Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Анализ репаративных процессов в нижней челюсти при использовании модифицированных остеопластических материалов серии Гапкол с мезенхимальными стромальными клетками в эксперименте

□03168875

На правах рукописи

УДК: 616-056.3-02:616.314-76-085.462

Фионова Элина Викторовна

Анализ репаративных процессов в нижней челюсти при использовании модифицированных остеопластических материалов серии Гапкол с мезенхимальными стромальными клетками в эксперименте

14.00.21 - «Стоматология»

14.00.16-«Патологическая физиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

1 5 (;/'- 7г-п

кандидата медицинских наук ' ¿г^

Москва - 2008

003168875

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» и в ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия Росздрава»

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Воложин Александр Ильич доктор медицинских наук, профессор Караков Карен Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Топольницкий Орест Зиновьевич

ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

доктор биологических наук, профессор

Вальцева Инга Алексеевна

ГОУ ВПО «Московская медицинская академия имени Сеченова Росздрава»

Ведущая организация: ФГУ "Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Росмедтехнологий"

СС

Защита состоится у,иСлЛ& 2008 года в "Ь часов на заседании диссертационного совета Д 208 041 03 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу 127473, Москва ул Долгоруковская, дом 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава (125206, Москва, ул Вучетича, д 10а)

Автореферат разослан « -У » Ч.иХчХ'_2008 г

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

М А Зоткина

Общая характеристика работы

Актуальность

В настоящее время в практической медицине, а именно в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и травматологии, используются резорбируемые и биостабильные композиционные материалы для замещения костных дефектов после травмы, удаления опухолей, устранения врожденных и приобретенных дефектов (М Ш.Мустафаев и соавт, 1998, 2000, С.Г Курдюмов и соавт, 2000, А М Воложин, В С Агапов и соавт 2000) Среди резорбируемых остеопластических материалов большое распространение получили композиты, образованные из коллагена и синтетического минерального компонента, гидроксиапатита и трикальцийфосфата К ним относится серия материалов Колапол, Гапкол, Коллапан, производимые фирмами «Полистом» и «Интермедапатит». Эти материалы обладают высокой степенью биосовместимости, технологичны при изготовлении, имеют по сравнению с импортными аналогами невысокую стоимость, но не уступают им в качестве и остеопластических свойствах.

В механизме остеопластического действия этих материалов основная роль принадлежит их остеокондуктивным свойствам, что способствует хорошей интеграции с костной тканью Недостатком материалов является низкая способность инициировать построение костной ткани из-за отсутствия специфических стимуляторов-остеоиндукторов

(морфогенетических белков и др) В связи с этим продолжительность реабилитации пациентов после оперативного вмешательства у некоторых пациентов (особенно при наличии общесоматических заболеваний сахарный диабет, другие эндокринопатии, гипертоническая болезнь и т д ) отличается длительностью и, кроме того, повышается риск послеоперационных осложнений С целью придания этим материалам свойств инициировать построение костной ткани в их состав вводят компоненты межклеточного матрикса гиалуроновую кислоту и

хондроитинсульфат (В В Сарычев, 2005; И.С Мальгинова, 2005). Важная позитивная роль может принадлежать также неколлагеновым костным белкам, которые выделены в чистом виде и испытаны в эксперименте.

Дальнейшее совершенствование свойств остеопластических материалов может быть осуществлено при использовании новой биотехнологии, позволяющей сформировать на поверхности биосовместимых резорбирующихся композитов слой костных клеток из клеток - предшественников костного мозга. Костные клетки сами являются источником специфических факторов костного морфогенеза Использование этих технологий в дальнейшем может существенно снизить риск осложнений и сократить период реабилитации пациентов после оперативного устранения дефектов костей лица и челюстей, а также других костей скелета, особенно в случае нарушенного заживления костной раны при иммунодефицитных состояниях и общесоматических заболеваниях Исследований по применению биорезорбируемых композитных материалов заселенных остеопрогениторными клетками, полученными из мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, проведено не было, что послужило основанием для формулирования цели и задач данной работы

Цель работы в лабораторных условиях и экспериментально обосновать эффективность применения неколлагеновых белков кости в составе остеопластического материала Гапкол, модифицированного вакуумной обработкой и с культурой мезенхимальных стволовых клеток для оптимизации репаративной регенерации челюстной кости

Задачи

1. Оценить в длительных культурах костного мозга декстеровского типа динамику кроветворения на поверхности образцов остеопластических материалов Гапкол, Коллаген и Пародонкол.

2 Определить возможность применения образцов Гапкола, модифицированного вакуумной обработкой и содержащего неколлагеновые белки кости, для длительного культивирования в среде, содержащей мезенхимальные стволовые клетки

3. Изучить влияние материала Гапкол на цитотоксичность, пролиферацию и дифференцировку фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток человека.

4 Определить влияние Гапкола без вакуумной обработки и не содержащего неколлагеновые белки кости, внесенного в костную рану ветви нижней челюсти кролика, на репаративную регенерацию.

5. Оценить, как влияет Гапкол с вакуумной обработкой и содержащий неколлагеновые белки кости на построение костной ткани ветви нижней челюсти кролика

6 Определить особенности репаративного остеогенеза в ветви нижней челюсти кролика при внесении в костную рану Гапкола, содержащего неколлагеновые белки кости с мезенхимальными стволовыми клетками на поверхности

Основные положения, выносимые на защиту

1 Формирование на образцах Гапкола преимущественно стромальных, чем кроветворных клеток при культивировании в длительной культуре костного мозга декстеровского типа Образцы Гапкола и Индоста подвергнутые вакуумной обработке и содержащие НБК не могут быть культивированы более 3-х дней вследствие перехода клеток в суспензию, содержащую мезенхимальные стволовые клетки 2 Малое количество клеток на поверхности Гапкола и Индоста дает ложное представление о токсичности материала, так как МСК быстро переходят в культуральную среду с разрушающегося материала Быстрая деструкция материала в условиях

культивирования не позволяет клеткам пролиферировать и подвергаться остеогенной дифференцировке

3. Внесение в костную рану ветви нижней челюсти кролика Гапкола без вакуумной обработки, не содержащего НБК, вызывает умеренные воспалительные и воспалительно-деструктивные процессы.

4. Внесение в костную рану ветви нижней челюсти кролика Индоста с вакуумной обработкой и содержащего НБК вызывает усиление построения костной ткани Нанесение МСК на поверхность Гапкола, содержащего неколлагеновые белки кости, вызывает более высокую активность остеогенетических процессов в челюсти и интенсификацию процессов созревания новообразованной костной ткани.

Научная новизна

Впервые установлено, что в декстеровской культуре костного мозга на образцах остеопластического материала Гапкол формируется значительно больше стромальных, чем кроветворных клеток. Научной новизной отличаются данные о том, что Индост, подвергнутый вакуумной обработке и содержащий неколлагеновые белки кости, не может быть длительно культивирован вследствие нестойкости материала и быстрого разрушения в жидкой среде Деструкция образцов Гапкола и Индоста в условиях культивирования не позволяет мезенхимальным стволовым клеткам пролиферировать на материале и подвергаться остеогенной дифференциации Введение в состав Индоста неколлагеновых белков кости повышает его остеогенетический потенциал при репаративной регенерации нижней челюсти только после удаления летучих соединений с помощью вакуумной обработки материала. Заселение МСК Индоста, содержащего НБК, вызывает слабые проявления воспалительно-деструктивных реакций, повышает активность остеогенетических процессов и способствует созреванию новообразованной костной ткани.

Практическое значение

Оценка динамики кроветворения в длительных культурах костного мозга на поверхности Гапкола является важным этапом для оценки их биосовместимости. Преобладание на материалах Гапкол формирования стромальных клеток над кроветворными клетками характеризует его остеопластический потенциал Вакуумная обработка материала Гапкол с целью удаления остатков уксусной кислоты и формальдегида является необходимым условием для проявления активности, введенного в состав материала неколлагеновых белков кости Культивирование мезенхимальных стволовых клеток на Индосте, модифицированном вакуумной обработкой и содержащим неколлагеновые белки кости, может продолжаться не более 3-х дней из-за нестойкости материала в жидкой среде и не позволяет проведение остеогенной дифференциации. Заселение поверхности Гапкола, содержащего НБК, мезенхимальными стволовыми клетками уменьшает проявления воспалительно-деструктивных реакций, повышает активность остеогенетических процессов и усиливает процессы созревания новообразованной костной ткани

Личное участие автора

Автором лично изучено формирование стромальных и кроветворных клеток на поверхности остеопластических материалов Гапкол и Индост В ходе сбора материалов освоены современные методики, позволившие проверить эти материалы на цитотоксичность, способность фиксировать и пролиферировать мезенхимальные стромальные клетки костного мозга Соискателем лично проведены эксперименты на кроликах и изучены гистологические препараты с целью анализа репаративных процессов в челюсти под влиянием Гапкола и Индоста с мезенхимальными стволовыми клетками

Внедрение

Полученные данные используются в учебном процессе и в научной работе на кафедрах патологической физиологии стоматологического факультета и госпитальной терапевтической стоматологии МГМСУ

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на 124 странице машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, в том числе 74 российских автора и 102 иностранных В диссертации представлено 7 таблиц и 30 рисунков

Апробация работы

Основные положения и результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на совместном совещании сотрудников кафедры патофизиологии стоматологического факультета, госпитальной терапевтической стоматологии и детской хирургической стоматологии и челюстно-лицевой стоматологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава, 20 марта 2008 года и на совместном заседании кафедр терапевтической стоматологии, ортопедической стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии, кафедры патологической физиологии, кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО Ставропольской государственной медицинской академии 10 апреля 2008 года

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Работа проведена в 3 этапа На 1-м этапе работы на модели длительных культур костного мозга декстеровского типа были изучены 3 материала, из них два - составляющие мембрану «Пародонкол» 1-й материал - коллаген, «сшитый» химическим путем (формальдегидом), и являющийся собственно мембраной для предотвращения миграции клеток эпителия и рыхлой соединительной ткани. 2-й материал - активная часть мембраны, представляющая собой Гапкол в виде коллагеновой губки и ГАП. 3-й материал представлял собой собственно Пародонкол, состоящий из «сшитого» коллагена и Гапкола, соединенного между собой коллагеном по специальной технологии Все материалы лиофилизированы в вакуумной сушке при низкой температуре

На 2-м этапе работы исследован только материал Гапкол, то есть активная часть Пародонкола, обладающая остеопластическим действием. Гапкол был взят в двух модификациях К моменту проведения этого этапа получены новые данные о том, что введение в состав Гапкола неколлагеновых белков кости (НБК), вьщеленных на ЗАО НПО «Полистом» улучшает остеопластические свойства материала Новый

остеопластический материал получил название «Индост» (пластины). Необходимым условием проявления активности Индоста является его вакуумная обработка с целью устранения остатков уксусной кислоты и формальдегида (М О Бондаренко, 2007, С А.Ожелевская, 2007) На 3-м, завершающем, этапе работы проведена экспериментальная оценка остеопластической эффективности применения МСК, нанесенных на поверхность модифицированных образцов Гапкола и Индоста, у кроликов, которым закрывали искусственно вызванный дефект ветви нижней челюсти этими материалами. В эксперименте на кроликах были взяты следующие образцы остеопластического материала 1 - Гапкол, без МСК, вакуумной

обработки и без НБК, 2 - Индост - без вакуумной обработки и содержащий НБК, 3 - Индост с вакуумной обработкой и содержащий НБК, 4 - Индост с вакуумной обработкой, содержащий НБК и с нанесенной на поверхность материала культурой МСК

Ниже излагаются методы проведения эксперимента на каждом этапе работы

Методы исследования свойств материалов на модели длительных культур костного мозга

Эксперименты выполнены с использованием костного мозга мышей (С57В1/6 х СВА) массой 18-24 г, поставляемых питомником РАМН «Столбовая» Длительные культуры костного мозга декстеровского типа вели, как описано ранее /Чертков И Л., Фриденштейн АЛ, 1977/ Костный мозг одной бедренной кости мышей без суспендирования помещали в 10 мл полной среды на основе среды Фишера, обогащенной Ь-глютамином, 14% лошадиной сыворотки, 6% эмбриональной телячьей сыворотки, 10'8 М гидрокортизона и антибиотиками. Культуры вели при температуре 33° С в пластиковых флаконах (площадь дна 25 см2) с еженедельной сменой половины культуральной среды.

Через 3 недели культивирования, когда на дне флакона образовывался нормально функционирующий стромальный подслой, проводили изучение процессов кроветворения на материалах, помещенных в длительные культуры костного мозга Исследовано и проведено сравнение следующих видов материалов по группам- 1 Гапкол. 2. Коллаген сшитый (в виде пленки) 3. Мембрана «Пародонхол».

Образцы материалов были прямоугольной формы, площадью около 1,5-2 см2 Материалы сначала помещали в чашки Петри диаметром 35 мм, на их поверхность наносили костный мозг в концентрации 1,5х10б клеток на мл среды После этого инкубировали в течение 30 минут при температуре 37° С. Затем материалы переносили в культуральные флаконы, содержащие

3-недельные длительные культуры костного мозга, и помещали в термостат для дальнейшего культивирования. Через 7, 14, 21 и 28 суток культивирования из флаконов извлекали образцы и проводили исследование клеточного состава адгезирующего слоя Было взято по 3 образца каждого материала на каждый срок исследования Для снятия клеток с материалов использовали раствор трипсина в концентрации 0,02% в сочетании с 0,02 % раствором ЭДТА Для изучения морфологического состава костного мозга, снятого с материалов, раствор с клетками центрифугировали 10 минут при скорости 1500 оборотов в минуту Затем клетки промывали раствором Хенкса и повторно центрифугировали После центрифугирования сливали надосадочную жидкость и из осажденных на дне пробирки клеток приготавливали мазки-отпечатки, которые окрашивали по методу Паппенгейма, и подсчитывали миелограммы

С целью оценки интенсивности процессов кроветворения на различных по составу образцах материалов, перед приготовлением мазков для морфологических исследований, под микроскопом в камере Горяева подсчитывали общее количество клеток костного мозга в суспензии После снятия клеток измеряли размер каждого образца с точностью до 1 мм, вычисляли площадь поверхности, а затем результаты оценки количества клеток на образцах рассчитывали на 1 см2 их поверхности Абсолютные значения содержания стромальных и кроветворных клеток на исследуемых образцах получали расчетным путем, на основании значений общего количества клеток, снятых с 1 см2 поверхности материалов, и процентного содержания стромальных и кроветворных клеток, определенных при подсчете миелограмм

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью ^критерия Стьюдента Различие между группами считали достоверными при 1> 2 и р < 0,05

Методика заселения и изучения свойств мезенхимальных стволовых клеток на остеопластических материалах

С целью выявления цитотоксичности различных материалов, а также определения годности их поверхности для заселения клетками применяют различные неизотопные методы, основанные на окрашивании клеток красителями, с последующей экстракцией из клеток органическим растворителем и определением его концентрации с помощью спектрофотометрических методов Данный подход позволяет оценивать число клеток в исследуемом образце по показателю оптической плотности солюбилизированного из них красителя

В качестве носителей для МСК тестировали 2 имплантационных остеопластических материала.

1 Гапкол (экстрагирование в вакууме). Не содержит НБК.

2 Индост (экстрагирование в вакууме). Содержит НБК

Культивирование клеток. В работе использовали клеточные культуры фибробластов кожи человека из криохранилшца НИЦ Биомедицинских технологий (Вилар), а также МСК, полученные из костного мозга человека. Количество клеток на образцах оценивали методом фотометрии

Оценка CD-профиля МСК. Клетки, находящиеся в монослое, снимали с культурального флакона при помощи растворов трипсина и Версена. Затем клетки промывали раствором PBS центрифугированием при 1000 об/мин, 10 мин Далее клетки инкубировали в течение 30 минут в буферном растворе, содержащем PBS, 2% FBS, 0,2% Tween 20 с одним из перечисленных ниже антител к CD 54, CD 90, CD31, CD 34, CD 117, CD 621, CD 62e, HLA-DR, коньюгированными с FITC Затем клетки промывали PBS и использовали для цитометрического наблюдения на проточном цитометре Coulter Epics.

Определение показателя эффективности клонирования МСК

Монослойную культуру клеток трипсинизировали на 4 день после пересева Для этого клетки промывали 0,02 % раствором Версена, затем к ним добавляли 0,25 % раствор трипсина, инкубировали 30 - 40 секунд Клетки культивировали в условиях насыщающей влажности при температуре 37°С с 5% С02 Колонии фиксировали на 18 сутки культивирования 10 % раствором формалина Промывали дистиллированной водой, окрашивали 0,1 % раствором метиленового синего Эффективность клонирования определяли как долю клеток, способных за 18 суток культивирования сформировать колонии, состоящие из 16 и большего числа клеток При инкубации клеток в течение 18 суток в условиях клонального роста колонии достигают своего максимального размера Эффективность клонирования выражали в процентах

Оценка цитотоксичности образцов с помощью МТТ- теста.

Для фотометрической оценки пролиферации и гибели клеток в культуре использовали МТТ-тест МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромид) восстанавливается в митохондриях живых клеток под действием сукценатдегидрогеназы до водонерастворимого темноокрашенного формазана. Формазан элюирован из клеток с помощью органических растворителей

Окрашивание клеток акридиновым оранжевым. При взаимодействии с чистыми нуклеиновыми кислотами акридиновый оранжевый образует комплексы, флуоресцирующие зеленым при связывании с ДНК и красным - при связывании с РНК Клетки высевали на образцы по 60 и 20 тысяч клеток на образец После инкубации 3 и 14 дней соответственно, клетки промывали и фиксировали 10% водным раствором формалина в течение 15 минут, промывали, окрашивали раствором акридинового оранжевого Препараты просматривали при помощи флуоресцентного микроскопа 1епа1итаг при длине волны возбуждения флуоресценции 450 нм и с запирающим фильтром в 247

Окрашивание клеток флуоресцеиндиацетатом и бромистым этидием.

Флуоресцеиндиацетат (FDA) - гидрофобное нефлуоресцирующее соединение, легко проникающее через клеточную мембрану в клетки, где оно подвергается метаболизму при участии клеточных эстераз с образованием флуоресцеина, имеющего зеленую флуоресценцию Флуоресцеин не способен проходить через неповрежденные мембраны и сохраняется только в цитоплазме жизнеспособных клеток с интактной цитоплазматической мембраной. Бромистый этидий (EtBr), флуоресцирующий в красной области спектра при связывании с ДНК, используют для визуализации погибших клеток Он проникает только в клетки с поврежденной цитоплазматической мембраной Комбинированное использование этих красителей позволяет оценить долю живых клеток в суспензии или на субстрате. Клетки высевали в количестве 60 тысяч на образец, культивировали 7 дней В культуральную среду добавляли FDA 25 мкг/мл и EtBr 1 мкг/мл, инкубировали 5 минут при 37 "С Затем клетки промывали средой без сыворотки и просматривали при помощи флуоресцентного микроскопа Jenalumar при длине волны возбуждения флуоресценции 450 нм и с запирающим фильтром G 247 Изучение организации клеточного слоя на поверхности тестируемых материалов. Образцы материалов с расположенными на их поверхности клетками фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на 0,13 М какодилатном буфере с рН=7,4 Затем их дофиксировали 2% раствором 0s04, обезвоживали и высушивали методом перехода критической точки на аппарате «Hitachi НСР-2» Полученные препараты наклеивали с помощью токопроводящего клея на столики, напыляли медью в атмосфере аргона на приборе «Bakers SCD 040» и исследовали в сканирующем электронном микроскопе «Philips SEM-515»

Методика изучения репаративной регенерации нижней челюсти кролика под влиянием материалов Гапкол и Индост с МСК

В серии экспериментов на 24 половозрелых кроликах весом около 3 кг, породы шиншилла, изучено влияние модифицированных остеопластических материалов Гапкол и Индост с нанесенными на его поверхность МСК человека на заживление дефекта ветви нижней челюсти Кролики были разделены на 4 группы (по 6 животных в каждой) 3 группы -контрольные и одна группа - основная. Контрольным животным подсаживали материалы без МСК. В 1-й контрольной группе был использован Гапкол без вакуумной обработки и без НБК, во 2-й контрольной группе использовали Индост без вакуумной обработки с НБК, в 3-й контрольной группе использовали Индост с вакуумной обработкой и НБК 4-я группа - основная, использован Индост с вакуумной обработкой, НБК и нанесенной на поверхность культурой МСК. Для нанесения культуры МКС клетки высевали в 24-луночные платы с плотностью 50 тыс кл/лун Через 24 часа, когда клетки распластывались, в лунки вносили образцы Гапкола и Индоста (размером 15x15 мм) на 72 часа и непосредственно из культуральной среды переносили на область костной раны челюсти. Остеогенную дифференцировку МСК клеток не проводили, так как за время, необходимое для этой процедуры, происходит разрушение материала в среде с потерей основной массы клеток.

Под гексеналовым наркозом у кроликов выстригали шерсть в области края и ветви нижней челюсти справа С соблюдением правил асептики делали разрез кожи, тупым путем обнажали угол и ветвь челюсти. В области угла челюсти с помощью фрезы, при малых оборотах с постоянным охлаждением физиологическим раствором, создавали дефект размером около 10 х 10 мм. Дефект закрывали одним из материалов, который накладывался на края дефекта без дополнительной фиксации, кожу ушивали Для профилактики послеоперационных осложнений кроликам вводили антибиотики под кожу. Животных выводили из эксперимента через

1 и 2 месяца после операции под наркозом введением воздуха в ушную вену Фрагменты нижней челюсти кроликов фиксировали в 4% нейтрализованном растворе формальдегида. Образцы ткани помещали в Трилон Б для декальцинации, и после дегидратации, заливали в парафин Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и изучали на световом микроскопе

1. Исследование свойств остеопластических материалов на модели длительных культур костного мозга

Результаты сравнительного изучения свойств материалов Гапкол, Коллаген и Пародонкол при оценке костномозгового кроветворения в длительных культурах костного мозга показали, что на образцах Гапкола отмечалось значительно больше стромальных клеток в период с 7 по 28 сутки культивирования (табл 1)

Полученные данные о числе и морфологическом составе клеток на материалах Гапкол, Коллаген и Пародонкол в течение 4 недель культивирования свидетельствуют о хорошем развитии на всех материалах кроветворных и стромальных клеток Это отражает не только интенсивное формирование кроветворного микроокружения, но и остеогенную способность клеток-предшественников, играющих важную роль в механизме регенерации костной ткани

Изменения общего числа клеток, а также количества стромальных и кроветворных клеток на материалах Гапкол, Коллаген и Пародонкол в различные сроки культивирования в длительных культурах костного мозга

Таблица 1

Сроки исследования Число клеток Х103 на 1 см2 Образцы материалов

Гапкол Коллаген Пародонкол

7-е сутки Общее число клеток 135,0±8,2 * 92,1 ±7,4 128,0±7,9

Стромальные 28,4±1,7* 9,2±0,8 24,3±1,5

Кроветворные 106,б±6,5 82,2+6,4 103,7+6,4

14-е сутки Общее число клеток 156,3±9,4 * 111,3+7,1 137,8±9,2

Стромальные 70,5±4,2 » 13,4±0,9 22,0±1,5 **

Кроветворные 85,9+5,2 97,9±6Д 115,8±7,7

21-е сутки Общее число клеток 279,2±21,4 * 110,5±6,9 86,1±7,1 **

Стромальные 223,4±17,1 * 49,2+3,1 42,2+3,4 **

Кроветворные 55,8±4,3 61,3+3,8 43,9+3,2

28-е сутки Общее число клеток 415,0±28,9 * 152,5±8,7 242,5± 14,3 **

Стромальные 327,8±22,8 * 56,3±3,2 150,4±8,8 **

Кроветворные 87,2±6,1 96,2+5,5 92,1±5,5

* - достоверно при р<0,05, по сравнению с материалом Коллаген

** - достоверно при р<0,05, по сравнению с материалом Гапкол. На основании проведенных экспериментов по изучению изменений числа стромальных и кроветворных клеток, развивающихся на материалах в условиях культивирования в течение 4 недель, было установлено, что данные материалы не вызывали отрицательных реакций и не оказывали ингибирующего влияния на рост клеток костного мозга Наблюдалось постепенное возрастание числа клеток, отмечалось нормальное кроветворение и образование молодых и зрелых гранулоцитов Эти данные могут свидетельствовать о биосовместимости материалов Полученные результаты свидетельствовали о том, что именно Гапкол является основным остеопластическим компонентом Пародонкола, а коллаген в виде пленки выполняет барьерную функцию. Поэтому в дальнейших исследованиях изучению были подвергнуты образцы уже модифицированного Гапкола, то есть Индоста, подвергнутого вакуумной обработке, содержащего НБК и заселенного МСК

Необходимость выполнения 2-го этапа исследования заключалась в том, что Индост планировался как носитель МСК, которые обладают очень высокой чувствительностью к характеру поверхности, химическому составу и другим характеристикам материала

Показано, что поверхность образцов обоих материалов не имела существенных отличий (рис 1) Она образована коллагеновыми волокнами,

мембраноподобными структурами и скоплениями гранул ГАП.

Рис. 1. Рельеф поверхности образцов остеопластического материала. А -ГАПКОЛ, Б - ИНДОСТ (СЭМ. Ув. X 300).

Было установлено, что обе используемые модификации образцов материалов не могут быть длительно культивированы вследствие размокания и перехода клеток в суспензию. Клетки сохранялись не более 3-х дней, часто имели округлую форму и откреплялись от поверхности носителя, что подтверждается данными МТТ - теста, СЭМ и других методов исследования. Малое количество клеток на поверхности Гапкола дает ложное представление о токсичности материала (рис.2), на самом деле размножающиеся клетки быстро переходят в культуральную среду с разрушающегося материала.

Цитотоксичностъ образцов для мезенхимзльиых стволовых клеток

образец

Рис.2. Цитотоксичностъ образцов для мезенхимальных стволовых клеток.

Быстрая деструкция образцов в условиях культивирования не позволяет МСК пролиферировать на их поверхности, значительная часть клеток оказывается на поверхности лунки (табл 2 и 3), что также исключает проведение остеогенной дифференциации до внесения в область костной раны

Таблица 2.

Эффективность пролиферации. Образцы материала.

Опт. плоти. Образец

ед. Контр (лунка) ГАПКОЛ ИНДОСТ

1 0,562 0,152 0,097

2 0,653 0,184 0,153

3 0,521 0,175 0,127

Средн знач 0,58 ±0,0466 0,171±0,0187 0Д26±0,0317

Кол-во клеток х 103 176 ±21,2 7 ±4,3 5,4 ±7,6

Таблица 3.

Эффективность пролиферации Лунки

Опт. плотн. ед. Образец

Контр (лунка) ГАПКОЛ ИНДОСТ

1 0,562 0,153 0,28

2 0,653 0,14 0,259

3 0,521 0,135 0,265

Средн знач 0,58 ±0,0466 0,143±0,0105 0,268±0,0122

Полученные данные явились основанием для применения модифицированного введением НБК Индоста без проведения остеогенной дифференцировки, как в случаях со стабильными носителями стволовых

клеток: лолиметилметакрилатом, полиэтиленом, полиамидом и др (Т.Ю Татаренко-Козьмина, 2007). Тем не менее, необходимость применения этих материалов на практике требует дальнейшего совершенствования применения резорбируемого остеопластичекого материала, заселенного стволовыми клетками и содержащими факторы роста в составе НБК. Это обстоятельство и определило планирование и проведение 3-го этапа работы.

С этой целью в серии экспериментов на 24 кроликах изучено влияние модифицированного остеопластических материалов Гапкол и Индост с нанесенными на его поверхность МСК на заживление дефекта ветви нижней челюсти Животных выводили из опыта через 1 и 2 месяца после оперативного вмешательства Этих сроков эксперимента было достаточно для оценки общих тенденций, лежащих в основе построения костной ткани на месте дефекта челюсти

Как показывают результаты исследования тканевого материала, полученного от животных 1-й (без вакуумной обработки и без НБК) и 2-й (без вакуумной обработки с НБК) контрольных групп, ответы тканевых элементов на применение материалов могут быть квалифицированы как умеренные воспалительные и воспалительно-деструктивные процессы, особенно через 1 месяц после начала опыта Возможно, что эти реакции в зоне репаративной регенерации обусловливаются выходом из материала частиц ГАП, воздействующих на тканевый субстрат в области травмы В то же время в тканях отмечалось и новообразование костной субстанции. В 3-й контрольной группе (Индост с вакуумной обработкой) наблюдений процессы дифференцировки в костных структурах протекали значительно быстрей, чем в 1-й и 2-й контрольной группах. В мягких тканях наблюдались организация и частичное восстановление клеточных и волокнистых структур, в том числе мышечной ткани. Другая особенность, характерная для 3-й группы, заключалась в заметном сужении слоя материнской кости Местами она была представлена одной лишь кортикальной пластиной и отделялась от инородного тела слоем

новообразованной кости и соединительнотканной прослойкой Тем не менее, наружный край материнской кости, определяемый по базофильной линии склеивания, был ровным, что свидетельствовало об отсутствии в этой области выраженных резорбтивных процессов Таким образом, в 3-й группе подтверждена эффективность применения НБК-содержащего Индоста

Для 4-ой, основной группы наблюдений, были характерны более умеренные, чем в других группах, проявления воспалительно-деструктивных изменений Отмечена более высокая активность остеогенетических процессов и значительная интенсификация процессов созревания новообразованной костной ткани, по сравнению с контрольными, и в том числе 3-й контрольной группой

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, использование Индоста после вакуумной обработки, с НБК и с нанесенной культурой МСК вызывает падение интенсивности патогенных эффектов и повышение остеогенетического потенциала материнской костной ткани Остеогенный потенциал ксеногенных МСК, нанесенных на Гапкол с последующим введением в костную рану кролика можно объяснить следующим образом Показано, что МСК костного мозга вырабатывают значительное количество таких факторов, как VEGF, bFBF, PIGF, МСР-1 Клетки при дифференцировке в остеогенном направлении вырабатывают белки внеклеточного матрикса, в том числе специфичного для костной ткани, коллаген 1 типа, остеопонтин, остеокальцин, остеонектин (Zuk, 2002)

Таким образом, клетки, выращенные на носителе и имплантированные в место дефекта, могут стимулировать собственный остеогенез ткани за счет секреции ряда факторов роста и отложения костного матрикса Эффективность ксеногенных стволовых клеток, полученная в нашем эксперименте и выражающаяся в стимулировании построения костной ткани у другого вида, позволяет предположить, что

белки внеклеточного матрикса, специфичные для костной ткани, не обладают строгой видовой специфичностью По-видимому, МСК на биорезорбируемом носителе (коллаген с ГАП) в присутствии НБК и факторов имеющихся в ткани, куда произведена имплантация, проходят самостоятельную остеогенную дифференциацию, что и определило эффективность применения остеопластического материала в 4-й группе эксперимента. Полученные результаты позволяют также сформулировать дальнейшие направления исследований Во-первых, применение аутологичных или аллогенных МСК, исключающих иммунный конфликт и перенос трансмиссионных заболеваний реципиенту Во-вторых, разработка новых резорбируемых носителей, более устойчивых в культуральной среде для проведения начальных этапов остеогенной дифференцировки для внесения в костную рану. Эти исследования в настоящее время находятся в сфере внимания исследователей и являются предметом дальнейших разработок.

выводы

1 Результаты сравнительного изучения свойств остеопластических материалов при оценке костномозгового кроветворения в длительных культурах костного мозга показали, что на образцах Гапкола формировалось значительно больше стромальных клеток, чем кроветворных в период с 7 по 28 сутки культивирования Интенсивное развитие кроветворного микроокружения на остеопластических материалах тесно связано с остеогенной способностью клеток-предшественников.

2. Образцы Индоста подвергнутые вакуумной обработке и содержащие неколлагеновые белки кости не могут быть длительно культивированы с мезенхимальными стволовыми клетками вследствие их перехода в суспензию и на пластик Эти клетки сохраняются на поверхности Гапкола в течение 3-х дней после начала культивирования.

3 Малое количество клеток на поверхности Гапкола и Индоста дает ложное представление о токсичности материала, так как размножающиеся клетки быстро переходят в культуральную среду Быстрая деструкция образцов материалов в условиях культивирования не позволяет проведение остеогенной дифференцировки

4 Внесение в костную рану ветви нижней челюсти кролика Гапкола без вакуумной обработки и не содержащего неколлагеновые белки кости вызывает умеренные воспалительные и воспалительно-деструктивные процессы через 1 месяц после начала опыта. Новообразование костной субстанции происходит к концу 2-го месяца после нанесения травмы

5 Внесение в костную рану ветви нижней челюсти кролика материала «Индост» с вакуумной обработкой и содержащего неколлагеновые

белки кости вызывает усиление построения костной ткани на фоне снижения воспалительно-дистрофических реакций 6. Нанесение мезенхимальных стволовых клеток на поверхность Индоста вызывает более умеренные, чем в других группах, проявления воспалительно-деструктивных реакций Отмечена более высокая активность остеогенетических процессов и значительная интенсификация процессов созревания новообразованной костной ткани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется использование длительной культуры костного мозга декстеровского типа для предварительной оценки биосовместимости и остеогенного потенциала материалов Гапкол и Индост (пластины)

2 Культивирование мезенхимальных стволовых клеток на Индосте, содержащем неколлагеновые белки кости, может продолжаться не более 3-х дней из-за нестойкости материала в культуральной среде и не позволяет проведение остеогенной дифференциации

3 Заселение мезенхимальными стволовыми клетками поверхности Индоста, может быть рекомендовано для уменьшения проявления воспалительно-деструктивных реакций, повышения активности остеогенетических процессов и усиления процессов созревания новообразованной костной ткани

Список работ опубликованных теме диссертации

1 Мальгинов Н Н., Фионова Э.В, Ожелевская С А., Чепель А А Клеточные технологии в оценке биосовместимости остеопластических материалов // Материалы третьей международной конференции «Болезни

цивилизации в аспекте учения В И.Вернадского. Москва, 10-12 октября 2005 года, М, 2005, С 238-240

2. Воложин А.И., Мальгинова И.С., Лебедев В.Г., Фионова Э.В., Воложин Г.А., Чепель A.A. Оценка биосовместимости остеопластических материалов с использованием длительных культур костного мозга. // Российский стоматологический журнал 2005, №3, С 17-19.

3. А.И.Воложин, М.О.Бондаренко, А.В.Фионова, С.А. Ожелевская. Применение иммуномодулятора Полиоксидоння совместно в неколлагеновыми белками кости для ускорения регенерации челюсти при иммунодефицитном состоянии в эксперименте. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2007, №1, С 27-28.

4. С А.Ожелевская, А С Григорьян, К С Десятниченко, В Н.Матвеева, Р А Дружинина, Э В Фионова, А Н Гурин, К Г Караков Оптимизация регенерации челюсти помощью неколлагеновых белков кости в составе материалов «Гапкол» в эксперименте // Материалы 9-го ежегодного научного форума «Стоматология 2007», посвященного 45-лентию ЦНИИС С291-292

5. Фионова Э. В., Десятниченко К. С., Докторов А. А., Воложин А. И., Репаративные процессы в нижней челюсти кроликов при использовании остеопластического материала ИИДОСТ пластины с мезенхимальными стромальными клетками. Cathedra. - 2008. - Т. 7 . -№. 1- С. 16-20.

Заказ № 617. Объем 1 п л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш» г. Москва, ул Палиха~2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Актуальность

В настоящее время в практической медицине, а именно в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и травматологии, используются резорбируемые и биостабильные композиционные материалы для замещения костных дефектов после травмы, удаления опухолей, устранения врожденных и приобретенных дефектов (М.Ш.Мустафаев и соавт., 1998, 2000; С.Г.Курдюмов и соавт., 2000; А.М.Воложин, В.С.Агапов и соавт. 2000). Среди резорбируемых остеопластических материалов большое распространение получили композиты, образованные из коллагена и синтетического минерального компонента, гидроксиапатита и трикальцийфосфата. К ним относится серия материалов: Колапол, Гапкол, Коллапан, производимые фирмами «Полистом» и «Интермедапатит». Эти материалы обладают высокой степенью биосовместимости, технологичны при изготовлении, имеют по сравнению с импортными аналогами невысокую стоимость, но не уступают им в качестве и остеопластических свойствах. В механизме остеопластического действия этих материалов основная роль принадлежит их остеокондуктивным свойствам, что способствует хорошей интеграции с костной тканью. Недостатком материалов является низкая способность инициировать построение костной ткани из-за отсутствия специфических стимуляторов-остеоиндукторов (морфогенетических • белков и др.). В связи с этим продолжительность реабилитации пациентов после оперативного вмешательства у некоторых пациентов (особенно при наличии общесоматических заболеваний: сахарный диабет, другие эндокринопатии, гипертоническая болезнь и т.д.) отличается длительностью и, кроме того, повышается риск послеоперационных осложнений. С целью придания этим материалам свойств инициировать построение костной ткани в их состав вводят компоненты межклеточного матрикса: гиалуроновую кислоту и хондроитинсульфат (В.В.Сарычев, 2005; И.С. Мальгинова, 2005). Важная позитивная роль может принадлежать также неколлагеновым костным белкам, которые выделены в чистом виде и испытаны в. эксперименте в составе составе остеопластического материала. Этот материал под названием «Пластины коллагеновые с гидроксиапатитом остеоиндуктивные "ИНДОСТ" ВФС 01032006/4599-06 от 22.12.2006» разрешены к клиническому применению в стоматологии.

Дальнейшее совершенствование свойств остеопластических материалов может быть осуществлено при использовании новой биотехнологии, позволяющей сформировать на поверхности биосовместимых резорбирующихся композитов слой костных клеток из, клеток — предшественников костного мозга. Костные клетки- сами являются источником специфических факторов костного морфогенеза. Использование этих технологий в дальнейшем может существенно снизить, риск осложнений и сократить период реабилитации, пациентов после оперативного устранения дефектов костей лица и челюстей, а также других костей скелета, особенно в случае' нарушенного заживления костной раны при иммунодефицитных состояниях и общесоматических » заболеваниях. Исследований по применению биорезорбируемых композитных материалов заселенных остеопрогениторными клетками, полученными из мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, проведено не было, что послужило основанием для формулирования цели , и задач-данной работы.

Цель работы: в лабораторных условиях и экспериментально обосновать эффективность применения» неколлагеновых белков кости в составе остеопластического материала Гапкол, модифицированного вакуумной обработкой и с культурой мезенхимальных стволовых клеток для оптимизации репаративной регенерации челюстной кости. 6

Задачи

1. Оценить в длительных культурах костного мозга декстеровского типа динамику кроветворения на поверхности образцов остеопластических материалов: Гапкол, Коллаген и Пародонкол.

2. Определить возможность применения образцов Гапкол а, модифицированного вакуумной обработкой и содержащего неколлагеновые белки кости, для длительного культивирования в среде, содержащей мезенхимальные стволовые клетки.

3. Изучить влияние материала Гапкол на цитотоксичность, пролиферацию и дифференцировку фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток человека.

4. Определить влияние Гапкола без вакуумной обработки и не содержащего неколлагеновые белки кости, внесенного в костную рану ветви нижней челюсти кролика, на репаративную регенерацию. *

5. Оценить, как влияет Гапкол с вакуумной обработкой и содержащий неколлагеновые белки кости на построение костной ткани, ветви нижней челюсти кролика.

6. Определить особенности репаративного остеогенеза в ветви нижней челюсти кролика при внесении в костную рану Гапкола, содержащего неколлагеновые белки кости с мезенхимальными стволовыми клетками на поверхности.

Положения, выносимые на защиту

1. Формирование на образцах Гапкола преимущественно стромальных, чем кроветворных клеток при культивировании в длительной культуре костного мозга декстеровского типа. Образцы Гапкола и Индоста подвергнутые вакуумной обработке и содержащие НБК не могут быть культивированы более 3-х дней вследствие перехода клеток в суспензию, содержащую мезенхимальные стволовые клетки. Малое количество клеток на поверхности Гапкола и Индоста дает ложное представление о токсичности материала, так как МСК быстро переходят в культуральную среду с разрушающегося материала. Быстрая деструкция материала в условиях культивирования не позволяет клеткам пролиферировать и подвергаться остеогенной дифференцировке. 3'. Внесение в костную рану ветви нижней челюсти кролика Гапкола без вакуумной обработки, не содержащего НБК, вызывает умеренные воспалительные и воспалительно-деструктивные процессы.Внесение в костную рану ветви нижней челюсти кролика Индоста с вакуумной обработкой и содержащего НБК вызывает усиление построения костной ткани. Нанесение МСК на поверхность Гапкола, содержащего неколлагеновые белки кости, вызывает более высокую активность остеогенетических процессов в челюсти и интенсификацию процессов созревания новообразованной костной ткани.

Научная новизна

Впервые установлено, что-в декстеровской культуре костного мозга на образцах остеопластического материала Гапкол формируется значительно больше стромальных, чем кроветворных клеток. Научной новизной отличаются данные о том, что Индост, подвергнутый вакуумной обработке и содержащий неколлагеновые белки кости, не может быть длительно культивирован вследствие нестойкости материала и быстрого разрушения в жидкой среде. Деструкция образцов Гапкола и Индоста в условиях культивирования- не позволяет мезенхимальным стволовым клеткам пролиферировать. на материале и подвергаться остеогенной дифференциации. Введение в состав Индоста неколлагеновых белков кости повышает его остеогенетический потенциал при репаративной регенерации нижней челюсти только после удаления летучих соединений с помощью вакуумной обработки материала. Заселение МСК Индоста, содержащего НБК, вызывает слабые проявления воспалительно-деструктивных реакций, повышает активность остеогенетических процессов и способствует созреванию новообразованной костной ткани.

Практическое значение

Оценка динамики кроветворения в длительных культурах костного мозга на поверхности Гапкола является важным этапом для оценки их биосовместимости. Преобладание на материалах Гапкол формирования стромальных клеток над кроветворными клетками характеризует его остеопластический потенциал. Вакуумная обработка материала Гапкол с целью удаления остатков уксусной кислоты и формальдегида является необходимым условием для проявления активности, введенного в состав материала неколлагеновых белков кости. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток на Индосте, модифицированном вакуумной обработкой и содержащим неколлагеновые белки кости, может продолжаться не более 3-х дней из-за нестойкости материала в жидкой среде и не позволяет проведение'остеогенной дифференциации. Заселение поверхности Гапкола, содержащего НБК, мезенхимальными стволовыми клетками уменьшает проявления воспалительно-деструктивных реакций, повышает активность остеогенетических процессов и усиливает процессы созревания новообразованной костной ткани.

Предложения по использованию результатов исследования

Полученные данные используются в учебном процессе и в дальнейшей научной работе на кафедре патофизиологии стоматологического факультета МГМСУ и на кафедре госпитальной терапевтической стоматологии.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на 124 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, в том числе 74 российских автора и 102 иностранных. В диссертации представлено 7 таблиц и 30 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. Результаты сравнительного изучения свойств остеопластических материалов при оценке костномозгового кроветворения в длительных культурах костного мозга показали, что на образцах Гапкола формировалось значительно больше стромальных клеток, чем кроветворных в период с 7 по 28 сутки культивирования. Интенсивное- развитие кроветворного микро окружения на остеопластических материалах тесно связано с остеогенной способностью клеток-предшественников.

2. Образцы Индоста подвергнутые вакуумной обработке и содержащие неколлагеновые белки кости не могут быть длительно культивированы с мезенхимальными стволовыми клетками вследствие их перехода в суспензию и на пластик. Эти клетки сохраняются на поверхности Гапкола в течение 3-х дней после начала культивирования.

3. Малое количество клеток на поверхности Гапкола и Индоста дает ложное представление о токсичности материала, так как размножающиеся клетки быстро переходят в культуральную среду. Быстрая деструкция образцов материалов в условиях культивирования не позволяет проведение остеогенной дифференцировки.

4. Внесение в*костную рану ветви нижней челюсти кролика Гапкола без вакуумной обработки и не содержащего неколлагеновые белки кости вызывает умеренные воспалительные и воспалительно-деструктивные процессы через 1 месяц после начала опыта. Новообразование костной субстанции происходит к концу 2-го месяца после нанесения травмы.

5. Внесение в костную рану ветви нижней челюсти кролика материала «Индост» с вакуумной обработкой и содержащего неколлагеновые белки кости вызывает усиление построения костной ткани на фоне снижения воспалительно-дистрофических реакций. 6. Нанесение мезенхимальных стволовых клеток на поверхность Индоста вызывает более умеренные, чем в других группах, проявления воспалительно-деструктивных реакций. Отмечена более высокая активность остеогенетических процессов и значительная интенсификация процессов созревания новообразованной костной ткани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется использование длительной культуры костного мозга декстеровского типа для предварительной оценки биосовместимости и остеогенного потенциала материалов Гапкол и Индост (пластины).

2. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток на Индосте, содержащем неколлагеновые белки кости, может продолжаться не более 3-х дней из-за нестойкости материала в культуральной среде и не позволяет проведение остеогенной дифференциации.

3. Заселение мезенхимальными стволовыми клетками поверхности Индоста, может быть рекомендовано для уменьшения проявления воспалительно-деструктивных реакций, повышения активности остеогенетических процессов и усиления процессов созревания новообразованной костной ткани.