Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Дотимусный этап развития Т-лимфоцитов: свойства, созревание и функции предшественников Т-клеток

¿СЯ4

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

МИРОШНИЧЕНКО Ирина Вадямовна

УДК 612.112.94.017.1 - 063

дотаюгсныЯ ЭТАП РАЗВИТИЯ Т-МЮДОТОВ:СВОЙСТВА, СОЗРЕВАНИЕ И ФУНКЦИИ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ Т-КЛЕТОК

14.00.36 - аллергология н им/унологпл

АВТОРЕФЕРАТ дзосертацпя на с искание ученой степени доктора биологических наук

Москва , 1989

Работа выполнена в Институте) иммунологии Маниотерства здравоохранения СССР

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,профессор А.А.Михайлова доктор биологических наук В. Г.Галактионов

доктор г'вдйциноких наук .профессор Б. Б Луке

Ведущая организация: Институт эпидемиологии и микробиология им,почетного академика Н,Ф.Гамалеи

Защитч диссертации состоится " " ............19 г.

в ...... часов на заседании'специализированного совета

Д 074.09.01. при Институте иммунологии Министерства здравоохранения СССР

115478, Москва,Каширское шоссе,24,корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Министерства здравоохранения СССР

Автореферат разослан " " ...............19 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, Л

доктор биологических наук А.В.Колобов

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проблемы.Наг.монее изученными в иммунологии остаются ранние этапы Т-лимфопоэза.Актуальность исследований в данном направлении обусловлена тем,что именно на стадии предшественников формируется потенциал всего разнообразия Т-лимфоцитов,осуществляющих регуляцию иммуногенеза. Ряд иммунодефицитов а лимХопролифера-тишнх заболеваний являются проявлением патологии созревания и пролиферации клеток Т-ряда,и успехи в профилактике и лечении этих заболеваний находятся в прямой зависимости от уровня теоретических знаний в рассматриваемой области иммунологии.

Выявление дисбаланса субпопуляций Т-клеток и нарушение их функциональных связей,обусловленные применением традициошпл. методов терапии онкологических больных,также ставят вопрос разработки подходов для коррекции Т-кммунодефяцитов и,с ъ\Л точки зрения, определение потенциальных возможностей предшественников Т-лимфо-цитов (ПТЛ) костного мозга в факторов ях активации может явиться продолжением исследований отечественных ученых в этой области ( Яраляп.ПЩ ) ,но на пплнципиалъно новой основе.

Изучение генеза Г-клеток-важно я с точки зрения их рег^,.прущего потенциала в гемопоэзе,впервые показанного в экспериментах коллектива сотрудников,возглавляемых Р.В.ивтрошм (1967 г) и развившееся в самостоятельное направление исследований.

Кроветюрзпзэ,являвшееся ваигеЯапм физиологическим процессе , чувствительно к воздействию разнообразных повре^даш^я агентов. Его нарушение леалт в основа многочисленных наследственных 1 приобретенных заболеваний.Изучение регуляции кроветворения,в частзо-стз.рэзпдентнкка ПГЛ китат дать ключ к расс ¡гровке еце одного иг-хапззгл рзтуляцзз гсглопсэза, осуществляемого в нормальных £изиоло-гзчзекпх условиях.

Свойстш ПТЛ костного мозга,последовательность стадий их развития, факторы,регулирующие эти события,остаются малоизученными, как и вопрос о роли оамих ПТЛ как элементах микроокрукеная костного мозга.Накопление в латературэ сведения о некоторых реакциях костномозговых ПТЛ в системе in vitro на воздействия препаратов rOpMl IOB ТИМуСаСвасЬ et Bl.,t971 ,t;'fi3tScl^f<» et «1,1973 ,

рОСТОЕЫХ И ДИ|ЙерьНЦИрОВОЧНЫХ факторов (обзор PaJacloe *t al.,108Bj Мов»а1ау1 Bt al. , 1i9»5) Ahnwd »t fll.,H9B6 ,h TOWSe ОПОСреДОВаИ-

ные доказательства участия ПТЛ в гемопоэзе (^Поверенный с соавт., 1978; Teeta.s^iiofieid, 1978 ;Сешша с соавт.,1981;Сеыенец с соавт., 1986 3 свидетельствуют об огромном дЩеренцирсвочноы,про-литеративном и функциональном потенциале этих клеток костного мозга, что Дает основание пересмотреть существующие представления об их инертности .Работа по изучению клеточных факторов активированных зро^чх Т-клеток,влияющих на ди'1форенцировку а рост псшшотентной стволовой кроветворной клетки ( СКК ) и комшшрованных гемопоэти-Ч0СКИХ ПреДШаСТЕвННИКОВ CGoodm»n»shi"Pock>,9814M»tcair,19fl5l shark!»,IPS'» J создают реальную основу для исследования подобной активности среди продуктов ПТЛ а объяснения механизма надзора за развитием i ;мопоэтических клеток на ранках стадиях развития в костном мозгу.

Даль и задачи исследования. Целью работы явилось выявление дискретных стадий развития ПТЛ в костном isoaiy,регулирующих это* процесс факторов а реяв самих ПТЛ как элементов ыикроокрухеная костного мозга.

Для выполнения поставленной целя были сформулированы следующие задаче:

1. Разработать методы выделения в анализа ПХЯ.

2. Охарактеризовать типы выделенных ПТЛ костного мозга а сравнить их с ПТЛ тимуса.

3.Смоделировать in vitro стадии развития костномозгоих ПТЛ.исследовав в дана/яке смену маркеров,выход из состояния покоя, приобретение или усиление функций в гемопоазе и способности мигрировать в тимус.

4.Провести анализ различных по структуре гор>-оног тимуса и их активных фрагментов в активации той или иной функции ПТЛ.

5.Исследовать механизм мембранных и внутриклеточных событий, ведущих к активации ПТЛ.

в.Изучить свойства факторов,секретируеммг ПТЛ,и их регулирующую роль в гемопоазе и регенеративных про^е«<и,протек?'хцих в костном мозгу я тимусе.

7.Раз работать тест для выявления 11ТЛ в периферической крови человека на основе экспериментальных исследований.

Научная новизна. Полученные данные позволили гФормулировать представление о неизвестном ранее-этапе активация ПТЛ,который про» текает в костном мозгу под дистантным контролем гормонов тг-луса. Этот зависимый от концентрации и времени контакта с пептидами тимуса процесо включает изменения в экспрессия мсмбришых антигеноз, повышение активности ок^о-б'нуклэстидаэи,уровня циклического аде-нозипксно^ос^ата (цАМЗ ) .выход из состояния покоя,продукции ({актеров,регулиругщях рост предшественников мичлопозза.и переход на аутскрянннй тип роста.

Способность активированных ПТЛ эффективнее прениями в тимус и приобретение этой способности после индуцирующих воздействий in vitro позволяет рассматривать этот тип клеток как активный резерз на ранних сроках регенерации после различных поврежвающих воздействия.

Совокупность представленных в работе экспериментальных данных мотпо рассматривать как основу для формаровання нового научного, направления, преду скатра вашего исследование развитая ПТЛ в костиоа

мозгу как активный процесс взаимодействия этих клеток о другими клетками микроокруяения костного мозга,регулируемый гуморальными факторами тимуса а осуществляемый медиаторным путем,что открывает перспективу напра ленной регуляции лимфо- 2 гемопоэза на стадаи ь^едшесз.иенников, определяющих весь спектр кроветворения.

Научно-практическое значение.Впервые рыделены и охарактеризованы два типа 1ГГЛ костного мозга,первый из них sc-n* тьу-)~ (щЦ ) ближе к 1Ш1 генетически бестимусных мышей,второй, sc-i+ Thy-tf (ПТд2) является активированной фермой первого я напоминает по свойствам внутритимусные ПТЛ.Смоделирована in vitro горыонзавиевмая стадия перехода 1ГГЛ1 в их активированную форму ПТЛ2 с помощью пептидных гормоноъ тимуса разной структуры.

Е-ервые показано,что функция костномозговых ПТЯ в регуляции миелопоэза осуществляется каделяеыыми ими продуктами с супрессор-ной ( 45 кД) и хелперной ( 30 кД ) активностью.

Дана характеристика хелперного фактора,являющегося такие ауто-крашшм фактором роста с а;.! их секретирующих ПГЛ2,в показано его отлично от аятерлейкшюв ( ИЛ) -2, -3 и -4.

Впервые показана роль хелперного фактора в процессах регенерации костного мозга и тимуса.

Дифференцирована роль пептидов ткмуса а некоторых лекарствеа-шх препаратов ( гамоптин,тесфшпщ,шдометаци11) в индукции и блокада отдельных признаков активации костномозговых IfTJI.

На основании вксперлменталышх исследований предложен метод скрининга препаратов,усиливающих рокалопазаци» опустошенного тимуса за счет притока костномозговых СИ.

Избирательный мятогениий в$$окт препаратов гормонов тимуса, оодержаиЕХ «¿1-теыозвн ели тЕыуяии ( сывороточный таыусцый fait тор i4ch"a) ,ua ранние неактвварованше ПТЛ1 послужил основанием для

разработки теста определения повышенного фона незрелых "0"-кле.эк в периферической крови человека.Мэтод апробирован в юп.лике Института иммунологии ( отделение хронических патологических процессов, обусловленных нарушениями иммунитета ) и показал свою состоятельность при выявлении клеточной патологии на уроЕНР ИТ у больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких.

Специфичность действия продуцируемых ПТЛ (¡акторов и пептидов тимуса определенной структуры позволяет использовать их .tai' инструмент для анализа потенциальной активности предшественников Т-лнм-фопоэза а гемопоэза при различных нарушениях их функщ»опальной активности.

Основные положения.выносимые на защиту.В костном мозгу пооис-ходит тимусзам сикай процесс активации ПТЛ.'фактором активации являются горлоны тимуса. Активированное ПИ способны ч более быстрой миграции в тимус.

Самостоятельной функцией этих клеток в костном мозгу ячяется регуляция гемопоэза.Регулирующая функция опосредуете.; их продуктами с супрессорной и хелперной активностями.

Хелперннй фактор имеет молекулярную-массу около 30 кД и отличается от известных ИЛ-2,-3 а -4 по ростовым характеристикам.

Хелперннй «фактор участвует в процесссг восстановлю л я костного тозга и тимуса после поврездающих воздействий.

Апробатая диссертация. Доклад по результатам диссертации был обсуяден па заседании секции .'<2 Ученого совета Института иммунологии Министерства здравоохранения СССР,состоявшемся 15 июня 1980 г. • Основные результаты,отражающие содержание работы,бнлз доложены на конференции'Совремешше методы иммунотерапии" (Ташкент, 1984); 1-ой Белорусской иммунологической конференции "Вопросы иммунологии" ( Витебск,1982) ;меддународнся симпозиуме "Стромальная и Т-клеточ-

ная регуляция кроветворных стволовых клеток" (Москва,1984) ¡республиканской конференция "Механизмы иимуностимуляции" (Киев, 1985) 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде "Биохимия иммунного ответа" (Киев,1985 )¡конГэренций "Физиология,морфология и патология тимуса" (Москва, 1935 ) конференции "Макромолекулы и функционировалиа клетчк" ( Ереван,1986 ); семинаре по иммунологи АН СССР (Москва, 1987 ); симпозиуме о мевдународным участием "Структура,биосинтез,функции молекулярных элементов шаунной систски" (Путано, 1987) ; Всесоюзной конференции с международным участием "Возрастные изменения в иммунном балансе" (Ташкент, 1937 ) ¡Всесоюзной конференции с международным участием "Стволовая кроветворная клетка в норме и патологии" (..овссибирск,1988) ;Ре спу блик ел ской конференции "Изу-ение и применение лектинов" (Таллинн,1988 ); Всесоюзном симпозиума с участием иностранных специалистов "Структура к.ыуноре-гуляторпкх пелтидов"( Москва,1988); 1-ом Всесоюзном радиобиологической съезде ( Москва,1983 )¡рабочем совещании "Эффекторние в регуляторнае функции иммунной системы" (Суздаль,1989 );11 Мвзду-народной конференций "йитерлек П"( Таллинн,1969 г) ,

Публикации.Основные результаты и солсдоаанай, рассмотренных- в диссертации,изложена в 30 публикациях: 14 журнальных статья?,6 статьях в научных сборниках и 10 тезисах докладов.

Структура и объем диссертанта. Диссертационная работа состоит из введения,обзора литература(I" глава.. ),описания материалов и катодов исследованая, собственных исследований( 5 глав) ,обсуждения результатов,выводов в списка литературы. Диссертация азлаае-иа на страниц ..включающих . таблиц г рисунков;библио-графлчесКЕЙ указатель включает иататих ,вэ квх отечественных работ .иностранных публикаций .

МАТЕИШЫ К МЕТОДЫ ИССЛЩОВлВЫ Кивотам. В работа использованы мыши линий cba,akr,balb/c,c3H, (сва * C57bl/6)f,| из питомников "Центральный" АН ССОР и "Столбовая" АМН СССР,бестимуснна мыши nu/nu на основе линии bald/o (Всесоюзный онкологический цатчпый центр .Е.С.Ре азоьа ),бестимус-1шв мыши первого поколения,отобранные на основе мутаций в лаборатории экспериментальных аявотных Института иммунологии Минздрава СССР, кролики породы Шиншилла.

Доноры п больниа. В иммунологических реакциях in vitro обследована периферическая кровь 9 доноров и 25 больных сроничес-ими неспецифическимз заболеваниями легких( ХНЗЛ ),из них 9 человек с обострениями и 16 человек в стадии ремиссии.Работа шггалнялг-ь в комплексе о сотрудниками клиники Института иммунологии и ВНИИ технология кровезаменителей я гормональных препараго:

Препараты.Тимотродзн (пропарат разработан во ВНИИ, технологии кровезаменителей и гормональных препаратов,фармакологически название тимоптпн )5синтетаческие аналоги гормонов тимуса и их фрагменты ( получены из Всесоюзного кардиоцентра AIM СССР,г. 1осква;Государ-ственного университета,г.Ленинград;лаборатории пептидов Инс: ¡тута иммунологии Минздрава СССР );набор «сеченных взотиацианатом флуорес-цевпа (ФИТЦ) лектинов (Отделение Институт.^ биохимии влиА.В.Палла-двна АН УССР,г.Львов ).

Фракционирование клеток. Фракционирование клеток костного га а тимуса проводили дхя пояучзпля суспензий,обогааошшх ПТЛ.При фракционировании в градиента плотности челсЕзчаского оыеор^точзого альбумина использовала разведония со следугчей удельной активностью: 1,095 - 1,0892 - 1,0824 - 1,0788 - 1.СГ67 - I.0G97 - 3. Фракционирование по скорости седиментации осупестзляаз з паю тя-яеета I е па установке типа • "Станут" .модифщаревспно? Г.В.Луцзн-яо( 1984) ,в лилейном градиенте пнотзгеста I—1-2% раствора бычьего

сывороточного альбумина. Фракционирование на основе поверхностных маркеров проводили методами отрицательной и положительной иммунО-селекции-С. м«вв »t «1.197'г].используя иммунную сыворотку против иммуноглобулинов 1ыши, моноклональные антитела против тьу-,1- ан-

¡гена l иммунную сыворотку против sc-i, -антигена.Для получения последней кроликов иммунизировали гомогенатом головного мозга мышей по схеме с»'" ( 1ЭТ1) и истощали клетками печени и тиыоцитама.

Выделение мононуклеарных клеток из периферической крова человека осуществляли на градиенте плотности фиколл-верогр&уш (1,077).

Определение ПТЛ.Принадлежность клеток к ПТЛ оценивали по их способности проникать в тимус,что оценивала по числу меченных ФИТЦ клеток костного мозга,попавших в тимус через 3 часа после внутгчвенного введения . реципиенту {Lepault,Velaeman, I !>8t

И ПО реколонизации тимуса на 14 сутки C.BiiBch,KacUehsi;)77

Определение клеток костного мозга,образующих колонии в селезенке ( КО Ее ). Использовали тест, предложенный тш,McCuiioch ( 1961 ).Тестируемыо фракции клеток костного мозга переносили летально облученным мышам в количестве 0,1 млн и на 7,9,11-13 сутки в селезенках забитых мышей подсчитывали визуально после фиксации в растворе Карнуа число колоний.

Ог^еделекие поверхностных маркеров,При наличии цитотоксическах иммунных сывороток и моноклональных антител ( мАТ) поверхностные маркеры определяли в цитотоксическог^ комплементзависимом теста CGorer.o'oormari, 1956 3 в мякрообъемах.в других случаях реакцию антиген-антитело учитывали на микроскопе Люмам или приборах Epic а с или cytofluorograph 50-Н,помечая реагяруювде компоненты меченной ФИТЦ сывороткой против иммуноглобулинов соответ-ветствующего вида животных.

Определение активности экто-5'нуклеотидазц ( 5Н ^Активность БН определяли,используя АМФ,меченный ^Р фирмы "Изотоп" по методу

Dornend et «1.(1982).

Определение уровня цАМФ. Использовали радиотест и стандартный набор ^ирмы Amerahjm .Определение цАШ проводили в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией.

Определение уровня J. I-тимозина. Уровень <*1-тимс ина в сыворотке человека определяли в конкурентном радиоиммунотесте TlMcCJure et 1982 J на базе ВНИИ технологии кровезаменителей и гормональных препаратов.Тест разработан Аршиновнм В.Ю.

Определение синтеза ДНК.ГИК и белка. Синт э ДНК определяли по включению культивируемыми клетками °Н-тимидина,вносимгп> в разных вариантах опытов в последние 4-18 часов культивирования из расчета 2,5 мкКи/млн клеток.Спонтанный синтез ДНК у свежевыделенн"х клеток определяли при I -Зх-часовой инкубации с °Н-тимидином.При определении синтеза белка и РНК в качестве метки испол'-зовали %-лей-цян и ^Н-уридиа.Специфичность выявляемых в клетках изменений синтеза макромолекул определяли с помощью соответствующих спе: г] и чес— ких ингибиторов:митомицина С для синтеза ДНК,пуромици..а для синтеза белка , актиномвцина для синтеза РНК ,индометагмна или аспирина для синтеза простагланд«на ( ПГЕ^).

Получение и фракционирование надосадка ПТЛ. Для получения над-осадков,содержащих активные клеточные факторы,инкубащ.^ осуществляли в бесснвороточной среде,надосадок собирали через 1-24 часа. Фракционирование проводили методом гельфильтрации См* r.ouio . 1984 J на колонках с ультрагелем АсА 54(ibf) .Колонка ООО х 16 мм была калибрована маркерами молекулярной массы - бычий сывороточный •альбумин ( 68 кД >,овальбумин ( 45 кД> .химотрнпсин ( 22 кД) ,цито-хрои ( 12 кД) .Фракционирование было выполнено В.Ю.Галаевым.

Статистическая обработка данных. Результаты опытов представлены в виде среднеарифметических значений с их ошибкой.Уровень достовер-носта различий показателей определяли по критерию t Стьюдента.Но-

которые результаты выражены в виде индекса стимуляции( К.С. ).В этом случае сравнивались только статистически различающиеся величины.

ршулъита иссэдовлний и ш овсухдшие.

Получение суспензий клеток костного мозга и тимуса,обогащенных ПТЛ.Характристика 1ГГД. Сравнение разных методов фракционирования,используемых для получения ПТЛ,показало,что наиболее про-от-чм и специфичным является разработанный нами метод отрицательной и положительной иммуноадсорбции.дополненный масс-цитолизои, с использо; анием сывороток против иммуноглобулинов ьши.ьс-j -антигена и мАТ к тьу-) -антигену.Метод позволил получить 3 фрак-ции.Двв из них включали sc-i+- клетей з отличались наличием или отсутствием Tt>y-i* клеток.3-я фракция не содержала клеток с указанными маркерами ( Ркс.П .

Специфичность антигенов ьо-i ц тьу-i для ПТЛ подтверздена способностью клеток,несущих эти маркеры,мигрировать в тимус. Стволовые кроветворные клетки ( СКК) .напротив,содержались во фракции,из которой были удалены sc-i* и т'1у-|+-клетки,и приобретали способность формировать колонии в селезенке при добавлении к ним ПТЛ обиих типов из костного мозга в sc-i+- тамоцитов(Рис.2)

При сравнении двух типов клеток,мигрирующих в тимус, sc-i* Thy-j-{ обозначенные как ПТЛ1) и sc-t tThJr-i + ( ПТЛ2) показано, что,помимо более выраженной хелперной функции в гемОпоаае,ПТЛ2 имеют меньшую плотность ( 1,0628) .большую скорость оседания,высокий уровень включения ^-тимидина, активность 5Н я повышенный урпень цАМФ.Все эти признаки свидетельствуют об активации ПТЛ2. ПТЛ2 близки по своим характеристикам внутритимусным sc-i+-IIM, а ШУИ - ближе к ИГЛ, выделенным аналогичным образом из клеток ' костного мозга мышей nude ^

антн-Тьу-1

/

Тв"5С-»*П1у-1"

(ПТЛ1)

вНТИ-БС-!

Г в ВС -I

I

комплемент + ►анти-у + ънти-тьу->

1е эс-! тку-«

(ПТЛ2)

эс-г тн/-1 (содержатся СКК)

Рис.1. Схема фракционирования клеток костного мозга

Отаека после обработок клеток костного мозга (К ) сыворотками:

миграции (столбики.) и реко- миграгаи (столбики) и колониеоб-лонизации тимуса (пунктир) разования в селезенке (пунктир)

100 50

антв-

—"Ч ■

ТЪу-1

к \ анти-

у БС-|1

ь

Т" ч ант."

К ] ТИу—1

анти-

Ч

«ч1

Фраяцяя клеток костного мозга,способные:

мигрировать в тимус

1000 500

ГГГЛ2

ПТЛ1 СКК

100 50

восстанавлиг ть ксдоняеооразоЕание СКК +

I -А--«.

* лГЛ2 ПГЛ1

;с-л

Рис.2. Специфичность маркеров тъ>-г в г.с-и для ПТЛ

По оси ординат:выражение реакции в проце"тах от контроля, нефракцвонированных клеток костного мозга

Моделироиание этапов развития ПТЛ в костном мозгу.Полученные нами данные о гетерогенности ПТЛ .костного мозга но плотности и скорости оседания,положению в клеточном цикле,фенотипу в функции в гемопоэзе даю-" основание для утверждения,что определенный про-цесо l .тивации ПТЛ происходит в костном мозгу и предворяет миграцию этих клеток в тимус. Отсутствие активированных ПТЛ2 у мышей

mid« и еозмс лость индукции in vitro после инкубации с препаратами гормонов тимуса или агентами,повышающими уровень цАШ>, на части клеток их костного мозга антигенов зрелых Т-клеток Miuch et Bl. , 1971. i.cheid et »1,1 o7j),свидетельствует о зависимости процесса активации ПТЛ от гормонов тимуса. В связи с этим следующ: ; эксперименты были направлены на моделирование

ir vitro с помощью различных по структуре гормонов тимуса или их синтетических аналогов этапов развития ПТЛ в костном мозгу. При моделировании перед нами стояла задача воспроизвести в конечном итоге необратимый переход из состояния 1ГГЛ1 в состояние,аналогичное ПТЛ2.Реи,-ниа этой задачи включало доказательства специфичности действия гормона на ПТЛ1,подбор оптимальных концентраций и определение временных параметров для индукции необратимых изменений в свойствах индуцированных in vitro активированных ПТЛ.

На перном этапа работы был использован тимотропин( Тт) .активным действующим началом которого был «¿1-тимозин.

То обстоятельство,что предварительная обработка клеток костного мозга в течение I часа in vitro Тт увеличивала число поступивших в тимус реципиента меченных ФИТЦ клеток костного мозга дойора,свидетельствует о том,что клеткой-мишенью для Тт являются ПТЛ.При внутрибршинном введении сублетально облученным мышам Тт не шшял на первый пик регенерации тимуса,то есть на внутрити-мусныо ПТЛ,но увеличивал число клеток на 20 сутки по сравнению

с контролем,гае значительной регенерации не наблюдалось.Эффекг Тт проявлялся при введении на следующие сутки после облуч^.шя и отсутствовал,если Тт вводили мышам в другие сроки после облучения ( Рис.3) .

Инкубация с Тт вызывала экспрессию Thy-i- ак-иге"! на ПТЛ1. Предварительное удаление sc-iклеток отменяло индуцирующий эффект Тт.Лизпс индуцированных тьу-i*- клеток приводил к одновременной элиминация в sc-i+- клеток.Таким образ ом .мишенью д.я "г в этой модели были sc-i+ _ клетки и аменно на • чх появлялся тьу-i-антягея. Тт оказывал патогенный эффект на ПТЛ1.котору* регистрмро-вался по усилению включения ^Н-тпмидпна через 12 - 20 часов культивирования ( Ряс.4) .Тт из индуцировал такой реакции ни у ДТЛ2, на у тимоцятов.неоуидос рецептор к агглютинину арахиса!гna - рецептор) или у периферических Т-клятсх.

Тт усиливал хелпзряуп Функцию ПТЛ1 в тесте экзогетого селезеночного колониеобразования и клеткой-мишенью его действия 'ылв ПТЛ1 ( Таблица I ).

Эффекта Тт была дозозависимъми в определенном чнгервале концентраций и реализовал!, jb при разных концентрациях Тт.котор'ч,однако,укладывалвсь в интервала от О,COI до 1,0 тг/т. Для вндухщ.^ необратимых изменений требовалось определенное время i..датахта ПТЛ1 с Тт { Таблица 2 ).

Мы попытались дийеренцпровать отдельннэ тямусзаЕ..оимие проявления активации ПТЛ1 о помощью синтетических пептидов,воспроизводящих структуру разных естественных гормонов твмуса или ах активных участков.Все пептиды вызывали ту или иную модуляцию мембранных антигенов.Изменения поверхностных маркеров,наиболео коррелируг-ия с переходом ПГЛ1 в ах активированную форму с последующей полной утратой sc-i - антигена,вызывали ' «<1-тамоэин и тимулкн.Эти же пептиды вызывала значительное повняензе уровня цАМ5 по сравиеяяю е

Рис.3. ВЛИЯНИЕ ТИУ.ОТРОШНА НА МИГРАЦИЮ ПТЛ В ТИМУС И РЕКОДОНИЗАЦИЮ ТЖУСА. Обозначения:миграция и рсколокизация в отсутствие Тт (I) и с Тт(2)

го

10

0 0,001-0,01 0,1

8

12

16

20

Рис.4. Влияние тимотроплна (Тт) на мембранные маркеры (а) и усиление синтеза ДНК (б) у ПТЛ1.

а - экспрессия Thy-»- антигена (I) , экспрессия se-i,- антиге-на( 2) .экспрессия тьу-i.- антигена у ПТЛ1,предварительно обработанных анти-sc-t- сывороткой и комплементом(з)• По о^и ординат-число положительных клеток,по оси абсцисс-концентраци). Тт,мкг/мд б - инкубация ГГТЛ1 с Тт (I ), то по,но ИТЛ1 были предварительно обработаны комплементом и анти- sc-t - сывороткой (2 )Ло оси ординат - включение %-тимидина,имп/мин х 1000,но оси абсцисс-время инкубирования с Тт.часы.

Влияние тимотролина (Тт) иа колоняеобразо-валие в селезенке и определение клетки-шпеки,

Таблшт.ч I.

Число колоний на селезенку при переносе реципиенту фракций.

СКК

без Тт

с Тт

ПОТ

без Тт

с Тт

: с?'~*си СКК и ГГЛ при — разных вариантах : обработка их Тт

0,1 £ ОД :

: 0,1 ¿0,1

2,0 ± 0,1 2,0 ± ОД

ОД i ОД :

2,1 £ 0,6

10,6 £ 1,3 11,2 £ 1.2

24,5

_L8.

хстатистически значимое увеличение числа колоний в селезенке.

Оптимальные условия активации ПТЛ1.

Таблица 8

Признак активации

Оптимальные условия проявления признака

время контакта 6 Тт.часы

I.Элиминация эс-!- антигена 6-8

(необратимая)

2.Эк лрессия тьу-1-ш1Тигона . 6-8 ■ (необратимая)

3.Митогенный гвет 18-20

4.Инвазия в тимус б.Реколонизация тимуса

б.Халперная функция в миелопоззе 6

концентрация Тт.мкг/мл

0,1-1,0 0,001-0,1

.0,01-0,1 0,01-1,0 х 0,01-1,0 0,01-0,1

хэ$фект зависит от дозы переносимых реципиенту клеток костного моэгг

Роль пептидов тимуса в активации ПТИ.

Таблица 3

Признак активаций

Наличие ективноста у гормонов тимуса: .тЕмопентина : тимулина : а1-тимозиио

I.Элиминация яс-1 - антигена

2. Экспрессия тьу-1-антигена

3.Активация цАМФ £

4.Ывтогенная реакция б.Хелперная функция в миелопоэзе -

6.Усиление экспрессии рецепторов к агглютинину арахиса ' +

сои +

7.Ренолонязацпя тимуса +

+

+ + + + + +

+ + + + + +

+

другими пептидами,оказывали митогенный эффект а усиливали экзогенное селезеночное колониеооразование.Тимопентин в большей степени ассоциировался с усилением миграции в тимус (Таблица 3 ).

Молекула ^I-тнмозина обладала полипотентным действием,а отдельные ее участки ассоциировались с индукцией или ингибицией того или иного признака ПТЛ ( Рио.5).

Селективный митогенный эффект «¿I-тимозина и тимулина,а,в равной степени,и препаратов,содержащих их или повышающих уровень цАМФ в ГГШ.Сыл использован для выявления аналогичных незрелых ПТЛ в периферической крови человека.Нефракционированные клетки периферической крови человека или 1е+- клетки и Т-лимфоциты,образующие розетки о эритроцитами барана или носущие cd-2 -антиген,не пролдферировали 'в IB-часовой культуре в присутствии Тт.Клеткой-ившенью митогенного действия Тт была ф.ракция не-Т-,не-В-клеток, обогащенная до 12 - 1В% "0"-клетками.На этой же фракции клеток после инкубации в течение I часа in vitro о Тт или теофиллином удалось индуцировать экспрессию со-г- антигена или Е-рецептора у 12 - 1В% клеток. В группе больных ХНЗЛ 64$ обследованных далз in vitro митогенную реакцию на Тт при постановке теста о не-фракционированшад мононуклеарными клетка;«] крова,что свидетельствует о повышенном содержании у них против кормы незрелых ПТЛ. Этот показатель более коррелировал о выявленной патологией,чем определение уровня Л1-тимозйн& в cunt ;отко.

Механизм передача а реализации активирующего сигнала гормонов тимуса. Молекула .¿I-тимсэшт оказалась для ПТЛГ фактором,который , активирует разнообразные клеточные процессы,в результате ооуцеств' -левая которых клетка приобретает новые свойства ала усиливает присущие ей функции,становясь подобием 1Ш12. По-видимому, этот пептод является единым сигналом активация разнообразии йразнаков.. -

, О I 5 10

и

Н,с - С- Л -сер-асп-ала-ала-вал-асп-тре-сер-сер-глу-лей-тре-тре-лиз-о I _________

Н I

15 20 25 28 0

и

-асп-лей-лиз-глу-лиз-лиз-глу-вал-вал—глу-глу-ала-глу-асп- С - ОН

1,6 1,2,3 ^

--о

I

1,2,3,4,5

Рис. 5 Схема распределения различных типов активности в молекуле <л1-тимозина.

0бозначения:1 - иццукция ТЬу-1-АГ; 2 - элиминация «УС-1- АГ; 3 - м1тогенез,4 - усиление хелперной функции в гемопоэзе; 5- усиление реколонизации тимуса сублетально об-луттенных килей костномозговым ПТЛ1; б - угнетение митогенеза.

-21В этом раздела ми попытаемся о помощью различных агентов целенаправленного действия на клетку и ннгибиторного анализа выяснить механизм передачи гормонального сигнала у ПТЛ1 и пути его реализация.

Для выявления пусковых механизмов действия Тт на ПТЛ1 моделировали его ¿фХект с помощью агентов,влияющих на ионную проницаемость мембранн.а таило факторов,изменяющих активность цАМФ,которые играют рмь аторичиых мессенджеров гормонального сигнала. В качестве соединений,действующих на мембранный транспорт,были использованн ваяиномицин ( ионофор 1С1* ) .нонактян ( избирательно повышает проницаемость мембран для ионов N8+ а в меньшей степени К+ ) .антибиоз

откк .123187,являющийся аонофором Са ,а такхв каналофсрмер грамицидин А,увеличивающий,в первую очередь, протонную проницаемость. Анализ роли цАМФ в передача гормонального сигнала у ПТЛ1 проводили с помощью тео1:1ллп:а,повышающего уровень цАМЗ в клетках через инги-блрование фос.£одиэстерагы цАМФ.я индометацина пли аспирина,блокирующих синтез ЛП^, Последний является продуктом активации циклоок--снгеназного пути метаболизма арахвдоновой кислоты,и действие его па клетку может реализоваться чорез повышение уровня цАМФ.

Усиление транспорта ионов,само по себе недостаточное для полноценной активации ПТЛ1,модулирует мембрану,вследствие чего,очевидно, происходит перераспределение поверхностных антигенов на клетка а изменение их плотности.Поскольку зтот I 10цесс на мембрана мо.т.ет происходить без активации других свойств ПТМ.он является,по-види-моку.инициатзгннм к в системо вое» последуюетх событий активация необходим™,но недостаточным.То,что после обработка ПТЛ1 переносчиками иснов утрачивается способность отвечать на б^яетельстлу-ат о строго специфической организации мембраны,способной воспринять гормойалышй сигнал.Подобную картину иа набяюдата при контакте ПТЛ1 с высоко" концентрацией Тт ( I мкг/мл ), вызывающей в течение очень

короткого промежутка времени перераспределение эс-1- и тьу-1-антигенов.и клетка в таком состоянии не реагировала на Тт.Грамицидин А,как мы полагаем,воспроизводит состояние мембраны,при котором сигнал способен поступить в клетку и реализоваться в виде митоген-ной реакции. Изменения,вызванные этим агентом,можно объяснить изменением мембранного потенциала,изменением рН внутриклеточной среда или побочными его эффектами. Не исключено в прямое тимозинподобное действие грамицидина л,являющегося линейным пептидсм.

Тео^иллин воспроизводил все эффекты Тт.Индометацин при постоянном присутствии в среде культивирования клеток или аспирин блокировали активацию Тт.В этих системах мы подтвердили,что активация ПТЛ1 реализуется через повышение уровня цАЫФ,которое,однако,не должно быть длительным. Таким образом,есть основание полагать,что синтез ЮТ»2 и временное повышение уровня цАМФ являются теми общими механизмами,которые участвуют в запуске как антигенной перестройки мембраны ПТЛ1,так и их пролиферации и усилении хелперной функция в гемопоэзе.Последующие события,составляющие процессы реализации этих реакций,могут быть различными,что и обусловливает относительную независимость их осуществления.Смена поверхностных маркеров бс-и и тьу-1 ассоциировалась с изменениями в синтезе РНК,, белка и ПГЕз,переход в в -фазу - РНК,белка,ДНК и хелперной функции в гемопоэзе - белка,РНК и ПГЬр. Передача штогснного сигнала связана с целостностью как ее-)- антигена,так я рецепторов к р"а в агглютинину сои; миграция в тимуо - с лекгиновыми рецепторами, блокада которых отменяла* миграцию в тимус,

Харяктряствка лкщ оккнов.секретирусшх ПТЛ. Поскольку эф^ектор-ные функции зрелых Т-клеток опосредуются через выделяемые ими лим-§©хины,мы предположили,что такой хе механизм медиаторного взаимодействия может существовать между ПТЛ в СКК.

Супернатанты получали при культввированвв ПТЛ костного мозга

и тимуса в бессывороточной среде.Уже через 6 часов клетки выделяли активность,полностью замещающую эффект самих клеток в тесте экзогенного колониеосЗразования.

В следующей серии экспериментов мы сравнивали действие получеа-ных надосадков от (ПЛ разной степени зрелости на экзогенное и эндогенное колониеобразование у мышэй-реципиентоз.Колонии эндогенного происхояденпя отсутствовали ( при дозе 8,5 - 9,0 Гр )у контрольных аивотных и появлялись на 9 - II сутки после введения им надосадков ПТЛ,

При определенна активности надосадков от ПТЛ мышей, nude , костномозговых 1ГВД а ПТЛ2 эутимусных мышей а тимусных ПТЛ усиление хелперной активности в тестах колониеобразования коррелировало со степенью созревания секретирующих их ПТЛ,однако у костномозговых ITOI2 и внутритимусных 1ТГЛ появлялась активность, блокирующая хелперный аффект.Она выявлялась в более концентрированных надосад-ках.Предварительная обработка 1ГГЛ1 эутимусных мышей в течение I часа Тт усиливала секрецию хелперного фактора. Надосадок ПТЛ от мышей nud» в таких ае условиях получения не был эффективен. Таким образом,хотя фенотипическя ЛТЛ1 была похожи на ПТЛ от бвс-тимусных мышей.функционально они были более зрелыми. Такую ае закономерность мы выявили при культивирования in vitro той же фракция клеток костного мозга,которая содержала СКК я нувдалась в помощи ПТЛ при формировании колоний в селезенке в тесте in vivo. Síh полагаем поэтому,что эффект хелперного и оупрессорного факторов колониеобразования реализуется через регуляцию роста СКК (Рио.6 ).

Клетками,секретирующими оба фактора во фракции клеток,обогащенных ИГЛ, били sc-i + -клетка.

Ростовой эффект, как стимулирующий так и ингибируюадай, был проверен на Т-клетках разной степени зрелости.Клеткой-мишенью оказались sc-i+ -клетка во фракция клеток костного мозга,обогащен-

Рис.6. Действие надосадков ПТЛ разной степени зрелости на фракцию клеток костного мозга,содержащую СКК

а - тест экзогенногвг колониеобразоваяия;б - тест эндогенного колонвеобразованвя; в - тест включения "^Н-тиыидина т«го Надосадки от ИГЛ; от мышей„иа» ( I), ПТЛ1 эутимусных мышей/ 2 \ ПТЛ1 эутямусных мышей,стимулированные Тт ( 3),ПТЛ2 эутимусных мышей ( 4 ) ,ПТЛ тимуса ( 5 ).По оси ординат: а,б,-число колоний на селезенку; в - индекс стимуляции пролиферации;по оси абсцисс - концентрация надосадков,?.

ной ПТЛ2.И во фракции клеток тимуса,обогащенной ПТЛ. Таким образом, клетки,секретирутацив регулирующие рост СКК {акторы поддерживала рост sc.ii* -клеток из тех же фракций,в которых находятся секретирующие клетки,Мы предполагаем,что ИТЛ2 а ИГЛ тамуса способны к аутокрлнному росту,хотя окончательный ответ могут дать лишь исследования на клональном уровне.

Ростовой эффект иадосадка отличался от ИЯ-2 и ИЛ-3,поскольку исследуемый надосадок не поддерживал роста ИЛ-2- и ИЛ-З-эависимых линий клеток.По-видимому,в надосадке отсутствует и активность ИЛ-4, поскольку этот лкмфокин поддерживает рост ИЛ-2-зависамых линий клеток. мАТ к ИЛ-4 не отменяли стимулирующий эффект хелперного фактора в колонаеобразовании в тесте тш.мсСипосл (1961).

С другой стороны,ИЛ-3 усиливал рост ПТЛ2 и . гемопоэз у фракции клеток костного мозга,аз которой были удалены 1ГГЛ1 и ПТЛ2.Таким эффектом не обладал супернатант клеток линии .^н^ .испсль-

" зуемый как источник ИЛ-2,я рекомбинантный ИЛ-2 . Как по поверхностным маркерам,так а по активности надосадков, ГГГЛ2 костного мозга я ПТЛ тимуса были близки с линией трансформированных клеток тимуо-ного проасхоаденвя тс.вс->/г.о (Ьичкян, 1987,1963 ") { Рас.7 ) .

При фракционировании на ультрагеле АсА 54 удалось разделить хелперную а ингибирувщую активности.Хелперная активность,выявляемая в тестах экзогенного а эндогенного колсниеобразования в селезенка в по усилению проляферацаа ПТЛ2 ассоциировалась с фракциями 9 - 10 (молекулярная масса около 30 кД) .ингибирующая актавнооть - с фракция?«! 6 - 7 ( молекулярная масса 45 кД ) .Супрессорный фактор,в отличав от хелперного,бал чувствителен к прогреванию пря температуре 56 °С,понижению ( рН 2,0 ) или повышению ( 10,0 ) реакции среды.Хелперный фактор был отнесен к гликопротеинам,содержащий концевую п -маннозу.

Другой подход к разделению хелперной а супрессорной активноста

Источник фактора

н/о ГГГЛ2 из КЫ Н/0ИЕН1-ЗВ ( ИЯ-3) н/о тс.зс-1./а.о (ФРТ), рекомбинантный ИЛ-2 я/О Лигк^

клетка-мишень

тест-система

_ экзогенное

хв тьу-1. sc.ii колони «образование в селезенк«

н/о ГГГЛ2 яз КМ

н/о кюи-эв ( ил-э) н/0тс .5С-» /г .о (ФРТ)

рекомбинантннй ИЛ-2

эндогенное ко-лоняеобразовонне в селезенке

н/о ПТЛ2 из КМ

Н/О ИЕН1-ЭВ ( ИЛ-3)

рекомбинантннй Ш~2

ПТЛ2 КМ

1п У11го

включение Оцтами дина

И.С.: 1,0

4,0

7,0

Рис.7. СРАВНШЕ ЭФ5ЕКТ0В ОТ НАДОСАДКОВ ПГЛ2 С ДР7ШМИ ИЗВЕСТНЫМИ РОСТОВЫМИ ФАКТОРАМИ.

Сокращения: н/о-надосадок, КМ-костннй мозг.ИЛ-ннтерлейкин, ФРГ-фактор роста тимоцвтов

По оси абсцисс - индекс стимуляции дИ.С.) реакции,за I принята реакция клеток в отсутствие н/о.

И.О.

2,0 -

3

1,0 4

0,4

2,0

10,0

50,5

Рис.8. Дозозависимоа проявление стимулирующей и внгибирующей пролиферацию 1ГГЛ2 активностей надосадка 1ГГЛ ткмуса в зависимости от уровня экспрессии эс-и- антигена на клетках-продуцентах.

Обработка клеток-продуцентов: без обработки (1) .удаление яс-т* -клеток игл.г/нрадс орбци ей на чашках с анти- яс-1- сывороткой

(2) .обработка тимотропяиом (3) .удаление sc-.ii* - клеток коиплв-ментзавасишм лизисом (4) .

■ По оса ординат - индекс стимуляции (И.О.) пролиферации,за I принят уровень пролиферации ПТЛ2 в отсутствие надосядков.По оса абсцисс - концентрация надосаднов,^.

надосадкоэ бал получен оря фракционировании секретирувщих фактора внутритииуснах ИГЛ по экспрессии вс-и - антигена.Оказалось.что супрессорний фоктор выделяют клетка,на которых слабо экспрессироваи эс-г-антиген,то есть клетка,на которых при попадании в тшус снижается экспрессия этого антигена.Такие клетки можно псяучлть либо удалением клеток с высокой плотностью бс-г - антигена методом поло-катальной ишуноадсорбдиз.либо при обработке секретврузоздх ПТЛ Тт,

который также снижает экспрессиюsc-n .антигена на внутритимусных ПТЛ.Таким образом,изменение секреции хелперного фактора ка оупрес-сорный связано с гормонзависимой стадией созревания ПТД в тимусе. ( Рис.8 ) .

Роль Факторов ПТД в процессах регенерации костного мозга и тимуса. Поскольку надосадки ПТЛ2 и внутритимусннх sc-i+ - ГШ1 стимулировали появление эндогенных колоний и поддерживали рост радиорезистентных внутритвмусных sc-i* -ГОЛ,мы проверили влияние над-осадков на процессы регенерации клеток костного мозга и тимуса после повреждающего действия.Последнее моделировали облучением мышей в летальной дозе ( 0,5 - 9,0 ).Анализ показал,что хелпер-яый фактор усиливал пролиферацию сохранившихся клеток костного мозга и тимуса.Мишенью действия фактора in vitro были sc-i+ -ПГЛ твмуса и клетки миелоядного ряда костного мозга,формирующие в присутствии хелперного фактора колонии в селезенке.Облучение со-провоадалось гибелью чувствительных к нему ПТЛ1 и быотрой ( в течение 2 часов) эмиграцией ПТЛ2 из костного мозга в тимус.Незначительный процент СКК,по-видимому,сохранялся в костном мозгу,но в отсутствие ПГЛ они утрачивали способность формировать колонии в селезенке.Введение мышам экзогенного хелперного фактора устраняло частично этот дефицит.ПТЛ тимуса,наряду с хелперным,усиливали под влиянием облучения секрецию супрессорного фактора,который,возможна, блокировал в организме действие хелперного.Введением экзогенного хелперного фактора ПГЛ можно было коррегировать рост СХК и внутри-тимусных ПГЛ на ранних этапах регенеративных процессов, ххххх

Таким образом,анализ выбора маркеров ПГЛ и разработанные на их основе методы получения фракций костного мозга и тимуса,обогащенных клетками со свойствами ПТЛ,позволили выделить два типа этих клеток.Маркером обоих являетсяsc-« -антиген.На ¡тетках второго

удаа (ПТЛ2 )помимо sc-ti- антигена экспресоировался Thy-v- антиген. Активация ПТЛ1 в костном мозгу проэсходит под контролем гормонов тимуса.Оба типа выступали и рола хелперов клетох маелоидао-го ростка кроветворения,холониаобразувщая активность которых опрг-делялась в теста тт.нссинось ( IS6I ).

Хелперггай эффект ПТЛ мог быть замещен фактором с молекулярной массой около 30 кД.сехретаруемым in vitro спонтанно,продукция которого in situ ,по-видимому,находится под контролем гормонов тимуса,о чем свидетельствует усиление секреции хелперного фактора у ПТЛ1 пра обработка этих клеток in vitro Тт.В надосадке ПТЛ2 и внутрятпмусных sc-i + -ПТЛ определялся также супрессорный фактор ( 45 кД).Обе активности.помимо колониеобразованяя в селезенке,регулировала рост -1ТГЛ2,наиболее активно мигрирующих з тимуо.н Ену-тратгмусшга sc-i+ -ПГЛ,являясь,по-видимому,для пах аутокрвнныыи факторами роста противоположного действия.

Принципиально новым в нашей работе является установление факта, что во взрослом организме определенные этапы дзфференцвровки ПТЛ могут протекать гае тлмуса на территория костного мозга,но под контролем гормонов тамуса а что пра нормальном физиологическом разватши ПТЛ выделяют лимфскигш.рэтулпрующне процессы,связанные с ростом гамопоатичвских предшественников маелопогза.Змиграцйя ПТЛ2 аз костного мозга явдеются естественным сигналом к усилению роста СКК з отсутствие оупрессорного фечтора,выделяемого этими метками.Новый сагнал со стороны гормонов тимуса вызывает переход ПТЛ1 в ПТЛ2,усиление секреции оупрессорного фактора я ингабицви гомопоэза.Способность к аутокрпнкому росту позволяет ГГГЛ2 сохранить относительную автономность пра смене условий макроокрунигая прз. эмиграции аз костного мозга в тимус.

швода

1.Впервые идентифицировано два типа костномозговых ПТЛ -sc-i + vi»-i-("ITMI ) н sc-t+Thy-i+ ( ПТЛ2 ^Последние близки по свойствам внутритимусным sc-t+ ИГЛ и имеют все признаки активированных кле-ток:крупный размер,низкую плотность,высокий спонтанный уровень включения ®Н-тимидина,повышенный уровень цАМФ и активности экто-5'нукле-отидаэы.

2.Разработан метод получения фракций,обогащенных ПТЛ1 и 1ГГЛ2, в основе которого лежит метод положительной и отрицательной имыу-ноадсорбции в комбинации с ыасс-цитолизом.Ыетод менее трудоемок и более специфичен,чем существующие методы фракционирования клеток.

3.Переход ПГЛ1 в активированную ¿[орму ПТЛ2 смоделирован in vitro с помощью препарата тимотропина (аналог тимозина).Процесс активации включает экспрессию тьу-i-антигена.усиление экспрессии рецепторов к агглютининам арахиса и сои,постепенную утрату fc-i-антигена,переход в s-фазу клеточного цикла,усиление хелперной функции в гемопоэзе при сохранении способности мигрировать в тимус. Необратимость процесса активации определялась концентрацией тимотропина и временем контакта с ним ПТЛ1.

4.С помощью синтетических аналогов пептидных гормонов тимуса разной структуры проведен анализ специфичности проявлений признаков активации в зависимости от структуры воздействующего гормона.Наи-больивм спектром действия на ПТЛ1 обладал «<1-тимозин,полипотент-ность действия которого обеспечивалась особенностями структуры его молекулы.Действие тимопентина в пептидов тимуса негормональной природы в большей степени было направлено на усиление миграции ПТЛ

в тимус и увеличение экспрессии рецепторов к лектинам арахиса и соа,существенных для инвазии в тимус.

5.Передача гормонального сигнала в клетку опосредовалась через активацию системы цАМФ и сопровождалась изменениями в синтезе макро-

моленул.Ингибиторный анализ свидетельствует,что для мембранных перестроек и усиления хелперной функции в гемопоэзе существенным являются изменения в синтезе РНК,белка а ПГ^.для выхода клетки из состояния покоя - РНК,белка,HTIlj z ДНК.

6.ПТЛ2 костного мозга и внутратимусные sc~i+- ПТЛ спонтанно се-кретируют фактор,который замещает их хелперный эффект в колониеоб-разовании я,по-видимому, является аутокринным фактором роста.Это гликопротеин о молекулярной массой SO кД,отличный по ростовым характеристикам от' Ш-2, -3 и -4. Наряду с хелперным вырабатывается супрессорйый фактор о молекулярной массой 45 кД,чувствительный к прогреванш и изменениям pH.Фактор со стимулирующей активностью

• усиливает процессы регенерации клеток костного мозга и тимуса; супрессорнш фактор блокирует эти эффекты;

7.Специфическим свойством 1ГГЛ1 является матоганная реакция на препараты гормонов тимуса,содержащие »¿I-тимозин ила тимусныи сывороточный фактор,а также препараты негормональной природы,вызывающие пошление уровня цЛМЗ. В связи о этим реакция может быть использована для выявления повышенного фона незрелых ПТЛ в нефракциокя-ровакной суспензии мононуклеарных клеток периферической крови человека при патологиях.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Мирошниченко И.В. .Акназарова Р.Х. Использование теофиллана для определения предшественников Т-лнмфоцитбв, Материалы I Белорусской конференции "Вопросы иммунологии".Витебск,1982,С.30-31.

2.Мальцева В.В..Няроинпченко И.В..Кондратенко И.В.,Ярилия A.A.. 1ахаль'и Л.Н. Тест-система для изучения предшественников Т-лилфс-цатов а "(Г-франциа меток крова к костного мозга пра илмунодефи-цгтах.Материалы науп.ксиф."Совремеюшо метода Егзм7Нотераш1а".М.~ Тазгкйнт, 1984,0.52-53.

3.Ярилин A.A..Мирошниченко И.В.,Кихна М.Г.,Рябинина И.Д.,По-лушкина Е.Б.Дуцик М.Д. Комплекс методов для оценки активности препаратов тимуса . Там же,С.253.

4.Яршшн A.A. .Кочергина Н.И. .К'лрошниченко И.В. Внутритимусные предшественники Т-лимфоцитов у мышей AKR . Икмун ология, 1985,М1, С.24-27.

5.Мирошниченко И.В.,Ярилин A.A..Шарова Н.И. Прояяферагавный ответ предшественников Т-димТоцитов на действие тео}иллина. Иммунология, 1935,1<3, С.30-33.

6.Ярилин A.A..Полушкина Э.Ф..Мирошниченко И.В..Кочергина Н.И. Пострадиационная динамика предшественников ТЧлимфовдтов и регенерация тимуса. Радиобиология,1985,т.25.Л4.С.505-509.

7.Ярилин A.A..Шарова Н.И..Мирошниченко И.В. Взаимодействие клеток костного мозга,несущих антиген стволовых клеток и лишенных его, в процессе селезеночного колониеобразования. Иммунология,1985,#6, С.49-52.

б.Ярилин A.A..Мирошниченко И.В..Акназарова Р.Х. Взаимосвязь митогенеза и антигенной модуляции поверхности преткыоцитов при их превращении в Т-лимдоциты, Материалы 5-го Всесоюзного биохимич. съезда :Биохимия иммунного ответа".Киев,1985,С.38.

Э.Ярилин A.A..Мирошниченко И.В..Михна М.Г. .Полушкина Е.Б.,Ря-бинина И.Д..Луцик М.Д..Зажирей В.Д. .Соколова Е.Д..Тепелина О.М. Комплексное тестирование препаратов тимуса .Иммунология,198в,КЗ, С.23-26.

Ю.Миршнвчеыко И.В. .Ярилин A.A. .Рябинина И.Д. .Мартынов В.Ф., Леонтьева Л.И..Сорочинская В.И. Властная трансформация и смена поверхностных маркеров пря дейотвии синтетических фрагментов типических факторов на предшественники Т-лимфоцитов. Иммунология, 1986,*2,С.85-86.

II.Мирошниченко И.В..Ярилин A.A. Моделирование ранних измене-

ний,которые происходят в предшественниках Т-лим^оцитов в тимусе. В сб.:"Физиология,морфология и патология тимуса".Я.,1986,0.37-40.

12.Ярилин A.A..Мирошниченко И.В..Рябинина И.Д..Филатов A.B. Исследование миграция предшественников Т~лим1оцитов в тимус и факторов, алияющнх на этот процесс. Билл.экспер.биол.,1986,№10, С.447-449.

13.Ярилин A.A..Мирошниченко И.В..Шичкин В.П..Акназарова P.i. Взаимосвязь ростовых и дифференцировочных эдиктов при действии лкм^окинов и гормонов тимуса на предаественники Т-лим;|Оцитоа. Матер.конф. "Макромолекулы и Функционирование клетки".Ереван, 1986.С.54.

14.Лелякнна Ю.А..Акназарова P.X.i-Борисова A.M. .Мирошниченко

И.В. Применение 'тимотропина для лечения больных с иммунодефицитами. Матер.науч.конф. "Актуальные проблемы иммунологиа:аммунодефициты( иммунокоррекцяя". Владивосток, 1987 ,С. 168.

15.Мирошниченко И.В..Ярилин A.A..Акназарова Р.Х..Рябинина И.Д.. Азьмуко A.A..Фонина Л.А. Роль определенных участков молекулы .¿I-тимозина в активапии предшественников Т-лим|оцитов костного мозга. Там же,С.Г72-173.

16.Мирошниченко И.В. .Рябинина И.Д. .Акназарова Р.Х. Характеристика предшественников Т-лимфоцатов костного мозга,регенерирующих тимус после облучения, В сб.¡"Радиобиология стволовых и кроветворных клеток".Обнинск,1987,С.48-51.

17.Шарова Н.И..Ярилин A.A..Мирошниченко И.В..Сорокина Н.И., Акназарова Р.Х. Хелперный эффект предшественников Т-лимфоцитов на гемопоэз.Роль моральных факторов в этом процессе. Таа же, С.42-44.

18.Мирошниченко И.В..Ярилин A.A..Шарова Н.И..Акназарова Р.Х., Рябинина И.Д.,Филатов A.B. Активированные предшественники Т-лямфо-цитов,несущие Thy-i- aHTareH.HMMyH£uionifl,I9ü7,<42,C.29-02.

19.Мирошниченко И.Б..Акназарова Р.Х..Ярилин A.A. Взаимосвязь антигенной перестройки и пролиферации предшественников Т-лимфоцитов при действии гуморальных факторов тимуса. Иммунология,1987,#4.С.71-75.

20.Мярошничянко И.В..Ярилин A.A..Акназарова P.X..Шарова Н.И., Рябинина И.Д. .Тепелша О.М. .Дшжант И.П. Оценка активности тимотро-пина по его действию на предшественники Т-лимфоцитов костного1 мозга. В сб.:"Иммуномодулятори".М.,1986,0.48-54.

21.Мирошниченко И.В..Сорокина H.H.,Шарова Н.И..Акназарова Р.Х., Филатов A.B..Ярилин A.A..Филиппович И.В. Характеристика внутри ти-мусных предшественников Т -лимфоцитов. Иммунология,1987,£6,С.26-29.

22.Сорокина Н.И., Мирошниченко И.В..Акназарова Р.Х..Никонова М.Ф.,Мяхна М.Г..Ярилин A.A..Филиппович И.В. Изменение антигенного фенотипа тимоцитов мышей при действии химических индукторов диффе-ренцировки и ионизирующей радиации. Радиобиология,1987,№5,С.581-585.

23.Шарова Н.И.,Яршшн A.A. .Мврошниченко И.В. »Сорокина Н.И., Акназарова Р.Х. Гуморальное опосредование рейдирующего действия предшественников Т-лимфоцятов на гемопоэз. Иммунология,1987,№4, С.76-79.

24.Яршшн A.A. ,Шичккн В.П.«Мирошниченко И.В.^Шарова Н.И.< Процак Е.А. .Талаев В.Ю. Продукты предшественников Т-ллмфошзтов /ИГЛ/,регулирующие гемо- и лимфопоэз. Тезисы симпозиума с иевдунар. участием "Структура,биосинтез,функции малек.элементов кмглунной система".Пу1зпио,1987,С.37.

25. MixoehnltchenJto I .V., Yarilin A.A.Sharova K.I., 4knazarova R.H. .Ryabir.ina I.D» Stape of T-lymphocy te precursor devolopnant. Eigth European i:munology meetlne.Zagreb, 1.987,N 13-26.P.80.

26.Мирошниченко H.B.,Рябинина И.Д..Шарова Н.И..Познахврева Л.П., Яралян A.A. Фактора,сскрстЕруекиз предаоствеплс^йми Т~л2;моф1;то1з раз-

ного происхождения. Материалы ызаиистатут.иауч.конф. "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиолсрич.и пато-логич.состояниях? Челябинск,1988,0.112-113.

27.Мирошниченко И.В..Шарова H.H..Ярилин A.A..Кочеткова М,С., Николаева И.С..Рябинина И.Д. Анализ клеток,участвующих в формировании колониеобразующих единиц селезенки,с помощью комбинированных методов фракционирования клеток костного мозга. Иммунология, 1988,.'.'4,0.27-30.

28.Ярилин A.A. .Мирошниченко И.В..Никонова М.ф.,Михна И.Г., Рябинина И.Д. Взаимосвязь менду структурой ткмувных пептидов и

нх действием на клетки Т-ряда. Итога науки и техника.Иммунология, Т.26, 1988,0.52-60.

29. Борисова A.M., Ярилин А.А . .Мирошниченко И.Р, Делякина XX. А. Состояние клеточнох-и иммунитета у больных ХНЗЛ а эффективность иммунотерапии. В сб.аауч.трудов "Клеточный иммунитет в патогенеза заболеваний легких".Л.,1988,0.144-149.

30.Мирошниченко И.В..Шарова Н.И.,Ярилин A.A..Талаев В.Ю. Выделение факторов,регулирующих селезеночное колоннеобразование,

и дальнейшая характеристика нх эффектов. Иммунология,1989,JK3,С.35-37.

Поцписано к печати 10.07.89 34 № .116771 Формат I/I6 Тираж 100 экз. Бесплатно, заказ № 86

Ротапринт Е1Г.110, Каширское шоссе д.22 корп. 3