фотосенса и Тиосенса, соответственно. Мощность облучения и время воздействия варьировали: от 50 мВт/см2 до 200 мВт/см2 и от 5 минут до 20 минут, соответственно. Патоморфологическое исследование проводили по общепринятой методике. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Проницаемость кровеносных микрососудов опухолей оценивали методом экстравазации красителя Эванс голубой из сосудов в межклеточное вещество.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием параметрического t-критерия для оценки накопления фотосенсибилизатора в опухолевой ткани. Анализ выживаемости проводили с использованием Лог-рангового критерия с помощью пакета статистических программ "Statistica 6.0". Разницу считали достоверной при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

С целью изучения проницаемости ГЭБ мы изучали интенсивность флуоресценции Фотосенса и Тиосенса в ткани опухоли и в нормальной ткани мозга в течение суток после их введения на 9 день опыта, когда опухоль достигает значительных размеров. Было показано, что оба препарата проникают через ГЭБ, а селективность накопления Фотосенса и Тиосенса увеличивается в течение суток и достигает максимума через 24 часа после введения препаратов, главным образом за счет выведения фотосенсибилизатора из нормальной ткани мозга (рис.1).

Часы

О Тиосенс-Сб И Тиосенс-ГБ г Фотосенс-Сб | ЕЗ Фотосенс-ГБ |

Рисунок 1. Индекс селективности накопления Фотосенса и Тиосенса в глиоме С6 и глиобластоме 101/8 на 9 день после перевивки опухоли.

Так, индекс селективности накопления Фотосенса в глиоме С6 и глиобластоме 101/8 увеличивался с 3,9 и 4,2 через 3 часа после введения фотосенсибилизатора до 11,4 и 7,9 через 24 часа после введения, соответственно. Индекс селективности накопления Тиосенса в глиоме С6 и глиобластоме 101/8 через 3 часа после введения составлял 3,5 и 2,9, а через 24 часа - 8,5 и 14,3, соответственно.

С целью определения срока начала проведения ФДТ после перевивки глиобластомы 101/8 и глиомы С6, изучали динамику уровня накопления Фотосенса и Тиосенса в процессе роста опухоли с 6 по 10 сутки опыта. Измерения проводили через 24 часа после введения фотосенсибилизатора (рис.2).

Рисунок 2. Интенсивность флуоресценции Фотосенса и Тиосенса в глиоме С6, глиобластоме 101/8 и нормальной ткани мозга с 6 по 10 дни после перевивки опухоли через 24 часа полсе введения фотосенсибилизаторов.

Уровень накопления Тиосенса и Фотосенса в глиобластоме 101/8 через 24 часа после его введения уже на 6 день опыта составлял 1,8 усл.ед. и 1,7 усл.ед., соответственно, а на 9 день - 1,6 усл.ед. и 2,6 усл.ед., соответственно. Уровень накопления Тиосенса и Фотосенса в глиоме С6 через 24 часа после его введения на 6 день опыта составлял 1,34 усл.ед. и 2,0 усл.ед., соответственно, а на 9 день - 1,9 усл.ед. и 3,1 усл.ед., соответсвенно. В нормальной ткани мозга уровень накопления фотосенсибилзаторов не превышал 0,1-0,3 усл.ед.. При этом индекс селективности на 6 день опыта колебался от 6 до 13 в зависимости от вида опухоли. Учитывая данные литературы и данные собственных исследований, 6 день после перевивки опухоли был выбран для начала проведения ФДТ.

На первом этапе была изучена эффективность ФДТ при лечении опухолей головного мозга в монотерапии.

ФДТ с Фотосенсом в монотерапии при поверхностном лазерном облучении через трепанационное отверстие привела к увеличению продолжительности жизни крыс с глиомой С6 по сравнению с контрольными животными на 4-

6%, а интерстициальном облучении - 10-14% при разных дозах лазерного облучения (рис.3).

Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier)

1.0 0.9 0.8 <? 0.7

I 0.6

сл

I 0.5

о

a

0

£ 0.4

a]

1 0.3

r Ё

О 0.2 0.1 0.0 -0.1

: о--о— П1........ ..................:.........'.....: ......

tn

■h-tt,..:.

т^п....... м'Гт!

0—i- -с—с— •....................:.....ULi............;.........................

ii' i. ........H-j^...... Ь~ - ! ........... ; ..............A-i ......à- ■

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 Time

M=20 M=21 M=22 M=23 M=23

— контроль

— поверхностно 15Дж/см2

....... поверхностно

60 Дж/см2

— ■ интерстициапьно

15 Дж/см2

— ■ интерстициально

60 Дж/см2

Рисунок 3. Кривые выживаемости крыс после ФДТ с Фотосепсом глиомы С6 (у2 = 4,60464, р = 0,33034).

Низкая эффективность ФДТ в монотерапии связана с особенностью Фотосенса вызывать отек окружающих тканей, что приводило к гибели животных от нарастающей внутричерепной гипертензии. При изучении эффективности ФДТ с Тиосенсом в монотерапии на глиоме С6 УПЖ составило 23% при поверхностном лазерном облучении с плотностью мощности лазерного излучения 200 мВт/см2 в течение 20 минут, а при плотности мощности 100 мВт/см2 в течение 20 минут-42% (рис. 4).

1.0

— контроль

облучение 120 Дж/см: облучение 240 Дж/см2

М=20

М=31

М=26

-0.1

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 Time

Рисунок 4. Кривые выживаемости крыс после ФДТ с Тиосенсом глиомы

Уменьшение продолжительности жизни крыс с глиомой С6 при увеличении дозы лазерного облучения, вероятно, связано с развитием побочных эффектов, главными из которых являются отек мозга и повреждение нормальной ткани головного мозга.

При ФДТ с Тиосенсом глиобластомы 101/8 применяли еще интерстициальное облучение с помощью специального световода, вводимого через трепанационное отверстие. УПЖ при этом составило 22% (рис. 5). Более низкая эффективность ФДТ с Тиосенсом на глиобластоме 101/8, чем на глиоме С6, коррелирует с литературными данными. Известно, что глиобластома хуже поддается лечению вследствие высокой степени злокачественности и инвазивности.

С6 (у1 = 9,117015, р = 0,01048),

1.0

M=16

M=19

0--I

-0.1

... Q

- контроль

— облучение через трепанационное

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Time

Рисунок 5. Кривые выживаемости крыс после ФДТ с Тиосенсом глиобластомы 101/8 (^2 = 18,53016,р = 0,00009).

Таким образом, эффективность ФДТ с Тиосенсом в монотерапии оказалась более высокой, чем эффективность ФДТ с Фотосенсом. Максимального эффекта удалось добиться на глиоме С6 при облучении в дозе 120 Дж/см2, УПЖ составило 42%. Однако, эффективность ФДТ в монотерапии оставалась недостаточно высокой.

С целью определения характера повреждающего воздействия ФДТ на опухолевую и нормальную ткань мозга, проводили патоморфологическое исследование. При патоморфологическом исследовании глиобластомы 101/8 после ФДТ с Фотосенсом выявлен некроз и апоптоз, разрушение сосудов с кровоизлияниями и тромбоз сосудов в результате деструктивного васкулита (рис. 6).

./г?..ьг ^ -з

» _. й »ж»». • «

уе »и в. **

X 200 Х400

Рисунок 6. Глиобластома 101/8. Через 72 часа после ФДТ с Фотосенсом (50 мВт X 5 мин). Гематоксилин-эозин.

Кроме того, после облучения отмечалось резкое снижение количества митозов в опухолевой ткани. Помимо описанных изменений, в опытной группе выявлены более выраженные повреждения прилежащей к опухоли ткани мозга, в связи с инфильтрацией ее опухолевыми клетками. В окружающей ткани выявлялся некроз, отек, полиморфноядерно-лейкоцитарная инфильтрация, тромбоз сосудов и кровоизлияния, пролиферация глиальных элементов, эндотелиоцитов и фибропластических элементов оболочек, продуктивные васкулиты, острая воспалительная реакция, острые гемодинамические нарушения и реактивные изменения в мозговых оболочках, репаративные изменения нервной ткани. После ФДТ с Тиосенсом наблюдали схожие патоморфологические изменения. Для снижения повышенного ВЧД и гибели животных от отека мозга на следующем этапе исследования, мы выполняли декомпрессионную краниотомию размером 4X5 мм и удаление максимально возможного объема опухоли. Нами также получено статистически значимое увеличение продолжительности жизни крыс после ФДТ, проведенной после декомпрессионной краниотомии. УПЖ крыс с глиомой С6 после краниотомии и ФДТ с Фотосенсом составило 21%, а с Тиосенсом достигало 54% (рис. 7).

Рисунок 7. Кривые выживаемости крыс после декомпрессионной краниотомии и ФДТ глиомы С6 (/2 = 18,62844, р = 0,00009).

УПЖ крыс с глиобластомой 101/8 после краниотомии и ФДТ с Тиосенсом в зависимости от способа проведения лазерного облучения - поверхностно или интерстициально, составило 48% и 70%, соответственно (рис. 8).

Time

Рисунок 8. Кривые выживаемости крыс после декомпрессионной краниотомии и ФДТ глиобластомы 101/8 (/2 = 22,34818, р = 0, 00001).

Повышение эффективности ФДТ при использовании Тиосенса можно объяснить не только меньшим количеством побочных эффектов, но и тем, что этот фотосенсибилизатор относится к фотосенсибилизаторам ближнего инфракрасного диапазона, что приводило к значительному увеличению глубины фотодинамического воздействия при лазерном облучении. Несмотря на многочисленные данные мировой литературы об эффективности терапевтических методов лечения опухолей головного мозга, хирургическое лечение является методом выбора. Однако, даже после казалось бы полного иссечения опухоли, в данной области остаются злокачественные клетки, инфильтрирующие здоровую ткань мозга и дающие в дальнейшем рост рецидива.

С целью повреждения инфильтрирующих здоровую ткань мозга опухолевых клеток, мы использовали интраоперационную ФДТ после резекции глиомы Сб.

Было установлено, что интраоперационная ФДТ с Тиосенсом ложа опухоли после хирургического удаления глиомы С6 с параметрами лазерного облучения: плотностью мощности 100 мВт/см2 в течение 10 минут, вызывает увеличение продолжительности жизни опытных животных по сравнению с контрольными на 68%, а при уменьшении плотности мощности до 50 мВт/см2 УПЖ несколько снижалась до 59%. Резекция глиомы С6 в монотерапии приводила к увеличению продолжительности жизни опытных животных по сравнению с контрольными лишь на 21%. Эффективность интраоперационной ФДТ с Фотосенсом в монотерапии не отличалась от эффективности хирургического лечения (рис. 9).

Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier)

M=20 M=29 М=36 М=32

— контроль

— хирургическое удаление

....... удаление+

облучение 60 Дж/см2

— - удаление+ облучение

45 30 Дж/см2

Рисунок 9. Кривые выживаемости крыс после интраоперационной ФДТ с Тиосенсом глиомы С6 (%2 = 9,117015, р = 0, 01048).

Рядом авторов показано, что химиотерапевтическое лечение в сочетании с предварительным удалением опухоли и послеоперационной лучевой терапией позволяет повысить одно- и двухлетнюю выживаемость больных со злокачественными глиомами.

Мы установили, что обе опухолевые модели были чувствительны к

химиотерапии. Так, при химиотерапии с Темодалом в дозе 50 мг/кг

глиобластомы 101/8 УПЖ составило 54%, а при химиотерапии с Лизомустином в дозе 80 мг/кг глиомы С6 - 68% (рис. 10).

Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier)

1.0 OS O.E

oi 0.7

1 0.6 со

I 0.5 о a.

0

£ 0.4 ш

1 0,3

3 £

О 0.2 0.1 0.0 -0.1

M=32 M=20 M=24 M=16

— химиотерапия с Лизомустином глиомы С6

-- контроль глиома С6

— химиотерапия с Темодалом глиобластомы 101/8

■ - контроль

глиобластома 101/8

Рисунок 10. Кривые выживаемости крыс после химиотерапии (у2 = 34,27093, р = 0, 00000).

С целью определения оптимальных сроков проведения химиотерапии при комбинированном лечении крыс с опухолями головного мозга предварительно оценивали влияние ФДТ с Тиосенсом на проницаемость кровеносных микрососудов глиомы С6 методом экстравазации красителя Эванс голубой из сосудов в межклеточное вещество. В результате исследования показано, что наблюдалось увеличение проницаемости микрососудов в опухоли опытной группы по сравнению с опухолью контрольной группы. Так, уже через 15 минут после проведения ФДТ наблюдается увеличение абсорбции красителя в ткани опухоли с 0,6+1,67 (контрольная группа) до 0,86+0,148 (р=0,117), что свидетельствует о повреждении кровеносных сосудов в опухоли. Через 3 часа после проведения

ФДТ проницаемость сосудов еще больше увеличилась и абсорбция составила 1,23+0,44 (р=0,084). Таким образом, при проведении ФДТ с Тиосенсом развивается поражение микрососудов в опухоли, причем эффект имеет временную зависимость. Следовательно, оптимальным сроком проведения химиотерапии при комбинированном лечении глиомы С6 является 72 часа после интраоперационной ФДТ с Тиосенсом.

Комбинированное лечение глиомы С6, включающее интраоперационную ФДТ и химиотерапию с Лизомустином, приводило к увеличению продолжительности жизни крыс на 78% по сравнению с контрольными животными. При дополнительном хирургическом удалении глиомы С6 и последующей интраоперационной ФДТ с Тиосенсом ложа опухоли и химиотерапией с Лизомустином, УПЖ достигало 84% (рис. 11).

Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier)

M=20 M=39 М=31 М=37

- контропь

- ФДТ+ химиотерапия с Лизомустином

..... ФДТ

- • хирургическое удаление+ ФДТ+

химиотерапия с Лизомустином

Рисунок 11. Кривые выживаемости крыс после комбинированного лечения глиомы С6 ДО = 26,31059, р = 0, 00001).

При оценке эффективности ФДТ с Тиосенсом на глиобластоме 101/8 при декомпрессионной краниотомии и последующем введении Темодала нам удалось получить стойкую ремиссию в течение 3 месяцев у 50% крыс. При

макроскопическом исследовании опухолей у этих крыс не обнаружено, что расценивали как их излечение. У оставшихся 50% крыс с глиобластомой 101/8 УПЖ по сравнению с контрольными животными составило 127% (рис.12).

Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier)

Time

Рисунок 12. Кривые выживаемости крыс после комбинированного лечения глиомы С6 = 26,31059, р = 0,00001).

Таким образом, по критерию УПЖ было показано, что ФДТ является эффективным дополнительным методом при комбинированном лечении глиом. В результате проведенных исследований разработана схема комбинированного лечения злокачественных опухолей головного мозга с включением интраоперационной ФДТ, которая позволяет воздействовать на не удаленные во время хирургического вмешательства опухолевые клетки.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что Фотосенс и Тиосенс проникают через ГЭБ и селективно накапливаются в опухолевой ткани мозга.

2. Уровень и селективность накопления Фотосенса и Тиосенса становятся достаточными для проведения ФДТ через 24 часа после внутривенного введения препаратов на 6 день после перевивки опухолей.

3. С ростом опухоли индекс селективности растет и достигает к 9 дню 8,2 на глиобластоме 101/8 для Фотосенса и 13,5 для Тиосенса, а на глиоме С6 -21,4 и 10,7, соответственно.

4. Установлены терапевтические дозы: для Фотосенса - 2 мг/кг, для Тиосенса - 3 мг/кг, и параметры лазерного облучения: 100 мВт/см2 в течение 10-20 минут при поверхностном облучении и 60 мВт/см в течение 15 минут при интерстициальном облучении.

5. По патоморфологическому критерию показана высокая эффективность ФДТ с Фотосенсом и Тиосенсом на обеих опухолевых моделях.

6. Эффективность ФДТ с Тиосенсом в монотерапии на глиоме С6 составляет 42% УПЖ, а на глиобластоме 101/8 - 22% УПЖ.

7. Показано, что комбинированное лечение глиомы С6, включающее хирургическое удаление опухоли, интраоперационную ФДТ с Тиосенсом и последующую химиотерапию с Лизомустином, приводит к УПЖ= 84%.

8. Установлено, что комбинированное лечение глиобластомы 101/8, включающее декомпрессионную краниотомию, интраоперационную ФДТ с Тиосенсом и последующую химиотерапию с Темодалом, приводит к излечению 50% крыс с опухолью. УПЖ остальных 50% животных составляет 127%.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ермакова, К.В. Селективность накопления фотосенсибилизатора «Фотосенс» в глиоме С6 крыс / З.С. Смирнова, И.Ю. Кубасова, JI.M. Борисова, К.В. Ермакова, М.П. Киселева, A.C. Халанский, Г.А. Меерович, А.Ю. Барышников, Е.А.Лукьянец, Г.Н.Ворожцов // Материалы межрегиональной конференции, посвященной 55-летию онкологической службы Республики Саха (Якутия). «Актуальные проблемы клинической онкологии и преканцерогенеза», Якутск, июнь 2005 г., С. 227-229.

2. Ермакова, К.В. Изучение проницаемости гематоэнцефалического барьера для фотосенса спектрально-флюоресцентным методом у крыс с глиомой С6 / И.Ю.Кубасова, К.В.Ермакова, Л.М.Борисова, М.П.Киселева, А.С.Халанский, Г.А.Мееерович, З.С.Смирнова, А.Ю.Барышников, Е.А.Лукьянец, Г.Н.Ворожцов // Материалы V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», М., 21-22 апреля 2006г. — Российский биотерапевтический журнал. — 2006. —№1. — С. 27-28.

3. Ермакова, К.В. Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия при лечении злокачественных опухолей головного мозга / И.Ю. Кубасова, Е.Г.Вакуловская, К.В.Ермакова, З.С.Смирнова // Российский биотерапевтический журнал. — 2006. — №4. — С. 54-63.

4. Ермакова, К.В. Морфологические критерии прогнозирования рецидивирования глиальных опухолей после фотодинамической терапии / Е.А. Коган, С.А. Демура, З.С.Смирнова, И.Ю. Кубасова, К.В.Ермакова, Г.А.Меерович, А.Ю.Барышников, Е.А.Лукьянец, Г.Н.Ворожцов // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», М., 24-26 марта 2007 г. — Российский биотерапевтический журнал. — 2007. — №1. — С. 17.

5. Ермакова, К.В. Эффективность фотодинамической терапии с использованием Фотосенса после хирургического удаления глиомы С6 крыс / К.В.Ермакова, И.Ю.Кубасова, Л.М.Борисова, М.П.Киселева, Е.А.Коган,

23

Г.А.Меерович, З.С. Смирнова, А.Ю.Барышников, Е.А.Лукьянец, Г.Н.Ворожцов // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», М., 24-26 марта 2007 г. — Российский биотерапевтический журнал. — 2007. — №1. — С. 15.

6. Ермакова, К.В. Эффективность фотодинамической терапии с Тиосенсом на глиоме С6 / К.В.Ермакова, Л.М.Борисова, М.П.Киселева, З.С.Смирнова, И.Г.Меерович, Н.А.Оборотова, Г.А.Меерович, Е.А.Лукьянец, Г.Н.Ворожцов // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», М., 17-19 марта 2008 г. — Российский биотерапевтический журнал. —2008. — №1. — С. 15-16.

7. Ермакова, К.В. Патоморфологическая оценка эффективности фотодинамической терапии с Фотосенсом на глиоме С6 / З.С.Смирнова, К.В.Ермакова, И.Ю.Кубасова, Л.М.Борисова, М.П.Киселева, Е.А.Коган, Г.А.Меерович, Е.А. Лукьянец // Нижегородский медицинский журнал. -2008.-№ 4.-С. 12-18.

8. Ермакова, К.В. Эффективность фотодинамической терапии с липосомальной лекарственной формой отечественного фотосенсибилизатора Тиосенс на глиоме С6 крыс / К.В.Ермакова, З.С.Смирнова, Л.М.Борисова, М.П.Киселева, Н.А.Оборотова, И.Г.Меерович, Г.А.Меерович, Е.А. Лукьянец // Материалы I научной конференции с международным участием «Наноонкология», М.,18-19 февраля 2009г. — Российский биотерапевтический журнал. — 2009. — №1. — С. 19-20.

9. Ермакова, К.В. Значение ФДТ при комбинированном лечении глиом крыс / К.В.Ермакова, И.Ю.Кубасова, З.С.Смирнова, Л.М.Борисова, М.П.Киселева, Н.А.Оборотова, И.Г.Меерович, Г.А.Меерович, Е.А.Лукьянец, Г.Н.Ворожцов // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», М., 21-22 апреля 2009 г. — Российский

24

биотерапевтический журнал. — 2009. — №2. — С. 33.

10. Ермакова, К.В. Значение фотодинамической терапии при комбинированном лечении глиом крыс / К.В.Ермакова, З.С.Смирнова, И.Ю.Кубасова, Л.М.Борисова, М.П.Киселева, Н.А.Оборотова, И.Г.Меерович, Г.А.Меерович, Е.А.Коган, Е.В.Степанова, Е.А.Лукьянец // Журнал для практикующих врачей «Практическая медицина», Казань. - 2009. - №04. - С. 93-96.

11. Ермакова, К.В. Эффективность фотодинамической терапии при комбинированном лечении опухолей головного мозга / К.В.Ермакова, З.С.Смирнова, И.Ю.Кубасова, Л.М.Борисова, М.П.Киселева, Г.А.Меерович, Е.А.Лукьянец // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения» Санкт-Петербург, 6-10 апреля 2010г. -С. 254.

12. Ермакова, К.В. Эффективность фотодинамической терапии с Фотосенсом глиобластомы 101/8 крыс / К.В.Ермакова, И.Ю.Кубасова, Л.М.Борисова, М.П.Киселева, З.С.Смирнова, Г.А.Меерович, Е.А.Коган, Е.А.Лукьянец, Г.Н.Ворожцов // Российский биотерапевтический журнал. —

2009.—№4, —С. 73-78.

13. Ермакова, К.В. ФДТ при комбинированном лечении глиобластомы 101/8 крыс / К.В.Ермакова, З.С.Смирнова, И.Ю.Кубасова, Л.М.Борисова, М.П.Киселева, Н.А.Оборотова, И.Г.Меерович, Г.А.Меерович, Е.А.Лукьянец, Г.Н.Ворожцов // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Нижний Новгород, 18-19 мая 2010 г. — Российский биотерапевтический журнал. —

2010. —№2. —С. 18-19.

Подписано в печать 19.10.2010. Формат 60X84/16 Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 экз. Заказ № 821 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность темы

Первичные злокачественные опухоли1 головного мозга составляют около 1,5-2% от всех новообразований человека и характеризуются способностью к быстрой пролиферации, ангиогенезу и инвазивному росту. Глиомы составляют около 77% первичных злокачественных опухолей мозга и включают астроцитомы (астроцитома, анапластическая астоцитома, мультиформная глиобластома), олигодендроглиомы, эпендиомы и смешанные глиомы.

Лечение злокачественных глиом комбинированное и включает в себя хирургическое удаление опухоли, лучевую и химиотерапию. Основным ограничением нейрохирургии является плохая визуализация границ опухоли и особенности ее локализации. Радикальная резекция опухоли в большинстве случаев невозможна, т.к. иссечение здоровой ткани мозга с инфильтрирующими ее опухолевыми-клетками не допустимо из-за. высокой вероятности развития тяжелых неврологических осложнений. Поэтому мультиформные глиобластомы (глиомы IV степени злокачественности -классификация ВОЗ) рецидивируют в 100% случаев, чаще всего в пределах 2 см от места резекции первичной опухоли. Лучевая и химиотерапия применяются в основном в послеоперационном периоде с целью профилактики возникновения рецидивов.

Несмотря на современные достижения в области нейрохирургии, химиотерапии и лучевой терапии, прогноз для больных со злокачественными глиомами остается крайне неблагоприятным. Так, медиана выживаемости больных с мультиформной глиобластомой после частичной резекции опухоли составляет 8,8 месяцев, при радикальной резекции — 11 месяцев. После лучевой терапии медиана выживаемости не превышает 12 месяцев, при сочетании-лучевой терапии и химиотерапии с темодалом - 15 месяцев.

Недостаточная эффективность традиционных методов лечения, привела к поиску новых методовтерапии.

Фото динамическая терапия (ФДТ) является принципиально новым методом в лечении злокачественных опухолей головного мозга, основанным на способности фотосенсибилизаторов селективно накапливаться в ткани опухолей вследствие особенностей биохимии злокачественной клетки и при локальном воздействии лазерного облучения определенной длины волны генерировать образование синглетного кислорода и других активных радикалов, оказывающих токсический эффект на опухолевые клетки. Эффективность фотодинамического повреждения сенсибилизированной клетки определяется внутриклеточной концентрацией сенсибилизатора, его локализацией в клетке и фотохимической активностью (квантовым выходом генерации синглетного кислорода или свободных радикалов), подводимой световой дозой лазерного облучения. Кроме прямого цитотоксического воздействия ФДТ на опухолевые клетки, важную роль в деструкции новообразования играют: нарушение кровоснабжения за счет повреждения эндотелия кровеносных сосудов опухолевой ткани; цитокиновые реакции, обусловленные стимуляцией продукции фактора некроза опухоли, активацией макрофагов, лейкоцитов и лимфоцитов.

В' ряде экспериментов in vitro и in vivo, а также в клинических исследованиях, была подтверждена эффективность фотодинамической терапии опухолей головного мозга с использованием в качестве фотосенсибилизаторов фотолона, аласенса, фотофрина, гематопорфирина, фоскана и некоторых других фотосенсибилизаторов. При использовании интра- и послеоперационной ФДТ медиана выживаемости достигает 21 мес.

ФДТ имеет преимущества перед лучевой и химиотерапией при комбинированном лечении опухолей головного мозга. Во-первых, это локальная^ форма терапии, которая обладает низкой системной токсичностью. Во-вторых, к настоящему времени не получено данных о возможности развития устойчивости при повторном использовании ФДТ. В связи с высокой поглащающей способностью ткани опухоли- с накопленным в ней фотосенсибилизатором, свет проникает ограниченно, в связи с чем возможно многократное проведение ФДТ, что, вероятно, приведет к увеличению медианы выживаемости больных с опухолями головного мозга. Для достижения оптимального терапевтического эффекта лазерного облучения необходимо длительное облучение инфильтрирующих опухолевых клеток не удаленных во время резекции.

Одним из важных направлений повышения эффективности фотодинамической терапии является поиск фотосенсибилизаторов (ФС) с поглощением в спектральном диапазоне 700-800 нм, в котором собственное поглощение биологических тканей минимально. Использование таких ФС позволяет минимизировать потери на собственное поглощение ткани, увеличить глубину проникновения возбуждающего света и повысить терапевтическую эффективность. Цель исследования

Изучение эффективности ФДТ с использованием отечественных фотосенсибилизаторов Фотосенса и Тиосенса в монотерапии и при комбинированном лечении экспериментальных глиом. Задачи исследования

1. Оценить уровень и селективность накопления Фотосенса и Тиосенса в глиомах крыс.

2. Определить терапевтическую дозу фотосенсибилизатора и разработать оптимальный режим лазерного облучения для опухолей головного мозга крыс. 1

3. Оценить эффективность ФДТ с использованием Фотосенса и Тиосенса на глиомах крыс в монотерапии по критерию увеличения продолжительности жизни, медиане выживаемости, а- также патоморфозу опухолей.

4. Оценить эффективность комбинированного лечения глиомы С6 и глиобластомы 101/8 крыс.

Научная новизна

Впервые в отечественной практике в эксперименте на моделях злокачественных глиом изучена эффективность фотодинамической терапии с применением новых фотосенсибилизаторов. Разработан оптимальный режим лазерного облучения и выявлена терапевтическая доза Фотосенса и Тиосенса для ФДТ экспериментальных глиом.

Впервые в отечественной практике в эксперименте изучена эффективность комбинированного лечения опухолей головного мозга с включением интраоперационной ФДТ и последующей химиотерапии.

Впервые в отечественной практике определен наиболее оптимальный порядок проведения ФДТ и химиотерапии при комбинированном лечении экспериментальных злокачественных опухолей головного мозга.

Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований разработан и экспериментально обоснован комбинированный метод лечения злокачественных глиом человека, включающий хирургическое удаление первичного очага, использование ФДТ с отечественными фотосенсибилизаторами Фотосенсом и Тиосенсом и химиотерапии.

Составлен протокол клинических испытаний ФДТ с Фотосенсом при опухолях головного мозга.

Апробация работы

Материалы приведенных в диссертационной работе исследований были представлены на следующих научных сообществах:

- Заседание Ученого совета НИИ ЭДиТО;

- IX Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения»;

- VI, VII, VIII и IX Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты».

- Совместная конференция подразделений НИИ ЭДиТО и НИИ КО РОНЦ имени Н.Н. Блохина РАМН, 18 июня 2010 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит 151 страницу машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов и списка литературы, включающего 3 отечественных и 149 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 54 рисунками и 18 таблицами.

Выводы:

1. Установлено, что Фотосенс и Тиосенс проникают через ГЭБ и селективно накапливаются в опухолевой ткани мозга.

2. Уровень и селективность накопления Фотосенса и Тиосенса становятся достаточными для проведения ФДТ через 24 часа после внутривенного введения препаратов на 6 день после перевивки опухолей.

3. С ростом опухоли индекс селективности растет и достигает к 9 дню 8,2 на глиобластоме 101/8 для Фотосенса и 13,5 для Тиосенса, а на глиоме С6 -21,4 и 10,7, соответственно.

4. Установлены терапевтические дозы: для Фотосенса - 2 мг/кг, для Тиосенса — 3 мг/кг, и параметры лазерного облучения: 100 мВт/см в течение 10-20 минут при поверхностном облучении и 60 мВт/см в течение 15 минут при интерстициальном облучении.

5. По патоморфологическому критерию показана высокая эффективность ФДТ с Фотосенсом и Тиосенсом на обеих опухолевых моделях.

6. Эффективность ФДТ с Тиосенсом в монотерапии на глиоме С6 составляет 42% УПЖ, а на глиобластоме 101/8 - 22% УПЖ.

7. Показано, что комбинированное лечение глиомы С6, включающее хирургическое удаление опухоли, интраоперационную ФДТ с Тиосенсом и последующую химиотерапию с Лизомустином, приводит к УПЖ= 84%.

8. Установлено, что комбинированное лечение глиобластомы 101/8, включающее декомпрессионную краниотомию, интраоперационную ФДТ с Тиосенсом и последующую химиотерапию с Темодалом, приводит к излечению 50% крыс с опухолью. УПЖ остальных 50% животных составляет 127%.