Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное и клиническое обоснование фармакологической стимуляции неоваскулогенеза при ишемии конечности

На правах рукописи

Орлова Анжелика Юрьевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И КЛИНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ НЕОВАСКУЛОГЕНЕЗА ПРИ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТИ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.27 - хирургия

1 О ДЕК 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курск - 2009

003488693

Работа выполнена на базе Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители: кандидат фармацевтических наук Артюшкова Елена Борисовма доктор медицинских наук, профессор Суковатых Борис Семенович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Быстрова Наталья Анатольевна кандидат медицинских наук Лазарев Евгений Владимирович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится <£ на заседании диссертационно образовательном учреждении

2009 г,

асов

совета Щ 208.039.03 при Государственном высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан «

2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Хронические облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей (ХОЗАНК) составляют более 20% от всех видов сердечно-сосудистой патологии, что соответствует 2-3% от общей численности населения и 35-50% от численности лиц старше 60 лет (Дадвани С.А., 2000). Особенностью этих заболеваний является тенденция к неуклонному прогрессированию процесса, высокой степени инвалидизации, ампутациям и летальности. Несмотря на широкое распространение различных видов реконструктивных оперативных вмешательств и прогресс в разработке и создании многочисленных моделей имплантатов, не всегда удается добиться адекватной перфузии ишемизированных тканей. Проблема раннего послеоперационного тромбоза шунтов и протезов связана с отсутствием у больных воспринимающего дистального русла, что в условиях увеличивающегося притока крови после операции приводит к осложнениям (Шевченко Ю Л.,2006).

В последнее время возрос интерес к возможностям ангиогенеза в лечении облитерирующих заболеваний, основным патогенетическим звеном которых является ишемия тканей (Ball R.Y. et al., 1995). Повышение компенсаторных возможностей микроциркуляторного русла может быть за счет увеличения плотности и общей площади капиллярной сети, что достигается путем стимуляции неоангиогенеза в ишемизированной конечности (Al-Khaldi А. et al., 2003). Для улучшения кровообращения активно разрабатываются методы стимуляции неоангиогенеза путем введения в организм ангиогенных факторов роста (Asahara Т. et al., 1999). Также используется генная инженерия для введения трансформированных генов с целью стимуляции развития сосудов в области ишемии (Baumgartner I. et al., 1998; Бокерия A.A., 2000; Давыденко B.B. и др., 2000; Константинов Б.А. и др., 2003). Однако все эти факторы роста в организме быстро разрушаются, и появляется необходимость повторных введений, что вызывает ряд побочных эффектов: выраженную вазодилатацию с развитием гипотензии, возникновение сосудистых новообразований в виде гемангиом. Генная инженерия пока находится только на экспериментальном уровне, и ее методы недоступны практическому здравоохранению. В связи с этим продолжается поиск новых факторов неоангиогенеза, ангиогенные свойства которых максимальны, а побочные эффекты сведены к минимуму.

Известно, что в тромбоцитах в большом количестве содержатся факторы роста, стимулирующие образование новых сосудов: VEGF - сосудистый эндо-телиальный фактор роста, FGF - фактор роста фибробластов, PDGF - тромбоци-тарный фактор роста, TGF - трансформирующий фактор роста, VPF - сосудистый фактор проницаемости, EDGF - эпидермальный фактор роста (Sandberg et al., 2001). Введение ангиогенных ростовых факторов в зону ишемии приводит к развитию коллатерального кровообращения и улучшению микроциркуляции в пораженном органе (Мачс В.М., 2000; Iba О. et al., 2002).

В Российской Федерации в настоящее время не зарегистрировано ни одного лекарственного препарата с очевидными доказательствами клинической

эффективности применения у пациентов с перемежающейся хромотой. Несмотря на устоявшиеся программы консервативного лечения больных ХОЗАНК, целостное представление о фармакологической стимуляции неоангиогенеза в полной мере не сформировано. Стимуляция неоангиогенеза в пораженной конечности и активация коллатерального кровообращения - одно из перспективных направлений лечения.

В связи с вышеизложенным интересным является изучение эффективности аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами (аутоБоТП), для лечения ишемии конечности как в эксперименте, так и в клинике, и иммуностимулирующего препарата «Миелопид» пептидной природы, полученного из культуры клеток костного мозга млекопитающих (свиней или телят), в условиях экспериментальной ишемии конечности.

Цель исследования.

Изучить эффективность стимуляции неоваскулогенеза при экспериментальной ишемии конечности посредством интрамускулярного введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, и применения иммуномодулятора «Миелопид», а также использования аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, в пилотном исследовании у больных облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние интрамускулярного введения обогащенной тромбоци-

тами плазмы и препарата «Миелопид» на состояние микроциркуляции при экспериментальной ишемии конечности.

2. Изучить влияние интрамускулярного введения обогащенной тромбоци-

тами плазмы и препарата «Миелопид» на динамику морфологических изменений при экспериментальной ишемии конечности.

3. Оценить уровень гемодинамики в магистральных сосудах и сосудах мик-

роциркуляторного русла в ишемизированной конечности у больных на фоне создания аутоплазмоинфильтратов под ультразвуковым контролем по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий.

4. Изучить клинический статус пациентов по шкале Rutherford et al. и «каче-

ство жизни» с помощью опросника MOS SF-36, нормированного для сосудистых больных, до и через б месяцев после лечения аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами.

5. Разработать новый способ лечения ХОЗАНК - аутоплазмоинфильтрацию

нижних конечностей под ультразвуковым контролем.

Научная новизна.

Определена положительная динамика уровня микроциркуляции и морфологической картины в ишемизированной конечности крыс на фоне введения плазмы, обогащенной тромбоцитами.

Установлено положительное влияние препарата «Миелопид» на состояние микроциркуляции и морфологическую картину в ишемизированной конечности крыс.

Определено позитивное влияние аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, на макро- и микрогемодинамику в ищемизированной конечности у больных

хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей, а также на их клинический статус и «качество жизни».

Разработан новый способ лечения ХОЗАНК - аутоплазмоинфильтрация нижних конечностей под ультразвуковым контролем, отличающийся от имеющихся тем, что полученную аутоБоТП вводят по ходу сосудистых сегментов (глубокой бедренной и подколенной артерий) с сохраненным кровотоком.

Практическая значимость.

Доказательство эффективности фармакологической стимуляции неоан-гиогенеза при экспериментальной ишемии конечности с помощью препарата «Миелопид» открывает его новые свойства и позволяет проводить его клиническую апробацию, что расширит спектр консервативных мероприятий в лечении хронической ишемии.

Предложенный метод непрямой реваскуляризации посредством интраму-скулярного введения аутоБоТП для стимуляции неоангиогенеза позволяет улучшить результаты лечения больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей.

Положения, выносимые на защиту.

1. Возможности применения плазмы, обогащенной тромбоцитами, для улучшения микроциркуляции в ишемизированных тканях при экспериментальной ишемии конечности.

2. Применение препарата «Миелопид» в условиях экспериментальной ишемии конечности улучшает микроциркуляцию и уменьшает площадь нек-ротизированных тканей.

3. Технология лечения аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами, путем создания аутоплазмоинфильтратов по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий ишемизированной конечности у больных с ХОЗАНК под ультразвуковым контролем.

4. Комплексная оценка результатов лечения пациентов с облитерирующим атеросклерозом аутоБоТП, основанная на изучении гемодинамики, микроциркуляции, клинического статуса и «качества жизни» больных. Внедрение в практику и апробация диссертации.

Результаты выполненных исследований внедрены в работу отделения сосудистой хирургии больницы скорой медицинской помощи МУЗ ГКБ СМП г. Курска. Материалы диссертации используются при проведении занятий со студентами, интернами и ординаторами в Курском государственном медицинском университете.

Основные положения диссертационной работы доложены на III Всероссийской конференции молодых ученых, организованной Воронежской государственной медицинской академией им. H.H. Бурденко и Курским государственным медицинским университетом (г. Воронеж, 2009), заседании научно-практического общества хирургов Курской области (2008 г.), на итоговых научных сессиях Курского государственного медицинского университета (2008, 2009 гг.). По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 - в жур-

налах, рецензируемых ВАК. Получен патент на изобретение: «Способ комбинированного лечения хронической ишемии конечности», № 2353977 от 27.04.2009 г., Курским государственным медицинским университетом приняты 2 заявки на изобретения. Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр хирургических болезней № 1, 2, ФПО, общей хирургии, фармакологии, клинической фармакологии, оперативной хирургии и топографической анатомии Курского государственного медицинского университета.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 126 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Представленный материал иллюстрирован 24 таблицами и 43 рисунками. Библиографический указатель содержит 107 отечественных и 87 иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для решения диссертационных задач нами проведены экспериментальные исследования на 190 крысах-самках линии Вистар и анализ результатов обследования и лечения 12 больных с хронической ишемией нижних конечностей на фоне облитерирующего атеросклероза, находившихся на лечении в отделении сосудистой хирургии МУЗ ГКБ СМП г. Курска с 2008 по 2009 годы.

Материалы и методы исследования.

Для исследования животные были разделены на две серии: контрольную (п=100) и опытную (п=90). В контрольную серию вошла интактная группа крыс (п=10), у которых оценен нормальный уровень микроциркуляции. У животных обеих серий изучали симптоматические проявления, динамику уровня микроциркуляции и морфологической картины в ишемизированной конечности без и на фоне лечения экспериментальной ишемии плазмой, обогащенной тромбоцитами, препаратом «Миелопид», а также их комбинированного применения.

Хроническую ишемию задней конечности моделировали по методике М. Б^апо е! а1. (2004), Б. ТакезЬка еХ а1. (1998) путем иссечения магистрального сосуда, включающего бедренную артерию, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени.

Оценка уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс выполнялась методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). Исследование осуществляли при помощи аппарата - лазер-допплеровского флоуметра «Вюрас-вуБ!«!« МР-100» и датчика «Т5Ю-144». Запись и обработка данных производилась при помощи программы АсяКштЫяе 38. Исследование выполняли под наркозом хлоралгидратом в дозе 250-300 мг/кг, который вводили внутрибрюшинно в виде водного раствора. После наступления наркотического сна иссекали участок кожи на передне-латеральной поверхности правой голени задней конечности. Животное укладывали на противоположную сторону. Датчик вплотную приставляли к мышце и проводили флоуметрию. Уровень микроциркуляции регистрировали в пяти точках: 1) середина длины мышцы; точки на 3-4 мм 2) выше, 3) ниже, 4) латеральнее и 5) медиальнее от первой (патент № 2353977 от 27.04.2009). Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение

30 сек в каждой точке. Из полученных пяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в мышцах голени у данного животного. Из 10 полученных значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования. Общий вид регистрируемой кривой уровня микро-

Рис. 1. Общий вид кривой уровня микроциркуляции, зарегистрированного в пяти точках1. Резкие амплитуды графика между точками связаны со «сканированием воздуха» при переходе от одной точки к другой.

Для изучения реакции микроциркуляторного русла на плазму, обогащенную тромбоцитами, и препарат «Миелопид», а также их комбинированное применение опытная серия крыс была разделена на 3 группы по 30 животных в каждой. Крысам первой группы вводили плазму, обогащенную тромбоцитами, по 0,15 мл в мышцы бедра и голени через 3 часа и трое суток после операции в той же дозировке.

Плазму, обогащенную тромбоцитами, готовили непосредственно перед введением по следующей методике: у одной крысы брали кровь из правого желудочка в объеме 5-7 мл в пробирку с гепарином, центрифугировали ее при скорости 2,5 тысяч оборотов в минуту в течение 15 минут. Затем полученную плазму набирали в стерильный одноразовый шприц и вводили в объеме по 0,15 мл в мышцы бедра и голени правой задней конечности животного.

Крысам второй группы вводили препарат «Миелопид» по 50 мкг/кг в мышцы бедра через 3 часа после операции, затем через одни, двое и трое суток.

Крысы третьей группы получали комбинированное лечение по следующей схеме: через 3 часа после создания ишемии животным вводилась плазма, обогащенная тромбоцитами, в объеме по 0,15 мл в мышцы бедра и голени правой задней конечности, затем через трое суток после операции в той же дозировке + миелопид в дозе 50 мкг/кг в мышцы бедра через 3 часа после операции, затем через одни, двое и трое суток.

Животных выводили из эксперимента на 10, 21 и 28 сутки (по 10 крыс из группы на каждый срок наблюдения). На этих сроках производили лазерную допплеровскую флоуметрию в мышцах голени оперированной конечности. После проведения процедуры ЛДФ мышцу, в которой только что зарегистрировали уровень микроциркуляции, забирали для морфологического исследования.

'Колебания уровня мнкроциркуляции связаны с дыхательными движениями животного.

После выведения животных на разных сроках из эксперимента удаленные ишемизированные мышцы голени фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. После фиксации из каждой мышцы вырезали по два кусочка и после дегидратации в спиртах восходящей крепости заливали в парафин по общепринятой методике. Парафиновые срезы толщиной 7-10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для количественной оценки зоны поражения, воспаления и грануляционной ткани проводили планиметрию срезов с помощью сетки Г.Г. Автандилова. Изготовленные препараты смотрели в 20 полях зрения.

Клиническая апробация (Приказы Минздрава РФ от 25.11.2002 г. № 363 «Об утверждении «Инструкции по применению компонентов крови» и от 23.09.2002 г. № 295 «Об утверждении «Инструкции по проведению донорского прерывистого плазмафереза») разработанной технологии лечения субкритической ишемии конечности в эксперименте проведена у 12 пациентов, вошедших в пилотное исследование при их информированном согласии, находившихся на лечении в отделении сосудистой хирургии МУЗ ГКБ СМП в 2008 - 2009 годах. Все пациенты были мужского пола в возрасте от 48 до 72 лет. Хроническая ишемия нижних конечностей НБ степени на фоне облитерирующего атеросклероза обнаружена у 12 человек. Продолжительность заболевания колебалась от нескольких месяцев до 10 лет и составила в среднем 6,5+0,5 года. У 100% пациентов выявлена различная соматическая патология. При этом у одного и того же больного, как правило, встречалось сочетание нескольких заболеваний: гипертонической болезнью страдали - 7 (58,3%), ишемической болезнью сердца -6 (50%), из которых 4 (33,3%) перенесли инфаркт миокарда, хроническими неспецифическими заболеваниями легких -3 (25%), ишемической болезнью мозга- 2 (16,7%), язвенной болезнью желудка или двенадцатиперстной кишки - 5 (41,7%), мочекаменной болезнью - 2 (16,7%) больных.

Критериями включения пациентов в группу больных, подвергшихся лечению аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами, были: 1) хроническая ишемия нижних конечностей ПБ степени; 2) наличие магистрального кровотока по глубокой артерии бедра и коллатерального кровотока по подколенной или берцовой артериям; 3) невозможность выполнения реконструктивной операции из-за наличия тяжелой сочетанной сопутствующей патологии; 4) диффузное поражение дистального сосудистого русла и плохое состояние путей оттока. Критериями исключения явились: 1) распространенные ишемические расстройства на бедре и голени; 2) наличие сахарного диабета с синдромом диабетической стопы; 3) ампутация конечности на уровне бедра или верхней трети голени.

Наряду с общеклиническими методами: сбор жалоб и анамнеза заболевания, использовали стандартные методы инструментальной диагностики: реова-зографию (РВГ), фотоплетизмографию (ФПГ), допплерографию, ультразвуковое ангиосканирование. Основными критериями терапии явились реовазогра-фический индекс (РИ), фотоплетизмографический индекс (ФИ) и лодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ), которые определяли до и через 6 месяцев после лечения у больных на обеих нижних конечностях.

Результаты лечения оценивались на основании степени изменения клинического статуса по отношению к периоду до клеточной терапии по шкале ЯШег-

ford et al., которая рекомендована в качестве стандарта Российским обществом акгиологов и сосудистых хирургов. В соответствии с международными рекомендациями проведена оценка «качества жизни» больных до и через 6 месяцев после лечения аутоБоТП на основании анкетного обследования пациентов с помощью опросника MOS SF-36, нормированного для сосудистых больных (Российский консенсус, Москва, 2001 г.). Для сравнения использовались показатели «качества жизни» в контрольной группе лиц (п=30) без хронической ишемии нижних конечностей, рандомизированных по полу, возрасту и сопутствующей патологии.

Статистическая обработка результатов. Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±т) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2007.

Результаты экспериментальных исследований и их обсуждение.

Среднее значение уровня микроциркуляции в наружной группе мышц правой голени у интактных (здоровых) крыс составляет 535,2+37,1 п.е. (перфу-зионных единиц). Ошибка этого среднего значения (37,1) не превышает 10% от абсолютного значения (53,52), что свидетельствует о достаточном количестве единиц наблюдения в группе.

Частота симптомов при экспериментальной патологии на 7-10 сутки после операции в обеих сериях животных представлена в таблице 1.

Таблица 1

Частота симптомов экспериментальной ишемии на 7-10 сутки

после операции

Симптомы экспериментальной ишемии конечности Контрольная серия (п=90) Опытная серия(п=90)

Группа №1 (п=30) Группа №2 (п=30) Группа №3 (п=30)

Боль (по косвенным признакам) 85 (94,4%) 23 (76,7%) 25 (83,3%) 30 (100%)

Ограниченное участие конечности в передвижении 79 (87,8%) 17 (56,7%) 19 (63,3%) 27 (90%)

Бледность кожи конечности 64(7,1%) 9 (30%) 8 (26,7%) 17 (56,7%)

Ишемический отек 2 (2,2%) 1 (3,3%) 2 (6,7%) И (36,7%)

Сухая гангрена стопы 6 (6,7%) 2 (6,7%) 3 (10%) 1 (3,3%)

Как видно из таблицы, при осмотре животных после операции моделирования у всех отмечены признаки ишемии оперированной конечности. Имели место ишемический отек, боль в конечности, что проявилось неучастием по-

следней в передвижении, а также агрессивной реакцией крысы в ответ на касание инструментом к больной конечности. Лишь в единичных случаях у животных развилась влажная гангрена голени и стопы. Несмотря на достаточную агрессивность модели экспериментальной патологии и развитие выраженной острой ишемии конечности, через 3-4 суток наблюдалась относительная компенсация артериальной недостаточности: конечность включалась в акт передвижения, исчезал или уменьшался ишемический отек. С течением времени появлялись признаки формирующейся хронической ишемии конечности, что характеризовалось наличием таких патогномоничных симптомов, как трофические расстройства в дистальных участках конечности, ограничение последней в передвижении. В некоторых случаях наблюдалась сухая гангрена пальцев стопы, характерная для синдрома хронической артериальной недостаточности с последующей самоампутацией конечности. То есть у крыс на фоне экспериментальной патологии сформировались те же самые патогномоничные признаки хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК), которые наблюдаются у пациентов с ХОЗАНК.

При сравнении частоты встречаемости симптомов между контрольной и опытной сериями оказалось, что в группе № 1 (на фоне лечения плазмой, обогащенной тромбоцитами) болевой синдром уменьшился на 17,7%; ограниченное участие конечности в передвижении - на 31,3%; в группе № 2 (на фоне лечения миелопидом) процент встречаемости тех же симптомов - на 11,1% и 24,5% соответственно. В группе № 3 (на фоне комбинированного лечения) частота возникновения боли увеличилась на 5,6%, ограниченного участия конечности в передвижении - на 2,2%.

Результаты оценки уровня микроциркуляции с помощью ЛДФ у животных контрольной серии представлены в таблице 2.

Таблица 2

Динамика уровня микроциркуляции в контрольных группах животных

(М+т в абсолютных значениях перфузионных единиц, п=10)

№ п/п Характеристика группы Уровень микроциркуляции Количество животных

1 Интактные (норма) 535,22+17,53 10

2 Модель, ЛДФ через 30 мин 209,82+10,26* 10

3 Модель, ЛДФ на 1 сутки 227,36+8,47* 10

4 Модель, ЛДФ на 3 сутки 222,78+6,32* 10

5 Модель, ЛДФ на 7 сутки 221,20+8,31* 10

6 Модель, ЛДФ на 10 сутки 209,20+6,45* 10

7 Модель, ЛДФ на 14 сутки 250,10+13,69* 10

8 Модель, ЛДФ на 21 сутки 312,08+14,03* 10

9 Модель, ЛДФ на 28 сутки 369,56+14,64* 10

10 Модель, ЛДФ на 90 сутки 512,92+15,09 10

Примечание. Знаком «*» отмечены статистически значимые различия по сравнению

со значением, зарегистрированным в группе I (интактных животных) прир<0,05.

Для наглядности динамика уровня микроциркуляции в мышцах задней конечности животных контрольной серии на протяжении 90 суток изображена на рис. 2.

2.

Рис.

Срок наблюдения

2. Динамика уровня микроциркуляции в контрольной серии животных на

протяжении 90 суток . В точках, отмеченных белым цветом, имеются достоверные различия по сравнению со значением в точке «Норма» при р<0,05.

Как видно из данных таблицы и из графика, после операции уровень микроциркуляции резко и быстро снижается, а затем медленно восстанавливается, однако до 28 суток включительно остается достоверно ниже нормального значения, зафиксированного в группе интактных крыс. Прежних значений уровень микроциркуляции достигает только через 3 месяца после операции.

На протяжении первых десяти суток уровень микроциркуляции остается приблизительно таким же, который наблюдался и в остром периоде после операции - в пределах 210-230 п.е.; тенденция к восстановлению появляется только с 14 суток эксперимента. Данный факт объясняется становлением к этому сроку анатомического механизма компенсации артериальной недостаточности (7и(1аЬ Р., 1998).

Динамика оценки уровня микроциркуляции с помощью ЛДФ у животных опытной серии (3 группы) в сравнении с контрольными и интактной группами отражена в таблице 3.

Таблица 3

Влияние интрамускулярного введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, и препарата «Миелопид» на уровень микроциркуляции у животных с экспериментальной ишемией конечности

Группы животных 10 сутки 21 сутки 28 сутки

Интактная 535,22+17,53 535,22+17,53 535,22+17,53

Контрольная 209,20+6,45* 312,08+14,03* 369,56+14,64*

Группа № 1 (плазма) 480,34+25,39# 594.42+21.73# 885,08+42, Ш

Группа № 2 (миелопид) 350,23+19,05# 470,09+23,03# 760,98+70,12#

Группа № 3 (плаз-ма+миелопид) 135,22+8,73# 258,94+20,12# 291,36+22,41#

Примечание: * - при р< 0,05 в сравнении с интактной группой (норма); в сравнении с контрольной группой.

# - при р<0,05

Расстояния между точками показаны одинаковыми с целью упрощения графика.

Из таблицы видно, что по сравнению с группой интактных животных уровень микроциркуляции в группе крыс, получавших плазму, обогащенную тромбоцитами (группа № 1), на 21 сутки был выше в 1,1 раза, на 28 сутки - в 1,6 раза; по сравнению с контрольной на 10 сутки - в 2,3 раза, на 21 сутки - в 1,9 раза, на 28 сутки — в 2,4 раза. По сравнению с группой интактных животных уровень микроциркуляции в группе крыс, получавших миелопид (группа №2), на 28 сутки был выше в 1,4 раза, а по сравнению с контрольной на 10 сутки возрастает в 1,7 раза, на 21 сутки - в 1,5 раза, на 28 сутки - в 2 раза. Таким образом, на фоне лечения плазмой, обогащенной тромбоцитами, и миелопидом достоверные различия между опытными и контрольными группами появляются уже на 10 сутки. При сопоставлении данных показателей между группой № 1 и № 2 оказалось, что уровень микроциркуляции в группе № I на 10 сутки был выше в 1,4 раза; на 21 сутки - в 1,3 раза; на 28 сутки - в 1,2 раза. Следовательно, наибольшим эффектом воздействия на состояние микроциркуляторного русла обладает плазма, обогащенная тромбоцитами.

Под влиянием терапии комбинированным способом (группа № 3) уровень микроциркуляции достоверно снижается по сравнению с контролем: на 10 сутки в 1,5 раза, на 21 сутки - в 1,2 раза и на 28 сутки - в 1,3 раза.

Микроскопическое исследование удаленных мышц в контрольной серии животных показало следующее. На 10 сутки в пораженных мышцах обнаруживались крупные участки некроза (площадь поражения составила 25-30% от всей площади мышц), на периферии которых и в их глубине имелась картина тяжелого воспаления в виде выраженной инфильтрации сегментоядерных нейтро-филов (рис. 3). Грануляционная ткань занимала небольшую площадь - 3-5% от площади пораженных мышц. На 21 сутки вокруг зоны некроза происходило интенсивное образование грануляционной ткани, богатой сосудами капиллярного типа. Зона некротизированной ткани на этом сроке уменьшалась до 10-12% от площади всей мышцы. На 28 сутки зона некротизированной ткани уменьшалась до 7-10% от площади среза, наблюдалось большое количество регенерирующих миобластов (рис. 4).

Рис. 3. Экспериментальная ишемия конечности, 10 сутки. Густая инфильтрация нейтрофилами (1) некротизированной мышечной ткани (2). Окраска Г+Э. Увеличение 7x40.

Рис. 4. Экспериментальная ишемия конечности, 28 сутки. Густое скопление регенерирующих миобластов (1) среди грануляционной ткани (2). Окр. Г+Э. Ув. 7x40.

Гистологическое исследование пораженных мышц ишемизированных конечностей в опытной группе № 1 (плазма, обогащенная тромбоцитами) показало следующее. На 10 сутки площадь некроза была заметно меньше, чем в контрольной группе, составляя всего лишь 12-16% от площади мышц. Воспалительная реакция носила преимущественно продуктивный характер и характеризовалась выраженным разрастанием грануляционной ткани, богатой капиллярами. Отмечалось большое количество регенерирующих миобластов по периферии некротизированной мышечной ткани уже на 10 сутки эксперимента. На 21 сутки площадь некротизированных участков составляла 5-10% от площади мышц. Грануляционная ткань глубоко врастала в резорбируемую некротизиро-ванную ткань. На 28 сутки в окружающих непораженных мышцах отмечалась пролиферация капилляров, не связанных с грануляционной тканью, некротизи-рованная ткань была обнаружена только у 4 крыс из 10, и ее площадь составляла 2-5% от площади всех мышц (рис. 5).

Рис. 5. Экспериментальная ишемия конечности + плазма, обогащенная тромбоцитами, 28 сутки. Новообразованные капилляры (1) в непораженных мышцах, окружающих грануляционную ткань. Окр. Г+Э. Ув. 7x40.

При проведении гистологического исследования достоверных различий в динамике морфологических изменений в ишемизированных конечностях в группе крыс, получавших миелопид (группа № 2), по сравнению с группой животных, пролеченных плазмой, обогащенной тромбоцитами (группа № 1), не обнаружено. На 10 сутки наблюдалось большое количество полнокровных капилляров в грануляционной ткани, а на 28 сутки также появлялись новообразованные капилляры в непораженных мышцах, окружающих грануляционную ткань.

В группе № 3 (плазма, обогащенная тромбоцитами, + миелопид) гистологическое исследование удаленных мышц показало, что на 10 сутки площадь некроза по сравнению с контролем была больше и составила 35-42%. В артериальных и венозных сосудах обнаруживались обтурируюшие и пристеночные тромбы, в нервных стволах отмечались тяжелые дегенеративные изменения в виде набухания нервных волокон с исчезновением аксональных цилиндров (рис. 6). К 28 суткам у некоторых крыс по периферии некротизированных участков обнаруживались немногочисленные регенерирующие миобласты среди грануляционной ткани, в то время как в контрольной серии они к этому сроку уже густо покрывали площадь среза.

Рис. 6. Экспериментальная ишемия конечности + комбинированное лечение, 10 сутки. Сосудисто-нервный пучок. Тромбы в сосудах (1), вакуольная дистрофия и исчезновение аксонов в нервных волокнах нервных стволиков (2). Окр. Г+Э. Ув. 7x20.

Позитивное воздействие плазмы, обогащенной тромбоцитами, на симптоматическую картину, уровень микроциркуляции и морфологические изменения в ишемизированной конечности животного мы связываем с нахождением в ее составе полипептидных факторов роста, а именно VEGF165 и FGF, которые содержатся в определенных соотношениях, необходимых для неоангиоге-неза. При сопоставлении полученных нами результатов экспериментального исследования с литературными данными (Iwaguchi Т., 1993; Kinnaird Т., Stabile Е., Epstein S.E., Fuchs S., 2003) механизм действия плазмы, обогащенной тромбоцитами, на неоангиогенез схематически представлен на рис. 7.

VEGF индуцирует увеличение сосудистой проницаемости, продукцию оксида азота, разрыхление базальной мембраны и экспрессию молекул адгезии

на поверхности эндотелиоцитов. Все это способствует миграции макрофагов, гладкомышечных клеток, клеток-предшественников эндотелия и в итоге образованию нового сосуда. Похожие биологические эффекты имеет действующий в синергизме с УЕСР фактор роста фибробластов.

Учитывая, что миелопид не обладает непосредственным воздействием на систему микроциркуляции, можно предположить, что механизмом действия данного препарата является стимуляция неоангиогенеза в ишемизированных мышцах. Данный эффект, по всей видимости, связан с наличием в его составе целого комплекса регуляторных молекул - индивидуальных миелопептидов (МП), обладающих широким спектром действия, полностью не изученных до настоящего времени. Полифункциональность пептидов костномозгового происхождения способствует стимуляции неоангиогенеза при ишемии конечности.

В группе крыс, получавших комбинированное лечение (плазма, обогащенная тромбоцитами, +миелопид) нами получены отрицательные результаты их совместного применения. Уровень микроциркуляции достоверно ниже показателей контрольной группы на всех сроках эксперимента, что, скорее всего, связано с их фармакодинамическим антагонистичным взаимодействием.

Рис. 7. Механизм действия плазмы, обогащенной тромбоцитами, на неоангио-генез.

Таким образом, результаты экспериментальных исследований, подтверждающие возможность стимуляции неоваскулогенеза с помощью полипептид-

ных факторов роста, позволяют поставить вопрос об оценке их эффективности в клинической практике. Наиболее предпочтительным является использование интрамускулярного введения аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, по ходу сосудистых сегментов (глубокой бедренной и подколенной артерий) с сохраненным кровотоком, что и послужило предметом пилотного клинического исследования.

Результаты клинических исследований и их обсуждение.

Частота клинической симптоматики в исследуемой группе больных отображена в табл. 4.

Таблица 4

Частота клинических симптомов в исследуемой группе_

Клинические симптомы Исследуемая группа (п=12)

Перемежающаяся хромота на расстояние от 100 до 200 метров 7 (58,3%)

Зябкость и парестезии стоп 10 (83,3%)

Изменение окраски кожи и местной температуры (резкое побледнение и похолодание конечности) 12(100%)

Симптом Леньель-Лавастина («бледного пятна») 12(100%)

Из таблицы видно, что ишемические трофические расстройства, отеки нижних конечностей и распространенные некрозы не отмечались. Таким образом, у всех пациентов клиническая картина соответствовала хронической ишемии конечностей НБ степени.

Всем больным на протяжении стационарного лечеиия проводился комплекс консервативной терапии, направленный на улучшение реологических свойств крови. В одну из нижних конечностей, более ишемизированную (исследуемую) под ультразвуковым контролем вводилась аутоБоТП по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий. Нижняя конечность, менее ишемизи-рованная, в которую аутоБоТП не вводилась, стала контрольной.

Технология изготовления и лечения аутоБоТП заключается в следующем. В асептических условиях перевязочной у пациента из локтевой вены забираем 500,0 крови в специальные контейнеры «Гемокон», предназначенные для забора донорской крови. Полученную кровь центрифугируем при скорости 2,5 тысячи оборотов в минуту в течение 15 минут и помещаем в плазмоэкстрактор, с помощью которого плазма отделяется от эритроцитарной массы в другой контейнер. В результате этого получаем аутоБоТП, содержащую большое количество полипептидных факторов роста, которую набираем в одноразовые шприцы по 50 мл. За время приготовления аутоБоТП пациент получаел инфузионную терапию в объеме 200 мл 0,9% раствора ЫаС1. После манипуляции больного транспортируем в ультразвуковой кабинет на кресле-каталке и укладываем на спину. Проводим обработку паховой области на стороне пораженной конечности дважды 70% раствором спирта, обкладываем стерильным материалом, затем ультразвуковым датчиком лоцируем общую и глубокую бедренную артерии. В кожу и глубжележащие ткани паховой области по ходу артерии вводим

анестетик (0,5% - 10,0 раствор новокаина). Берем иглу со шприцем с заранее набранной аугоплазмой и под ультразвуковым контролем продвигаем по ходу глубокой бедренной артерии, распределяя аутоплазму в рядом расположенных мышцах и создавая вокруг нее аутоплазмоинфильтрат объемом 100 мл. Накладываем асептическую повязку. Затем больного переворачиваем на живот, обрабатываем подколенную область на стороне пораженной конечности дважды 70% раствором спирта, обкладываем стерильным материалом. После этого ультразвуковым датчиком лоцируем подколенную артерию. В кожу и глубже-лежащие ткани подколенной области по ходу артерии вводим анестетик (0,5% -10,0 раствор новокаина). Берем иглу со шприцем с заранее набранной ауто-плазмой и под ультразвуковым контролем продвигаем по ходу подколенной артерии, распределяя аутоплазму вокруг нее в мягких тканях, также создавая аутоплазмоинфильтрат объемом 100 мл. Накладываем асептическую повязку. Пациента транспортируем в палату.

Все больные перенесли малоинвазивное хирургическое вмешательство по предложенной технологии без осложнений. На следующий день пациенты отмечали лишь умеренную болезненность в местах инъекций, гиперемии кожи, повышения локальной температуры не наблюдалось.

Результаты исследования периферической гемодинамики и микроциркуляции представлены в таблице 5.

Таблица 5

Динамика показателей периферической гемодинамики и микроциркуляции у больных с хронической ишемией после лечения _аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами, п=12 _

Показатели гемодинамики и микро-цмркуляции До лечения После лечения

Контрольная конечность Исследуемая конечность Контрольная конечность Исследуемая конечность

РИ (рсовазо-графический индекс) 0,47±0,06 0,29±0,05* 0,49±0,07 0,41±0,06**

ЛПИ (лоды- жечно-плечевой индекс) 0,73±0,15 0,55±0,13* 0,73±0,15 0,7±0,14**

ФИ (фото-плстизмо-графический индекс, %) 47,5±2,1 39,35±2,4* 48,5±2,1 4б,55±4,б**

Примечание: * - при р<0,05 в сравнении с показателями в контрольной конечности до лечения; ** - при р<0,05 в сравнении с показателями в исследуемой конечности до лечения.

Из таблицы видно, что инструментальные показатели статистически достоверно не отличались в контрольных нижних конечностях до и через 6 месяцев после стандартного лечения, а в исследуемых конечностях отмечались дос-

товерные различия по РИ, ЛПИ, ФИ в сравнении с периодом до клеточной терапии аутоБоТП. Объемный кровоток (по данным РИ) в пролеченной конечности увеличился на 0,12±0,01; магистральный кровоток (по данным ЛПИ) - на 0,15±0,01, уровень микроциркуляции (поданным ФИ) - на 7,2±2,2%.

Результаты оценки степени изменения клинического статуса по отношению к периоду до клеточной терапии представлены в табл. 6.

Таблица 6

Оценка эффективности лечения в исследуемой группе больных по шкале Rutherford et al.

Баллы Эффективность Исследуемая группа больных (п=12)

+3 Значительное улучшение -

+2 Умеренное улучшение 10(83,3%)

+1 Минимальное улучшение 2(16,7%)

0 Без изменений -

-1 Минимальное ухудшение -

-2 Умеренное ухудшение -

-з Значительное ухудшение -

Из таблицы видно, что значительного улучшения гемодинамики и микроциркуляции в исследуемой конечности достигнуть не удалось. В 83,3% случаев был достигнут результат с «умеренным» улучшением и в 16,7% - с «минимальным» улучшением. Через 6 месяцев после клеточной терапии все больные отметили уменьшение боли и потепление кожных покровов стопы. Повышение температуры кожных покровов стопы сохранялось в течение всего периода наблюдения у всех пациентов. Дистанция безболевой ходьбы увеличилась в среднем со 100 до 500 метров у 58,3% больных только через 4-6 месяцев после лечения.

Результаты оценки «качества жизни» пациентов отражены в табл. 7.

Таблица 7

Результаты оценки «качества жизни» больных с ХИНК до и через

6 месяцев после лечения аутоБоТП (М+m в абсолютных значениях)

Шкала SF-36 Контрольная группа(п=30) Больные до лечения (п=12) Больные после лечения (п=12)

ФФ 96,0+1,7 30,8+2,1* 32,01+3,4

РФ 90,2+1,8 31,3+3,9" 37,04+2,3

ФБ 89,4+2,1 27,7+1,5* 39,07+1,7'

ООЗ 73,2+1,9 25,4+5,6* 38,18+6,1

ЖА 60,2+2,8 29,3+3,9* 43,7+0,9*

СФ 84,2+3,2 28,1+5,8" 38,43+1,2*

ПЗ 62,4+1,2 35,8+2,1* 34,56+2,4

РЭ 61,1 + 1,7 43,1 + 1,3* 29,71+1,8

ФКЗ 60,2±1,8 31,6+1,9* 38,6+2,1'

ПКЗ 49,1 + 1,8 31,6+2,1* 39,43+3,2

Примечание: # - р < 0,001 в сравнении с показателями в контрольной группе; * - р < 0,05 в сравнении с показателями до лечения.

По данным таблицы видно, что у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей до лечения показатели «качества жизни» статистически достоверно снижены по всем шкалам: физическая функция (ФФ) - на 67,9%, ролевое функционирование вследствие физических проблем (РФ) и общее ощущение здоровья (ООЗ) - на 65,3%, болевой фактор (ФБ) - на 69%, жизненная активность (ЖА) - на 51,3%, социальное функционирование (СФ) - на 66,6%, психическое здоровье (ПЗ) - на 42,7%, ролевые ограничения, обусловленные эмоциональным состоянием (РЭ), - на 29,5%. Показатели «физический компонент здоровья» (ФКЗ) и «психологический компонент здоровья» (ПКЗ) до лечения статистически достоверно снижены соответственно на 47,5% и 35,6%. У больных после лечения аутоБоТП отмечается статистически достоверное увеличение показателей шкал: ФБ - на 29,1%, ООЗ - на 33,5%, ЖА - на 33,0%, СФ - на 26,9%, РФ - на 15,5%, ФКЗ - на 18,1%, ПКЗ - на 19,9%. Статистически недостоверное увеличение показателя ФФ - на 3,75% и достоверное уменьшение шкал «эмоциональная роль» и «психическое здоровье» на 45,1% и 3,6% соответственно говорят о том, что, несмотря на хороший клинический результат терапии, эти больные не выполняют должную физическую нагрузку, стараются оградить себя от любого физического труда, боясь каких-либо осложнений. Они постоянно находятся в состоянии эмоционального напряжения, жалуются на собственную неполноценность, беспомощность, что мешает им вернуться к обычному образу жизни. Положительный эффект больные начинают отмечать через 6 месяцев после лечения.

Таким образом, проведенное нами пилотное исследование доказало эффективность лечения субкритической ишемии у больных ХОЗАНК с помощью разработанной нами технологии аутоплазмоинфильтрации нижней конечности. Тем не менее небольшое количество наблюдений не позволяет сделать далеко идущие выводы. В связи с этим необходимо продолжить исследования в этом направлении.

ВЫВОДЫ

1. Введение 0,15 мл плазмы, обогащенной тромбоцитами, через 3 часа, а затем через трое суток после моделирования экспериментальной ишемии конечности вызывало существенное улучшение показателей микроциркуляции при ЛДФ-метрии ишемизированной конечности, увеличивая значения перфу-зионных единиц на 28 сутки в 2,4 раза по сравнению с контрольной серией. Иммуномодулятор «Миелопид» пептидной природы из культуры клеток костного мозга в дозе 50 мкг/кг через 3 часа и однократно через одни, двое и трое суток также улучшил микроциркуляцию ишемизированной конечности на 28 сутки в 2 раза по сравнению с контролем. Комбинированное использование плазмы, обогащенной тромбоцитами, и миелопида оказалось неэффективным, н уровень микроциркуляции снижался в 1,3 раза.

2. Площадь некроза мышц в ишемизированной конечности в группе животных после введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, и в группе - после введения миелопида не имела статистически достоверных различий и на 10 сутки уменьшилась в среднем на 13,5%, на 21 сутки - на 3,5% по сравнению

с контрольной серией крыс и полностью редуцировалась к 28 суткам, а при комбинированном введении оставалась в среднем такой же, как в контрольной группе.

3. В пилотном исследовании у больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей введение аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий улучшило показатели макро- и микрогемодинамики: объемный кровоток (по данным РИ) в исследуемой конечности увеличился в 1,4 раза; магистральный кровоток (по данным ЛПИ) - в 1,3 раза; уровень микроциркуляции (по данным ФИ)-в 1,2 раза.

4. Оценка клинического статуса пациентов по шкале Rutherford et al. и «качества жизни» с помощью опросника MOS SF-36 обнаружила, что через 6 месяцев после применения разработанного способа лечения у 100% больных отмечалось улучшение клинического статуса: у 16,7% до уровня минимального улучшения, а у 83,3% до уровня умеренного улучшения, физический компонент здоровья повысился на 18,1%, психологический компонент здоровья - на 19,9% по сравнению с периодом до лечения.

5. Разработанный способ аутоплазмоинфильтрации нижней конечности, основным отличием которого является введение аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, под ультразвуковым контролем по ходу сосудистых сегментов (глубокой бедренной и подколенной артерий) с сохраненным кровотоком патогенетически обоснован, легко выполним, не требует создания дополнительных конструкций и не имеет специфических осложнений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Доказанная в эксперименте эффективность иммуномодулятора «Мие-лопид» в дозе 50 мкг/кг при лечении ишемии конечности позволяет рекомендовать его для дальнейших клинических исследований в комплексной терапии больных ХОЗАНК.

2. Для терапии субкритической ишемии нижних конечностей у больных ХОЗАНК следует включить в комплексное лечение с целью стимуляции неова-скулогенеза аутоплазмоинфильтрацию пораженной нижней конечности.

3. Для лечения пациентов с ХОЗАНК необходимо применять следующую технологию аутоплазмоинфильтрации. Из локтевой вены забрать 500,0 крови в специальные контейнеры «Гемокон». Полученную кровь отцентрифугировать при скорости 2,5 тысячи оборотов в минуту в течение 15 минут. Приготовленную аутоплазму, обогащенную тромбоцитами, набрать в одноразовые шприцы по 50 мл. В асептических условиях под ультразвуковым контролем ввести по 100 мл аутоплазмы из двух точек пораженной конечности: в паховой и подколенной областях, соответственно расположению глубокой бедренной и подколенной артерий, по ходу которых и создать аутоплазмоинфильтраты.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Лечебно-диагностический алгоритм развития критической ишемии нижних конечностей / В.В. Князев, А.Ю. Орлова, Ю.С. Строев, MB. Князев // Материалы III Всерос. конф. молодых ученых, организованной Воронеж, гос. мед. акад. им. H.H. Бурденко и Курск, гос. мед. ун-том. - Воронеж, 2009.-Т. 2.-С. 40-43.

2. Оценка неоангиогенного эффекта L-аргишша и его сочетания с плазми-дами гена VEGF при экспериментальной ишемии конечности / Д.В. Пашков, М.В. Покровский, И.М. Колесник и др. // Кубанский науч. мед. вестн. - 2009. - № 5 (110). - С. 102-106.

3. Пат. 2353977 Российская Федерация, МПК7 G 09В 23/28. Способ комбинированного лечения хронической ишемии конечности / Покровский М.В. [и др.]; заявитель и патентообладатель Покровский М.В., Ар-тюшкова Е.Б., Пашков Д.В., Суковатых Б.С. - № 2007145163/14; заявл. 6.12.07; опубл. 27.04.09, Бюл. № 12.

4. Способ лечения хронической ишемии конечности плазмой, обогащенной тромбоцитами, в эксперименте / А.Ю. Орлова, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Кубанский науч. мед. вестн. - 2009. - № 3 (108). -С. 86-90.

5. Суковатых, Б.С. Новый способ лечения хронической ишемии конечности в эксперименте / Б.С. Суковатых, А.Ю. Орлова // Актуальные вопросы хирургии: материалы науч. конф., посвящ. 70-летию каф. (госпитальной хирургии) хирург, болезней № 1. - Курск, 2009. - С. 80-81.

6. Суковатых, Б.С. Новый способ лечения экспериментальной ишемии конечности / Б.С. Суковатых, А.Ю. Орлова, М.В. Покровский // Материалы второго съезда хирургов Южного федерального округа с междунар. участием. - Ростов н/Д., 2009. - С. 245.

7. Суковатых, Б.С. Новые подходы к лечению хронической ишемии конечности в эксперименте / Б.С. Суковатых, А.Ю. Орлова, М.В. Покровский // Сб. материалов конф. «Актуальные проблемы хирургии». - Ташкент, 2009.-С. 280-281.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АутоБоТП - аутоплазма, обогащенная тромбоцитами Ж А - жизненная активность ЛДФ - лазерная допплеровская флоуметрия ЛПИ - лодыжечно-плечевой индекс МП - миелопептиды ООЗ - общее ощущение здоровья ПЗ - психическое здоровье ПКЗ - психологический компонент здоровья РВГ - реовазография РИ - реовазографический индекс

РФ - ролевое функционирование, обусловленное физическим состоянием РЭ - ролевое функционирование, обусловленное эмоциональным состоянием

СФ - социальное функционирование

ФБ - болевой фактор

ФИ - фотоплетизмографический индекс

ФКЗ - физический компонент здоровья

ФПГ - фото плетизмография

ФФ - физическое функционирование

ХИНК - хроническая ишемия нижних конечностей

ХОЗАНК - хронические облитерирующие заболевания артерий нижних

конечностей

ЭК - эндотелиальные клетки

eNOS - синтетаза, приводящая к образованию N0

FGF - Fibroblast growth factor - фактор роста фибробластов

VEGF - vascular endothelial growth factor - сосудистый эндотелиаль-

ный фактор роста

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 17.11.2009 г. Подписано в печать 18.11.2009 г. Формат 30x427s. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 110А. Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

ХОЗАНК составляют более 20% от всех видов сердечно-сосудистой патологии, что соответствует 2-3% от общей численности населения и 35-50% от численности лиц старше 60 лет [25, 84, 40, 101]. Особенностью этих заболеваний является тенденция к неуклонному прогрессированию процесса, высокой степени инвалидизации, ампутациям и летальности. Несмотря на широкое распространение различных видов реконструктивных оперативных вмешательств и прогресс в разработке и создании многочисленных моделей имплантатов, не всегда удается добиться адекватной перфузии ишемизированных тканей. Проблема раннего послеоперационного тромбоза шунтов и протезов связана с отсутствием у больных воспринимающего дистального русла, что в условиях увеличивающегося притока крови после операции приводит к осложнениям [104].

По данным М.И. Лыткина и И.Г. Перегудова [56], при естественном течении атеросклеротического поражения, в частности в аорто-подвздошном сегменте, более 1/3 больных умирает в первые 5-8 лет от начала болезни, а в 25 -50% случаев за этот же срок проводится ампутация пораженной конечности. Даже при лечении пациентов в условиях специализированного стационара количество ампутаций достигает 10 - 20% , а летальность - 15% [11, 39, 77, 103]. Через 5 лет после ампутации умирает, по данным Э.А. Каримова, 6% больных [43].

В последнее время возрос интерес к возможностям ангиогенеза в лечении облитерирующих заболеваний, основным патогенетическим звеном которых является ишемия тканей [133, 179, 129]. Повышение компенсаторных возможностей микроциркуляторного русла может быть достигнуто за счет увеличения плотности и общей площади капиллярной сети, что достигается путем стимуляции неоангиогенеза в ишемизированной конечности [104, 110, 139]. Для улучшения кровообращения активно разрабатываются методы стимуляции неоангиогенеза путем введения в организм ангиогенных факторов роста (Т. Asahara et al., 1999): сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР), фактора роста фибробластов (ФРФ), тромбоцитозависимого фактора роста (ТФР). Также используется генная инженерия для введения трансформированных генов с целью стимуляции развития сосудов в области ишемии (I. Baumgartner et al., 1998; А.А. Бокерия, 2000; В.В. Давыденко и др., 2000; Б.А. Константинов и др., 2003). Однако все эти факторы роста в организме быстро разрушаются и появляется необходимость повторных введений, что вызывает ряд побочных эффектов: выраженную вазодилатацию с развитием гипотензии, возникновение сосудистых новообразований в виде гемангиом. Генная инженерия пока находится только на экспериментальном уровне и ее методы недоступны практическому здравоохранению. В связи с этим продолжается поиск новых факторов неоангиогенеза, ангиогенные свойства которых максимальны, а побочные эффекты сведены к минимуму.

Более 30 лет назад была показана возможность усиления неоваскулогене-за путем введения в ишемизированные ткани конечностей цельной аутокрови [16,17,119].

Известно, что в тромбоцитах в большом количестве содержатся факторы роста, стимулирующие образование новых сосудов: VEGF-сосудистый эндоте-лиальный фактор роста, FGF-фактор роста фибробластов, PDGF-тромбоцитарный фактор роста, TGF-трансформирующий фактор роста, VPF-сосудистый фактор проницаемости, EDGF-эпидермальный фактор роста (Sand-berg et all., 2001). Введение ангиогенных ростовых факторов в зону ишемии приводит к развитию коллатерального кровообращения и улучшению микроциркуляции в пораженном органе [28, 150].

В Российской Федерации в настоящее время не зарегистрировано ни одного лекарственного препарата с очевидными доказательствами клинической эффективности применения у пациентов с перемежающейся хромотой [85]. Несмотря на устоявшиеся программы консервативного лечения больных ХО-ЗАНК, целостное представление о фармакологической стимуляции неоангиогенеза в полной мере не сформировано. Стимуляция неоангиогенеза в пораженной конечности и активация коллатерального кровообращения -одно из перспективных направлений лечения [28].

В связи с вышеизложенным интересным является изучение эффективности аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами (аутоБоТП), для лечения хронической ишемии конечности как в эксперименте, так и в клинике, и иммуностимулирующего препарата «Миелопид» пептидной природы, полученного из культуры клеток костного мозга млекопитающих (свиней или телят) в условиях экспериментальной ишемии конечности.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить эффективность стимуляции неоваскулогенеза при экспериментальной ишемии конечности посредством интрамускулярного введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, и применения иммуномодулятора «Миелопид», а также использование аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, в пилотном исследовании у больных облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 7

1. Изучить влияние интрамускулярного введения обогащенной тромбоцитами плазмы и препарата «Миелопид» на состояние микроциркуляции при экспериментальной ишемии конечности.

2. Изучить влияние интрамускулярного введения обогащенной тромбоцитами плазмы и препарата «Миелопид» на динамику морфологических изменений при экспериментальной ишемии конечности.

3. Оценить уровень гемодинамики в магистральных сосудах и сосудах мик-роциркуляторного русла в ишемизированной конечности у больных на фоне создания аутоплазмоинфильтратов под ультразвуковым контролем по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий.

4. Изучить клинический статус пациентов по шкале Rutherford et. al. и «качество жизни» с помощью опросника MOS SF-36, нормированного для сосудистых больных, до и через 6 месяцев после лечения аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами.

5. Разработать новый способ лечения ХОЗАНК - аутоплазмоинфильтрацию нижних конечностей под ультразвуковым контролем.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Определена положительная динамика уровня микроциркуляции и морфологической картины в ишемизированной конечности крыс на фоне введения плазмы, обогащенной тромбоцитами.

2. Установлено положительное влияние препарата «Миелопид» на состояние микроциркуляции и морфологическую картину в ишемизированной конечности крыс.

3. Определено позитивное влияние аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, на макро- и микрогемодинамику в ищемизированной конечности у больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей, а также на их клинический статус и «качество жизни».

4. Разработан новый способ лечения ХОЗАНК -аутоплазмоинфильтрация нижних конечностей под ультразвуковым контролем, отличающийся от имеющихся тем, что полученную аутоБоТП, вводят по ходу сосудистых сегментов (глубокой бедренной и подколенной артерий) с сохраненным кровотоком.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

1. Доказательство эффективности фармакологической стимуляции неоан-гиогенеза при экспериментальной ишемии конечности с помощью препарата «Миелопид» открывает его новые свойства и позволяет проводить его клиническую апробацию, что расширит спектр консервативных мероприятий в лечении хронической ишемии.

2. Предложенный метод непрямой реваскуляризации посредством интраму-скулярного введения аутоБоТП для стимуляции неоангиогенеза позволяет улучшить результаты лечения больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Возможности применения плазмы, обогащенной тромбоцитами, для улучшения микроциркуляции в ишемизированных тканях при экспериментальной ишемии конечности.

2. Применение препарата «Миелопид» в условиях экспериментальной ишемии конечности улучшает микроциркуляцию и уменьшает площадь некротизированных тканей.

3. Технология лечения аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами, путем создания аутоплазмоинфильтратов по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий ишемизированной конечности у больных с ХОЗАНК под ультразвуковым контролем.

4. Комплексная оценка результатов лечения пациентов с облитерирующим атеросклерозом аутоБоТП, основанная на изучении гемодинамики, микроциркуляции, клинического статуса и «качества жизни» больных.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты выполненных исследований внедрены в работу отделения сосудистой хирургии больницы скорой медицинской помощи МУЗ ГКБ СМП г. Курска. Материалы диссертации используются при проведении занятий со студентами, интернами и ординаторами в Курском государственном медицинском университете.

Основные положения диссертационной работы доложены на III Всероссийской конференции молодых ученых, организованной Воронежской государственной медицинской академией им. Н.Н. Бурденко и Курским государственным медицинским университетом (г. Воронеж, 2009), заседании научнопрактического общества хирургов Курской области (2008 г), на итоговых научных сессиях Курского государственного медицинского университета (2008, 2009 гг.). По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 - в журналах, рецензируемых ВАК. Получен патент на изобретение: «Способ комбинированного лечения хронической ишемии конечности», № 2353977 от 27.04.2009 г., Курским государственным медицинским университетом приняты 2 заявки на изобретения. Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр хирургических болезней № 1, № 2, ФПО, общей хирургии, фармакологии, клинической фармакологии, оперативной хирургии и топографической анатомии Курского государственного медицинского университета.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертация изложена на 126 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Представленный материал иллюстрирован 24 таблицами и 43 рисунками. Библиографический указатель содержит 107 отечественных и 87 иностранных источника.

выводы

1. Введение 0,15 мл плазмы, обогащенной тромбоцитами, через 3 часа, а затем через 3 суток после моделирования экспериментальной ишемии конечности вызывало существенное улучшение показателей микроциркуляции при ЛДФ-метрии ишемизированной конечности, увеличивая значения перфузион-ных единиц на 28 сутки в 2,4 раза по сравнению с контрольной серией. Им-муномодулятор пептидной природы из культуры клеток костного мозга «Миелопид» в дозе 50 мкг/кг через 3 часа и однократно на 1, 2 и 3 сутки, также улучшил микроциркуляцию ишемизированной конечности на 28 сутки в 2 раза по сравнению с контролем. Комбинированное использование плазмы, обогащенной тромбоцитами, и «Миелопида» оказалось неэффективным и уровень микроциркуляции снижался в 1,3 раза.

2. Площадь некроза мышц в ишемизированной конечности в группе животных после введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, и в группе - после введения «Миелопида» не имела статистически достоверных различий и на 10 сутки уменьшилась в среднем на 13,5%, на 21 сутки - на 3,5% по сравнению с контрольной серией крыс и полностью редуцировалась к 28 суткам, а при комбинированном введении оставалась в среднем такой же как в контрольной группе.

3. В пилотном исследовании у больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей введение аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий улучшило показатели макро- и микрогемодинамики: объемный кровоток (по данным РИ) в исследуемой конечности увеличился в 1,4 раза; магистральный кровоток (по данным J И ЛИ) - в 1,3 раза; уровень микроциркуляции (по данным ФИ) - в 1,2 раза.

4. Оценка клинического статуса пациентов по шкале Rutherford et. al. и «качества жизни» с помощью опросника MOS SF-36 обнаружила, что через 6 месяцев после применения разработанного способа лечения у 100% больных отмечалось улучшение клинического статуса: у 16, 7% до уровня минимального улучшения, а у 83,3% до уровня умеренного улучшения, физический компонент здоровья повысился на 18,1%, психологический компонент здоровья - на 19,9% по сравнению с периодом до лечения.

5. Разработанный способ аутоплазмоинфильтрации нижней конечности, основным отличием которого является введение аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, под ультразвуковым контролем по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий патогенетически обоснован, легко выполним, не требует создания дополнительных конструкций и не имеет специфических осложнений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Доказанная в эксперименте эффективность иммуномодулятора «Миелопид» в дозе 50 мкг/кг при лечении ишемии конечности позволяет рекомендовать его для дальнейших клинических исследований в комплексной терапии больных ХОЗАНК.

2. Для терапии субкритической ишемии нижних конечностей у больных ХОЗАНК следует включить в комплексное лечение с целью стимуляции неова-скулогенеза аутоплазмоинфильтрацию пораженной нижней конечности.

3. Для лечения пациентов с ХОЗАНК необходимо применять следующую технологию аутоплазмоинфильтрации. Из локтевой вены забрать 500,0 крови в специальные контейнеры «Гемокон». Полученную кровь отцентрифугировать при скорости 2,5 тысячи оборотов в минуту в течение 15 минут. Приготовленную аутоплазму, обогащенную тромбоцитами, набрать в одноразовые шприцы по 50 мл. В асептических условиях под ультразвуковым контролем ввести по 100 мл аутоплазмы из двух точек пораженной конечности: в паховой и подколенной областях, соответственно расположению глубокой бедренной и подколенной артерий, по ходу которых и создать аутоплазмоинфильтраты.