Автореферат и диссертация по медицине (14.00.26) на тему:Диагностика диссеминированного туберкулеза и других гранулематозных заболеваний легких (клинико-лабораторное исследование)

На правахрукописи

Николаева Галина Михайловна

Диагностика диссеминированного туберкулеза и других гранулематозных заболеваний легких (клинико-лабораторное исследование)

14.00.26-фтши>трна 14.00.46-клянвчесхая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2004

Работа выполнена в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы (директор академик РАМН В.И.Литвинов)

Научные консультанты:

член-корр. РАМН, профессор Ерохип Владислав Всеволодович

доктор медицинских наук, профессор Петрова Александра Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мишин Владимир Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор Стаханов Владимир Анатольевич доктор медицинских наук, профессор Шапиро Наум Абрамович

Ведущая организация:

Ярославская государственная медицинская академия МЗ РФ

Защита состоится «12 » октября 2004 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 001.052.01 при ГУ Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН (107564, Москва, Яузская аллея, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ЦНИИТ РАМН

Автореферат разослан_2004 г,

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор

В.А.Фирсова

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Проблема патогенеза, диагностики и дифференциальной диагностики диссемипированного туберкулеза и других диссеминированных процессов в легких является одной из сложнейших во фтизиатрии и пульмонологии. Диагностические ошибки составляют 75,0% - 82,0% [Мотус ИЛ., 1998; Са-довникова А.А. и др., 2001; Шмелев Е.И., 2002].

За последние годы развитие эпидемиологической ситуации по туберкулезу в России расценивается как угроза эпидемии [Литвинов В.И., Сельцовский П.П, 2000; Левашов Ю.Н. и др., 2001]. Растет не только заболеваемость, но и смертность, причем среди лиц, умерших от недиагно-стированного при жизни туберкулеза, — диссеминированные формы являются преобладающими [Соловьева И.П., 1999; Хоменко А.Г. и др., 1999; Андрюхина ГЛ., Сон И.М., 2000; Заратьянц О.В. и др., 2001].

Нехарактерность, в ряде случаев, клинико-рентгенологической картины, отсутствие микобактерий туберкулеза, нормергические или даже отрицательные туберкулиновые пробы приводят к затруднениям при диагностике туберкулеза или определении активности процесса. Наибольшие трудности возникают при дифференциальной диагностике туберкулеза с саркоидозом и некоторыми другими диссеминированными процессами в легких [Радапов Р., Керамидчева В., 1985; Озерова Л.В., 1996; Хоменко А.Г., 1997; Bahri J. et al., 2001].

К тому же отмечен рост числа больных саркоидозом, диагностические ошибки при этом заболевании составляют 50,5% [Борисов С.Е., 1997; Гармаш Ю.Ю., 2001,2003].

Различные аллергические и интерстициальные болезни легких, в прошлом считавшиеся редкой патологией, в современной клинической практике встречаются довольно часто [Чучалин А.Г., 2000].

Все вышеизложенное свидетельствует о том, что проблема диагностики и дифференци

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ

•s»» 9¡m - eos

легких остается актуальной. Ведется поиск различных специальных методов исследования, одним из которых является морфологическая верификация природы процесса. До недавнего времени основным видом морфологической верификации при диссеминированных процессах являлось гистологическое исследование легочной ткани, полученной при открытой биопсии легкого, цитологическое исследование при диссеминированных процессах легких было мало информативным.

Разработка и внедрение в практику методов чрезбронхиальной биопсии легких и особенно бронхоальвеолярного лаважа изменило роль цитологического метода в диагностике различных диссеминированных заболеваний легких.

Впервые возникла возможность получать материал из глубоких отделов легких, с большой площади альвеол и бронхиол в достаточном количестве и, практически, без осложнений. Малая травматичность и доступность метода дает возможность производить бронхоальвеолярный ла-важ повторно и изучать популяции клеточных элементов дистальных отделов легких до и после лечения.

К настоящему времени достаточно хорошо изучены цитограммы жидкости бронхоальвеолярного лаважа при разных формах и разной степени активности саркоидоза, при экзогенном аллергическом и идиопати-ческом фиброзирующем альвеолитах, пневмокониозах и некоторых «редких» заболеваниях легких.

Однако, подавляющее большинство исследований проведено на светооптическом уровне изучения клеточных элементов жидкости бронхо-альвеолярного лаважа. В единичных случаях применены электронно-микроскопические и цитохимические методики. К настоящему времени отсутствуют работы по изучению клеточного состава жидкости бронхоальвеолярного лаважа с применением комплекса (светооптического, цитохимического и электронно-микроскопического) методов исследования, что позволило бы оценить как морфологические, так и функциональные

особенности всех клеток жидкости бронхоальвеолярного лаважа, и их изменения на разных этапах развития болезни.

Не изучена возможность практического использования цитологического изучения клеточных элементов жидкости бронхоальвеолярного ла-важа при туберкулезе: особенности морфофункционального состояния клеток при активном и неактивном туберкулезе, его разных морфологических, формах, изменения клеток жидкости бронхоальвеолярного лаважа при лечении и т.д. Нет четких цитологических критериев отличия диссе-минированного туберкулеза и саркоидоза.

Известна важная роль измененных (дефектных по клеточной стенке) вариантов микобактерий туберкулеза в патогенезе туберкулеза, однако отсутствие методов окраски L-форм микобактерий туберкулеза не позволяет выявлять их непосредственно в патологическом материале.

Цель исследования

Повышение эффективности диагностики и дифференциальной диагностики диссеминированного туберкулеза и других гранулематозов легких на основе изучения механизмов патогенеза с помощью комплексного цитологического исследования.

Задачи работы

1. Выяснить возможности использования цитологического метода исследования в выявлении L-трансформированных вариантов мико-бактерий туберкулеза.

2. Определить клеточные реакции макроорганизма на вегетиро-вание типичных и измененных микобактерий туберкулеза в эксперименте и клинике.

3. Изучить клеточный состав браш-биопсий, цитограммы жидкости бронхоальвеолярного лаважа и морфофункциональные особенности макрофагальных элементов при диссеминированном и других формах туберкулеза легких, внутригрудных лимфатических узлов и плевры до и на фоне лечения.

4. Изучить цитологические особенности экспериментального саркоидоза, в разные сроки после заражения экспериментальных животных.

5. Охарактеризовать цитологический состав материала чрез-бронхиальной биопсии легких, пунктата внутригрудных лимфатических узлов и жидкости бронхоальвеолярного лаважа у больных на разных стадиях и при различном течении саркоидоза до и после лечения. Изучить цитологические и цитохимические свойства макрофагов при саркоидозе.

6. Определить состав и функциональные особенности клеток жидкости бронхоальвеолярного лаважа у больных альвеолитами, гистио-цитозом X, альвеолярным протеинозом и идиопатическим гемосидерозом легких.

Научная новизна

Впервые использован комплекс лабораторных методов (цитология, микробиология, цитохимия и электронная микроскопия) для изучения материала бронхоальвеолярного лаважа у больных различными диссемини-рованными процессами в легких, что дало возможность выявить морфо-функциональные характеристики макрофагальных элементов патогномо-ничных для разных заболеваний.

Впервые предложено использовать цитологический метод окраски для выявления измененных ^-трансформированных) вариантов микобак-терий туберкулеза в патологическом материале и культуре, что повышает эффективность диагностики туберкулеза.

Впервые дана комплексная морфофункциональная характеристика макрофагов бронхоальвеолярного лаважа у больных диссеминированным и другими формами туберкулеза легких, внутригрудных лимфатических узлов и плевры и их изменения в процессе лечения.

Изучены цитограммы и морфофункциональная характеристика мак-рофагальных элементов жидкости бронхоальвеолярного лаважа у больных на разных стадиях и с разным течением саркоидоза. Выявлены неизвест-

ные ранее четкие цитологические различия макрофагальной формулы у больных туберкулезом и саркоидозом.

Описана цитологическая картина туберкулеза при преобладающем вегетировании L-трансформированных вариантов микобактерий туберкулеза.

Разработаны: приоритетный способ определения активности туберкулеза (авторское свидетельство № 1469462) и способ ускоренной реверсии L-форм микобактерий туберкулеза (авторское свидетельство № 1604841).

Практическая значимость работы

Полученные результаты широко используются в повседневной практической работе врача-цитолога при:

1. дифференциальной диагностике различных диссеминирован-ных заболеваний легких;

2. определении активности специфического процесса;

3. контроле за эффективностью лечения;

4. экспериментальных исследованиях с целью изучения изменений микобактериальной популяции под воздействием различных факторов (антибактериальная терапия, иммуномодуляторы, КВЧ и т.д.).

Основпые положения, выносимые на защиту

1. Дефектные по клеточной стенке (L-трансформированные) варианты микобактерий туберкулеза хорошо окрашиваются гематологическими красителями, что позволяет выявлять различные формы их морфогенеза in vitro и в диагностическом материале.

2. Клеточные реакции макроорганизма и морфофункциональное состояние клеточных элементов зависят от формы вегетирования микобак-терий туберкулеза.

3. Комплекс лабораторных методов исследования (цитология, цитохимия, электронная микроскопия, микробиология) материала бронхо-

альвеолярного лаважа позволил выявить признаки патогномоничные для активной фазы следующих гранулематозов легких.

Туберкулез - цитограмма жидкости бронхоальвеолярного лаважа носит лимфоцитарный, макрофагальный или смешанный характер. Среди макрофагов преобладают биосинтезирующие клетки (более 35%), увеличено число секретирующих макрофагов (12% - 20%), высокий индекс ферментативной активности кислой фосфатазы, возбудитель туберкулеза в виде типичной палочки, кислотоустойчивых или некислотоустойчивых зернистых шаров L-форм микобактерий туберкулеза.

Саркоидоз - лимфоцитарный или макрофагальный тип цитограммы жидкости бронхоальвеолярного лаважа, среди макрофагальных элементов отмечено преобладание секретирующих макрофагов, присутствие вакуоли-зированных макрофагов, низкий уровень индекса ферментативной активности кислой фосфатазы и высокий — сукцинатдегидрогеназы. Отсутствие типичных микобактерий туберкулеза, выявление L-форм микобактерий только при использовании биологической пробы. В макрофагальных элементах жидкости бронхоальвеолярного лаважа при электронной микроскопии выявляются сферопластоподобные образования.

Гистиоцитоз X - пестрый клеточный состав цитограммы жидкости бронхоальвеолярного лаважа: макрофаги, лимфоциты, нейтрофилы, эози-нофилы, среди макрофагов - встречаются эритрофаги, липофаги, клетки Лангерганса, при электронной микроскопии в них определяются Х-тельца.

Альвеолярный протеиноз - наличие глыбок ШИК-положителыюго неклеточного вещества.

Идиопатический гемосидероз легких - большие скопления гемосиде-рина внутри и вне клеточных элементов, положительная реакция Перльса.

Экзогенный альвеолярный альвеолит - лимфоцитарный или смешанный характер цитограммы жидкости бронхоальвеолярного лаважа, повышение числа эозинофилов, присутствие тучных клеток.

Идиопатический фиброзирующий альвеолит - нейтрофильный характер цитограммы жидкости бронхоальвеолярного лаважа, низкое содержание миэлопероксидазы в нейтрофилах жидкости бронхоальвеолярного лаважа, при десквамативном варианте идиопатического фиброзирующего альвеолита наличие альвеолоцитов П типа.

Внедрение результатов работы в практику Результаты диссертационного исследования используются в лекционном курсе на циклах, повышения квалификации врачей-цитологов; включены в методические рекомендации «Диагностический бронхоальве-олярный лаваж (Москва, 1986). Методы цитологической диагностики L-форм микобактерий туберкулеза применяются в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН, Московском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы, больнице МПС № 1. Способ определения активности туберкулезного процесса по макрофагальной формуле бронхоальвеолярно-го лаважа используется в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН, Московском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на Советско-французском рабочем совещании «Сурфактант в норме и при патологии» (Москва, 1984), Всесоюзных и Республиканских съездах фтизиатров (Кишинев 1985, Киев 1986, Минск 1989, Санкт-Петербург 1992, Саратов 1994, Екатеринбург 1997, Москва 2003), итоговых сессиях ЦНИИТ РАМН (1986, 1988, 1990, 1992), съезде врачей-патологоанатомов (Тбилиси 1986, Москва 1998), Всесоюзных и Всероссийских конгрессах по болезням органов дыхания (Москва 1994, 1995, 1996, Санкт-Петербург 2000, Москва 2001, 2002), секции «Микробиология и иммунология туберкулеза» Московского отделения ВОЭМП, Всероссийском съезде врачей-лаборантов (Москва 1996), Все-

российских съездах врачей-цитологов (Воронеж 1999, Великий Новгород 2001).

Публикации По теме диссертации опубликовано 51 работа.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 217 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. В тексте содержится 12 таблиц, 40 рисунков. Библиография включает 299 источников литературы, из них 159 на русском и 140 на иностранных языках.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач были проанализированы результаты обследования 350 больных, находившихся на лечении в клиниках Центрального научно-исследовательского института туберкулеза РАМН и Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы (МНПЦБТ) и наблюдавшихся в консультационных отделениях этих учреждений с 1983 по 2002 годы. Среди них было 170 мужчин и 180 женщин в возрасте от 12 до 68 лет, преобладали лица наиболее работоспособного возраста (30 - 50 лет).

Только 67 (19,1%) больных были направлены в клиники для антибактериальной терапии и/или оперативного вмешательства с уже установленным диагнозом (в основном это больные с локальными формами туберкулеза). Остальные 283 (80,9%) больных были направлены для уточнения диагноза или определения активности специфического процесса.

Контрольную группу составляли 12 практически здоровых лиц (5 женщин и 7 мужчин) в возрасте от 22 до 54 лет.

Всем больным было проведено полное клинико-рентгенологическое и лабораторное обследование. Особое внимание уделялось микробиологическому исследованию на микобактерии туберкулеза (МБТ): применялось бактериоскопическое исследование мазков, окрашенных по методам Циля-Нильсена и люминесцентными красителями. Посевы патологического материала производились на традиционные плотные яичные среды Левен-штейна-Йенсена и Финна-2, для выделения типичных МБТ, и на полужидкую среду Школьниковой в модификации Дорожковой, для выделения L-трансформированных вариантов возбудителя, использовались и биологические пробы.

Бронхологическое исследование выполнено у всех больных и 12 практически здоровых лиц (контрольная группа). Бронхоальвеолярный ла-

важ (БАЛ) выполнен у 275 больных и 12 лиц из контрольной группы. Другие виды чрезбронхиальных биопсий (браш- и катетер-биопсии, чрезброн-хиальная биопсия легких, пункция внутригрудных лимфатических узлов) -произведены у 92 больных, 36 больных были оперированы. С биопсиро-ванного и резецированного материала готовили мазки-отпечатки для цитологического и бактериоскопического исследований.

В результате клшшко-рентгено-лабораторного исследования (включая и комплексное цитологическое исследование) обследованным больным были установлены следующие диагнозы: туберкулез - 212 больным, сар-коидоз - 95, экзогенный аллергический альвеолит -17, идиопатический фиброзирующий альвеолит - 7, гистиоцитоз X - 7, альвеолярный протеи-ноз - 8, идиопатический гемосидероз легких - 4 больным.

У 212 больных был туберкулез легких и внутригрудных лимфатических узлов (ВГЛУ) (у 204 больных - в активной фазе, у 8 - в неактивной). По формам туберкулеза они распределялись следующим образом: диссе-минированный туберкулез у 86 больных, туберкулез ВГЛУ - у 76, тубер-кулемы - у 25, кавернозный и фиброзно-кавернозный туберкулез - у 10, инфильтративный туберкулез — у 10, экссудативный плеврит — у 5 больных.

Выбор больных разными формами туберкулеза был продиктован:

• наибольшими дифференциально-диагностическими затруднениями при диссеминированных процессах, туберкулезе ВГЛУ у взрослых и округлых солитарных образованиях в легких;

• необходимостью выяснения цитологических особенностей материала БАЛ и других видов биопсий у больных разными формами туберкулеза до и во время лечения.

У 12 больных туберкулезом цитологическое исследование жидкости БАЛ проводили повторно во время курса антибактериальной терапии (от 2 до 6 исследований на одного больного), что позволило проследить изменения цитограммы и макрофагальной формулы в процессе лечения.

Больных саркоидозом было 95. У 45 больных был диагностирован саркоидоз ВГЛУ (I группа), у 50 - саркоидоз ВГЛУ и легких (И группа). Часть больных (8 случаев) наблюдалась нами в течение длительного времени (от 6 месяцев до 14 лет), что позволяло видеть изменения цитологической картины на разных фазах и при различном течении болезни.

Цитологический светооптический метод исследования был использован при изучении всех видов патологического материала у всех больных. Мазки для цитологического исследования окрашивали по методам Рома-новского-Гимзы или Паппенгейма.

Бронхоальвеолярный лаваж. Для решения дифференциально-диагностических задач было изучено морфофункциональное состояние клеток жидкости БАЛ, особое внимание уделяли моноцитоидно-макрофагальным элементам. Для этого, кроме цитологического светоопти-ческого изучения клеток, применяли цитохимические (75 образцов) и электронно-микроскопические (39 образцов) исследования. При цитологическом светооптическом исследовании нативной жидкости БАЛ подсчитывали общее число клеток, определяли жизнеспособность макрофагальных элементов (с помощью трипанового синего). Далее жидкость центрифугировали и из части осадка делали мазки, которые использовали для цитологического и цитохимического исследований [Николаева Г.М., 1988]. В окрашенных мазках лаважа подсчитывали цитограмму (процентное содержание различных клеточных элементов) и макрофагальную формулу (процентное соотношение разных типов макрофагов). Среди макрофагальных элементов жидкости БАЛ выделяли молодые биосинтезирующие макрофаги (Мф), фагоцитирующие и секретирующие Мф. Увеличение числа био-синтезирующих Мф более 35,0% свидетельствует об активности туберкулеза (табл. 1) (Ерохин В.В., Николаева Г.М., Филиппенко Л.Н. Авторское свидетельство на изобретение от 01.12.88 г. № 1469462).

Таблица 1

Макрофагальная формула жидкости бронхоальвеолярпого лаважа у практически здоровых лиц и больных неактивным туберкулезом

Группы обследованных лиц Число обследованных Макрофаги (%) •

биосинте-зирующие фагоцитирующие секрети-рующие

Практически здоровые лица 12 10,05±8,6 86,6±10,1 3,3±4,9

Туберкулез неактивный 8 13,6±11,8 80,2±14,1 6,2±8,3

Часть осадка жидкости БАЛ использовали для электронно-микроскопического исследования, которое проводили по методике Л.Н. Филиппенко (1988) в электронно-микроскопических лабораториях ЦНИИТ РАМН и лаборатории патоморфологии ЦНИЛ Медицинской академии им. И.М. Сеченова.

Цитохимическое исследование обычно применяется в гематологии для изучения ферментного состава клеток крови и определения их функционального состояния. Ввиду того, что в доступной нам литературе мы не встретили работ, посвященных вопросам цитохимического исследования макрофагальных элементов бронхоальвеолярного лаважа с применением полуколичественного метода, то методики, разработанные для гематологической практики, адаптированы нами для клеток жидкости БАЛ и апробированы в течение 10 лет.

Показателем функционального состояния клеток является их ферментативная активность. Учитывая, что преобладающими клетками БАЛ в большинстве случаев являются альвеолярные Мф, лимфоциты (Лц) и ней-трофилы (Нф), использовали те цитохимические реакции, которые выявляют ферменты, характерные для этих клеток: кислая фосфатазы (КС), миелопероксидаза (МП) и сукцинатдегидрогеназа (СДГ).

Кислая фосфатаза выявлялась методом азосочетаний с парарозани-лином по Goldberg-Barka; МП - по Graham и Kamovsky; СДГ - по методу Р.П. Нарциссова.

Для более объективной оценки функциональной активности клеток применялся полуколичественный метод подсчета индекса ферментативной активности по формуле Kaplow (подсчет производится на 100 клеток): R = ОхА + 1хВ + 2хС + 3xD

Цифровые значения индекса ферментативной активности обозначались в условных единицах (усл.ед.).

Результаты цитохимического исследования клеток жидкости БАЛ у практически здоровых лиц и больных неактивным туберкулезом представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Результат цитохимического исследования макрофагов жидкости бронхоальвеолярного лаважа

Группы обследованных лиц Число исследований Активность ферментов (усл.ед.)

кислая фосфатаза сукдинат-дегидрогеназа

Практически здоровые лица 7 228,6±5,7 125,5±4,5

Туберкулез неактивный 3 234,0±8,8 109,2±6,0

Для дифференциальной диагностики темно-коричневых включений гемосидерина от пылевых частиц, меланина или пигментов желчных кислот в нативном материале использовали реакцию Перльса (реакция на берлинскую лазурь).

Для диагностики альвеолярного протеиноза применяли ШИК-реакцию.

В эксперименте использованы 225 морских свинок, весом 250 - 400 г, прошедшие карантин, и 110 мышей линии СВА.

Для изучения морфологии микобактерий на ранних этапах культивирования в экспериментах in vitro были применены штаммы М. tuberculosis Н37 Rv (2); М. Bovis Bovinus 8 (2), М. Bovis BCG (2), М. Smegmatis (1) и 2 штамма клинических изолятов.

Для выяснения возможности использования светооптического цитологического метода в выявлении L-трансформированных вариантов МБТ, изучены 74 культуры L-форм, полученные от больных туберкулезом и 30 культур L-форм - от больных саркоидозом. Нативный материал из культур L-форм МБТ просматривали с помощью фазово-контрастного метода, а затем готовили мазки, которые окрашивали гематологическими красителями (метод Романовского-Гимзы) и по Цилю-Нильсену. Пять культур L-форм (3 - от больных туберкулезом и 2 - от больных саркоидозом) были изучены с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.

Все полученные цифровые данные подвергали статистической обработке по методу Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Цитология туберкулеза: цитологические исследования выполнены в эксперименте и клинике.

Экспериментальные исследования. Использование цитоморфоло-гического подхода к изучению возбудителя туберкулеза с применением как стандартных методов (Циль-Нильсена, люминесцентные красители) так и цитологических окрасок (Романовский-Гимза) дало возможность выявить некоторые особенности микобактерий.

В эксперименте изучены: 1) морфология микобактерий на

ранних этапах культивирования; 2) морфология L-трансформированных вариантов МБТ.

1. В ранние сроки роста (30 мин. - 12 суток) после посева на плотные питательные среды микобактерии проходят ряд морфологических трансформаций. Изменения начинаются сразу же после посева и выражаются в

следующем: частичная или полная потеря кислотоустойчивости, распад микобактерий на гетероморфную зернистость, формирование из этой зернистости шаровидных и вакуолизированных структур (L-фаза), образование в этих структурах зернистых, а затем и палочковидных форм микобак-терий с восстановлением временно утраченной кислотоустойчивости; одним из этапов является появление бесцветных светопреломляющих зерен и слоистых светопреломляющих образований. Скорость происходящих изменений, особенности морфологии переходных форм роста, глубина потери кислотоустойчивости зависели от вида микобактерий.

2. Морфология L-трансформированных вариантов МБТ: препараты, приготовленные из культур L-форм МБТ, выращенных па полужидкой агаровой среде, окрашивали по методу Романовского-Гимзы.

L-формы МБТ хорошо окрашивались краской Романовского-Гимзы, что позволило выявить их различные морфологические варианты и формы размножения.

Зернистые шары L-форм МБТ представляют собой голубовато-синие округлые безъядерные образования со слегка вакуолизированной цитоплазмой, размером 4 -7 мкм. Обнаружены фигуры размножения почкованием. Встречались и кислотоустойчивые варианты сферопластов МБТ. Все структуры L-форм МБТ выявлялись при рутинном цитологическом исследовании диагностического материала, что повышало эффективность диагностики туберкулеза.

В эксперименте изучены изменения микобактериальной по-

пуляции и ответные клеточные реакции макроорганизма в сроки от 1 часа до 4 недель после внутривенного заражения мышей сублетальной дозой M.tuberculosis H37Rv.

В сроки от 10 до 60 минут - клеточный состав мазков не отличался от нормы, МБТ присутствовали в небольшом количестве в виде типичных палочковидных и зернистых форм, частично внутри Нф; от одного до 5 часов - при сохранении в мазке типичных МБТ, увеличивалось число Нф и

моноцитов, появлялись прозрачные светопреломляющие кристаллоподоб-ные образования; после 5 часов ни бактериоскопически, ни культурально типичные МБТ в легких не выявлялись, но обнаруживались зернистые шары L-форм МБТ. Увеличивалось число моноцитоидно-макрофагальных скоплений, среди Мф преобладали секреторные формы клеток, возрастало количество Лц, появлялись эозинофилы (Эф), плазмоциты. К 2 - 3 суткам в большей части зернистых шаров L-форм появлялись зернистые и палочковидные МБТ, то есть происходила реверсия. В эти же сроки среди Мф нарастало число биосинтезирующих клеток, в цитоплазме некоторых из них определялись единичные МБТ; продолжало увеличиваться число Лц, среди которых появлялись бластные формы.

К 6 - 7 суткам в легких сформировались микрогранулемы, состоящие из макрофагальных и эпителиоидных клеток на фоне дистрофически измененных Нф. Среди Мф продолжало увеличиваться число биосинтезирую-щих клеток, сохранялись секретируюшие и зрелые фагоцитирующие альвеолярные Мф. МБТ представлены типичными палочковидными микроорганизмами, большинство их располагались внеклеточно. Дальнейшее про-грессирование процесса сопровождалось уменьшением числа Мф и эпите-лиоидных клеток и выраженной нейтрофильной инфильтрацией легких; типичные МБТ в больших количествах обнаруживались как внутри, так и вне Нф.

При лечении туберкулеза, в первую очередь, исчезали палочковидные МБТ, уменьшалось число Нф и биосинтезирующих альвеолярных Мф, появлялись L-формы МБТ. При продолжении лечения переставали определяться и L-формы, среди альвеолярных Мф преобладали зрелые фагоцитирующие формы и немного секретирующих клеток, Лц и фибробласты.

Проведенные эксперименты позволяют отметить, что при пересеве микобактерий на новые питательные среды, при попадании в организм хозяина они, как правило, проходят цикл L-трансформации, помогающий адаптироваться к новым условиям существования. То же самое происходит

и при лечении антибактериальными препаратами [Земскова З.С., Дорожко-ва И.Р, 1984].

Различные формы изменчивости МБТ вызывают разные клеточные реакции организма. Типичная палочковидная МБТ поглощается, в первую очередь, нейтрофильными лейкоцитами, которые, не справляясь с задачей полного уничтожения патогена, гибнут в больших количествах, вызывая приток новых лейкоцитов и Мф, последние, прибыв в очаг воспаления, наращивают свой лизосомальный аппарат (и другие системы, от которых зависит их бактерицидная активность) и трансформируются в молодые био-синтезирующие, а затем и зрелые фагоцитирующие клетки. Обнаружение дистрофически измененных Нф и большого числа биосинтезирующих Мф указывает на присутствие в материале классических палочковидных форм МБТ.

Зернистые шары L-форм МБТ, из-за большой величины и особенностей рецепторного аппарата, плохо поддаются фагоцитозу, что заставляет макроорганизм усиливать гуморальный иммунитет и секреторную функцию макрофагальных элементов, - цитологически это выражается в увеличении числа секретирующих Мф, эпителиоидных и гигантских клеток, а также плазмоцитов. Кроме того, L-формы МБТ обладают аллергизирую-щей способностью, что выражается в повышении числа Эф в очаге воспаления.

Клинико-лабораторные исследования: Проведен анализ результатов клинико-лабораторного исследования 212 больных туберкулезом (у 204 больных был активный туберкулез, у 8 - неактивный); 40,5% составили больные диссеминированным туберкулезом. Цитологическое исследование материала браш-биопсий показало, что у больных активным туберкулезом бронхиальный эпителий находится в состоянии дистрофии, инфильтрации его Нф и Лц.

При туберкулезе ВГЛУ как самостоятельной форме, так и сопутствующей другим формам туберкулеза (наиболее часто диссеминированному

туберкулезу), встречается поражение бронхов в виде лимфобронхиальной фистулы (или микрофистулы). Цитологически картина лимфобронхиальной фистулы проявляется в виде скоплений лимфоидных элементов, казе-озных или гнойно-некротических масс, эпителиоидных и гигантских клеток, плазмоцитов и L-форм микобактерий. При длительных и глубоких поражениях слизистой оболочки бронха специфическим процессом, наблюдается выраженная дисплазия бронхиального эпителия, иногда с явлениями плоскоклеточной метаплазии.

Наиболее информативным, в целях дифференциальной диагностики и определения активности диссеминированного и других форм специфического процесса, было цитологическое исследование жидкости БАЛ. Оно проведено у 138 больных активным и 8 больных неактивным туберкулезом.

Основными клеточными элементами БАЛ являлись Мф, Лц и Нф. Соотношения между клеточными элементами чрезвычайно вариабельны и зависели от:

• активности специфического процесса,

• формы туберкулеза,

• формы вегетирования возбудителя.

При неактивном туберкулезе цитограмма жидкости БАЛ и макрофа-гальная формула практически не отличались от нормы (см. табл. 1).

Часто и при активном туберкулезе цитограмма жидкости БАЛ не отличалась от нормы (у 36,6% больных диссеминированным туберкулезом, у 82,0% больных с туберкулемами и всех больных экссудативным плевритом).

Выраженная лимфоцитарная реакция отмечена у 25,0% больных диссеминированным туберкулезом и 34,7% больных туберкулезом ВГЛУ.

Выраженная нейтрофильная реакция встречалась не часто: у 5,0% больных диссеминированным туберкулезом, у 6,0% больных туберкулезом ВГЛУ, у 20,0% больных фиброзно-кавернозным туберкулезом.

Наиболее распространен при активном туберкулезе смешанный тип цитограммы с умеренным повышением Лц (15% - 21%) и Нф (5% - 14%).

При активном туберкулезе не выявлено цитограмм, характерных для данного заболевания.

Патогномоничным для туберкулеза является субпопуляционный состав Мф - макрофагальная формула. У подавляющего большинства больных всеми формами активного туберкулеза среди Мф преобладали мелкие базофильные клетки (биосинтезирующие Мф). Процент биосинтезирую-щих Мф превышал 35% (часто наблюдали 41% - 56%), при норме до 15%.

Одновременно с повышением числа биосинтезирующих Мф увеличивалось и количество секретирующих Мф - 12% - 20%, при норме до 5%.

У больных, выделяющих типичные палочковидные МБТ, процентное содержание биосинтезирующих Мф было выше, чем у лиц, выделяющих L-формы МБТ, у них же, как правило, было повышено число Нф в ци-тограмме БАЛ.

У больных, выделяющих лишь L-формы МБТ, в цитограмме преобладали Лц, число биосинтезирующих Мф могло быть менее 35%, а число секретирующих Мф значительно увеличено (20% - 29%).

Цитохимическое исследование Мф БАЛ при активном туберкулезе выявило повышение индекса ферментативной активности КФ - 253 (К -228,6) и снижение СДГ - 75,5 (К- 125,5).

При повторных исследованиях БАЛ во время и после проведения курса лечения отмечалась нормализация цитограммы, и постепенное снижение числа биосинтезирующих Мф, в случае неэффективности лечения число биосинтезирующих Мф не только не снижалось, но могло и повыситься. Отмечено, что нормализация цитограммы происходила быстрее, чем уменьшение числа биосинтезирующих Мф.

Зернистые шары L-форм МБТ наиболее часто выявлялись при дис-семинированном туберкулезе (21,0%), туберкулемах (44,0%) и туберкулезе ВГЛУ (32,8%). Преобладали некислотоустойчивые зернистые шары L-

форм МБТ, однако, у части больных встречались и их кислотоустойчивые варианты.

Цитология саркоидоза. Для определения роли клинической цитологии в диагностике и изучении этиопатогенеза саркоидоза, были проведены экспериментальные и клинические исследования.

Экспериментальные исследования. Проведенное экспериментальное и клинико-экспериментальное исследования показали у экспериментальных животных, зараженных материалом, полученным от больных сар-коидозом, через 3-6 мес. в органах развитие тех или инвгх изменений, сходных с саркоидными. В ранние сроки (3 мес.) преобладала лимфоидная инфильтрация с наличием моноцитоидно-макрофагальных элементов, Эф и плазмоцитов. Бактериоскопически выявляли кислотоустойчивые кокко-видные и, единично, палочковидные микобактерии, а также их L-формы и скопления мелких бесцветных светопреломляющих зерен. При посеве этого материала на полужидкие питательные среды, получен рост стабильных L-форм микобактерий при отсутствии роста типичнвк микобактерий на плотных питательных средах. В более поздние сроки (6 и более месяцев) появлялись эпителиоидно-клеточные скопления, единичные гигантские клетки, секреторные и вакуолизированные Мф. Бактериоскопически кислотоустойчивые микобактерии и их L-формы не выявлялись; сохранялись лишь скопления мелких светопреломляющих зереп вне и внутри Мф.

При повторных пассажах гомогенатов от животного к животному наблюдалось постепенное угасание изменений в органах животных и прекращение выделения L-форм микобактерии.

Рост L-форм микобактерии при непосредственном посеве патологического материала на полужидкую питательную среду получен только у 2 больных с прогрессирующим течением саркоидоза, и у всех больнвк при использовании биологической пробы (30 наблюдений).

Изучение жидкого ампулированного антигена Квейма показало наличие в нем агента, морфологически сходного с измененными формами

микобактерий и способного к бактериоскопической реверсии в кислотоустойчивую палочковидную форму.

В материале от больных активным рецидивирующим и прогрессирующим саркоидозом, а также у экспериментальных животных в поздние сроки после заражения, выявляются своеобразные вакуолизированные Мф со светопреломляющими включениями в цитоплазме. При электронно-микроскопическом исследовании эти включения представляют собой полиморфные, мельчайшие (0,2 - 0,3 мкм) сферобластоподобные образования, морфологически сходные с измененными формами микобактерий.

Клинико-лабораторные исследования. Комплексное цитологическое изучение различного материала, полученного от 95 больных саркои-дозом, помогло определить цитологические характеристики различных фаз саркоидоза.

Фаза альвеолита активного саркоидоза — в цитограмме жидкости БАЛ высокий лимфоцитрз (45%-70%), могут присутствовать Эф (1 % - 3%). Среди альвеолярных Мф уменьшается число фагоцитирующих клеток за счет увеличения моноцитов и секретирующих Мф с низкой активностью кислой фосфатазы (КФ) и высокой окислительно-восстановительных ферментов (СДГ). При цитологическом и гистологическом изучении материала чрезбронхиалыюй биопсии легких, встречаются скопления моноцито-идно-макрофагальных элементов, окруженных Лц; среди Мф преобладают секретирующие формы и молодые эпителиоидные клетки. В пунктате ВГЛУ у 2 из 10 больных обнаружены бледно окрашенные зернистые шары L-форм микобактерий.

При благоприятном течении саркоидоза (после лечения или даже без лечения) при повторном исследовании жидкости БАЛ отмечали значительное уменьшение числа Лц, иногда до нормы, субпопуляционный состав альвеолярных Мф также медленно нормализовался - начинали преобладать фагоцитирующие Мф. При отсутствии лечения или неадекватной терапии процесс мог перейти в следующую фазу.

Гранулематозная фаза активного саркоидоза. В цитограмме БАЛ умеренный лимфоцитоз или нормальное число Лц. Зернистые шары L-форм микобактерий не встречались. Число Лц зависело от интенсивности альвеолита: в начале гранулематозной стадии интенсивность альвеолита высока, поэтому процент Лц в цитограмме на высоких или средних цифрах, по мере увеличения числа эпителиоидно-клеточных гранулем количество Лц в альвеолах и межальвеолярном пространстве уменьшалось, что отражалось на цитограмме жидкости БАЛ. Среди альвеолярных Мф преобладали секретирующие Мф и эпителиоидные клетки, появлялись вакуо-лизированные Мф, иногда со светопреломляющими включениями в цитоплазме. При цитологическом и гистологическом исследовании видны типичные эпителиоидно-клеточные гранулемы с гигантскими клетками типа «инородного тела» и Пирогова-Лангтанса.

На гранулематозной стадии также может произойти рассасывание гранулематозных изменений с восстановлением структуры легкого, что проявлялось в нормализации цитограммы жидкости БАЛ. Однако, чаще, наряду с рассасыванием, происходит фиброзирование гранулем. Процессы фиброзирования (особенно прогрессирующего фиброзирования и гиалино-за) отражались на цитограмме БАЛ появлением и увеличением числа Нф до 15% - 25% [Сидорова Н.Ф., 1992]. Чем выше число Нф, тем менее благоприятен прогноз заболевания. При лечении число Нф могло снижаться.

При волнообразном рецидивирующем течении саркоидоза во время обострения вновь начиналась фаза альвеолита, наслаивающаяся на уже имеющиеся изменения. В цитограмме снова повышалось процентное содержание Лц.

Высокий лимфоцитоз жидкости БАЛ всегда свидетельствует об обострении процесса, но низкий - не говорит об отсутствии активности, так как может иметь место при гранулематозной фазе, когда преобладающими элементами цитограмм являются секретирующие Мф и эпителиоидные клетки.

При прогрессирующем течении саркоидоза изменения в цитограмме носят более глубокий и трудно обратимый характер: число Лц чаще держится на среднем и низком уровне 34%), может быть значительно повышено число Нф (до 28%). Среди альвеолярных Мф возрастает число биосинтезирующих форм, что приближает цитограмму по своему характеру к цитограмме БАЛ при туберкулезе. Отличительным признаком может служить большое число крупных вакуолизированных Мф со светопреломляющими включениями з цитоплазме и вне ее.

Результаты экспериментального и клинического исследований, вместе с данными литературы, позволяют говорить об участии микобактерий в этиопатогенезе саркоидоза, однако, нужны еще более целенаправленные исследования с применением микробиологических, иммунологических, цитологических и, особенно, молекулярно-генетических исследований с целью всестороннего изучения особенностей возбудителя и ответной реакции макроорганизма.

Туберкулез и саркоидоз, сходство и различие. Давно отмечено сходство клинической и рентгенологической картин саркоидоза и диссемини-рованного туберкулеза и только обнаружение МВТ или казеоза помогает решить вопрос в пользу туберкулеза.

По данным I. БсаёШ^ (1956, 1961) из 230 больных саркоидозом у 11 предшествовал активный туберкулез с бацилловыделением, а у 5 - туберкулез следовал за саркоидозом, переходу одного заболевания в другое сопутствовало изменение туберкулиновой чувствительности. У 7 из 137 больных, наблюдавшихся более 5 лет, образовались прикорневые петри-фикаты, что позволило автору говорить, что единый этиологический агент (МБТ) вызвал одновременно и неказеозные и казеозные очаги, последние затем кальцинировались.

Проба Манту также не всегда позволяет надежно различать туберкулез и саркоидоз. При саркоидозе основное число больных имеет отрицательную реакцию на пробу Манту, вместе с тем, часть больных имеет по-

ложительную реакцию. К тому же, 25% больных туберкулезом имеют отрицательную туберкулиновую пробу [Pesanti E., 1994].

Присутствие МБТ всегда означает туберкулез, но их отсутствие не всегда его отрицает: у 10% - 15% больных диагноз туберкулеза ставят без бактериального подтверждения [Small P. et al., 1994].

Велико и морфологическое сходство гранулем при этих двух заболеваниях: саркоидные гранулемы, как и туберкулезные бугорки лишены сосудов; при туберкулезе не всегда присутствует казеоз, а при саркоидозе может встречаться ограниченный неказеозный некроз [Hsu R. et al., 1996]. Типичные саркоидные гранулемы формируются в лимфатических узлах и легких у больных с туберкулемами; при туберкулезе в фазе заживления, особенно при вегетировании в организме L-форм МБТ, как и при саркои-дозе, усиливается фиброз с гиалиновой дезорганизацией коллагеновых волокон [Земскова З.С., 1976; Пузик В.И. и др., 1979]. Т.И.Казак (2002) пишет: «Эпителиоидно-клеточные гранулемы при разных формах гранулема-тозов неразличимы».

Цитологическое изучение жидкости БАЛ тоже не помогло уверенно отличать саркоидоз и диссеминированный туберкулез: и при одном, и при другом заболевании часто встречался лимфоцитарный тип жидкости БАЛ, к тому же, почти у четверти больных цитограмма, практически, не отличалась от нормы. Сравнивая цитограммы жидкости БАЛ больных диссеми-нированньш туберкулезом без распада (49 наблюдений) и больных сар-коидозом II (45 наблюдений), мы не смогли определить достоверной разницы (Р>0,01) (табл. 3).

Однако, подсчет макрофагальной формулы жидкости БАЛ у этих же групп больных выявил дифференциально-диагностически значимую разницу: при туберкулезе значительно увеличено число биосинтезирующих (45,4%), а при саркоидозе - секретирующих (57,2%) Мф. Выявленные различия статистически достоверны (р<0,01) {табл. 4).

Таблица 3

Цитограмма жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных туберкулезом и саркоидозом

Группы обследованных Число обследованных (абс.) Клеточные элементы (%)

макрофаги лимфоциты нейтрофи-лы эозинофи-лы

Диссеминирован-ный туберкулез 49 68,4±6,6 26,5±6,3 5,3±3,2 1,3

Саркоидоз ВГЛУ и легких 45 55,5±7,4 40,3±7,3 3,3±2,6 0,9

г = 1,3 Р<95% р > 0,05 х =1,4 Р<95% р > 0,05 1 = 0,48 Р < 95% р > 0,05

Таблица 4

Макрофагальная формула жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных туберкулезом и саркоидозом

Группы обследованных Число обследованных (абс.) Макрофаги (%)

бносинтези-рующие фагоцитирующие секретирую-щие

Диссеминированный туберкулез 49 45,4±7,1 42,1±7,0 12,5±4,7

Саркоидоз ВГЛУ и легких 45 7,9±4,0 34,9±7,1 57ДЬ7,3

г =4,6 Р > 99% р < 0,01 1 =0,7 Р < 95% р > 0,05 1 =5,2 Р > 99% Р<0,01

Также высоко достоверной оказалась разница результатов цитохимического исследования Мф жидкости БАЛ у больных туберкулезом и саркоидозом, при туберкулезе в Мф повышено содержание КФ, а при сар-коидозе-

Таблица 5

Результат цитохимического исследования макрофагов жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных туберкулезом и саркоидозом

Группы обследованных Число обследованных (абс.) Активность ферментов (усл.ед.)

кислая фосфатаза сукцинатдегндрогена-за

Диссеминировашшй туберкулез 17 253,4±3,8 42,1 ±7,0 75,5±2,1

Саркоидоз 24 191,4±2,1 34,9±7,1 139,0±2,4

1 =3,3 Р>99% р< 0,01 1 = 19,8 Р>99% р < 0,01

Из вышеизложенного следует, что основным цитологически выявляемым отличием саркоидоза и туберкулеза являются морфологические и функциональные особенности Мф: преобладание молодых фагоцитирующих (биосинтезирующих) Мф с высоким содержанием КФ при туберкулезе и секретирующих, с высоким содержанием СДГ, при саркоидозе. Число зрелых фагоцитирующих Мф при саркоидозе также несколько снижено, однако разница недостоверна Кроме того, при саркоидозе, осо-

бенно его прогрессирующем течении, встречались своеобразные вакуоли-зированные Мф с мельчайшими светопреломляющими включениями. Электронно-микроскопическое исследование расшифровывает их как сек-ретирующие Мф в состоянии деструкции с многочисленными включениями, представляющими собой разнообразные формы дефектных по клеточной стенке микроорганизмов (Ь-формы), часть из которых в процессе почкования.

В.С. Пауков и соавт. (2002) обнаружили в эпитслиоидных клетках больных саркоидозом скопления ультрамелких кокков (0,1-0,15 мкм).

Еще в 1982 г. О.Л. Уварова и соавт. писали: «Не исключено, что необнаруженным возбудителем саркоидоза являются измененные МБТ пер-систирующие в эпителиоидных и макрофагальных клетках гранулемы, неспособных к завершенному фагоцитозу». Д. Митчелл и соавт. (1981) и другие исследователи сообщили о фильтрующемся агенте, вызывающем сар-коидоз. Широко известны работы А.Г.Хоменко и соавт. (1987, 1996 и др.), касающиеся выявления измененных форм МБТ при саркоидозе.

О ведущей роли Мф в патогенезе саркоидоза свидетельствуют исследования В. Роховски (1989). Клетки жидкости БАЛ больных саркоидо-зом были разделены на фракции: Мф и Лц; при введении больному (по принципу пробы Квейма) фракции Мф, через 6 недель получали положительную реакцию (саркоидную гранулему в месте введения), при введении фракции Лц результат был отрицательный. Кроме того, при культивировании альвеолярных Мф больных саркоидозом отмечен спонтанный рост без стимуляции и спонтанное выделение интерлейкинов.

I.Barth и соавт. (1990) и S.Kunkel и соавт. (1996) также сообщают о выделении цитокинов Мф больных активным саркоидозом без дополнительной стимуляции, что они связывают с персистирующим в них неизвестным агентом.

Возможно длительное персистирование мельчайшего слабовирулентного агента внутри Мф стимулирует их активную секрецию и поддерживает гранулематозную реакцию.

Обнаруженные нами в Мф жидкости БАЛ больных саркоидозом внутриклеточные включения, некоторые из которых были в фазе почкования, могут претендовать на роль искомого возбудителя саркоидоза. Его малая величина, расположение внутри цитоплазмы Мф, отсутствие бактериальной стенки и наличие нескольких билипидных мембран вокруг части включений затрудняют выделение этого возбудителя не только при рутин-

ных микробиологических исследованиях, но, по-видимому, и при использовании молекулярно-биологических методик.

Основное отличие L-форм от типичных микобактерий - дефектность или полное отсутствие клеточной стенки: они окружены одним или несколькими слоями цитоплазматической мембраны. А если нет клеточной стенки, то нет и характерных для микобактерий рецепторов - отсюда и негативная реакция на пробу Манту при саркоидозе. Отрицательная туберкулиновая проба описана З.С. Земсковой и И.Р. Дорожковой (1984) и у мышей, зараженных стабильными L-формами, полученными от больных туберкулезом.

Нет клеточной стенки — неэффективна антибактериальная терапия, так как большинство препаратов воздействуют именно на клеточную стенку микобактерий, поэтому так медленно и плохо поддаются лечению больные туберкулезом с преобладанием L-форм МБТ (в частности, больные с туберкулемами, при которых отмечено почти 100% выделение L-форм МБТ [Кязимова Л.Г., 1986].

Своеобразно и взаимоотношение измененной микобактерий с организмом хозяина. При туберкулезе попадание МБТ в ее типичной бактериальной форме в организм хозяина вызывает, в первую очередь, неспецифическую реакцию защиты - реакцию Нф, мигрирующих в очаг и фагоцитирующих микробы; затем, если Нф не справляются с задачей, рекрутируются Мф и далее раскручивается каскад иммунологических реакций.

При саркоидозе типичного бактериального агента нет, поэтому нет необходимости в активной реакции фагоцитоза, следовательно, нет Нф, а в Мф отсутствует фактор, вызывающий миграцию Нф. Значительно снижено число фагоцитирующих Мф, особенно их молодых форм (биосинтези-рующие Мф), зато резко увеличено число сскретирующих Мф. Однако, существует маловирулентный патоген внутри или вне клетки, выделяющий определенные вещества и стимулирующий защитную реакцию, несколько сходную с реакцией организма на маловирулентные органические

или неорганические частицы путем образования гранулем. Но при саркои-дозе возбудитель сложен и неоднороден, обладая высокой пластичностью и малым размером, он может, проникая в Мф, быстро в них размножаться и распространяться по организму с током крови, оседая в мельчайших сосудах, сначала в органах-фильтрах: селезенке и лимфатических узлах, а затем и в других органах.

Патоген при саркоидозе обладает определенными аллергизирующи-ми способностями, что также сближает его с Ь-формами микобактерий. Возбудитель саркоидоза, также как и МВТ, остается персистировать в организме (возможно, внутриклеточно), что, при определенных обстоятельствах, приводит к рецидивам болезни и/или ее прогрессирующему течению. Как правило, именно при прогрессирующем саркоидозе мы наблюдали наибольшее количество вакуолизированных Мф. При прогрессирующем саркоидозе часть Ь-трансформированных микобактерий может реверсировать в кислотоустойчивую форму зернистых или палочковидных ми-кобактерий, но остается по-прежнему маловирулентной. В условиях реверсии у больных прогрессирующим саркоидозом могут появиться Нф и био-синтезирующие Мф, но обычно процесс остается продуктивным, типичный прогрессирующий туберкулез развивается очень редко.

Скорее всего, в патогенезе саркоидоза, кроме строения самого патогена, большую роль играют и какие-то иммунобиологические особенности макроорганизма. А какие - это еще предстоит выяснить иммунологам, биохимикам, морфологам. Использование цитологического метода исследования, особенно вместе с электронной микроскопией, бактериоскопией и цитохимией, помогают не только подтвердить диагноз саркоидоза и определить его фазу, а иногда и прогноз, но и помочь разобраться в его этиопа-тогенезе. А глубокое понимание этиопатогенеза приведет к более осмысленному подходу к медикаментозной терапии - поиску новых препаратов и методов лечения.

Цитология альвеолитов и редких гранулематозов. Внедрение в практику метода внутрилегочной биопсии и, особенно, БАЛ дало возможность цитологам диагностировать некоторые, недоступные ранее, интер-стициальные, гранулематозные и редкие заболевания.

Возможности клинической цитологии в диагностике этих болезней разные: от уверенного диагноза при альвеолярном протеинозе и идиопати-ческом гемосидерозе легких до скромного предположительного при идио-патическом фиброзирующем альвеолите.

Для экзогенного аллергического альвеолита характерно: повышение вязкости жидкости БАЛ, высокий цитоз (0,3-0,6x106), лимфоцитарный тип цитограммы, увеличение числа Эф (5% - 36%), иногда Нф (1% - 28%), постоянное присутствие лаброцитов (2% - 6%) с высоким содержанием КФ, МП и СДГ. Среди альвеолярных Мф с выраженной фагоцитарной функцией встречаются гистиоцитоподобные клетки.

При идиопатическом фиброзирующем альвеолите - нейтрофильный тип цитограммы, в гранулоцитах - низкая активность МП. Десквамативная пневмония отличается очень высоким цитозом среди альвеоляр-

ных Мф обнаруживаются клетки альвеолярного эпителия.

При гистиоцитозе X цитограмма носит макрофагально-гистиоцитарный характер с обязательным присутствием Эф, среди альвеолярных Мф встречаются эритрофаги, липофаги, гемосидерофаги и крупные, светлые, нефагоцитирующие клетки с подчеркнутым контуром ядра (клетки Лангерганса).

Окончательная верификация клеток Лангерганса возможна лишь при электронно-микроскопическом исследовании.

Для альвеолярного протеиноза характерен лимфоцитарный тип ци-тограммы и большие скопления аморфных, глыбчатых ШИК-положительных масс.

Идеопатический гемосидероз легких отличается нейтрофильно-макрофагальным типом цитограммы, патогномоничными являются значи-

тельные скопления золотисто-коричневого пигмента гемосидерина внутри и вне клеток; положительная реакция Перлса.

Выводы

1. Комплексное клшгако-лабораторное исследование, включающее клинический анализ заболевания, цитологию, цитохимию, микробиологию и электронную микроскопию, является высокоинформативным способом диагностики и определения активности диссеминированного туберкулеза и других гранулематозов легких и помогает в изучении их патогенеза.

2. Использование цитоморфологического подхода к изучению возбудителя туберкулеза с применением традиционных и цитологических методов окраски позволило выявить различные формы изменчивости ми-кобактерий туберкулеза, в том числе и лишенные клеточной стенки формы) непосредственно в диагностическом материале, что повышает эффективность диагностики туберкулеза, а также проследить формы последовательного морфогенеза микобактерий в процессе роста и подтвердить наличие у них факультативного цикла развития.

3. Вегетирование в организме разных морфологических вариантов микобактерий туберкулеза сопровождается различными клеточными реакциями: при доминировании палочковидных микобактерий туберкулеза отмечена выраженная нейтрофильная реакция, казеозные массы и биосинте-зирующие макрофаги, в то время как эпителиоидные и гигантские клетки Пирогова-Лангганса выявляются в небольшом количестве; преобладание в материале L-форм МБТ характеризуется увеличением числа лимфоцитов, секретирующих макрофагов, эпителиоидных и гигантских клеток Пирого-ва-Лангганса, появлением плазмоцитов и эозинофилов.

4. При комплексном цитологическом исследовании жидкости

бронхоальвеолярного лаважа установлено, что для активного туберкулеза,

независимо от формы процесса, патогномоничным является увеличение

числа молодых биосинтезирующих фор 0%), воз-

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ бЧЬДиОТЕКА

растание числа секретирующих макрофагов (16,8%), увеличение индекса ферментативной активности кислой фосфатазы (253,4 усл.ед.). Цитограмма бронхоальвеолярного лаважа имеет макрофагальный, лимфоцитарный, нейтрофильный или смешанный характер, тип цитограммы зависит от активности процесса и формы вегетирования возбудителя. В процессе лечения сначала нормализуется цитограмма, постепенно восстанавливается субпопуляционный состав макрофагов; в то время как при неэффективном лечении число биосгаггезирующих макрофагов остается высоким.

5. В ранние сроки (3 месяца) экспериментального саркоидоза, вызванного введением материала от больных саркоидозом, выявлена лимфо-идно-макрофагальная клеточная реакция, среди макрофагальных элементов преобладали моноциты и секретирующие макрофаги; бактериоскопи-чески в ряде наблюдений обнаружены кислотоустойчивые зерна микобак-терий и их L-формы. Через 6 месяцев преобладают макрофагально-эпителиоидноклеточные скопления, секретирующие и вакуолизированные макрофаги. Микобактерии и их L-формы не выявлены.

6. Комплексное цитологическое исследование жидкости бронхо-альвеолярного лаважа показало, что для активного саркоидоза, независимо от формы, характерно преобладание секретирующих макрофагов (57,2%), присутствие вакуолизированных макрофагов со светопреломляющими включениями, низкий индекс ферментативной активности кислой фосфа-тазы (191,4 усл.ед.) и высокий индекс сукцинатдегидрогеназы (139,0 усл.ед.). Цитограмма носит макрофагальный или лимфоцитарный характер и отражает фазу процесса. При лечении отмечена нормализация цитограм-мы и очень медленное уменьшение числа секретирующих макрофагов. При прогрессировании саркоидоза появляются биосинтезирующие макрофаги.

7. По материалу бронхоальвеолярного лаважа определены цитологические особенности альвеолитов: для экзогенного аллергического альве-олита характерны лимфоцитарный или смешанный характер цитограммы,

повышение числа эозинофилов, присутствие тучных клеток; идиопатиче-ского фиброзирующего альвеолита - нейтрофильный характер цитограм-мы, низкое содержание миелопероксидазы в нейтрофилах бронхоальвео-лярного лаважа, при десквамативном варианте - наличие альвеолоцитов II типа.

8. Редкие гранулематозы легких отличаются следующими цитологическими характеристиками: гистиоцитоз X - пестрый клеточный состав цитограммы бронхоальвеолярного лаважа: макрофаги, лимфоциты, ней-трофилы, эозинофилы, среди макрофагов встречаются эритрофаги, липо-фаги, клетки Лангерганса, в которых при электронной микроскопии определяются Х-тельца; альвеолярный протеиноз — наличие глыбок ШИК-положительного неклеточного вещества; идиопатический гемосидероз легких - большие скопления гемосидерина внутри и вне клеточных элементов, положительная реакция Перльса.

Практические рекомендации

1. Цитологическое исследование различного патологического материала рекомендуется широко использовать во фтизиатрии с целью диагностики, дифференциальной диагностики и определения активности туберкулеза.

2. Цитологическое исследование позволяет обнаружить измененные, лишенные клеточной стенки (Ь-трансформированные) варианты ми-кобактерий туберкулеза, которые представляют собой некислотоустойчивые округлые безъядерные образования голубовато-синего цвета размером 4-7 мкм. Обнаружение цитологом подобных образований в исследуемом материале помогает установить диагноз туберкулеза и при не вполне типичной клеточной реакции.

3. При туберкулезе внутригрудных лимфатических узлов наиболее информативен материал браш-биопсии; характерным для этой формы туберкулеза, кроме клеток специфической гранулемы, являются лимфоид-

ные элементы, плазматические клетки и Ь-формы микобактерий туберкулеза.

4. При туберкулемах наиболее информативна катетер-биопсия, в материале которой, кроме клеток туберкулезной гранулемы, часто присутствуют казеозные массы и Ь-формы микобактерий туберкулеза.

5. В целях диагностики и дифференциальной диагностики диссе-минированных процессов в легких, необходимо использовать цитологическое исследование жидкости бронхоальвеолярного лаважа.

6. Для дифференцировки туберкулеза и саркоидоза, кроме цито-граммы желательно подсчитывать макрофагальную формулу: увеличение числа биосинтезирующих макрофагов (более 35,0%) свидетельствует об активной фазе туберкулеза, а значительное преобладание секретирующих макрофагов (более 57,2%) - об активном саркоидозе (иногда при одинаковых изменениях цитограммы или нормальной цитограмме бронхоальвео-лярного лаважа).

7. Комплексное цитологическое исследование жидкости бронхо-альвеолярного лаважа с использованием цитологического метода, вместе с цитохимией и электронной микроскопией позволяет помочь в диагностике альвеолитов и некоторых редких заболеваний легких.

Цитологические особенности некоторых бронхолегочных болезней отражены в таблице б.

Таблица 6

Цитологические признаки бронхолегочных заболеваний

Нозологические формы Материал - Цитологические призпаки

Туберкулез: экссудативная фаза Мокрота, мазки-отпечатки, экссудаты Казеозные или гнойно-некротические массы, распадающиеся нейтро-филы; немного лимфоцитов и эпите-лиоидных клеток. МБТ* Ь-формы МБТ

Бронхо-альвеолярный лаваж Смешанный тип цитограммы, лимфоцитов - 9%-12%, нейтрофилов 8%-27% среди макрофагов преобладают биосинтезирующие (>35%) и фагоцитирующие клетки

продуктивная фаза Мокрота, мазки-отпечатки, экссудаты Значительное число лимфоцитов, мо-ноцитоидные, эпителиоидные и гигантские клетки Пирогова-Ланхганса, немного нейтрофилов, плазмоциты. МБТ± Ь-формы МБТ*

Бронхо-альвеолярный лаваж Лимфоцитный тип цитограммы (25%-60%),среди макрофагов преобладают и секреторные и биосинтезирующие клетки (>35%).

Саркоидоз Мазки-отпечатки Мономорфная цитологическая картина: округлые эпителиоидные клетки, изредка гигантские клетки "инородного тела", лимфоциты, отсутствуют нейтрофилы и некроз.

Бронхо-альвеолярный лаваж Лимфоцитарный тип цитограммы (30%-70%), среди макрофагов преобладают секреторные макрофаги; встречаются вакуолизировашше макрофаги.

Экзогенный аллергический альвеолит Бронхо-альвеолярный лаваж Лимфоцитарный тип цитограммы (16%-60%), наличие эозинофилов и тучных клеток.

Идиопатический фиброзирующий альвеолит Бронхо-альвеолярный лаваж Нейтрофильный тип цито граммы (39%-64%), высокий цитоз бронхо-альвеолярного лаважа, присутствие альвеолоцитов.

Альвеолярный про-теиноз Бронхо-альвеолярный лаваж Присутствие неклеточных ШИК-положительных масс, мало клеточных элементов (макрофаги и лимфоциты).

Идиопатический гемосидероз легких Бронхо-альвеолярный лаваж Множественные включения гемоси-дерина в клетках, положительная реакция Перльса.

Гястиоцитоз X Бронхо-альвеолярный лаваж Пестрота клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа: лимфоциты, эозинофилы, среди макрофагов встречаются эритрофаги, ли-пофаги, гемосидерофаги; крупные нефагоцитирующие клетки с подчеркнутым контуром ядра (КЛ).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ерохин В.В., Николаева Г.М., Филиппенко Л.Н. Возможности использования цитологического анализа бронхоальвеолярного лаважа у больных туберкулезом легких. // В сб.: Организация противотуберкулезной пульмонологической помощи населению Молдавской ССР. - М. - 1985. -с. 130-134.

2. Николаева Г.М. Цитологическая диагностика туберкулеза. // Тезисы докладов научно-практической конференции фтизиатров Москвы. - М - 1972. - с. 25-26.

3. Николаева Г.М. Задачи и возможности клинической цитологии по фтизиатрии. // Тезисы докладов ГХ научно-практической конференции фтизиатров г. Москвы. - М. — 1976. - с. 72-74.

4. Николаева Г.М., Лавренова В.Н. Информативность клинической цитологии при бронхологическом исследовании больных туберкулезом легких и бронхов. // Пробл. туб. - 1977. - № 12. - с. 37-42.

5. Лавренова В.Н., Николаева Г.М., Паштова Г.М., Иткина Р.К. К вопросу о клинике и диагностике туберкулеза внутригрудных узлов у взрослых. // Тезисы докладов научно-практической конференции фтизиатров г. Москвы. — М. - 1977. - с. 45-48.

6. Хоменко А.Г., Ерохин В.В., Николаева Г.М., Филиппенко Л.Н., Лавренова В.Н. Бронхоальвеолярный лаваж в клинике туберкулеза легких. // Пробл. туб. - 1984. - № 1. - с. 34-40.

7. Николаева Г.М., Филиппенко Л.Н. Возможности цитологического анализа БАЛ для диагностики диссеминированных заболеваний легких. // В сб.: Новые методы диагностики и реабилитации больных НЗЛ. -Барнаул. - 1985. - с. 28-29.

8. Филиппенко Л.Н., Николаева Г.М. Макрофагальные элементы БАЛ в оценке течения туберкулеза легких (клинико-экспериментальное исследование). // В кн.: Морфологические аспекты механизмов легких при туберкулезе и ХНЗЛ. - Свердловск. -1985. - с. 36-37.

9. Николаева Г.М., Евгущенко Г.В., Тимашева Л.Ю. Цитологические и цитохимические особенности клеток БАЛ при туберкулезе. // X Всесоюзный съезд фтизиатров. — Киев. - 1986. - 747 с.

10. Уварова О.А., Гедымин Л.Е., Николаева Г.М. Морфологическая диагностика диссеминированного туберкулеза и других диссеминиро-ванных заболеваний легких. //В сб.: X Всесоюзный съезд фтизиатров. -Киев.-1986.-с. 111.

11. Уварова О.А., Ерохин B.B., Гедымин Л.Е., Николаева Г.М. Морфологические особенности некоторых диссеминированных поражений легких и их дифференциально-диагностическое значение. // В кн.: Дифференциальная диагностика заболеваний легких. - Л. - 1986. - с. 126-131.

12. Хоменко А.Г. (титул.ред.). Диагностический бронхоальвеоляр-ный лаваж // Методич.рекомендации. - М. - 1986. - с. 20.

13. Николаева Г.М. Методика подготовки материала бронхоальве-олярного лаважа для цитологического и цитохимического исследования. // Лаб. дело. -1988. - № 3. - с. 59-61.

14. Николаева Г.М., Дорожкова И.Р. Морфология измененных форм микобактерий туберкулеза. // Пробл. туб. - 1988. - № 4. - с. 57-59.

15. Николаева Г.М., Дорожкова И.Р. Морфофункциональное состояние клеточных элементов туберкулезного воспаления при Ь-трансформации возбудителя. // В сб.: Функциональная морфология легких при туберкулезе и других заболеваниях. - М. - 1988. - с. 52-54.

16. Николаева Г.М., Дорожкова И.Р., Болотов П.А. Дифференциальная диагностика саркоидоза и диссеминированного туберкулеза по данным цитологического и бактериологического изучения БАС. //В кн.: Диагностический бронхоальвеолярный лаваж. - М. — 1988. - с. 104-108.

17. Николаева Г.М., Дорожкова И.Р. Клиническое цитологическое и бактериологическое исследование жидкости бронхоальвеолярного лава-жа в целях дифференциальной диагностики саркоидоза и диссеминированного туберкулеза легких. // Пробл. туб. - 1989. - № 3. - с. 33-36.

18. Дорожкова И.Р., Николаева Г.М. Ускоренная лабораторная диагностика изменешгых микобактерий. // Тез. докл.: X съезд фтизиатров Белоруссии. - Минск. - 1989. - с. 211.

19. Филиппенко Л.Н., Николаева Г.М., Ловачева О.В. Цитологическая диагностика активного туберкулеза легких по макрофагалыюму спектру бронхоальвеолярного лаважа. // Тез. докл.: X съезд фтизиатров Белоруссии. - Минск. - 1989. - с. 154.

20. Николаева Г.М. Цитологическая диагностика диссеминиро-ванных процессов в легких. // В сб.: Дифференциальная диагностика туберкулеза и других диссеминированных процессов в легких. - Свердловск. -1990.-с. 35-36.

21. Николаева Г.М., Филиппенко Л.Н. Цитологическая диагностика гистиоцитоза X по материалу бронхоальвеолярного лаважа. // Лаб. дело. -1991.-№3.

22. Николаева Г.М. Цитологическая диагностика туберкулеза и других гранулематозов легких. // В кн.: Сборник-резюме I (XI) съезда фтизиатров. - С.-Петербург. - 1992. - с. 233.

23. Ерохин В.В., Лепеха Л.Н., Гедымин Л.Е., Николаева Г.М. Особенности макрофагальной реакции при некоторых гранулематозных заболеваниях легких. // Пульмология. -1992. - № 4. - с. 39-47.

24. Николаева Г.М., Авдонина Л.Н. Клеточные реакции при заражении различными видами микобактерий в эксперименте. // Пробл. туб. -1993.- №6.

25. Николаева Г.М., Голышевская В.И., Пузанов В.А. Метод выявления форм микобактерий туберкулеза в периферической крови // Материалы научно-практической конференции. - Пермь. - 1993. - с. 91-92.

26. Ерохин В.В., Гедымин Л.Е., Николаева Г.М., Лепеха Л.Н. Морфологическая диагностика легочных гранулематозов. - В сб.: Диффузные и гранулематозные поражения легких. - М. —1993. - т. ЬУШ. - с. 82-91.

27. Николаева Г.М. Цитологическая характеристика различных форм и фаз туберкулеза. //В сб.: II (XII) съезд врачей-фтизиатров. - Саратов. - 1994. - с. 286.

28. Лепеха Л.Н., Ерохин В.В., Николаева Г.М., Гедымин Л.Е. Диагностическая оценка гетерогенности альвеолярных макрофагов при некоторых гранулематозных заболеваниях легких. - // II (XII) Съезд врачей-фтизиатров:- Саратов. - 1994. - с. 298.

29. Пузанов В.А., Николаева Г.М. Тинкториальные особенности микобактерий при использовании стандартных и нетрадиционных методов окраски. // Пробл. туб. - 1994. - № 1. - с. 31-35.

30. Николаева Г.М. Новые подходы к лабораторной диагностике туберкулеза. // Клиническая лабораторная диагностика. — 1995. - № 6. - с. 107-108.

31. Николаева Г.М., Лепеха Л.Н. Роль макрофагалышх элементов бронхоальвеолярного лаважа в диагностике саркоидоза и туберкулеза. // В сб.: 5 Национальный конгресс по болезням органов дыхания. Пульмонология. Приложение- 1995.- № 1100.

32. Дорожкова И.Р., Николаева Г.М. Микобактериальная популяция при персистированки и проявлениях болезни. //В кн.: Молекулярные основы патогенеза и диагностики туберкулеза и другой легочной патологии. - М. - 1995. - с. 13-14.

33. Пузанов В.А., Николаева Г.М. Состояние микобактериальной популяции в ранние сроки экспериментального туберкулеза. // Пробл. туб. -1995.-№2.-с. 55.

34. Николаева Г.М. Особенности морфологии измененных форм М. tuberculosis in vitro и in vivo. // Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М. - 1997. -Т.Н.

35. Николаева Г.М. Цитологическая диагностика туберкулеза, вызванного измененными формами туберкулеза //В сб.: П съезд ассоциации клинических цитологов. Новости клинической цитологии России. Приложение. - Воронеж. -1997.

36. Белянин И.И., Николаева Г.М., Мартынова Л.П. Воздействие растворенного озона на альвеолярные макрофаги и микобактерии туберкулеза. // Пробл. туб. - 1997. - № 1. - с 54-57.

37. Лепеха Л.Н., Николаева Г.М., Ануфриева Н.В., Мартынова Л.П. Роль макрофагальной формулы бронхоальвеолярного лаважа в оценке эффективности химиотерапии экспериментального туберкулеза. // В сб.: Ш Съезд научно-медицинской ассоциации фтизиатров. - Екатеринбург. -1997.-с. 109.

38. Пузанов В.Л., Голышевская В.И., Корнеев А.А., Николаева Г.М., Мишин В.Ю., Овсянкина Е.С., Лемешко М.В., Воронина Г.А., Шига-рева Э.В., Назарычева А.В. Бактериологическая диагностика туберкулеза, адекватное решение в условиях изменчивости микроорганизмов. // Congre-sul IV al igicnistitor, epidemiologilor, microbiologilor si parazitogilor din. -Rep. Moldava, Teze. - 1997. - v. 26. -p. 134-135.

39. Терешин B.C., Николаева Г.М. Влияние изменчивости М. tuberculosis на клиническое течение деструктивного туберкулеза. // Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. — М. - 1997. - Т. II. —326 с.

40. Николаева Г.М., Лепеха Л.Н. Цитология бронхоальвеолярного лаважа при редких диссеминированных процессах в легких. // В сб.: VIII национальный конгресс по болезням органов дыхания. - 1998. - 147 с.

41. Лепеха Л.Н., Николаева Г.М., Ануфриева Н.В., Лавренова В.Н. Оценка эффективности специфической химиотерапии туберкулеза легких по макрофагальной формуле бронхоальвеолярного лаважа. // В сб.: VIII Национальный конгресс по болезням органов дыхания. - 1998: -167 с.

42. Николаева Г.М., Лепеха Л.Н. Особенности цитологии при редких диссеминированных заболеваниях легких. //В кн.: Актуальные проблемы пульмонологии. Чучалин А.Г. (титул, ред.). - М. — 2000. - с. 543550.

43. Черноусова Л.Н., Николаева Г.М., Смирнова Т.Г. и др. Определение содержания ДНК микобактерий в диагностическом материале от больных туберкулезом легких в процессе химиотерапии. // В кн.: Генодиагностика в современной медицине. - М. — 2000. - с. 291-292.

44. Николаева Г.М. Диагностические возможности клинической цитологии во фтизиатрии. // В кн.: Научные труды к 75-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г. Москвы. - М. - 2001. - с. 273-275.

45. Николаева Г.М. Цитологические исследования при бронхоле-гочной патологии. // В кн.: Лабораторная диагностика туберкулеза. - М. — 2001.-С. 144-148.

46. Лавренова В.Н., Николаева Г.М., Кузьмин Д.Е. Роль бронхоло-гического и цитологического методов в диагностике туберкулеза внутри-грудных лимфоузлов у взрослых. //11 Национальный конгресс по болезням органов дыхания. - М. - 2001. - с. 339.

47. Трусов В.Н., Космиади ГА, Николаева Г.М., Воробьев А.А., Тарасенко Т.Л. Миграция CD4 и CD8 лимфоцитов во внутреннюю выстилку туберкулезной эмпиемы плевры и туберкулезной каверны при их локальной санации // Пробл.туб. - 2002. - № 6. - с 33-37.

48. Николаева Г.М., Кузьмин Д.Е., Лавренова В.Н., Ловачева О.В. Эндоскопическая и цитологическая картина воспалепия при туберкулезе и других бронхолегочных инфекциях. // В кн.: Туберкулез сегодня - материалы VII Российского съезда фтизиатров. — М. — 2003. — с. 314.

49. Гедымин Л.Е., Ерохин В.В., Лепеха Л.Н., Николаева Г.М., Каминская В.П., Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Бабаянц А.А. Влияние иммуно-модуляторов лейкенферона на течение экспериментального туберкулеза // Пробл.туб. - 2003. - № 1. - с. 45-52.

50. Belyanin I, Nikolaeva G. Activation of alveolar macrophages in experimental tuberculosis. Annual Congress Stockgolm // Evr. Respir. J. - 1996. -v.9.-23.-241 p.

51. Khomenko A., Colyshevskaja V., Puzanov V., Nikolayeva G., Mishin V., Korneev A., Grushina Т., Safonova S., Katargin N. // Mycobacterie-mia and possibilities for its diagnosis. - Tybercle and Lung Disease. - 1996. - v. 77.-111 p.

Подписано в печать 16.062004 г. Формат 60x90,1/16. Объем 2.75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №229

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Русаковская, д.1. т. 264-30-73 www.blok01centre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, переплет диссертаций.

»15218

Диссертационная работа является итогом более чем 35-летней работы во фтизиатрии в качестве врача-цитолога и 20-летних научных исследований в патоморфологической и микробиологической лабораториях Центрального научно-исследовательского института туберкулеза РАМН.

Актуальность проблемы. Проблема патогенеза, диагностики и дифференциальной диагностики диссеминированного туберкулеза и других диссеминированных процессов в легких является одной из сложнейших во фтизиатрии и пульмонологии. Диагностические ошибки составляют 75,0% - 82,0% [Мотус И.Я., 1998; Садовникова A.A. и др., 2001; Шмелев Е.И., 2002].

За последние годы развитие эпидемиологической ситуации по туберкулезу в России расценивается как угроза эпидемии [Литвинов В.И., Сельцовский П.П., 2000; Левашов Ю.Н. и др., 2001]. Растет не только заболеваемость, но и смертность, причем среди лиц, умерших от неди-агностированного при жизни туберкулеза, - диссеминированные формы являются преобладающими [Соловьева И.П., 1999; Хоменко А.Г. и др., 1999; Андрюхина Г.Я., Сон И.М., 2000; Заратьянц О.В. и др., 2001].

Быстрая и точная диагностика является «краеугольным камнем» глобальной стратегии по контролю за туберкулезом [Perkuns М., 2000; Hale Y. et al., 2001].

Нехарактерность, в ряде случаев, клинико-рентгенологической картины, отсутствие микобактерий туберкулеза, нормергические или даже отрицательные туберкулиновые пробы приводят к затруднениям при диагностике туберкулеза или определении активности процесса. Наибольшие трудности возникают при дифференциальной диагностике туберкулеза с саркоидозом и некоторыми другими диссеминированны-ми процессами в легких [Радапов Р., Керамидчева В., 1985; Озерова Л.В., 1996; Хоменко А.Г., 1997; Bahn J. et al., 2001].

К тому же отмечен рост числа больных саркоидозом, диагностические ошибки при этом заболевании составляют 50,5% [Борисов С.Е., 1997; Гармаш Ю.Ю., 2001, 2003].

Различные аллергические и интерстициальные болезни легких, в прошлом считавшиеся редкой патологией, в современной клинической практике встречаются довольно часто [Чучалин А.Г., 2000].

Все вышеизложенное свидетельствует о том, что проблема диагностики и дифференциальной диагностики диссеминированных заболеваний легких остается актуальной. Ведется поиск новых различных специальных методов исследования, одним из которых является морфологическая верификация природы процесса. До недавнего времени основным видом морфологической верификации при диссеминированных процессах являлось гистологическое исследование легочной ткани, полученной при открытой биопсии легкого, что требовало помещения больного в специализированное хирургическое отделение и, как всякое оперативное вмешательство, имело определенную долю риска и было связано с опасностью возникновения осложнений. С развитием бронхо-логии, для этих же целей, стали широко использовать цитологическое изучение пунктатов лимфоузлов и соскобов со слизистой оболочки бронха, что давало хорошие результаты в диагностике саркоидоза и некоторых диссеминаций злокачественного генеза в легких. Разработка методов чрезбронхиальной биопсии легких, с цитологическим и гистологическим изучением полученного материала, еще более расширило возможности морфологической верификации природы патологического процесса [Филиппов В.П. и др., 1997; Степанян И.Э. и др., 2001]. Однако, получение материала из очень ограниченного участка легкого не всегда позволяет установить сущность патологического процесса; из-за малого количества материала невозможно использовать различные дополнительные цитохимические и электронно-микроскопические методики; и, наконец, существует какой-то процент осложнений - все это создает предел возможностей и для этого метода. К тому же, гистологическое исследование не всегда может помочь в дифференциальной диагностике гранулематозов [Казак Т.И., 2002].

Разработка и внедрение в практику метода бронхоальвеолярного лаважа в корне изменило роль цитологического метода в диагностике различных диссеминированных заболеваний легких.

Впервые возникла возможность получать материал из глубоких отделов легких, с большой площади альвеол и бронхиол в достаточном количестве и, практически, без осложнений. Малая травматичность и доступность метода дает возможность производить бронхоальвеолярный лаваж повторно и изучать популяции клеточных элементов дистальных отделов легких до и после лечения. Все это может оказать существенную помощь не только в установлении диагноза, но и в изучении патогенеза различных заболеваний. Настала необходимость пересмотреть и определить роль клинической цитологии в изучении патогенеза, в диагностике и дифференциальной диагностике различных диссеминированных процессов в легких.

К настоящему времени достаточно хорошо изучены цитограммы бронхоальвеолярного лаважа при разных формах и разной степени активности саркоидоза, при экзогенном аллергическом и идиопатическом фиброзирующем альвеолитах, пневмокониозах и некоторых «редких» заболеваниях легких.

Однако, подавляющее большинство исследований проведено на светооптическом уровне изучения клеточных элементов бронхоальвеолярного лаважа. В единичных случаях применены электронно-микроскопические и цитохимические методики. К настоящему времени отсутствуют работы по изучению клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа с применением комплекса (светооптического, цитохимического и электронно-микроскопического) методов исследования, что позволило бы оценить как морфологические, так и функциональные особенности всех клеток бронхоальвеолярного лаважа, и их изменения на разных этапах развития болезни.

Не изучена возможность практического использования цитологического изучения клеточных элементов бронхоальвеолярного лаважа при туберкулезе: особенности морфофункционального состояния клеток при активном и неактивном туберкулезе, его разных морфологических формах, изменения клеток бронхоальвеолярного лаважа при лечении и т.д. Нет четких цитологических критериев отличия диссеминированного туберкулеза и саркоидоза.

Известна важная роль измененных (дефектных по клеточной стенке) вариантов микобактерий туберкулеза в патогенезе туберкулеза, однако отсутствие методов окраски Ь-форм микобактерий туберкулеза не позволяет выявлять их непосредственно в патологическом материале.

Цель исследования: повышение эффективности диагностики и дифференциальной диагностики диссеминированного туберкулеза и других гранулематозов легких на основе изучения механизмов патогенеза с помощью комплексного цитологического исследования.

Для достижения поставленной цели определены основные задачи.

1. Выяснить возможности использования цитологического метода исследования в выявлении Ь-трансформированных вариантов микобактерий туберкулеза.

2. Определить клеточные реакции макроорганизма на вегети-рование типичных и измененных микобактерий туберкулеза в эксперименте и клинике.

3. Изучить клеточный состав браш-биопсий, цитограммы жидкости бронхоальвеолярного лаважа и морфофункциональные особенности макрофагальных элементов при диссеминированном и других формах туберкулеза легких, внутригрудных лимфатических узлов и плевры до и на фоне лечения.

4. Изучить цитологические особенности экспериментального саркоидоза, в разные сроки после заражения экспериментальных животных.

5. Охарактеризовать цитологический состав материала чрез-бронхиальной биопсии легких, пунктата внутригрудных лимфатических узлов и жидкости бронхоальвеолярного лаважа у больных на разных стадиях и при различном течении саркоидоза до и после лечения. Изучить цитологические и цитохимические свойства макрофагов при сар-коидозе.

6. Определить состав и функциональные особенности клеток жидкости бронхоальвеолярного лаважа у больных альвеолитами, гис-тиоцитозом X, альвеолярным протеинозом и идиопатическим гемосиде-розом легких.

Научная новизна работы. Впервые использован комплекс лабораторных методов (цитология, микробиология, цитохимия и электронная микроскопия) для изучения материала бронхоальвеолярного лаважа у больных различными диссеминированными процессами в легких, что дало возможность выявить морфофункциональные характеристики мак-рофагальных элементов патогномоничных для разных заболеваний.

Впервые предложено использовать цитологический метод окраски для выявления измененных (Ь-трансформированных) вариантов мико-бактерий туберкулеза непосредственно в патологическом материале, что повышает эффективность диагностики туберкулеза.

Впервые дана комплексная морфофункциональная характеристика макрофагов бронхоальвеолярного лаважа у больных диссеминирован-ным и другими формами туберкулеза легких, внутригрудных лимфатических узлов и плевры и их изменения в процессе лечения.

Изучены цитограммы и морфофункциональная характеристика макрофагальных элементов бронхоальвеолярного лаважа у больных на разных стадиях и с разным течением саркоидоза. Выявлены неизвестные ранее четкие цитологические различия макрофагальной формулы у больных туберкулезом и саркоидозом.

Описана цитологическая картина туберкулеза при преобладающем вегетировании L-трансформированных вариантов микобактерий туберкулеза.

Разработаны: приоритетный способ определения активности туберкулеза (авторское свидетельство № 1469462) и способ ускоренной реверсии L-форм микобактерий туберкулеза (авторское свидетельство № 1604841).

Практическое значение работы. Полученные результаты широко используются в повседневной практической работе врача-цитолога при:

1. дифференциальной диагностике различных диссеминиро-ванных заболеваний легких;

2. определении активности специфического процесса;

3. контроле за эффективностью лечения;

4. экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo с целью изучения изменений микобактериальной популяции под воздействием различных факторов (антибактериальная терапия, иммуномодуляторы, КВЧ и т.д.).

Положения, которые выносятся на защиту:

1. Дефектные по клеточной стенке (L-трансформированные) варианты микобактерий туберкулеза хорошо окрашиваются гематологическими красителями, что позволяет выявлять различные формы их морфогенеза in vitro и в диагностическом материале.

2. При перемене условий окружающей среды (пересев на новую среду попадание в организм хозяина и т.д.), микобактерии туберкулеза проходят определенный цикл развития с обязательной фазой L-трансформации.

3. Клеточные реакции макроорганизма и морфофункциональ-ное состояние клеточных элементов зависят от формы вегетирования микобактерий туберкулеза.

4. Комплекс лабораторных методов исследования (цитология, цитохимия, электронная микроскопия, микробиология) материала брон-хоальвеолярного лаважа позволил выявить признаки патогномоничные для активной фазы следующих гранулематозов легких.

Туберкулез - цитограмма бронхоальвеолярного лаважа носит лим-фоцитарный, макрофагальный или смешанный характер. Среди макрофагов преобладают биосинтезирующие клетки (более 35%), увеличено число секретирующих макрофагов (12% - 20%), высокий индекс ферментативной активности кислой фосфатазы, возбудитель туберкулеза в виде типичной палочки, кислотоустойчивых или некислотоустойчивых зернистых шаров Ь-форм микобактерий туберкулеза.

Саркоидоз - лимфоцитарный или макрофагальный тип цитограм-мы, среди макрофагальных элементов отмечено преобладание секретирующих макрофагов, присутствие вакуолизированных макрофагов, низкий уровень индекса ферментативной активности кислой фосфатазы и высокий — сукцинатдегидрогеназы. Отсутствие типичных микобактерий туберкулеза, выявление Ь-форм микобактерий только при использовании биологической пробы. В макрофагальных элементах бронхоальвеолярного лаважа при электронной микроскопии выявляются сферопла-стоподобные образования.

Гистиоцитоз X - пестрый клеточный состав цитограммы бронхоальвеолярного лаважа: макрофаги, лимфоциты, нейтрофилы, эозинофи-лы, среди макрофагов встречаются эритрофаги, липофаги, клетки Лан-герганса, при электронной микроскопии в них определяются Х-тельца.

Альвеолярный протеиноз - наличие глыбок ШИК-положительного неклеточного вещества.

Идиопатический гемосидероз легких - большие скопления гемоси-дерина внутри и вне клеточных элементов, положительная реакция Перльса.

Экзогенный альвеолярный альвеолит — лимфоцитарный или смешанный характер цитограммы, повышение числа эозинофилов, присутствие тучных клеток.

Идиопатический фиброзирующий альвеолит — нейтрофильный характер цитограммы, низкое содержание миелопероксидазы в нейтрофи-лах бронхоальвеолярного лаважа, при десквамативном варианте идиопа-тического фиброзирующего альвеолита наличие альвеолоцитов II типа.

Внедрение результатов работы в практику.

Результаты диссертационного исследования используются в лекционном курсе на циклах повышения квалификации врачей-цитологов; включены в методические рекомендации «Диагностический бронхоаль-веолярный лаваж (Москва, 1986, 1998). Методы цитологической диагностики Ь-форм микобактерий туберкулеза применяются в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН, Московском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы, больнице МПС № 1. Способ определения активности туберкулезного процесса по макрофагальной формуле бронхоальвеолярного лаважа используется в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН, Московском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 51 работ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Советско-французском рабочем совещании «Сурфактант в норме и при патологии» (Москва, 1984), Всесоюзных и Республиканских съездах фтизиатров (Кишинев 1985, Киев 1986, Минск 1989, Санкт-Петербург 1992, Саратов 1994, Екатеринбург 1997, Москва 2003), итоговых сессиях

ЦНИИТ РАМН (1986, 1988, 1990, 1992), съезде врачей-патологоанатомов (Тбилиси 1986, Москва 1998), Всесоюзных и Всероссийских конгрессах по болезням органов дыхания (Москва 1994, 1995, 1996, Санкт-Петербург 2000, Москва 2001, 2002), секции «Микробиология и иммунология туберкулеза» Московского отделения ВОЭМП, Всероссийском съезде врачей-лаборантов (Москва 1996), Всероссийских съездах врачей-цитологов (Воронеж 1999, Великий Новгород 2001).

Содержание работы. Диссертация изложена на 217 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. В тексте содержится 12 таблиц, 40 рисунков. Библиография включает 299 источников литературы, из них 159 на русском и 140 на иностранных языках.

Выводы

1. Комплексное клиннко-лабораторное исследование, включающее клинический анализ заболевания, цитологию, цитохимию, микробиологию и электронную микроскопию, является высокоинформативным способом диагностики и определения активности диссеминирован-ного туберкулеза и других гранулематозов легких и помогает в изучении их патогенеза.

2. Использование цитоморфологического подхода к изучению возбудителя туберкулеза с применением традиционных и цитологических методов окраски позволило выявить различные формы изменчивости микобактерий туберкулеза, в том числе и лишенные клеточной стенки (Ь-формы) непосредственно в диагностическом материале, что повышает эффективность диагностики туберкулеза, а также проследить формы последовательного морфогенеза микобактерий в процессе роста и подтвердить наличие у них факультативного цикла развития.

3. Вегетирование в организме разных морфологических вариантов микобактерий туберкулеза сопровождается различными клеточными реакциями: при доминировании палочковидных микобактерий туберкулеза отмечена выраженная нейтрофильная реакция, казеозные массы и биосинтезирующие макрофаги, в то время как эпителиоидные и гигантские клетки Пирогова-Лангганса выявляются в небольшом количестве; преобладание в материале Ь-форм МБТ характеризуется увеличением числа лимфоцитов, секретирующих макрофагов, эпителиоидных и гигантских клеток Пирогова-Лангганса, появлением плазмоцитов и эо-зинофилов.

4. При комплексном цитологическом исследовании жидкости бронхоальвеолярного лаважа установлено, что для активного туберкулеза, независимо от формы процесса, патогномоничным является увеличение числа молодых биосинтезирующих форм макрофагов (более 35,0%), возрастание числа секретирующих макрофагов (16,8%), увеличение индекса ферментативной активности кислой фосфатазы (253,4 усл.ед.). Цитограмма бронхоальвеолярного лаважа имеет макрофагальный, лим-фоцитарный, нейтрофильный или смешанный характер, тип цитограммы зависит от активности процесса и формы вегетирования возбудителя. В процессе лечения сначала нормализуется цитограмма, постепенно восстанавливается субпопуляционный состав макрофагов; в то время как при неэффективном лечении число биосинтезирующих макрофагов остается высоким.

5. В ранние сроки (3 месяца) экспериментального саркоидоза, вызванного введением материала от больных саркоидозом, выявлена лимфоидно-макрофагальная клеточная реакция, среди макрофагальных элементов преобладали моноциты и секретирующие макрофаги; бакте-риоскопически в ряде наблюдений обнаружены кислотоустойчивые зерна микобактерий и их Ь-формы. Через 6 месяцев преобладают макрофа-гально-эпителиоидноклеточные скопления, секретирующие и вакуоли-зированные макрофаги. Микобактерии и их Ь-формы не выявлены.

•6. Комплексное цитологическое исследование жидкости бронхоальвеолярного лаважа показало, что для активного саркоидоза, независимо от формы, характерно преобладание секретирующих макрофагов (57,2%), присутствие вакуолизированных макрофагов со светопреломляющими включениями, низкий индекс ферментативной активности кислой фосфатазы (191,4 усл.ед.) и высокий индекс сукцинатдегидрогена-зы (139,0 усл.ед.). Цитограмма носит макрофагальный или лимфоцитар-ный характер и отражает фазу процесса. При лечении отмечена нормализация цитограммы и очень медленное уменьшение числа секретирующих макрофагов. При прогрессировании саркоидоза появляются биосинтезирующие макрофаги.

7. По материалу бронхоальвеолярного лаважа определены цитологические особенности альвеолитов: для экзогенного аллергического альвеолита характерны лимфоцитарный или смешанный характер цито-граммы, повышение числа эозинофилов, присутствие тучных клеток; идиопатического фиброзирующего альвеолита - нейтрофильный характер цитограммы, низкое содержание миелопероксидазы в нейтрофилах бронхоальвеолярного лаважа, при десквамативном варианте - наличие альвеолоцитов II типа.

8. Редкие гранулематозы легких отличаются следующими цитологическими характеристиками: гистиоцитоз X - пестрый клеточный состав цитограммы бронхоальвеолярного лаважа: макрофаги, лимфоциты, нейтрофилы, эозинофилы, среди макрофагов встречаются эритрофаги, липофаги, клетки Лангерганса, в которых при электронной микроскопии определяются Х-тельца; альвеолярный протеиноз — наличие глыбок ШИК-положительного неклеточного вещества; идиопатический гемоси-дероз легких - большие скопления гемосидерина внутри и вне клеточных элементов, положительная реакция Перльса.

Практические рекомендации

1. Цитологическое исследование различного патологического материала рекомендуется широко использовать во фтизиатрии с целью диагностики, дифференциальной диагностики и определения активности туберкулеза.

2. Цитологическое исследование позволяет обнаружить измененные, лишенные клеточной стенки (Ь-трансформированные) варианты микобактерий туберкулеза, которые представляют собой некислотоустойчивые округлые безъядерные образования голубовато-синего цвета размером 4-7 мкм. Обнаружение цитологом подобных образований в исследуемом материале помогает установить диагноз туберкулеза и при не вполне типичной клеточной реакции.

3. При туберкулезе внутригрудных лимфатических узлов наиболее информативен материал браш-биопсии; характерным для этой формы туберкулеза, кроме клеток специфической гранулемы, являются лимфоидные элементы, плазматические клетки и Ь-формы микобактерий туберкулеза.

4. При туберкулемах наиболее информативна катетер-биопсия, в материале которой, кроме клеток туберкулезной гранулемы, часто присутствуют казеозные массы и Ь-формы микобактерий туберкулеза.

5. В целях диагностики и дифференциальной диагностики дис-семинированных процессов в легких, необходимо использовать цитологическое исследование жидкости бронхоальвеолярного лаважа.

6. Для дифференцировки туберкулеза и саркоидоза, кроме цито-граммы желательно подсчитывать макрофагальную формулу: увеличение числа биосинтезирующих макрофагов (более 35,0%) свидетельствует об активной фазе туберкулеза, а значительное преобладание секрети-рующих макрофагов (более 57,2%) — об активном саркоидозе (иногда при одинаковых изменениях цитограммы или нормальной цитограмме бронхоальвеолярного лаважа).

7. Комплексное цитологическое исследование жидкости брон-хоальвеолярного лаважа с использованием цитологического метода, вместе с цитохимией и электронной микроскопией позволяет помочь в диагностике альвеолитов и некоторых редких заболеваний легких.

Цитологические особенности некоторых бронхолегочных болезней отражены в таблице.