Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Чувствительность геномных последовательностей D. melanogaster к мутагенному действию химических канцерогенов

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им.Н.Н.Блохина

Научно-Исел^Зфаффскин Институт Канцерогенеза

----------------------------------------------------------------

113 прянах рукописи

Добровольская Марина Алсксаилроииа УДК 616-006.02:575.224.22

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ГЕНОМНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ П.тс/апоцашсг К МУТАГЕННОМУ ДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКИХ КАНЦЕРОГЕНОВ.

(14.00.14 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой стсиснн кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена в НИИ Канцерогенеза Онкологического научного центра им.Н.Н.Блохш; Академии медицинских наук Российской Федерации.

Научный руководитель:

Руководитель лаборатории методов скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН, доктор медицинских наук, профессор Г.А.Белицкий

Официальные оппоненты: доктор биолог ических наук

в 14.00 часов на заседании специачизироваиного совета Онкологического научного центра им.Н.Н.Блохина РАМН но защите диссертаций на степень кандидата наук (Москва, 115478, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН.

профессор 10.А. Ревазова; доктор биологических наук профессор И.А.Кобляко»

Мсдущая организация: 11ИИ Общей генетики им. 11.И. Кашиюна 1'А11

Защита диссертации состоится " " _.1998

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета ОНЦ РАМН по защите диссертаций на С1спеп1> кандидата наук д.м.н., профессор В.С.'Гурусов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1. Актуальность проблемы.

I! исследованиях механизмов малигннзации основное внимание уделяс|ся попрекам нарушения генетического контроля за пролиферацией и дифференцпровкой кнсюк. Связь изменений в структуре и/или функции регуляториых последовательностей (опкок-нои и антионкогеноп) с онкологическими заболеваниями человека подтверждена экспериментальными и эпидемиологическими данными. Известно, что одной из причин нарушения структуры этих генов являются генотоксические агенты, число которых в обьектах окружающей среды ежегодно увеличивается. Покачана способность химических канцерогенов повреждать онкогены и гсны-супрессоры опухолевого роста у млекопитающих.

В геноме йгохорИИа те1апо£а$1ег идентифицированы как онкогены, так и антионкогены, однако только для первого класса показана структурная и функциональная гомоло! пя с одноименными онкогенами млекопитающих. Что касается торою класса, то из 5(1 известных в настоящее время антионкогенов дрозофилы только 9 имеют структурных гомологов в геноме позвоночных. Особый интерес привлекают данные о том, что у й.те!апо^ах1ег все известные типы новообразований связаны только с инактивацией антионкогенов. Опухоли, ассоциированные с изменением структуры онкогенов у м\х не описаны. Данные о способности генотоксических канцерогенов индуцировать мутации в онкогенах дрозофилы также отсутствуют. В то же время показана способность генотоксических канцерогенов вызывать широкий спектр генетических новреждпии в так называемых фенотипических маркерах, то есть генах, не играющих ключевой роли в регуляции клеточного цикла и развитии мух, мутации в которых совместимы с жизнеспособностью дрозофил и приводят к образованию фенотипически отличимого от варианта дикого типа органа, легко визуализируемого при помощи микроскопа. Последнее свойство позволяет использовать дрозофилу в качестве тсст-обьекга для скрининга генотоксических ксенобиотиков. В практике скрининга мутагенов и канцерогенов дрозофила уже зарекомендовала себя в качестве надежной, доступной и высокоинформативной модели. Несмотря на это все еще существует ряд ограничении к ее использованию, что обуславливает необходимость оптимизации методов скршпнпа. Решение вопроса о способности химических канцерогенов индуцировать мутации в онкогенах и фенотипических маркерах дрозофилы является важным но ряду асмекюв. Прежде всего ответ на этот вопрос необходим для выяснения эволюции молекулярных механизмов, осуществляющих контроль за постоянством генома и обеспечивающих

иптегрированность клеток в составе организма. Результаты изучения динамики мутаций в Iciuix дроюфппы, различающихся но ciciiL'iiii зпачимост для pciуляшш клсиишот пики развития мух, а также данные сравнительного анализа этого параметра у друтнх представителей животного мира, находящихся на разных ступенях эволюционной лестни позволили бм выяснить отличия сметем копiроля за стабильностью генома этих органihn и, возможно, проследить основные направления их эволюции от низших эукариоз до млекопитающих. Эти результаты, возможно, помогли бы проверить предположение о бол строгом контроле и преимущественной элиминации клеток с мутированными онкогенами дрозофилы, что, вероятно является причиной отсутствия у мух опухолей, ассоциирован!!ь с мутациями в аналогах онкогенов. Если бы это предположение подтвердилось, то было С важно выясшпь, возник ли подобный механизм защиты от мутаций в онкогенах у обще предка до дивергенции насекомых и был потом утрачен млекопитающими или он возни i после этого и характерен только для насекомых или их отдельных видов. Это тем более важно, что выживающие у млекопитающих клетки с мутациями в онкогенах обладают селективным преимуществом но сравнению с клетками дикого типа, что в определенных условиях становится решающим фактором для их автономизации в составе организма и. i известно, в конечном счете дает начало злокачественному росту.

I |рикладным аспектом решения вопроса о способности гепотокснческих ксенобиотиком индуцирован, мутации в oiiKoienax и фепотипнческих маркерах дрозофилы, является оптимизация современных методов скрининга канцерогенов. Ответ на этот вопрос можа внести существенный вклад в усовершенствование известных скрининговых моделей ii/iij создания нового поколения тестерных систем, позволяющих не только регистрировать гспотоксичность ксенобиотиков, но и определять молекулярный характер иидуцировашп, повреждений.

Таким образом, изучение индукции химическими канцерогенами мутаций в онкогенах и фепотипнческих маркерах дрозофилы представляет интерес для экснеримсшальпой онкологии в плане химического канцерогенеза, для общей биологии в свете аспектов эволюции механизмов контроля за постоянством генома и для практического здравоохранения в плане создания систем для выявления активных химических соединен способных индуцировать повреждения в регуля горных последовательностях. 2. Основные задачи исследования заключались в следующем: - Изучить мутагенное действие 5 групп проканцерогенов в системе "фепотипнческих маркеров" yellow и .«'н^сч/тестсрпых линий дрозофилы у м/И + и I wsn1/ i-u'.v/;3, традиционно используемых в скрининге гепотокснческих ксенобиотиков методом SMAR

- Апробировать новые тестерные линии дрозофилы y++/y++;Rl/R¡;R2/R2 и

+wsn3/i mn,;Rl/Rl;R2/R2 в скрининге проканцерогенных ПДУ и АЛ, мутагенный эффект которых ранее не выявлялся экспресс-методами па дрозофиле. Для чего:

а) проверить резистентность мух новых линий к токсическому эффекту ДД'Г

б) изучить мутагенный эффект БП (ПАУ) и 2-ААФ (АА) на гетерозиготных потомки» новых линий в системе "фенотипических маркеров"yellow и singed и сравнить этот эффект с мутагенностью БП и 2-ААФ на гетерозиготных потомков традиционных линии.

- Адаптировать метод ПЦР-ПДРФ, используемы» для детекции тонковых мутации \ млекошпающих, для аналогичных исследований у дрозофилы и определить степень чувствительности данного метода, применительно к дрозофиле.

- Применить мегод ПЦР-ПДРФ для детекции мутаций в 409 колоне фспо шпнческо! о маркера singed под действием использованных проканцерогенов.

- Оцепить вклад точковых мутаций п фсиотнпическом маркере singed, сравнивая pc<yii,inii.i III (l'-11ДРФ и SMAR'I' анализа.

- Изучить возможность использования онкогенов дрозофилы п качестве модели для определения способности геногоксических ксенобиотиков повреждать peí улигориые последовательности, для чего

а) применить метод ПЦР-ПДРФ для детекции точковых мутаций и 12 и 61 колонах i сна úrasl, высокогомологичного онкогену c-Ha-rasl млекопитающих.

б) применить метод ПЦР-ПДРФ для детекции соматических точковых мутаций »276 кодоне гена Dsrc41, высокогомологичного онкогену c-srcl млекопитающих. Ожидалось, что выполнение поставленных задач даст материал для получения новою поколения скрининговых моделей, позволяющих не только регистрировать гено токсичность исследуемых веществ, но и определять молекулярный характер индуцированных нарушений в геноме, в том числе и в регуляторных последовательностях.

3. Научная новизна.

Впервые исследована возможность использования метода ГИДР ПДРФ для детекции соматических точковых мутаций, индуцируемых химическими проканцерогенами у дрозофилы. Впервые поставлен вопрос о способности химических проканцерогенов индуцировать соматические мутации в консервативных участках генов Oras! и Osrc-tl дрозофилы, высокогомологичных онкогенам млекопитающих с Ha-ras и c-src-I, соответственно. Впервые методом ПЦР ПДРЧ> проведена детекция точковых мутации н 409 кодоне гена singed у мух.обработанных химическими канцерогенами. Впервые и lyien мутагенный эффект канцерогенных ПАУ и ААФ, а также их неканцерогенпых апитог он на

фсногнпические маркеры yellow и singed, расположенные на Х-хромосоме, у двух тестерных линии дрозофилы. различающихся по уровню активности изоформ цитохрома IM50B, мс!аболи зирующих приканцерогепы этого типа. Мутагенность канцерогенных для млекопитающих БП и 2-ААФ, ранее не доступная для детекции экспресс-методами с использованием дрозофилы. впервые покачана на новых тестерных линиях D.nic/tinogaslcr v I i,j'H ;RI/RI;R2/R2 и +\x-siMwsn};Rl/Rl;R2/R2, резистентных к ДДТ.

4. Научно-практическая значимость работы.

Теоретическая значимость данной работы заключается в выяснении способности i еноюкснческих ксенобиотиков вызывать мутации в геномных последовательностях, различающихся по степени значимости в регуляции клеточного цикла и развитии мух. От ланные необходимы для сравнительного анализа динамики индуцированных мутаций и регулягорных последовательностях организмов, находящихся на разных ступенях эволюционной лестницы дтя выяснения вопросов эволюции механизмов контроля за постянством юнома.

Практическая значимость заключается в исследовании мутагенности Б/1 н 2-ААФ, для новых reeiepiibix линии D.niehinugastery i I/у i i :R1/Rl ,R2/R2 и i wsir/i w.\ii\RI/RI.R2/R2. резистентных к ДДТ и характеризующихся повышенным уровнем экспрессии июформ щпохрома Р-450В, метаболнзирующих ПАУ и АА. До настоящего исследования в [радиционных экспресс-тестах на дрозофиле мутагенный эффект канцерогенных Г1АУ и А/1 не выявлялся. Результаты наших исследований в этом направлении могут быгь использованы для оптимизации скрининга генотоксических ксенобиотиков, относящихся к названным классам химических соединении, а также загрязняющих окружающую среду смесей, в состав которых входят Г1АУ и АА.

5. Апробация работы состоялась 8 декабря 1997г. на совместной конференции лаборатори методов скрининга канцерогенов, лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов лаборатории канцерогенных веществ и отдела эпидемиологии опухолей НИИ Канцерогенез ОНЦ РАМИ. Основные положения диссертации обсуждались на конференциях лаборатории методов скрининга канцерогенов и Ученом Совете НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН, 38-ой Ежегодной Международной Конференции Исследователей Дрозофилы (Чикаго, США, апрель 16-20, 1997) и Европейской Конференции по Инженерии Животных Клеток (Косга-Брава, Испания, октябрь 30 - ноябрь 2,1997).

6. Обьем работы. Диссертация изложена на 119 страницах машинописи, состоит из введени обзора литературы, использованных в работе материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. В работу включено 7 табли

26 рисунков, включая 16 фото. Указа1сль лнтерапры содержит 260 ссылок на рабом,i oieneci венных и зарубежных ai» opon.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Материалы ч методы. Основные химические соединения, использованные н рабою как мукнени, pací пори гели и ингредиенты ниппельных сред и буферов были hucokoí'i eieiieini чистоты. Наборы ферментов и реактивов, испольчоваиных для выделения ДНК. реетрикшого анализа, ПЦР. приготовления зонда для гибридизации, hmmyihwioi »ческой детекции роультатов гибридизации и члекгронпой сканирующей микроскопии имели серш(||ика1 качествам руководство ни применению or фирмы прошнодн юля. It рабою были использованы следующие липни D. melanogaster: традиционные тестерные линии v t i. V1 i и +icsnJ/+ir.uiJ, новые линии y+-t/_)>++,' RI/RI; R2/R2 и +wní/+imi); RI/Rl ; R2/R2, а также дикая линия Cantcm-S из разведения Лаборатории методов скрининга канцерогенов III III Канцерогенеза ОНЦ РАМИ. Москва. Линия Df(2R)E3363 CyO-CR.r¡n[Г 2] wvRu>! t í2,' несущая в ichomc ich UnisI с мутацией н 12 кодоне мод нромогором и чнхгшеером гена sevcnle.ss , и имеющая фенотип "грубые глаза" была получена из Bloomington Drosophila Slock Center (Department oí'Biology, Indiana University, Bloomington. IN 47405-6X0, Indiana, USA). В качестве контролен для анализа ДНК методом ПЦР-ПДРФ были использованы счедуютве кДПК": кД1 (К дикого типа юна Пгч\/. клонированная в ipiatMiru pUSK 1. ñi.ria любезно предоставлена Dr. Norbert Pcrriiiion (National Cancer Institute, Frédéric Cancer Research and Development Center, Maryland 21702, USA); кДНК дикого типа гена Aw c f ! н кДНК гена DsrcJl, содержащего замену нуклеотида в 276 кодоне были любезно предоставлены Dr. Tetsuya Kojima (Department of Biophysics and Biochemistry. University of Tokyo 7-3-1 Hongo. Bunkyo-ku, Tokyo 113, Japan).

Myiaieinioe действие исследуемых соединений па "фепопшичеекпе маркеры"yellow и лingal в соматических клетках дрозофил, гетерозиготных поданным маркерам, определяли по частоте пятен yellow и singed в Fl при транс-положении маркерных генов (г i и t ir. sir) методом SMART в модификации, описанной ранее Л.М.Шабадом с соавторами ( 1976). Pací воры канцерогенов, необходимой концентрации, наносились на иоверхноаь питательной среды, содержащей яйца и личинок 1-ого возраста. Вылетевших mnx исследовали при помощи бинокулярного стереоскопическою микроскопа М1>С'-2 в падающем свете для регистрации иутантных макрохет на голове и тораксе. С кинетическую обработку проводили с использованием критерия ф-Фшнера п комньтернон нро|рам.ме Microsoft l'.xcell. Особе», ироявшшшх пяти yellow, singed и морфиш дотшни ie;ii>no исследовали и фотографировали с использованием растрового члектронного микроскопа

PSIiM - 501 (Philips, Netherlands) u режиме детектирования вторичных электронов при ршлмчимх углах наклона (0°, 1(1° к 45 °) обьекта. Для изучения чокепчеекш о зффекш ДД па имаю традиционных и новых reelерных линии дрозофилы использовали сгапдаршыс сшштшшяционные флаконы, на дно которых наносилось необходимое количество ДДТ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Сшодст компьютерной программе Statgrapli. Выделение и электрофорез ДНК проводили по про юколам, описанным Manialis et al. (1990). Для спектрофотометрпческого определения копнет рации ДНК использовали прибор Backman-26 (США). Для амплификации при помощи ПЦР фраг мен гон гена Diaxl, охватывающих 12 и 61 колоны, были использованы следующие пары праймеров, соответственно: 1. 5' - TGACGGAATACAAACTGGTCG - 3' 5' - TAAGAGTCCTCGATTCTGGGG - 3'; 3. 5' - ATCCTGGACACCGCTGGC - 3'; 4. 5' -А('СТСTTCGGCATCO I T - 3'; гена Dsrc4l: 5. 5' - CGGACAGTTTGGCGATGTCTGG - 3 6. 5'- AAATCCTTGGGGTCCATTGTGCC - 3'; mm singed: 1. 5'-AATTCTTGTACTGAAGTGCGAGCCG - 3'; 8. 5' - ATGCGCCAGTATTTGCCGCTA - 3'. / подбора праймеров использовались данные сиквенсного анализа гена Draal, полученные i NCBI (NCBI Accession М16123; NID g158201); последовательность нуклеогидов юна Охгс-была любезно предоставлена Dr. F.Takahashi (University of Tokyo 7-3-1 Ilongo, Bunkyo-kn, Tokyo 113, Japan ). Все нраймеры были синтезированы в ПИИБОХ им. Шемякина-Овчинникова. Г1ЦР проводили с использованием программируемого аппарата РТС-100 (М Research Inc. USA) по программе: 1 цикл 94 С°, 2 мин; X С, 1мин; 72 С0, 1 мшц 28 цикле 94 С", 0.5 мин; X С°. 1мпи: 72 С°, 1 мин.:1 цикл 94 С°, 0.5мин; ХС°, 1мин: 72 С, 10 мин. IcMiicpaiypa oí жига X для амплификации фрагментов ¡)ras¡ , содержащих 12кодон составляла 54 С°, 61 кодоп - 55 С: 276 кодоп гена Dsrc41 - 63 С°, и 409 кодом тепа singeil ■ 62 С. Очистка фрагментов ПЦР из 11ЛА и Агарозного гелей проводилась н соответствии t протоколами, описаными Maniatis et al. (1990). Подготовка меченного зонда, гнбриднзаци иммунологическая детекция результатов проводилась с использованием набора реакт пион DIG DNA Lablíng and Detection Kit (Boehringer Manheim, Germany) в соошетствии с рекомендациями фирмы производителя. Рестриктный анализ продуктов ПЦР проводили п помощи зндопуклеаз рестрикции Msci, AsuC21, Mspl И Tru9I, используя буферы и соблюл; рекомендации фирм производителей (Sigma [USA], Promega [USA] и Сибэнзим|Россия]). СПИСОК СОКРАЩПНИЙ

ЛА ароматические амины

Л1В1 афлатоксни В1

ЛI (12 афлагоксип G2

2- А АФ 2-ацетиламидофлуорен

4-ААФ 4-ацет»лампдофлюорен

БП

бензо(а)пирен

днэтилннтрозамин

диамнлгштрозамин

дибромотрихлорпропап

1,1-бис(4-хлорофенпл)-2,2,2-1рп.хлортган

диметнлсульфоксид

дезоксирибонуклеозидтрнфосфаты

краткосрочные тесты

микросомные монооксигеназы

тест по индукции соматических мутации и рекомбинации додецилсульфат натрия

поливдклическце ароматические углеводороды

полимеразная ценная реакция

полиморфизм длины рестрикциопных фрагментов

полиакриламидный гель

зрибромпропаи

электронно-сканирующая микроскопия

ЮНА ДЛИЛ ДБХ11

ддт дмсо

дНТФ

кст ммо

SMART

ДСП

ПЛУ

ПЦР

ПДРФ

ПААГ

ТВП

эме

2. Результаты и Обсуждение.

2.1. Исследование мутагенного действия канцерогенов ни феиотипичеекгш маркеры yellow н shigetf методом SMARTп двух группах тестерных иптп дро их/наы

Использованные в работе канцерогены 6i.mii подобраны таким образом, чюйы обеснечнп. широкий спектр аддуктов с основаниями ДНК.

Четыре из няш исследонанных Kainiepoieiion (ДБ.М 1. АГТЛ. I IA н ДАНА) ока мчись мутагенными для гетерозиготных потомков традиционных тестерных линий г i t /у+ >- и +wsnJ/+wsnJ (табл.1). Частота соматических мутаций в фенотипических маркерах yellow и singed, индуцированная этими соединениями статистически значимо превышала данный показатель у мух контрольной группы. ДЭНА оказался наиболее сильным мутагеном. Частота пятен, индуцированная этим агентом составила 14.42% (р<0.01 по сравнению с контролем). Помимо мутагенного действия, все названные канцерогены проявили морфогенный эффект, а ДБХП, ДЕНА и ДАНА оказались токсичными для развивающихся дрозофил. Неканцерогенные пирен, AF-G2, 4-ААФ, а также 2 канцерогена (I>11 и 2-ААФ) оказались немутагенными, а неканцерогенпый ТБП слабомутагенным для гезерозигот лих линий (табл. 1). Таким образом наши эксперименты подтвердили данные ранних исследований о том, что канцерогенные для млекопитающих 11АУ (Б11) и АА (2-АЛФ) не мутагенны для традиционных тестерных линий D.melanogaster (Silabad L.M. el al.. 1976; Belitsky G.A., et al., 1994). Это создает ограничение к использованию дрозофилы в качестве тест-модели для скрининга генотоксических Г1АУ и АА в обьектах окружающей среды.

Таблица 1. Мутагенный эффект химических проканцсрогенов на [етерозиготных потомков

1 р\ una Концешраиия исследуемых соединений Количество экснеримсшов Количсст по самок Частот гнпен. В ыж| емос) (самк самщ

Kompojii.'1 12 6075 1.00

1,11 0.5 мг/мл 3 1404 1.42 76.9

11ирен 0.5 мг/мл 3 1962 1.27 101.3

Д'ШЛ 0.2% 3 1623 14.12* 81 Л

ДЛИЛ 0 Л" „ ,¡ 1069 6.47* 5Х.')

д|;хп 0 25 мМ 1 12X1 10.98» Kl.ii

п,и 0 25 мМ 3 1442 1.76** 46.5

ЛФ IU 3.2 х 10 7 М 3 1313 3.32* 94.ii

ЛОХ'."1 3 ?»11)' М 1 mi 1.42 III 1

2-ЛЛФ 0.5 mi /мл 3 1327 1.61 101 .К

-1-ЛЛ<]> 0.5 mi/мл 3 1190 1.43 92.7

л - 10% p;ic mop ДМ(Ч); 1>- суммарное количеств ияюп yellow и sn : c-l I ponen II me in ношение int epaiMieniiio с кошролем", * - p- 0 1)1, ** - p- 0.05 upii ераннепнп e кошролем no <p-Kpnicpiiiu Фишера

Одним и ( 1соретчсски возможных способов повышения чувствительности дрозофилы в скрипите арома! ическну. прокаицеротюв является индукция шпохрома 1М50. 1'апсе как н нишей лаборатрии, зак i: зарубежом было показано, что одни п 1С же нзоформы цшохрома Р-450В отегсгвепны за ргзпетен гность к инсектицидам и чувствительноец. к Ы1 (Zijlstra J.Л., el al., 1983; Шпнгсльмап B.C., 1995). На основании этих данных в нашей лаборатории к.м.н. В.СМЛпигельманом были сконструированы новые теаерные линии, получившие or мшерипеких, чувешшельных к ДД1 'линий фсногиническне маркеры yellow и singed', и oí резистентной к инсектициду линии 91R - главный и дополни 1сльиый локусы резистснтноеш. Ожидалось, что новые линии, обозначенные _v+ +/у+ + ; RI/Rl; R2/R2 и +nwJ/J wsn1; Rl/RI, R2/R2 должны быть резистентными к токсическому эффекту ДДТ и чувствительными к м> гш енному действию Ы1 и 2-ААФ. Нами показано, что имаго новых линий действительно более резистентны к юксичности ДДТ, чем имаго традиционных тестсрных липни (рис.1). Кроме эюго, мы обнаружили, что для поддержания способности новых линий дс юксицировагь токсический агент (ДДТ) необходимо содержание линий па питательной среде с добанлемнем инсектицида.

Рисунок 1. Выживаемосн. имаго новых тесгерных jiiiiniii но сравнению с мгпсрппскими на ДД'Г (5 мг/м.ч) н течение 8 часов. ( ■ - имаго линии + n.vijJ/H ил«1 : ф- имаго линии I Н-Л/Л'НГЛ»' . 1Н А'/. 112 112 -имаго линии г 1 > у> i ,Л- имаго липни г I I VI RI 1(1. 1С R2 )

Время с момента обработки инсектицидом, час

Ото, вероятно, можно объяснить тем, чю инсекгнцпл вымолняе! роль индукюра шофор.м цитохрома Р-450 В, инактивирующих ДДТ, или ингибирует деградацию соотвек-тующих мРНК. Ожилалось, чго обработка личинок, выращиваемых п ходе эксперимент на стандартной ппгателыюй среде канцерогенами (НИ и 2-АЛФ) индуцирует экспрессию изоформ нитохрома Р-450В, метаболизирующих ПАУ и АЛ, у новых тестерных линий дрозофилы.

Мы показали, что в отличие от мух контрольной группы и потомков исходных лиши') г' I V I 1 и ' н'л/г' 'мгл/г'. Г)П и 2-АЛФ ока зачись мутагенными дчя ктсрозт «и иы\ но тиков новых линий)'+ +/у+ + ; К1/Я1; /{2/112 и Ш'хп3/Ч их/г'; К//Я/: К2/К2 (таблица 2). При -иом Б11 оказался наиболее сильным мутагеном, что, вероятно обусловлено разными мехашпмами метаболизма этих соединений ферментными системами мух.

Таблица 2.Мутагенный эффект ПАУ и ААФ на терошгошых потомков линчи, резне iciiniMX к

Группа Концентрация исследуемого соединения Количество экспериментов Количество самок Частота пятен, h% Выжинае мост ь (сам КИ+ самим),с

Контроль'1 12 5601 0.82

БП 0.5 мг/мл 6 1492 2.95* 86.2

Пирен 0.5 мг/мл 6 1415 1.06 80.1

2-ААФ 0.5мг/мл 6 1868 1.54** ■ 47.6

4-ААФ 0.5мг/мл б 3404 1.14 88.5

а- 10% раствор ДМСО; Ь- суммарное количество пятен yellow и sn ;с- процентное оиюшение к значениям контрольной группы; * р<0.01 по сравнению с контрольной группой или i pynnoii гетерозигог чувствительных к ДДТ линий, обработанных ПП по ((»-критерию Фишера. ** р<0.05 по сравнению с контролем по (р-критершо Фишера

Таким образом, мы подтвердили теоретически ожидаемые свойства новых, резистентных i ннсскпщиду гестерпых линии у i i/y-i I ; Hl/KI: R2/R2 и i mv/rVi wsn: RI/RI; R2/R2. 2.2. Адаптация и использование метода ПЦР-ПДРФ дли исследования структуры консервативных кодонов феиотипического маркера singed и онкогенов дрозофилы Drus! и Dsrc41

К сожалению, опираясь па существующие знания о механизмах химического мутагенеза у дрозофилы, все еще остается невозможным предсказать частоту мутаций в конкретных локусах. и в частности в онкогенах дрозофилы Drasl и Dsrc4!. Част о l'a сомашческих мутаций и рекомбинаций, индуцированных канцерогеном в генах yellow 11 singed может cuiineiciii.eiiuman. oíi инiciicimiioc 111 обраtoitaiiii» 'Шскфофильнмх мешболи юн ироканцерогенов, которая зависит от структуры исходного соединения, активности ферментов, мстаболизирующих ксенобиотики, у определенной линии, а также от акгиниосп процессов репарации. Использованные в нашей работе i ою токсические ксенобиотики были подобраны таким образом, чтобы обеспечить возможность образования всего известного дл: химических канцерогенов спектра аддуктов с основаниями ДИК. Методом SMART мы показали, что канцерогены вызывают высокий уровень соматических мутаций в фепопшичсских маркерах yellow и singed (пример пятна singed см. па рис. 2)

Рисунок 2. Пятно singed, индуцированное ДБХГ1, на голов гетерозиготной самки чувствительных к токсическому эффекту ДЦТ линий, ЭСМ, увеличение 160.

Возможные молекулярные прич! появления пятна: разрыв в X-хромосоме между геном singed и центромерой,с последующим кроссинговером; двойной кроссинговер в локусе singed; деления или точковая мутация в локусе singed.

Помимо этго мы показали, что все канцерогены индуцировали широкий спектр морфозоп. выражающихся в нарушении количества макрохет па тораксе и скутеллюме мух. редукции крыльев, изменении окраски и формы глаз (рис.3), развитии дефектного скутеллюма (рис.1

и торакса. Это говорит о гибели клеточных клонов, несущих индуцированные канцерогенами мутации, несовместимые с жизнеспособное п.то мух.

Рисунок 3. Морфоз (редукция количества глазных фасеток), индуцированный ТБ11, у гетерозиготной самки чувствнгельпых к токсическому эффекту ДДТ линий. ЭСМ, увеличение 160.

Рисунок 4. Морфоз (дефекгпая форма скутеллюма- "двойной скутеллюм"), индуцированный TBI I у гегерозпгоиюй самки ч\кс тигельных к ДДТ тестерных линий. ЭМС, увеличение 80.

Мутагенный эффект, оцененный методом SMART в системе фенотшшческих маркеров yellow и singed, является результатом соматического кроссипговера, делении и ючкопых мутаций (Белицкий и др., 1986). До нашего исследования были известны попытки оценить вклад толковых мутаций в общий спектр генетических повреждений, индуцированных канцерогенами в Х-хромосоме, при помощи генетических методов. По данным Шаруппч Г-Г (Шаруппч П.Г., 1980) ДЭПА индуцировал высокий уровень гочконых Myramiii. оцененных автором по проявлению пятен singed на гемизиготных самцах y+-WY, у которых исключена возможность соматической рекомбинации с участием маркерных г енов yellow и singed. Тип мутаций при этом не был определен в силу особенностей использованного меюда. В настоящее время известно несколько типов изменении в сгрукгуре дико! о локуса \inaeil. приводящих к изменению формы щетинок у мух - деления ЛООнн к области О Q 0.0. ннссрцпя

55O1111 в области 1.2-0.0 Х-хромосомы, транспозиция Tp(l;3)3Cl-2;7C9-10;79I' и другие (Lindsley D. & Zimm О., 1990). Только и 1996г. появились данные Cant К et al. , согласно которым фенотип "скрученная щетинка", индуцированный прямым канцерогеном этилметансульфонатом, обусловлен заменой пар оснований в 409 ко доне дикого аллеля singet!. ')к> первая точковая мутация, обуславливающая изменение формы щеннжи у мух. показанная для локуса singed. Фенотип "скрученная щетинка" мы использовали в методе SMART в качестве одного из показателей мутагенности канцерогенов. Потюму анализ 409 кодона гена singed представлял интерес для детекции точковых мутаций. 1 (слученные нами результаты позволяют сказать, что с частотой, лежащей в пределах разрешающей способности метода ПЦР ПДРФ, химические канцерогены не индуцируют изменений в 409 кодопе [ епа singed (рис. 5), и фенотип "скрученная щетинка", коюрый мы пенолыуем в качестве показателя мутагенности исследуемых соединений, обусловлен другими изменениями в этом феногипическом маркере.

IS 17 1(1 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 I

Рисунок 5. Результаты анализа I II I ПДРФ 409 кодона i сна singed. ]{)"/ ПААГЭ. дорожки 1, 2 - Д1 И< мух д линии ('antonS; дорожки 3-6-Д| |1< 1 стсрозпгошыч самок п самцов, обработанных 10% ДМСО, дорож»

- ДНК самок и самцов, обрабоинш АФ-BI, дорожки 11-14 -личинок и куколок, обработанных ДЭ1IA; до| 15-18 - самок и самцов, обработан! ТБП. Аналогичные результаты нш при исследовании ДНК других экспериментальных групп, в том ч одиночных самок, проявивших sin

- негативный контроль, реакционн смесь для 11ЦР без ДНК. ММ - Maf молекулярного веса ДНК "- " -11р ПЦР (159пн), "+" - фрагменты (13: 24 пн), образующиеся после оСраб продукта ПЦР эндонуклеазой Asu(

Учитывая высокую степень чувствительности использованного молекулярного метода, можно заключить, что в спектре изменений локуса singed под действием канцерогенов преобладают разрывы в хромосоме с последующим кроссинговером, аточковые мутации, если и возникают, то их количество недостаточно для выявления при помощи ПЦР-ПДРФ.

Полученный нами в результате первой стадии данного исследования генетический материал представлял особый интерес для детекции структурных изменений в

+ -+ - + . + - + - +-+. + . + -НКММ

ш

II

159 135 11148 24^

— T1« , IMP -<3t

а .с -

1/(84 Г124

'89

|\64 к

консервативных кодонах генов Drasl и Dsrc4¡ дрозофилы, высоко гомологичных онкогенам млекоишлюшп.х. Чип интерес обусловлен icm. чю в лшсрапре нмсннся обширные данные о способности химических канцерогенов индуцировать гочковые мугацни в онкогенах н соматических клетках млекопитающих, in vivo исследованных на грызунах, а ш vino - на клеточных культурах человека (Роит Р., et al., 1007; Jíh 7,., el ai . 1006;), и совершенно oicyrcrnyioi данные аналогичных исследований на дрозофиле. Для > юн цели мы адат провали меюд ПЦР-11Д1'Ф, разработанный и используемый для детекции мукщий в онкогенах млекопитающих для аналогичных исследований генома дрозофил!,i и определили предел разрешающей способности данного метода примени гсльно к дрозофиле (рис 6-S). Порог чувствительное ni ПЦР I1ДРФ анализа, оцененный нами на модели 12 кодоиа i сна I>111X1. ШС1ЛНЛИС1 10 '.

5

!* 'V : ■ ■ i .. - -r- Я

i f 4 .

и 1

fe . ■>4* w i

-- . ür-jri T

щяя

I ММ ПК

* Т' » » ! i

• —i - •• -- i

tí-J

ImmoI IIM) UMJ ^ ^

L—riT »МЦ . ...

fts*'.' "

123 104 '89 80 51

a

Рисунок б. ['езулм.им ПЦР ПД[><|> у|асн<а юна 1>т\1(\2 М1дип|. III";. 11ЛЛ1 '). Продукт ПЦР, полученные на м;н рице /(I П\ .прелоПраб»!аннон Ж'юиуклсакш м\ \ линии ПГОШЗШ-С \(>-К.Пгу) 1/7.2/ ,1пАя/ I72/ п ДНК мух ДИКО!! ЛШ1Ш1 ( \inlonS , 01,11111 очищены н смешаны и ра шы\ пропорциях (дорожка 1 - 100% МЛ; дорожка 2 - 75%МЛ ' 25 % ДА; дорожка 3 - 50 % МЛ I 50% ДЛ; дорожка 4 - 25% МЛ I 75 % ДЛ: дорожка 5 - 10% МЛ I 00% ДЛ. дорожка 6 - 1% МЛ » <)<>% ДЛ. дорожка 7 - 100% ДЛ) МЛ - мутангпый аллель; ДЛ - дикий аллел I.

ММЕЧЛ1ШЕ. 1 рисунках 6 - 9:

К и НК1 - негативный контроль (реакционная смесь для ПЦР и рестрикции без ДНК, соответственно) M - маркер молекулярного веса ДНК. "- " - Продукт ПЦР, охватывающий 12ко<)он гена Drasl (118пн), "+" фрагменты (87 и 31 пн), образующиеся после обработки продукта ПЦР эндонуклеазон Mspl, "*" - продукт ¡Р (1 18пн), полученный на матрице геномной ДНК, предобработанной рестриктазпй Mspl, "**" -агменты (87 н 31 пн), образующиеся после обработки продукта "ПЦР эндоиуклеазон Ms/>t. I рисунке 10:

f - негативный контроль (реакционная смесь для ПЦР без ДНК) ММ - маркер молекулярного веса ДНК. " - Продукт ПЦР, охватывающий 61 кодом гена Drasl (164пн), "+" - верит! фрагмент (¡46 пн), мзующийея после обработки продукта ПЦР зндонуклеазой Msel. ! рисунках 12А и 12Б:

Г- негативный контроль (реакционная смесь для ПЦР бе! ДИК) ММ - маркер молекулярного веса ДНК. " - Продукт ПЦР. охшинывающгм 7 76 кодон гена Osrc4/ (15Хнп в случае геномной ДИК н 'Хит- а случае ЧК), "+ " - фрагменты (101 и 57 >.н ■ для геномной ДНК и 57 и 39 пн - г)лякДПК), образующиеся после шботки продукта ПЦР эндонуг изоù Tru9I, "*"- продукт ПЦР (15Нпн). полученный на матрице омнойДНК, предобраСютаинои ¡'сстриктазои Тгн91. "**" - (фрагменты /101 н 57 пн). обранюи/пссн нос /с шботки продукта *П11Р нн)он\ ' tecuon Тгн'И.

12 3456 78 9 10 11 12 НКММ- + * " - +*"_+***

Т^г-ПТ*

123ч 1040 89-s^

80---

51-,

«f - " ÜJ w —t ri

GS*: aa"'

\ VsrW«. .^'w'l^rj-

,v» tK, ¿«¡y W «U

» •* 5 --3K

6 5 4 3 2 1

Рисунок 7.Результаты ПЦ1' ИД!' анализа участка lena Drusl, содержащего 12 кодом, получеии при иомоиш 10% ПААГЭ в результате анализа i еномиой Д111 И 18 мух линии Df(2R)E3363/CyO-

CR,P{ry[+n.2]- aevRusI. V12¡ и l 187 "У" Дикой линии CcmtimS. Образ ДИК мух этих линий были смета в разных пропорциях для получи 3 образцов: |-ьш содержал \0%} мух мутангной линии и 90% ДИК мух дикой линии (дорожки 9-I2); ой - 1% ДНК мух мутаитном лищ 99% мух дикой линии (дорожки i 3-ий - 0.1% Д11К мух мутантом линии и 99.9% ДНК мух дикой л> (дорожки 1-4).

Рисунок 8. Результаты ПЦ1> НДР анализа участка гена Draxl, содержащего 12 кодой, получепн при помощи 10% 11АЛ1') в результате апалша продуктов 1111 полученных на матрице кДПК дикого типа нсслед>смого гена (дорожки 1-2) и ДНК , itoiivicTinn смеси мух, содержащей I муху линии Df(2R)E3363/CyO-CR,P[ry[+t7.2]=sevRasI. VI2} ср< 1000 мух дикой линии CantonS (дорожки 3-6).

118— 87—

2 I

+ - ММ НК

. tk ¿'A v" VVi

- «

** шЁй

' 'Я- ' -. i-?'* ' ''

■А *-.

Рисунок 9. Результаты ПЦР ПДР<1 анализа участка гена Draxl, содержащего 12 кодон, получениы при помощи 10% ПААГЭ в результате анализа ДИК самок '141 (дорожки I-4) и самцов (дорожки t

ЮЗ 8), обработанных АФ-В1,

,65 Аналогичные результаты получеш

при исследовании ДНК групп самс самцов, одиночных самок, проявивших пятна yellow или singi а так же личинок и куколок, обрабокишых ДР.1 |А.

Геномная /(ПК, полученная ич обработанных канцерогенами и исследованных меюдом SMAUT имаю (самок и самцоп но-отдельности). личинок и куколок, а также одиночных самок, проявивших пятна yeIJow, singa) и морфош была исследована методом IIIIII-11ДРФ па ирсдмепг htmciiciihíí в структуре консервативных кодонов генов дрозофилы Pnislи Dsrc41, высокотомологнчпых онкогенам с-Чч-ras и c-src-1, соответственно. Нами не обнаружено изменений в 12 колоне гена Drasl ни в одном из исследованных образцов (рис.9). Аналогичные результаты были получены и при исследовании сгр\кт\ры <>| колона этого гена (рис. 10).

12 I1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 + - + .+ .+ . + .+ .

6746-

Рпсумок 10. Результаты МЦР 11Д1'<1> апали«а, полученные мри исследовании структуры юна 1)гм-1 п районе 61 кодопа в обра щах кДНК дикого типа тепа (дорожки 1-2). геномной ДНК дикой линии ('ин/пнН (дорожки 3-4). личинок и куколок, обработанных ДЕНА (дорожки 5-6 и 7-8. соответственно), фупп самок и самцов, обработанных Д|!Х11

-184 (Дорожки 9-10 и 11 -12.

-123 соо,"вегетвенио). Аиа.кл нчпые ретулыаты получены н мри исследовании обращои ДНК остальных экспериментальных групп и отнпочмых самок. прочтштпих пятил \ellou или siп!J;Lчl

Поскольку для амплификации участка гена Птх1. охватывающем 61 кодой, мы синтезировали пранмер с заменой пуклеотида для создания сайт рестрикциоппой зндонуклеазы Мзс1, идентичность полученных прн помощи таких праймеров фрш ментов ПЦР последовательности гена £>пм7 была подтверждена при помощи гибрцдтпатши (рис. 11)

i

i ¡

j сахч» ** *¡¡* •

i II к 1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 11. Результаты гибридизации с использованием зоила, меченного днгоксишшном для подтверждения специфичности продукта ПЦР, охватывающего участок гена 1)т\1. содержащего 61 кодотт. Греки: I - продукт ПЦР полученный па матрице илазмнднои ДНК: 2- 9 продукты III (Р. полученные па матрице ДНК п 1 самок, обработаппт.тч ДЕ11Д. ДАНА, 2-ЛЛФ, 4-ЛЛФ, Ш, Пирепом, ДБХП и ТЫ I. соответственно. Аналогичные результаты полутень! в остальные образцах.

9

Одним in проявлений точковых мутаций и 12 кодопе гена liras! дрозофилы являе!« фепошп "ipyCbie глаза" (lio M., el al.. 1997). обусловленный неадекватен дифференпнровкой фоторсцепторных клеток в глазных имагинальных дисках личинок 3-сгс возраста в результате активации белка DRasl. Мы не встречали такого фенотипа среди шея1 мух, o6pa6oiaiii!bix сильными канцерогенами и проявившими миотчисленпые морфой.i i высокий уровень мутаций в генах yellow и singet!1.

Исследование 276 колона гена Dsre-Il представляло ншерес, поскольку по jniicpai)pi.i\ данным, в отличие от активирующих мутаций в 12 в 61 кодопе гена Dr asi, мутации в 27( колоне гена f>s/r4l принодя) к ипакпшацнн cool»eiciiiytoihciо белка. .Данных ( совместимости таких мутаций с жизнеспособностью мух нет, но, опираясь на высокук помологию между этим белком дрозофилы и млекопитающих (Takaliashi F., el al.. 1996) можно предположить, что инактивировапный такой мутацией белок DSrc41 не вызонс факпьных последствии у дрозофилы, поскольку его гомолог в клетках млекопитающих iipi ипак!пкации подобной мутацией совместим с жизнеспособностью клеток (Kamps, et al. 1986). По лому можно было ожидать, что клетка или клетки с индуцированной химичсскю каицеро1еном мутацией в 276 кодоне Dsre41uç будут элиминированы и их можно буде обнаружить при помощи ПЦР ПДРФ анализа. Мы не обнаружили изменений в 276 кодов i она Ihn-II (рис. 1 ?).

VVT

KR

нк мм

Рисунок 12А. Результаты 1 11 ПДРФ анализа, полученные при исследовании струюуры гена Dsrc4! в районе 276 кодона в образцах кДЦК. кДНК, обозначенная "\\t" -представляет собой последовательность смыслов части гена Dsrc41 дикого тш кД11К, обозначенная "KR" -представляет собой смыслов; последовак'льность гена Dsrc41, содержащую м\ laniii в 276 кодопе.

8 7 6 5 4 3 2 1 ** * + ** * + - MM нк

Рисунок I2I>. Резулыат м НЦР ПДРФ анализа, полученные при исследовании структур!,! гена Dsrc-fl в районе 276 кодош в образцах геномной ДНК самок (треки 1-4) и самцов (iреки 5-Х), обрабо I аннмх 10%ДМ( 'О. Аналогичные резудмаn,i получены во всех исследованных образцах ДНК

Результаты, полученные в рамках данной работы, позволяют говорить о том, что химические проканцерогены не индуцируют соматических толковых мутаций в исследованных консерватиппых кодопах онкогенов дрозофилы с частотой, лежащей в пределах чувствительности ПЦР ПДРФ анализа, определенных контрольными экспериментами. Можно предположить несколько объяснений данных результатов. Во-первых. потможно. чю мутации в Drasl и Dsrc41, индуцированные ксенобиотиками происходят очень редко и их уровень слишком мал для детекции использованным методом. Теоретически также возможно, что тепы, играющие ключевую роль в регуляции клеточного цикла и развитии мух, сильнее защищены от действия генотоксических агентов, например посредством особенностей вторичной структуры ДНК или белками в районах "горячих точек" . Во-вторых, возможно, что система контроля за стабильностью генома нренм\щес шенно элиминирует клетки и/или клоны клеток с поврежденными онкогенами или. н случае эпигенетического действия канцерогенов, клетки с неадекватно повышенным )ровнем экспрессии онкогенов, поскольку последние наряду с регуляцией клеточного никла играют ключевую роль в развитии мух (Sanson et al., 1997; Schreiber-Agus et al„ 1997). Подтверждением того, что в ходе развития дрозофил, обработанных канцерогенами, происходила гибель клеток или клонов с мутациями, несовместимыми с жизнедеятельностью мух, являются наблюдаемые нами морфозы (рис.3, 4). В числе таких мутаций могли быть и изменения в онкогенах, по крайней мере в Drasl, поскольку Karim Г. et al. показал, что, активированный мутацией в 12 кодоне Drasl вызывает гибель клеток имагинальных дисков, несущих такую мутацию, а также нормальных, окружающих их клеток у личинок (Karim F., et al., 1998). В-третытх, мугацшт в 12 кодоне тепа Drasl, произошедшие на ранних этапах онтогенеза, могли привести к гибели эмбрионов и потому

не были идентифицированы у имаго, поскольку известно, что экспрессия активированного в результате такой мутации гена Drasl детальна для эмбрионов (Gaul ., 1993). Гак как эмбриональная летальность показана только для DRasI, актиннроваппо! о в рсзульппе мутаций в 12 кодоне, но пег данных относительно эффекта мутаций в 61 кодоне данного гена на функцию белка у эмбрионов и отсутствуют данные о совместимости с жизнеспособностью мух мутаций в 276 кодоне гена Dsrc41, мы ожидали возможность выявления сфукгурпых изменений в этих точках вышеназванных генов, по крайней мерс у личинок или куколок. Однако данные, представленные па рисунках 10 и 12, не подтвердили 1акую во 1М0Ж1 юс i ь.

Таким образом, использование классическою варианта МЦР-ПДРФ для выявления способности канцерогенов вызывать мутации в онкогенах дрозофилы на данном этапе не возможно и нуждается в дальнейшем усовершенствовании.

В птапс перспектив развития данного направления исследовании помимо повышения степени чувавтельиости использованного метода можно наметить несколько возможных направлений для оптимизации выявления соматических точковых мутаций, индуцированных каинсро1спами в клетках дрозофилы. 1? наших экспериментах мы использовали канцеротям в концентрации, при которых 70-100% особей выживали. Возможно, что использование более высоких доз канцерогенов может обеспечить повышение частоты мутаций. Па модели клеток млекопитающих известно, что клетка с активированным онкогеном обладает селективными преимуществами по сравнению с клетками дикого типа. Если бы подобное свойство мутированных клеток имело место и у дрозофилы, то культивирование клеток имагипальиых дисков, обработанных генотоксическими ксенобиотиками in vitro или in vivo могло бы быть использовано для увеличения концентрации мутаций. Кроме этого, перспективным вариантом оптимизации детекции соматических мутаций, индуцированных генотоксическими ксенобиотиками в клетках дрозофилы, представляется использование ГЩР in situ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Н ходе исследования Myiareinioi о эффекта химических канцерогенов на гены дрозофилы, гомологичные онкогенам млекопитающих был адаптирован применительно к насекомым меюд ГЩР-ПДРФ, разработанный и традиционно используемый для детекции точковых мутаций в геноме млекопитающих. В случае использования модельной системы Drasl названный метод обладает чувствительность 1 х 10~3. Hat не исследование в этой области было первыми в мировой литературе и заложило фундамент, на котором в дальнейшем могут

быть построен!,[ методы, позволяющие оценивать громкость активных метаболию» канцерогенов к рсгудя горным послслшшсш.мооим генома.

I! ходе исследований мы апробировали новые теетерные линии ¡\melanogaster у++/у++;1{1/1{1 ;1{2;1{2 и +\\'$пЗ/+шпЗ;К1/Е1; R2/R2, используемые в тесте на соматическим мозаицизм и изучили чувствительность этих липни к токсическому эффсыу ДДТ и мутагенному действию канцерогенных для млекопитающих бепэо(а)пирепа и 2-ацетиламинофлуорегга, мутагешгость которых ранее была недоступна для дечекцнп при помощи дрозофилы. В работе представлены данные, показывающие преимущса ва новых линий для скрининга иолицнкличсскнх ароматических углеводородом и аромнпггескнх аминов но сравнению с традиционно используемыми в методе соматическою могаиппзма линиями. Выявленная в нашем исследовании большая мутагенность БП, но сравнению с 2-ААФ, для гетерозигот новых линий и данные литературы о том, что критическим этапом в активации 2-ААФ является реакция сульфоэтерификации (11а!Ыгот I.. с1 а1„ 1981), позволили наметить перспективы дальнейшей оптимизации меюдов скрининга ароматических канцерогенов в направлении индукции или повышения активности ферментов 2-ой фазы метаболизма ксенобиотиков у дрозофилы. Полученный нами экспериментальный материал свидетельствует о создании удобной скрипниговои модели, не имеющей аналогов среди всех известных на сегодняшний день моделей скрининга геногокспческих канцерогенов на О.тскто^ахП'г.

ВЫВОДЫ.

1. Канцерогенные для млекопитающих ДЭНА, ДАНА, ДБХП и АГ В1 мутагенны, а неканцерогенные ТБП, AFG2, пиреп и 4-ААФ и канцерогенные БП н 2-ААФ не мутагенны для гетерозиготных потомков традиционных тестериых линий дрозофилы у++/у+ + и +\vsn3/+\vsn3.

2. Новые тестерные линии D.melanogastery++/y++;Rl/Rl;R2/R2 и +n,sn3/+wsn3;RI/Rl .R2/R2 более устойчивы к токсическому эффекту ДДТ по сравнению с исходными линиями у-\-л!у\ ь и +wsn3/+wsn3.

3. Канцерогенные для млекопитающих БП и 2-ААФ мутагенны для гетерозиготных потомков новых тестерных линий дрозофилы в отличие от традиционных линий. При этом БП оказался более эффективным мутагеном, чем 2-ААФ.

4. Обнаруженная в даггггом исследовании мутагенность БП и 2-ААФ для гетерозию! пых потомков новых тестерных линий дрозофилы дает практическую возможное н> использования этих линий для оптимизации скрининга генотоксическнх 11АУ н АА в обьектах окружающей среды, ранее не выявляемых в традиционных тестах с использованием D.melanogaster. Для дальнейшей оптимизации скрининга АА предлагается индукция или повышение активности ферментов шорой фазы мечаболизма ксенобиотиков.

5. Метод ПЦР-ПДРФ, традиционно используемый для детекции мутаций в онкогенах млекопитающих, адаптирован для аналог ичных исследований генетического материала дрозофилы и установленный предел чувствительности дайною метода составляст 1x10я.

6. Методом ПЦР-ПДРФ не выявлено изменений в 409 кодоне гена singed у мух, обработанных генотоксическими канцерогенами, индуцировавшими высокий уровень соматических мутаций и рекомбинаций в Х-хромосоме.

7. В г енетическом материале, полученном из имаго, личинок и куколок, а также одиночных самок, проявивших пятна ye/Zoic, singed или морфозм, методом ПЦР-ПДРФ не обнаружен! изменений в 12 и 61 кодоиах гена Urasl и 276 кодоне Dsrc4¡ .

8. Использование классического варианта Г1ЦР-Г1ДРФ для выявления способности канцерогенов вызывать мутации в онкогенах дрозофилы на данном этане ие возможно и нуждается в дальнейшем усовершенствовании

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Добровольская М.А., Белнцкнй Г.А. Геномные последовательности D.melanogaster, гомологичные онкогенам млекопитающих (обзор)./ Генетика, 1997, Т'.ЗЗ, N.7., Р.869-882.

2. Dobrovolskaya М.А., Spiegelman V.S., Belitsky G.A. Newly constructed insecticide resistant D. melanngasler strains with elevated sensitivity to the mutagenic effect of benzo(a)pyrenc and 2-acetylaniinolluorene./Experimental oncology, 1997. V. 19, N.3., P. 185190.

3. Dobrovolskaia M.A.. Belitsky G.A. Comparison of the sensitivity of D.melimoguster nisi gene and yello\v(singed3) genes to mutagenic effect of procarcinogens./ 38"' Annual Drosophii Research Conference, Chicago, II., USA, April 16-20, 1997, Programm Addendum, p. 12.

4. Dobrovolskaia M.A. Comparative study of two different approaches to estimate the mutagenicity of chemical procarcinogens on D. melanogaster rasl gene and yellow(singed3) genes./ European Workshop on Animal Cell Engineering, Costa-Brava, Spain, October 30 -November 3, 1997, Abstract book, Poster Session.

5. Dobrovolskaia M.A., Belitsky G A. Detection of mutations, induced by procarcinogens in Drosophila Drasl and Dscre-i! genes. / Keystone Symposia, Conference Toward the Genetic Manipulation of Insects, Taos. New Mexico, USA, January 9-15, 1998, Poster Session.

Автор выражает сердечную благодарность научному руководителю д.м.н., профессору Геннадию Альтеровичу Белицкому за ценные советы в планировании экспериментов и обсуждении результатов.

Сердечно бла1 одарю д.м.н. Ю.А.Ровенского за помощь при электронно-сканирующей микроскопии, д.б.н. А.Г.Татосяна за ценные методические советы и критические замечания и д.м.н. Е.М.Горскую за помощь при обсуждении результатов.

Выражаю глубокую благодарность к.м.н. В.С.Шпигельману, к.б.н. В.П.Шелепову, к.м.н. С.А.Галецкому, к.б.н. Ю.Г.Кжишковской и к.м.н. М.Г.Якубовской за методическую помощ и критические замечания при обсуждении результатов.

Глубоко ценю помощь Ф.Я.Бурковской при разведении линий дрозофилы и поддержании фонда.

Особые слова благодарности автор выражает родителям Добровольским Александру Яковлевичу и Валентине Васильевне, а также Змиевским Владимиру Васильевичу и Наташ. Викторовне за моральную и материальную поддержку в процессе исследования.