Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фитохимическое изучение экстрактов коровяка черного и возможности их использования в медицине

На правах рукописи

КАЛИНИНА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ КОРОВЯКА ЧЕРНОГО И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 6 МАЙ 2013

Пермь-2013

1

н >

с "" "

005059308

Диссертационная работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:___

|Петриченко Василий Михайлович! доктор фармацевтических наук,

профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии и фармацевтической технологии ГБОУ ВПО «ЯГМА» Минздрава России

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии ФДПО и ФЗО ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздрава России

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «11» июня 2013 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.068.01 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2. Тел./факс (342)233-5501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Автореферат разослан 2013 г.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки РФ http://wwviif.nion.gov.ru «¿» апреля 2013 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России http ://www.pfa.ru (^»апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета Д 208.068.01, кандидат ,.,

фармацевтических наук '"' " Н.В. Слепова

Смропятов Борис Яковлевич

Официальные оппоненты: Фурса Николай Сергеевич

Эвич Нина Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В настоящее время лекарственные средства растительного происхождения составляют около 20% от общего числа препаратов. Растительные препараты используются в комплексном лечении хронических заболеваний, так как они обеспечивают безопасность терапии при длительном курсовом лечении.

С целью создания высокоэффективных и безопасных лекарственных средств актуальным является выделение из растительного сырья индивидуальных компонентов и создание новых фитопрепаратов.

Основным источником для поиска новых лекарственных растений является арсенал средств народной медицины. Широкое использование коровяка черного в народной медицине при лечении заболеваний сердечно-сосудистой, урогенитальной систем указывает на необходимость углубленного фитохимического анализа, исследования компонентного состава, определения групп соединений, проявляющих фармакологическую активность, и разработку препарата на его основе.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы являлось комплексное исследование химико-фармакологических свойств, технологии и стандартизация экстрактов коровяка черного и обоснование возможности их использования в медицине.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить качественный состав биологически активных веществ в экстрактах из травы и различных органов к. черного.

2. Провести хроматографическое разделение экстракта к. черного и выделить основные фракции БАВ и индивидуальные соединения.

3. Разработать методики количественного определения флавоноидов и иридоидов для изучения количественное содержание БАВ в исследуемых экстрактах к. черного.

4. Провести химико-технологические исследования по разработке оптимальной технологии экстракта травы к. черного сухого.

5. Обосновать методы стандартизации, показатели и нормы качества экстракта к. черного сухого.

6. Разработать НД на экстракт к. черного сухой.

7. Выявить и оценить фармакологическую активность, острую токсичность фракций и экстрактов к. черного.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые проведено комплексное фитохимическое исследование экстрактов из надземной части и различных органов к. черного.

Методом колоночной хроматографии из экстракта к. черного выделены фракции: полисахаридов, кумаринов, флавоноидов и фенолокислот; изучен их компонентный состав; впервые выделены и идентифицированы гесперидин, хлорогеновая и кофейная кислоты.

Разработана методика количественного определения флавоноидов в экстракте травы к. черного методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на гесперидин.

Методом математического моделирования разработана оптимальная технология экстракта травы к. черного сухого. Обоснованы методы стандартизации, показатели и нормы качества экстракта, включенные в проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП).

Впервые выявлено гипотензивное, антикоагулянтное и диуретическое действие экстрактов к. черного. Установлена связь между фармакологической активностью и количественным содержанием группы БАВ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. В результате проведенных исследований выделены индивидуальные соединения — гесперидин, хлорогеновая и кофейная кислоты. Разработан способ получения экстракта травы к. черного сухого, установлены основные показатели подлинности и доброкачественности экстракта, которые легли в основу нормативной документации. Доказана гипотензивная, антикоагулянтная, диуретическая активности экстракта к. черного. Подана заявка на патент № 2011126730 от 29.06.2011.

СТЕПЕНЬ ВНЕДРЕНИЯ. Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Пермской государственной фармацевтической академии, кафедры фармакогнозии и ботаники фармацевтического факультета Новосибирского государственного медицинского университета, кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета, кафедры фармакогнозии и фармацевтической технологии Ярославской государственной медицинской академии. Подготовлен к рассмотрению проект ФСП «Экстракт коровяка черного сухой».

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Результаты фитохимического анализа компонентного состава и количественного содержания основных групп БАВ в экстрактах к. черного.

2. Результаты хроматографического разделения экстракта к. черного и изучение компонентного состава фракций и выделение индивидуальных веществ.

3. Результаты фармакологических исследований экстрактов к. черного.

4. Обоснование методов стандартизации, показателей и норм качества экстракта надземной части к. черного сухого.

АПРОБАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Основные положения работы доложены и обобщены на научно-практических конференциях: VII Международной научно-практической конференции

«Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006); 65-ой открытой научно-практической конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007); II международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2007); Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования (Г1ГФА, Пермь, 2009 — 2012); ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010); International conference «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine» (Saint Petérsburg, 2011); научной конференции «Curtin Health Innovation Research Institute (CHiRI) conference» (Австралия, Перт, 2012), научной конференции «The second International Conference and Exhibition, PharmaTech 2012 on Pharmaceutical, Nutraceutical and Cosmeceutical Technology» (Малайзия, Куала-Лумпур, 2012).

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМАМИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.50 007426).

ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА. Автор непосредственно участвовал в проведении научных экспериментов, обработке и интерпретации экспериментальных данных, в апробации результатов исследования, подготовке публикаций по выполненной работе.

СООТВЕТСТВИЕ ДИССЕРТАЦИИ ПАСПОРТУ НАУЧНОЙ СПЕЦИАЛЬНОСТИ. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам исследования опубликовано 20 научных работ, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на 204 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, четырех глав, отражающих результаты собственных исследований и выводов. Работа иллюстрирована 60 таблицами и 29 рисунками. Библиографический указатель включает 295 источников, из них 193 на иностранных языках.

Во введении изложена актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, обозначена новизна и практическая значимость проведенных исследований; описаны положения, выносимые на защиту.

Первая глава содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы: систематическое положение, распространение

рода Verbascum L. и вида V. nigrum L. в Российской Федерации и за рубежом, ботаническое описание; химический состав и биологические свойства основных компонентов V. nigrum, данные о применении вида в народной медицине и экспериментальной фармакологии, обоснование перспективности изучения V. nigrum и разработки на его основе фитопрепаратов направленного действия.

Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования.

В третьей главе отражены результаты исследований качественного состава и количественного содержания БАВ экстракта к. черного. Определение состава фенольных и иридоидных соединений, идентификация хлорогеновой и кофейной кислот, гесперидина, кверцетина, люгеолина и аукубина. Методом колоночной хроматограф™ разделены фракции основных групп БАВ, выделены индивидуальные компоненты, при помощи УФ, ИК и ПМР спектроскопии доказана их структура. Приведена модификация методики количественного определения иридоидов фотоэлектроколориметрическим методом для экстракта. Определено количественное содержание фенольных соединений в экстрактах коровяка черного.

В четвертой главе изложена разработка технологии экстракта травы к. черного.

Пятая глава посвящена исследованию фармакологической активности экстрактов и БАВ к. черного.

В шестой главе приведена разработка нормативной документации на экстракт к. черного сухой.

В приложении представлены лабораторный регламент на технологию экстракта к. черного сухого, проект ФСП «Экстракт коровяка черного сухой», исследования микробиологической чистоты экстракта, результаты апробации методики количественного определения флавоноидов в пересчете на гесперидин, основные документы, отражающие внедрение результатов диссертационной работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили экстракты водные и спиртовые сухие травы, стеблей, листьев, цветков, корней трех видов рода Verbascum -Коровяк (V. nigrim - к. черный, V. thapsus - к. обыкновенный, V. densiflorum — к. скипетровидный) и ряд фракций БАВ к. черного. Образцы растений рода Verbascum для получения экстрактов заготовлены на территории Пермского края, Удмуртской республики и Свердловской области и на интродукционном участке питомника ПГФА в период 2006-2011 гг.

Исследуемые экстракты и извлечения получены по четырем методикам:

Методика I: 50 г измельченного и просеянного сквозь сито 2 мм растительного материала (трава, листья, стебли, цветки, корни) помещали в круглодонную колбу, заливали 300 мл воды и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч (экстракцию повторяли 2 раза); извлечения охлаждали, процеживали и объединяли; сгущали на ротационном испарителе марки ИР-1 под вакуумом. Извлечение выдерживали в сушильном шкафу при температуре не более 60'С в течение 6 ч, до полного удаления влаги.

Методика II: 50 г измельченного и просеянного сквозь сито 2 мм растительного материала (трава, листья, стебли, цветки, корни) помещали в круглодонную колбу, заливали 300 мл этанола 70% и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч; извлечение охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр; сырье повторно заливали 300 мл этанола 40% и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником 2 ч; извлечения объединяли; сгущали на ротационном испарителе под вакуумом. Извлечение выдерживали в сушильном шкафу при температуре не более 60 °С в течение 3 ч, до полного удаления экстрагента.

Методика III: измельченную и просеянную сквозь сито 1 мм траву к. черного экстрагировали методом реперколяции с законченным циклом в батарее из трех перколяторов, имеющих различную емкость. В качестве экстрагента использовали этанол 60%. Сырье (100 объемных частей) в экстракторы загружали в убывающих количествах в соотношении 50:30:20. Концентрированную вытяжку сливали в объемных частях в возрастающем соотношении 20:30:50, в целом, получали 100 объемных частей концентрированной вытяжки; процеживали, сгущали на ротационном испарителе под вакуумом. Густой экстракт выдерживали в сушильном шкафу при температуре не более 60 °С в течение 3 ч, до полного удаления экстрагента.

Методика IV: 400 г измельченной надземной части до размера частиц менее 5 мм помещали в круглодонную колбу и подвергали исчерпывающей экстракции: Сырье заливали 1,5 л этанола 70%, нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 5 ч; извлечение охлаждали, процеживали; затем заливали 800 мл этанола 40% нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 5 ч; извлечение охлаждали, процеживали; заливали 800 мл воды, нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 5 ч; извлечение охлаждали, процеживали. Полученные извлечения объединяли, сгущали на ротационном испарителе под вакуумом до объема 150 мл.

Качественный состав и количественное содержание БАВ исследовали с помощью современных методов фитохимического анализа: хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента.

фотоэлектроколориметрия, УФ спектроскопия. Спектрофотометрическое исследование проводилось на приборе СФ-2000.

Разделение суммы основных групп веществ с целью получения фракций биологически активных соединений проводили методом колоночной хроматографии, в качестве сорбентов использовали полиамид (фракция 50-160 шц, Германия «Fluka») и алюминия оксид (для хроматографии). Доказательство структуры выделенных соединений проводили с использованием физико-химических методов анализа: определение температуры плавления на приборе Gallenkamp, определение растворимости согласно методике ГФ ХП, ИК спектры, выполнены на спектрометре UR-20 Spectrod в таблетках калия бромида (концентрация вещества 0,5%). 'Н ЯМР спектры, выполнены на спектрометре Bruker Avance Ш (400 МГц), в качестве растворителя был использован ДМСО — dé, в качестве внутреннего стандарта применяли тетраметилсилан (TMS).

Гипотензивную активность исследовали на наркотизированных мединалом кошках (400 мг/кг). Для исследования одного экстракта использовали шесть животных. Все исходные экстракты и фракции БАВ вводили внутривенно в дозе 50 мг/кг. предварительно растворив в 5 мл изотонического раствора.

Антикоагуляционную активность определяли in vitro при помощи коагулометра «Minilab-701». Для опытов использовали цитратную кровь. Экстракты и фракции БАВ испытывали в концентрации 1 мг/мл крови. В качестве контроля использовали цитратную кровь с натрия хлоридом. Эталоном сравнения служил гепарин в концентрации 1 ЕД/мл крови. Для определения механизма антикоагулянтной активности методом центрифугирования получали плазму, обогащенную тромбоцитами, и безтромбоцитную.

Диуретическую активность изучали на крысах-самцах массой 250300 г. Исследуемые экстракты вводили в дозе 50 мг/кг. Препараты сравнения готовили из травы хвоща полевого и листьев брусники. Экскрецию креатинина с мочой определяли унифицированным методом Поппера, основанном на реакции Яффе, с помощью стандартного набора реактивов. Концентрацию ионов натрия и калия в моче определяли методом фотометрии на пламенном фотометре JENWAYPSP7.

Изучение острой токсичности сухих экстрактов и фракций к. черного проводили на белых мышах при однократном пероральном введении.

Экспериментальные животные находились в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., свободном доступе к пище и воде при 12-14-часовом световом дне. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии,

регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ статистической обработки данных «STAT -Статистика». Для выявления статистической значимости различий использовали параметрический критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение качественного и количественного состава БАВ

В результате фотохимического анализа в экстрактах к. черного установлено наличие основных групп биологически активных веществ: флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, иридоидов, кумаринов, полисахаридов и сапонинов; методами хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента по значению Rf, окраске реактивами и методом добавки идентифицированы: кверцетин, лютеолин, гесперидин, кофейная и хлорогеновая кислоты, аукубин и изокаталпол. В экстрактах к. черного доказано отсутствие сильнодействующих веществ, таких как алкалоиды и сердечные гликозиды.

Для изучения количественного содержания иридоидов и флавоноидов в экстрактах к. черного разработана методика количественного определения флавоноидов и модифицирована методика количественного определения иридоидов (табл. 1).

Таблица 1

Метрологические характеристики методик количественного определения иридоидов и флавоноидов в экстракте травы V. nigrum

Методика количественного определения / X S Р,% tW.fi А* Е, %

Иридоидов 9 4,57 0,0209 95 2,76 0,0953 ±2,1

Флавоноидов 9 6,54 0,75 95 2,76 0,33 ±5,0

Результаты определения содержания основных групп БАВ представлены в таблице 2. Максимальное содержание иридоидов обнаружено в экстрактах цветков к. черного, минимальное - в экстракте корней. Значительное накопление иридоидов в генеративных органах, подчеркивает их важную роль в процессах роста и развития растения. Содержание иридоидов в вегетативных органах находится в пределах от 1,1% до 4,7%. Установлено, что содержание иридоидов в экстракте из травы к. черного сопоставимо с их содержанием в экстракте цветков. Максимальное содержание флавоноидов и свободных органических кислот

обнаружено в экстракте стеблей к. черного, минимальное - в экстракте корней. Содержание анализируемых групп БАВ в листьях и цветках находится, примерно, на одном уровне, что, вероятно, связано с процессом их биосинтеза.

Таблица 2

Содержание БАВ в экстрактах V. nigrum

№ п/п Образец (экстрагент) Способ получения* Содержание, % (п = 3)

иридоидов флавоноидов свободных органических кислот

1 Экстракт из травы (вода) А 4,7 ± 0,02 3,2 ± 0,2 0,002 ± 0,0005

2 Экстракт из травы (спирт) Б 2,3 ± 0,01 7,5 ± 0,2 0,003 ± 0,0002

3 Экстракт из стеблей (вода) А 3,1 ±0,02 4,1 ±0,4 0,002 ± 0,0003

4 Экстракт из стеблей (спирт) Б 1,2 ±0,01 7,9 ± 0,3 0,004 ± 0,0001

5 Экстракт из листьев (вода) А 2,0 ± 0,03 3,1 ±0,1 0,002 ±0,0001

6 Экстракт из листьев (спирт) Б 1,1 ±0,02 6,4 ± 0,4 0,003 ± 0,0004

7 Экстракт из цветков (вода) А 5,1 ±0,03 2,5 ± 0,2 0,001 ± 0,0004

8 Экстракт из цветков (спирт) Б 2,1 ±0,01 5,3 ± 0,5 0,001 ±0,0007

9 Экстракт из корней (вода) А 0,8 ±0,01 1,0 ±0,1 0,001 ± 0,0002

10 Экстракт из корней (спирт) Б 0,5 ± 0,01 1,8 ±0,2 0,001 ± 0,0005

Примечание: * способ получения экстракта: А — методика I, Б — методика II.

Таким образом, использование травы к. черного для приготовления экстракта является целесообразным и обосновано накоплением основных групп БАВ. В качестве экстрагента рекомендуется использовать этанол с целью увеличения количественного содержания флавоноидов.

Фракционное разделение биологически активных веществ и выделение индивидуальных соединений экстракта коровяка черного

Для фракционного разделения основных групп БАВ использовали концентрированное извлечение к. черного, полученное по методике IV, которое подвергали очистке хлороформом от хлорофилла и липофильных веществ. В результате получали водные фракции «А» и «Б» (рис. 1). Фракцию «А» разделяли на колонке с алюминия оксидом, элюируя смесью бензол-метанол в соотношении 1:1 до отрицательной реакции на кумарины

(рис.2). После проведения качественного анализа элюаты 1-15 объединяли, элюент отгоняли под вакуумом, выдерживали в сушильном шкафу при температуре не более 60 °С 5 ч до сухого состояния, получали фракцию кумаринов (ККЧ), характеристика которой приведена в таблице 3.

Водную фракцию «Б» разделяли на колонке с полиамидным сорбентом (рис. 3). Сначала колонку промывали водой до отрицательной реакции на иридоиды, в результате были получены элюаты с 16 по 46. Общий объем водной фракции составил 3250 мл. Ее сгущали в вакууме до объема 200 мл. К концентрированному извлечению добавляли этанол 95% в соотношении 1:2, получали фракцию полисахаридов (ПКЧ) (рис. 3), характеристика приведена в таблице 3. Из водного остатка, оставшегося после осаждения полисахаридов, отгоняли растворитель под вакуумом, высушивали в сушильном шкафу при температуре не более 60 СС до сухого состояния. Таким образом, получали фракцию иридоидов (ИКЧ) (рис. 3, табл. 3).

Рис. 1. Схема фракционного разделения БАВ V. nigrum (<Ступень 1 - выделение водных фракций «А» и «Б»)

Далее колонку промывали этанолом 10% до отрицательной реакции на фенолокислоты, элюаты имеющие одинаковый компонентный состав объединяли 46-56, 57-61 и 62-70. Элюент отгоняли под вакуумом, фракции выдерживали в сушильном шкафу при температуре не более 60 °С 5 ч до сухого состояния. Таким образом получены три фракции фенолокислот (ФККЧЬ ФККЧ2, ФККЧ3) (рис. 3), характеристики которых представлена в таблице 3.

Далее колонку промывали последовательно этанолом с возрастающей концентрацией 40% (элюаты 71-95), 80% (элюаты 96-125), 95% (элюаты 126-139), собирали элюаты до отрицательной реакции на флавоноиды. Получены элюаты 71-139 (рис. 3). По результатам хроматографического анализа элюаты, полученные с использованием спирта одинаковой концентрации, объединяли, отгоняли под вакуумом, выдерживали в сушильном шкафу при температуре не более 60 °С 5 ч до сухого состояния. Таким образом получены три фракции флавоноидов (ФКЧ15 ФКЧ2, ФКЧз) (табл. 3).

Рис. 2. Схема фракционного разделения БАВ V. nigrum (Ступень 2 - хроматографическое разделение водной фракции «А» на колонке с АЬСь)

Концаггрнро ванне

Осаждение 95%

Фильтрование

Разделение на колонке полиамидного сорбента

-JL _

И.Элюирование 10% этанолом до отрицательной

реакции на фенол карболовые кислоты

Т

Ш.Эдюирование этанолом различной концентрации до отрицательной реакции на флавононды

Элюаты Эжши Элюагы Э.цоеты Эшоаш Элюаш

57-61 j 62-70 71-95 96-125 126-139

Отгонка элюентов

Отгонка элюентов

ФККЧ, ФККЧ, ФККЧз

||-Ч.-- - 1.... ■■■■.

ФКЧ,

Рис. 3. Схема фракционного разделения БАВ V. nigrum {Ступень 3 - хроматографическое разделение водной фракции «Б» на колонке с полиамидным сорбентом)

Компонентный состав фракций изучен методом хроматографии на бумаге и представлен в таблице 3. С помощью аутентичных образцов (по значению Rfj окраске реактивами и методом добавки) вещество фракции кумаринов К1 идентифицировано как скополетин, вещество К2 -умбеллиферон. Вещество фракции иридоидов И1 идентифицировано как аукубин, И2 - изокаталпол. Вещество ФК1 идентифицировано как кофейная кислота, ФКЗ - хлорогеновая кислота. Вещества фракции флавоноидов Ф1, Ф2, ФЗ идентифицированы, как кверцетин, лютеолин и гесперидин, соответственно. Для доказательства структуры гесперидина монокомпонентные фракции ФКЧ2 и ФКЧ3 объединяли, перекристаллизовывали дважды из этанола, выход вещества составил 3,8 г. Определяли физико-химические свойства. Подлинность доказана с помощью качественных реакций, температуры плавления и методами УФ, ИК и ПМР спектроскопии.

Таблица 3

Характеристика и выходы фракций экстракта V. nigrum

Код фракции Характеристика фракции Компонентный состав Выход, г (%)

пкч (полисахариды) Светло-коричневый аморфный порошок, легко растворимый в воде сладковатого вкуса, без запаха дает качественные реакции на полисахариды Не установлен 21,0 ±1,05 (7,0)

ккч (кумярины) Желтый аморфный порошок со специфическим запахом и вкусом, умеренно растворим в воде, хлороформе, этиловом эфире дает качественные реакции на кумарины К1, К2, КЗ, К4 0,6 ± 0,03 (0,2)

икч (нридоиды) Аморфный коричневый порошок без запаха, горького вкуса, легко растворим в воде, дает качественные реакции на иридоиды И1.И2 8,0 ± 0,4 (2,7)

ФККЧ, (фенолокислоты I) Порошок желтого цвета без запаха, горьковатого вкуса, растворим в воде," дает качественные реакции на фенолокислоты ФК1 0,02 ±0,001 (0,0006)

ФККЧ2 (фенолокислоты 11) Желтый порошок без запаха, горького вкуса, растворим в воде, дает качественные рекции на фенолокислоты ФК1.ФК2, ФКЗ 0,05 ± 0,007 (0,002)

ФККЧз (фенолокислоты III) Бледно-желтый порошок, без запаха, без вкуса, легко растворим в воде не растворим в хлороформе, мало растворим в диэтиловом эфире дает качественные реакции на фенолокислоты ФКЗ 0,03 ± 0,002 (0,0009)

Сумма ФККЧ (1-3) 0,1 (0,03)

ФКЧ, (флавоноиды I) Светло-коричневый кристаллический блестящий порошок растворим в воде горьковатого вкуса, дает качественные реакции на флавоноиды Ф1, Ф2, ФЗ 5,5 ± 0,27 (1,8)

ФКЧ2 (флавоноиды II) Желтоватый порошок умеренно растворим в воде, без запаха и вкуса, дает реакции на флавоноиды ФЗ 4,0 ± 0,2 (1,3)

ФКЧз (флавоноиды III) Желтоватый порошок умеренно растворим в воде, без запаха и вкуса, дает реакции на флавоноиды ФЗ 1,5 ±0,08 (0,5)

CvMMa ФКЧ (1-3) 11,0 (3,6)

Сумма БАВ 40,7 (13,6)

Разработка технологии экстракта травы коровяка черного сухого

Для разработки средства на основе травы к. черного предложено получение сухого экстракта, поскольку данный способ переработки JIPC является наиболее рациональным, обеспечивающим максимальное извлечение действующих веществ и возможность создания стандартизованного фитопрепарата. Методом математического моделирования установлены оптимальные значения факторов, влияющих на процесс извлечения флавоноидов, свободных органических кислот, иридоидов из травы к. черного и условия проведения технологического процесса: реперколяция с законченным циклом без выпарки в батареи из трех перколяторов с неравной загрузкой сырья, экстрагент - этанол 60%, размер частиц сырья — 1 мм, время экстракции 8 ч с каждой частью экстрагента. Разработан лабораторный регламент на производство экстракта коровяка черного сухого.

Полученный экстракт представляет собой аморфный порошок темно-коричневого цвета с красноватым оттенком сладковатого вкуса со специфическим запахом, дающий положительную реакцию с пробой Синода и Брианта. При хроматографировании в тонком слое сорбента раствор экстракта дает три вещества — кверцетин, лютеолин и гесперидин. УФ-спектр раствора экстракта имеет плечо при 285-287 нм и один максимум при 330 нм. При добавлении в испытуемый раствор алюминия (III) хлорида наблюдается гипсохромный сдвиг и гипохромный эффект длинноволнового максимума (329 нм).

По потере в массе при высушивании и содержанию тяжелых металлов субстанция соответствует требованиям ГФ XI, вып. 1, статья «Экстракты». По показателю «Микробиологическая чистота» экстракт травы коровяка черного сухой удовлетворяет требованиям ГФ XI и Изменению №3 (категория ЗБ).

Для определения суммарного содержания флавоноидных веществ в пересчете на гесперидин использован метод дифференциальной спектрофотометрии, рассчитан удельный показатель поглощения (A1/qicu) комплекса раствора PCO гесперидина с алюминия (III) хлоридом в смеси диоксан - вода (1:1) при аналитической длине волны (383 нм), который в пересчете на 100% субстанцию составляет 120±1. Установлена норма содержания суммы флавоноидов в экстракте коровяка черного сухом — не менее 5%.

Установлен срок годности экстракта — 2,5 года.

На основании полученных данных составлен проект ФСП «Экстракт коровяка черного сухой».

Фармакологические свойства сухих экстрактов и фракций БАВ коровяка черного

Гипотензивная активность

Спиртовые экстракты из стеблей активнее водных в 8,6, из травы, соответственно, в 2,5, листьев - в 1,6, цветков - в 1,4 раза. Гипотензивная активность водных извлечений на пике эффекта находилась в интервале 3,6-12,4% и убывала в ряду: трава, цветки, стебли, листья. Водные извлечения из листьев и травы проявляют максимальную активность на 2 мин, а из цветков и стеблей на 5 мин после введения. Спиртовые и водные извлечения из корней практически не влияют на уровень артериального давления (рис. 4). Доказано, что вклад в активность вносят, прежде всего, флавоноиды (87,1%) и кумарины (10,1%), в то время как иридоиды на данный вид активности не влияют (рис. 5).

40 35 30 25

!;; 10

•5 5 0

1

* И.?«.

I

т Ё

г;

ШШ'/'

i

Рис. 4. Гипотензивная активность Рис. 5. Гипотензивная

экстрактов V. nigrum активность фракций БАВ

Примечание: *р<0,05 у nigrum

Примечание: *р<0,05

Антикоагулянтная активность

Спиртовые и водные экстракты из различных органов к. черного обладают одновекторным действием. Наибольшую активность проявляют водный экстракт из стеблей, который удлиняет время свертывания крови на 26,3 % (табл. 4). Далее в порядке убывания следуют извлечения из цветков, травы, листьев, корней. Извлечения из корней практически не проявляют антикоагулянтного действия, а небольшие изменения времени свертывания крови находятся на уровне предела полуширины доверительного интервала. Водные извлечения из стеблей и цветков более

активны, чем спиртовые. Значительное превышение активности водных извлечений над спиртовыми свидетельствует о преимущественной растворимости биологически активных веществ, ответственных за антикоагулянтное действие, в воде.

Таблица 4

Антикоагулянтная активность экстрактов V. nigrum

Экстракт Способ получения* Время свертывания крови, с Увеличение времени свертывания крови, %

контроль опыт

Цветков А 25,9 ±2,0 31,7 ± 1,7** 22,0

Б 26,9 ±4,1 30,8 ±5,5 12,2

Листьев А 31,3 ± 1,3 35,2 ±2,1** 12,0

Б 23,8 ± 1,6 28,5 ±2,0** 19,0

Стеблей А 22,8 ± 1,1 28,8 ±0,8** 26,3

Б 21,2 ± 1,3 23,8 ±2,1 12,0

Корней А 38,8 ± 1,4 38,9 ±2,5 1,0

Б 23,8 ± 1,1 24,4 ± 1,0 2,5

Травы А 25,5 ± 1,3 30,2 ± 1,2 17,7

В 26,5 ± 1,1 33,1 ± 1,2 17,0

Эталон сравнения Гепарин 29,9 ± 0,5 36,6 ± 1,8** 22,4

Примечание: * способ получения экстракта: А - методика I, Б - методика II. В-методика III. "различия достоверны по сравнению с контролем.

При определении механизма действия экстрактов выяснено, что они замедляют время свертывания как цельной, так и безтромбоцитарной плазмы. При этом сила и направленность действия извлечений из отдельных органов аналогична данным, полученным для цельной крови. В связи с тем, что в плазме крови, обогащенной тромбоцитами, отсутствуют только эритроциты, можно сделать заключение, что БАВ к. черного не влияют на эритроцитарный компонент тромбообразования. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что извлечения из к. черного не вызывают блокады функций тромбоцитов, а оказывают влияние на плазменные факторы свертывания крови, сходное с действием гепарина. Доказано, что вклад в активность вносят прежде всего иридоиды (30%). Флавоноиды, экстрагируемые этанолом 40%, замедляли время свертывания на 11,0%, в то время как монокомпонентные фракции флавоноидов замедляли время свертывания на 9,3%.

Влияние фракций БАВ на безтромбоцитарную плазму аналогично действию на цельную кровь и плазму, обогащенную тромбоцитами.

Исследования антикоагулянтной активности официнальных видов к. обыкновенного и к.скипетровидного выявили антикоагулянтную

активность экстрактов из надземной части (рис. 6,7). Максимальное увеличение времени свертывания крови наблюдалось при исследовании водных экстрактов стеблей обоих видов, тогда как экстракты корней активности не проявили.

® =

а- о £-8"

14 Н,2

10,1% 9,8% 9,3%

& с* ¿^ ¿^ о??-

* * + *■ * + <?+ V V

Ь' « с,- »

Рис. 6. Антикоагулянтная активность экстрактов V. Марят Примечание: *р<0,05

Рис. 7. Антикоагулянтная активность экстрактов V. с1еп51Аогит Примечание: *р<0,05

При сравнении полученных результатов по влиянию экстрактов на свертывающую систему крови нам удалось установить, что среди трех видов рода коровяк наибольшую антикоагуляционную активность проявляет вид к. черный.

Диуретическая активность

Способность усиливать диурез характерна для всех экстрактов к. черного. При этом, за первые 3 ч опыта выделялся больший объем мочи, чем за последующее время эксперимента. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что биологически активные вещества экстрактов оказывают максимальный эффект в первые 3 ч после введения. Максимальный объем выделенной мочи был получен при введении экстракта из стеблей к. черного и составлял около 4 мл за все время эксперимента, что превышает объем жидкости, выделившейся под влиянием экстракта хвоща полевого и сопоставимо с этим показателем экстракта брусники (4,8 мл) (рис. 8). Меньшую активность проявил экстракт корней к. черного. С целью идентификации природы соединений, входящих в экстракт к. черного, отвечающих за диуретическую активность, нами были исследованы фракции БАВ (рис. 9). Все фракции флавоноидов проявили высокую диуретическую активность.

Рис. 8. Диуретическая Рис. 9. Диуретическая активность

активность экстрактов V. nigrum фракций БАВ V. nigrum

Экскреция мочи под действием фракции флавоноидов ФКЧ2 и ФКЧ3 увеличивалась в 4 раза по сравнению с действием травы хвоща полевого и в 2 раза по сравнению с действием листьев брусники обыкновенной. Фракции фенолокислот и иридоидов диуретической активности не проявили. При изучении влияния экстрактов к. черного на экскрецию натрия и калия было выявлено, что все экстракты растения усиливают выведение ионов натрия.

Концентрация креатинина в моче у крыс, получавших экстракты к. черного, находилась на уровне контроля (около 0,006 мМоль). Отсутствие снижения выделения креатинина с мочой под действием экстрактов позволяет сделать вывод о том, что экстракты из к. черного не влияют на функцию почек.

Доказано наличие гипотензивного, антикоагулянтного и диуретического действия у опытного образца экстракта травы к. черного, полученного по разработанной технологии. Экстракт не оказывает токсического действия в дозе 5000 мг/кг и относится к веществам малоопасным.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В результате анализа групп БАВ экстрактов из травы и различных органов к. черного установлено наличие: флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, иридоидов, кумаринов, полисахаридов и сапонинов. В экстрактах к. черного с использованием аутентичных образцов идентифицированы кверцетин, лютеолИН, гесперидин, кофейная и хлорогеновая кислоты, аукубин.

2. Методом колоночной хроматографии из экстракта к. черного, полученного исчерпывающей экстракцией, выделены фракции БАВ: полисахариды, кумарины, иридоиды, фенолокислоты, флавоноиды и установлены их физико-химические свойства. Определено, что поликомпонентными являются фракция кумаринов, в которой идентифицированы скополетин и умбеллиферон, а так же иридоидов, в которой идентифицированы аукубин, каталпол и изокаталпол. Выявлено, что ряд фракций флавоноидов и фенолокислот, содержат по одному компоненту, что позволило выделить индивидуальные соединения: хлорогеновую, кофейную кислоты и гесперидин. Изучены их физико-химические свойства и доказана структура с помощью УФ, ИК, ПМР -спектроскопии.

3. Изучено количественное содержание флавоноидов, иридоидов и свободных органических кислот в экстрактах травы и различных органов к. черного. Разработана методика количественного определения в экстракте к. черного суммарного содержания флавоноидных соединений в пересчете на гесперидин (метод дифференциальной спектрофотомерии). Ошибка единичного определения составила 5,0% с доверительной вероятностью 95%. Максимальное количество флавоноидов определено в спиртовых экстрактах к. черного, полученных из травы. Модифицирована методика количественного определения иридоидов экстракта из надземной части к. черного сухого. Ошибка единичного определения составляет 2,1% с доверительной вероятностью 95%. Максимальное количество иридоидов переходит в водные экстракты.

4. Установлены оптимальные значения факторов, влияющих на процесс извлечения БАВ из травы к. черного и условия проведения технологического процесса. Разработан лабораторный регламент на производство экстракта коровяка черного сухого.

5. Разработаны показатели качества и объективные методики анализа экстракта к. черного сухого, заключающиеся в проведении качественных реакций на флавоноиды, установлены параметры УФ-спектра и методики проведения ТСХ хроматографии, включенные в нормативную документацию.

6. Проведена стандартизация экстракта к. черного сухого и разработан проект ФСП «Экстракт коровяка черного сухой».

7. Изучена биологическая активность экстрактов и фракций БАВ к. черного. Установлено гипотензивное, антикоагулянтное, диуретическое действие. Экстракт травы не оказывает токсического действия в дозе 5000 мг/кг и отнесен к веществам малоопасным. Приоритет исследований подтвержден заявкой на патент РФ на изобретение № 2011126730 от 29.06.2011.

Список опубликованных работ

1. Устинова, С.A. The studies of the blood circulation system / C.A. Устинова, A.A. Краснова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2006. — № 1. - С. 118.

2. Устинова, С.А. Антикоагулянтная активность спиртовых и водных извлечений из коровяка черного / С.А. Устинова, Д.В. Калинин, А.А. Краснова, О.В. Щербакова, К.А. Мищенкова // Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы», Саратов. - 2006. - С. 151.

3. Устинова, С.А. Антикоа1улянтная активность спиртовых и водных извлечений из коровяка черного / С.А. Устинова, Д.В. Калинин, А.А. Краснова, К.А. Мищенкова // Сборник тезисов 80-ой студенческой научной конференции, Казань. — 2006. — С. 211.

4. Устинова, С.А. Антикоагулянтная и гипотензивная активности извлечений из различных частей коровяка черного / С.А. Устинова, Д.В.Калинин, А.А. Краснова, О.В. Щербакова, К.А. Мищенкова // Материалы VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», Москва. - 2006. - С. 516.

5. Устинова, С.А. Влияние водных и спиртовых экстрактов надземной части коровяка черного на свертывающую систему крови / С.А. Устинова, Д.В. Калинин, А.А. Краснова, О.В. Щербакова, К.А. Мищенкова // Материалы 65-й юбилейной открытой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Волгоград. - 2007. - С. 209.

6. Устинова, С.А. Влияние извлечений из коровяка черного на свертывающую систему крови и артериальное давление / С.А. Устинова, Д.В. Калинин, А.А. Краснова, О.В. Щербакова, К.А. Мищенкова // Материалы П международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения», Санкт-Петербург. - 2007. -С. 126.

7. Устинова, С.А. Влияние биологически активных соединений травы коровяка черного на гемостаз / С.А. Устинова, Д.В. Калинин, A.A. // Тезисы докладов межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», Санкт-Петербург. - 2009. - С. 107-108.

8. Устинова, С.А. Биологически активные вещества травы коровяка черного / С.А. Устинова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2009. - № 5. - С. 202-204.

9. Устинова, С.А. Влияние извлечений из Verbascum nigrum (Scrophulariaceae) на гемостаз / С.А. Устинова, В.М. Петриченко, Б.Я. Сыропятов// Раст. ресурсы.-2009. - вып. 4.-С. 111-116.

10. Петриченко, В.М. Биологические и химические свойства растений семейства норичниковые / В.М. Петриченко, ... С.А. Калинина и др. // Региональный конкурс РФФИ - Урал. Результаты научных исследований, полученные за 2007-2009 гг. Сб. статей. Ч. 2. Пермь: ПНЦ УрО РАН, 2010. - С. 113-117.

11. Щербакова, О.В. Токсичность экстрактов из растений семейства Норичниковые / О.В. Щербакова, Калинина С.А., Петриченко В.М., Сыропятов Б.Я., Ковалева М.Ю. // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2010. - № 7. - С. 227-229.

12. Калинина, С.А. Кумариновые соединения экстракта коровяка черного / Калинина С.А., Петриченко В.М. // Материалы ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье», Екатеринбург. - 2010. -С. 239-241.

13. Калинина, С.А. Унификация методики количественного определения иридоидов в экстрактах травы коровяка черного . / С.А. Калинина // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2010.-№ 6. - С. 207-210.

14. Kalinina, S.A. Biologically active extracts of Mullein black {Verbascum nigrum L.) / S.A. Kalinina, V.M. Petrichenko, B.Ya. Siropyatov // International conference «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine», Saint Petersburg, 2011. -P. 281-282.

15. Калинина, С.А. Фармакологическая активность комплексов биологически активных веществ травы коровяка черного / С.А. Калинина //Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. -2011.

8.-С. 155-157.

16. Калинина, С.А. Разработка современного метода стандартизации экстракта коровяка черного / С.А. Калинина, Т.В. Бомбела, В.М. Петриченко // Вестник уральской медицинской академической науки, 2011. - № 3/1. - С. 60.

17. Калинина, С.А. Гипотензивная активность экстрактов из Verbascum nigrum (Scrophulariaceae) / С.А. Калинина, В.М. Петриченко, Б.Я. Сыропятов//Раст. ресурсы.-2011.-вып. 1.-С. 131-135.

18. Калинина, С.А. Разработка технологии сухого экстракта травы коровяка черного / С.А. Калинина, Е.И. Молохова, В.М. Петриченко // Фармация, 2012. - №5. - С. 38 - 40.

19. Калинина, С.А. Фенольные соединения сухого экстракта надземной части Verbascum nigrum (Scrophulariaceae) / С.А. Калинина, В.М. Петриченко // Раст. ресурсы. - 2012. - вып. 2. - С. 237-244.

20. Kalinina, S.A. Plants of Scrophulariaceae family as a source of new therapeutic agents / S.A. Kalinina, B.Ya. Syropyatov, V.M. Petrichenko // International conference Pharma Tech, Kuala Lumpur, 2012. — P. 69.

Автор выражает искреннюю благодарность за помощь в работе к.ф.н., доценту Бомбела Т.В., сотрудникам кафедры фармакогнозии с курсом ботаники, кафедры микробиололии, кафедры промышленной технологии, кафедры фармацевтической технологии ГБОУ В ПО ПГФА Минздрава России.

Калинина Светлана Александровна (Россия)

Фотохимическое изучение экстрактов коровяка черного и возможности их использования в медицине

Проведен качественный анализ экстрактов коровяка черного доказано наличие флавоноидов, иридоидов, фенолкарбоновых кислот, полисахаридов и сапонинов. Разделены фракции БАВ. Выделены индивидуальные соединения гесперидин, кофейная и хлорогеновая кислоты, структурная характеристика доказана при помощи УФ, ПМР и ИК спектроскопии. Установлены оптимальные значения факторов, влияющих на процесс извлечения БАВ из травы к. черного и условия проведения технологического процесса. Разработаны показатели качества и объективные методики анализа экстракта к. черного сухого, заключающиеся в проведении качественных реакций на флавоноиды, установлены параметры УФ-спектра и методики проведения ТСХ хроматографии, включенные в нормативную документацию. Установлена гипотензивная, антикоагулянтная, диуретическая активности экстрактов к. черного.

Svetlana A. Kalinina (Russia)

Phytochemical study of extracts of black mullein and their possible use in medicine

A qualitative analysis of extracts of black mullein was done, the presence of flavonoids, iridoids, phenol carbonic acids, polysaccharides and saponins was proved. Fractions of BAS were separated. Individual compounds hesperidin, caffeic and chlorogenic acids were isolated, a structural feature was proved by UV, NMR and IR spectroscopy. Quality indicators and objective analysis techniques of the extract of black mullein were developed. The optimum parameters of technological process were developed. Antihypetensive, anticoagulant, diuretic activity of extracts of mullein black was established.

Подписано в печать 25.04.2013 Формат 60*84/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ. Тираж 100 экз. Усл. печ. л 1,5 Заказ № 71/2013.

Отпечатано на ризографе в типографии ГБОУ ВПО ПГФА 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел. (342) 282-57-92