Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки

Автореферат отсутствует в библиотеке
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертация отсутствует в библиотеке
ДИССЕРТАЦИЯ
Петренко, Анатолий Анатольевич Москва 2003 г.
Ученая степень
кандидат биологических наук
ВАК РФ
14.00.14
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки

На нравах рукописи

Петренко Анатолий Анатольевич

Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки

(14.00.14 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии вирусов (руководитель — доктор биологических наук, профессор ФЛ. Киселев) НИИ Канцерогенеза ГУ Российсвого Онкологического Научного Центра им. НЛ. Бяохина Российской Академии Медицинских Наук-

НаучныВ руководитель: доктор бюшичкш иаух,

профессор ФЛ. Кксмви

Официальные оппоненты:

доктор биологических ваух, профессор АЛ. Лншанкйа; доктор биологических неук, профессор ДМ. Сштвовсхяй

Ведущая организация: НИИ Физико-химической биологии им. Белозерского МГУ

Зашита диссертации состоится " 1200./г. в /О часов на

заседании Диссертационного совета при ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блояииа РАМН по адресу: 115478, Москва» Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ РАМН. Автореферат разослан 2003 г.

Учйный секретарь Диссертационного совета ГУ РОНЦ РАМН:

доктор медицинских наук, профессор ЮА. Барсуке»

4 г**-**

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Рак шейки матти занимает второе место среди всех онкологических заболеваний у женщин. Этнологическим фактором рака шейки метки (РШМ) является вирусы папиллом человека (ЯРУ) группы высокого риска (типы 16,18 и Другие). После вирусной инфекции РШМ может развиться на протяжении нескольких лет, в течение которых возникают и накапливаются изменения в клеточных генах, регулирующие такие важные клеточные процессы, как пролиферация, апоптоз, аягиогевез, поддержание генетической стабильности.

В последнее десятилетие было установлено, что в многостадийном процессе образования опухолей нарушение функций клеточных генов может происходить ве только в результате генетических событий (точечные мутации, делении, амплификация н реарранжнровка генов), но н в результате эпигенетических изменений, в том чвеле локального гнперыегштировання ДНК. Аберрантному метилированию в опухолевых клетках подвергаются специфические последовательности - СрО-островки, ассоциированные с 5' регуляторнымн районами многих генов. В нормальных клетках большинство Срв-островков не метилировано, а их метилирование в опухолевых клетках, как правило, сопровождается подавлением транскрипции соответствующего гена, наследуемой при делении клетки. Механизмы инициации локального метилирования СрО-островаи» в опухолях тока не ясны.

В последнее время разработаны методы вдентификацкв гиперметшлрояанных районов ФПС, основанные на дифференциалы! ом статусе метилирования СрО-островков в нормальных и опухолевых клетках. С немощью чтих методов были идентифицированы гены, ивактинируемые в опухолях путем аберрантного метилирования ассоциированных с ними Срв-островков. Среди них обнаружены как новые, утрата функций которых оказалась существенной дня развития опухолей, так и известные гены, подавление экспрессии которых в опухолях в отсутствии ннактнвнрующих мутаций уже было продемонстрировано. Число генов, для которых обнаружен эпигенетический механизм япактивации в опухолях, постоянно растет, что свидетельствует о широком распространении этого механизма в процессе ¿шщерогенеза. В связи с этим представляется актуальным поиск генов, ннагпгенруеыых в опухолях шейки матки при нарушения метилирования ДИК.

Цель данной работы состояла в идентификации гиперметнлироваяных в опухолях

икйкн матиг СиОчмштив я ассоциированных с ними генов, экспрессия которых может \ РОГ НАЦИОНАЛЬНАЯ

дать пояяиряишеждетвяе арутвеяия метилирования ДНК.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие эксперимигтальные задачи:

1) Провести скрининг аберрантно-метвлированных ОС-богатых последовательностей ДНК в карциномах шейки натки метода» метялчувствительной ПЦР со статистическими ОС-богатыми првймсрамя, определить иуклеотидную последовательность об1гаружсннш йС-богатых фрагментов ДНК, выявить среди них Сро-островкн.

2) Провести поиск в базах данных гомояогий выявленных Срв-островков с известными последовательностями ДНК.

3) В случае отсутствия гомологий СрО-островка с известными последовательностями в базах данных, провести клонирование и определение нуклеотадной последовательности фрагментов ДНК, фланкирующих Срв-островок для его локализадаи в геноме человека.

4) В случае установления ассоциации выявленных СрС-островков с генами, провести анализ статуса метилирования и экспрессии соответствующих генов в первичных опухолях 8 клеточных ливнях карцином шейки матки.

^ми»!пя.-

С помощью метода иетшпувствягельвой ПЦР со статистическими СС-богатымн лраймерами было выявлено 7 ОС-богатых фрагментов ДНК дпивоб от 300 до 1200 пир оснований, пять ю которых (более двух третей) обладают свойствами СрО-островков. Из пяти выявленных СрО-островков два оказались непредставленными в опубликованных версиях генома человека: фрагмент 26 был представлен неполностью (отсутствовала область, фланкирующая У конец гена рЗА-адаптина), фрагмент 22 до сих пор отсутствует в опубликованных базах даыпых.

В работе впервые показано подавление экспрессии мРНК гена рЗЛ-адаптина в клеточных линиях рпка шейки матки. Продукт гена рЗА-адаптина представляет собой одну нэ субьеданиц адаптеряого комплекса АР-3, вовлеченного во внутриклеточный транспорт белков. Показана возможность восстановления экспрессии мРНК (¡ЗА-адаптина под действием деметпирующего агента 5-азашггадииа, что указывает на емзь процессов метилирования и транскрипции гена. Впервые определена нуклеегшдиа! последовательность района, прилегающего к 5' концу гена. Установлены размер первого экзона гена рЗЛ-адаптина и размер СрО-островка, ассоциированного с геном. СрО-островок гена рЗА-адапяпта включает 5' ветранехрибирусмый район гена, первый экзон и начало первого янтрова.

-54. Цяттао-пп.тгежкм ютммкть овбогт.

Теоретическое значение рабеггы заключается в получении новых данных об участии клеточных генов в злокачественной трансформации под действием вирусов папиллом человека. Обнаруженное подавление экспрессии ггна рЗА-адантына в хлепсах карцином шейки матки указывает на необходимость дальнейшего исследования роли белковых комплексов, вовлеченных в эндо/экзоцитоз белков, в канцерогенезе. Показана возможность идентяфицикации СрО-островков, до сих пор не представленных в опубликованных версиях иукпеотвдных последовательностей генома человека, с помощью метода ыетилчувствительной ПЦР со статистическими СтС-богатыми праймерами, что позволяет получить информацию о ОС-богатых трудиоклонируемых районах генома человека.

Диссертационная работа была апробирована 20 нюня 2003 г. на совместной конференции лабораторий Молекулярной биологии вирусов, Методов скрининга канцерогенов, Биохимии опухолей, Регуляции клеточных н вирусных онкогенов, Иммунологии онкогеяшх виру«», Вирусного каяцерокееза НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохняа РАМН. Основные положения диссертации обсуждались на конференциях лаборатории Молекулярной биологии вирусов и на Учввом совете НИИ Канцерогенеза я представлены двумя сообщениями на международных конференциях. По теме диссертационной работы опубликовано б печатных работ. Работа выполнена прв финансовой под держке РФФИ (грант 01-04-49225). Спууктгру щ объЫ работы,

Диссертация состоит нз следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, раздела собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и библиография. Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста я включает 4 таблицы, 20 рисунков и список литературы из 129 ссылок на работы отечественных и

зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Иив ШУИ1 ?1>Ч|

Обзор литературы посвящен феномену метилирования ДНК в клетках млекопитающих. Обсуждают* функции метилирования ДНК, изменения статуса метилирования генома млекопитающих во время развития, механизмы регуляции. Описаны метнлтрансферазы - ферменты, осуществляющие метилирование ДНК у млекопитающих. Проанализирована роль метилирования ДНК в канцерогенезе Проведен сравнительный анализ современных методов определения статуса мегалирования ДНК.

Д. М«иммы я истоды.

Образцы рака шейки матки и морфологически нормальных прилегающих тканей были получены и отделении радиохирургни РОНЦ ям H.H. Блохнва РАМН и результате оперативных вмешательств и любезно предоставлены д.ы.н. Не-чушкиным М.И. Клинический диагноз был подтвержден патоморфологическим исследованием в отделении патоморфолопго РОНЦ им. H.H. Блсхииа РАМН дм.н. Смирновым A3. Сбор материала в создание банка биопсийного материала осуществляли ст.н.с. Л.А. Семенова и ц.с. Л.С. Павлова. ДНК и РНК выделена гуанндишгютвоционатным методом и часть любезно предоставлена Т. Гришо, М. Атталеб и ст.н.с, В.К. Кобзевой. Всего было исследовано 30 образцов цпоскоклеточвого рака шейки матки, имеющих стадии опухолевой прогрессии Т1а-Т3 и классифицированных согласно критериям 003. Все исследуемые образцы опухолей шейки матки были позитивны но HPV-16 или HPV-18. Также в работе исследовали клеточные линии рака шейки матжя HcLa и Sffla.

В работе были использованы следующие методы исследования: выделение ДНК и РНК из клеточных культур гуанидиняэотвосноиатным методом, выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови с использованием прогеяпазы К, рестрикция, бисульфитная модификация ДНК, ПЦР, гель-электрофорез нуклеиновых кнеяот, выделение продуктов ПЦР из гелей, клонирование продуктов ПЦР, блот-гибрядизацкя нуклеиновых кислот (Сауэсрн и Нозерн-блогшнг), обратная транскрипция в сочетании с ПЦР. Компьютерный анализ выявленных последовательностей ДНК проводили с шжощью сервиса BLAST (http^AvwwjicW.olmJtih.gov/BLAST/).

3. Результаты я обсуждение.

Поиск СрС-остро*껈, гыперметипмрованнмх * опухолях шешаг мамки

1) Прятал метода метидчу^утвитоддой ППР дп утатнстичес|д»я *У-<ч>гатыма

Для обнаружения CpG-островков, метилированных в опухолях шейки матки мы использовали метол метилчувствнтельБоЙ ПЦР со статнстнческнмн GC-богятымв ораймерами (СП-ПЦР) (Gonsalgo et at. 1997). Метод основан на использовании прайиеров, подобранных к среднестатистической последовательности ДНК, за исключением 3' кош», который состоит из 5-6 останков цитозииа я гуанина в различной комбинации. Такие праймеры амшшфшшрукгг в неспецифичесгах условиях (яри низких температурах отжига) ОС-богатые участки генома, включая в СрО-островки. Различие в статусе метилирования фрагментов ДНК между нормальной тканью (лейкоцитами) я опухолью выявляют с помощью обработка ДНК метилчуьствнтельнымн рестрютаэамя (МЧР), предшествующей амплификации (рис.1). МЧР имеют в составе своих сайтов рестрикции

ДНК ОПУХОЛЬ

Обработка МЧР

ПААГ-электрофорез

Рисунок I Схематическое изображение метой СП-ПНР Кружком обозначен сайт МЧР О - «йт не метилирован,® - сайт метилирован; У - статистический <5С-богатый праймер

один и более СрО линуклеотидов и не способны рестрипироватъ свой сайг, если иитоэии в составе определенного СрО линуклестнда метилирован После амплификации ПЦР продукты разделяли в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях Для детекции продуктов использовали два даюших адекватные результаты метода' включение меченого нуклеотида Га-^Р-ЙАТР) в состав продуктов ПЦР при амплификации и серебрение фрагментов ДНК непосредственно в полиакриламидном геле. На рисунке 2 представлены

44ЭЛ 4430 4Э9Л 4390 438Л 4380 МЧР - +-+_ + -+ -+ - +

Рисунок 2 Анализ тродукто» «ншшфнмщнк ДНК из опухолевых н нормальных меток с помощью СП-ПЦР £ ПААГе Стрелкой указан фрагмент, взятый в дальнейшее исследование Вверх> указаны номер образцов, где Л - ДНК из лейкоцитов, О - ДНК из опухоли шейки матки, МЧР НраТ1, Стрелкой )казан Дифференциально метилированный а нормальных н опухолевых клетках продукт СП-ПЦР

результаты типичного опыта. Объектами выбора и дальнейшего исследования служили продукты ПЦР, отсутствующие в ДНК из нормальных клеток и присутствующие в ДНК из некоторых опухолей при обработке МЧР (отмечен стрелкой)

Главными недостаткам метода являются обнаружение ОС-богатых последовательностей, которые не представляют собой Срв-островки, и возможность неполного расщепления сайта рестрикции МЧР Поэтому подтверждение статуса метилирования выявленных фрагментов требует дополнительных исследований Таким образом, при отборе фрагментов ДНК, как вероятных Срв-островко», мы

руководствовались следующими критериями. Во-первых, в составе фрагмента должны присутствовать сайты, по меньшей мере, одной метилчувствительной рсстриктазы, что определяется по отсутствию продукта в рестрицироваиной ДНК из нормальной ткани. И, во-вторых, он должен быть метилированным в двух и более опухолях.

31. Дяалнз фрагментов, вцяррерных с помошыо метидчувствитсльяой ПШ» со статистическими ОС-богатыми пра»™^^

В результате скрининга 15 парных образцов ДНК с набором GC-богатых праймеров были отобраны семь фрагментов ДНК, которые соответствовали вышеприведенным требованиям. Каждый фрагмент был выделен ш геля, повторно аишшфицирован в специфических условиях с праймерами, с которыми он был выявлен, и клонирован. Затем была определена его нуклеотидная последовательность.

Анализ полученных последовательностей включал локализацию исследуемых фрагментов в геноме человека с помощью набор программ поиска гомологий BLAST® и установления наличия в исследуемом фрагменте последовательности CpG-островка. Для этого использовали общепринятые критерии СрО-островков: длина более 200 п.и., ОС состав более 0.50, отношение наблюдаемого числа CpG дииуклеотидов к теоретически возможному (параметр Н/Т) более 0.60 (Gardmer<3anfoer and Frommer 1987).

Результаты анализа выявленных фрагментов представлены в таблице!.

Фрагмент И локализован во втором нитроне гена LOCI48870, расположенного на первой хромосоме в зоне 1р36.32. Дяиинлй ген получен автоматическим компьютерным анализом с использованием метода предсказания BLAST и подтвержден наличием гомологии с последовательностью одного клона EST. По GC составу и показателю Н/Т уют фрагмент не является CpG-островком.

Фрагмент 30 расположен в локусе ALI 37850 девятой хромосомы в зоне 9q31.3-33.3 Данный фрагмент также представляет собой просто GC-богатую последовательность.

Фрагмент 22. В базах данных не обнаружено последовательности гомологичной этому фрагменту. Фрагмент обладает свойствами СрО-островка.

Фрагмент 32 расположен в локусе AL137058 на тринадцатой хромосоме в зоне 13q32.2-33.3, окружен с двух сторон повторами MER21B - 5* и AhiSx-3' и гомологичен СрО-островку, выявленному с помощью компьютерного анализа (Sanger Centre Chromosome 13 Mapping Group, http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cbrl 3). Ген, ассоциированный с этим CpG-островком, не определен.

Фрагмент 34 был выявлен при клонировании фрагмента 32 в качестве незначительной примеси при электрофорезе в ПААГе. Местоположение фрагмента 34 в геноме - хромосома X, 3* область гена LOC254722, полученного компьютерным анализом с использованием метода предсказания GeoomeScan н подтвержденного гомологией с

одвкм клоном EST. Фрагмент 34 входит в состав последовательности CpG-островка, включающей конец последнего нитрона, последний экэон гена и ветранскрибиууемуто

меЖ1 енную последовательность.

Таблица 1. Фрагмент ДНК, идентифицированные методом СП-ГЩР.

Рапир фрагмента днК (■•я-) Размер CpG-остромеа Н/Т CpG* C"*GC*'"e Гомологп

18 267 — 0.16 0.53 хромосома 1, ген WC148S70

30 303 — 0.25 0.58 хромосома 9

22 563 563 0.» мшмтм

31 537 Ж 0.67 0.6$ хромосома 13

34 468 513** М9 »56 хромосммХ, n*LOC254722

36 633 3303** ♦.74 0.72 хромосомы 4 я It, 33-kb notrop, Tt*DUX4

26 175 Г74 0.60 хромосома S, гея BiA-одоптин

ИдапфтпвовныЯ вомер ■ GenBefc 22 - АР21 tl 12,26 - AF247736 * В случае фрепмегое 26,32,34 в 36 тяЛ потяел* правдой дм всего CpG острого " ПожныЯ ржшф CpG осфома укюан ва оспомлвя гомологии ■ случае фрагменп 34 с геном ЮС2Я722, > сжучае фрапюта 36 с 3J-ld> повтором, в случае фрагмент* 26 после определен» нумюгвдной яаеяамвимьиояи 3' регулугорвого раВоаа гена /)ЗА-айшшшш

Фрагмент 36 гомологичен близкородственным друг другу областям с таядемными 3.3-kb повторами, располагающимся в щяпеломервых областях хромосомы 10 (зова 10q26.3) и хромосомы 4 (зова 4q35, полиморфный район D4Z4), к кДНК гена DUX4. Локус D4Z4 включает от 10 до 100 ткццеыных 3.3-кЪ повторов. Каждая копня повтора содержит рамку считывания гена DUX4, кодирующего транскрипционный фактор с двумя гомеодомевамн (Gabriels et at. 1999). По своим параметрам З.З-kb повтор обладает свойствами CpG-островка.

Фрагмент 26 имеет неполную гомологию с 3' копцом кДНК гена filA-adanmima в 3' концом перекрывается с последовательностью, обнаруженной ранее как CpG-островок (Cross et al. 1994) в расположенной по результатам последующего анализа в интропе гева f&A-adatmwa. Нахождение фрагмента 26 в этого CpG-островка в составе единой последовательности мы подтвердили получением общего продукта амплификации ДНК из клеток HeLa и его последующем секвеиироваиием. Фрагмент 26 обладает свойствами CpG-островка (значение II/T составляет 0.78, содержание ОС равно 0.59).

Таким образом, асе семь фрагментов ДНК, выявленных методом СП-ПЦР, оказались ОС-богатыми последовательностями, и пять из них СрО-островками. Дна СрО-островка оказались непредставленными в опубликованных версиях генома человека. Для подтверждения дифференциального статуса метилирования был проведен анализ СрО-островков 32 в 26 на относительно большом числе опухолей и двух клеточных линиях карцином шейки дотлей.

3.3. Опредер?""Е гтртуса метцгтт™™и СрС?-остррвка 32 при раке шейки метки.

Анализ статуса метилирования СрО-островка 32 был проведен в 22 образцах опухолей шейки матки, 15 нормальных тканей шейки матки и 7 лейкоцитов периферической крови тех же пациентов, и в двух клеточных линиях карцином шейки матки методом мегнлчувствителыюй ПЦР (МЧ-ПЦР). Использовали два варианта анализа: одновременное расщепление четырех (1 сайт N81-1 и 3 сайта НраП) или шести (3 сайт НраП и 3 сайта НЬа!) сайтов узнавания МЧР в участке СрС-островка, который затем подвергался амплификации. В большинстве опухолей, лейкоцитов и нормальных тканях, прилегающих к опухоли, и в двух клеточных линий после обработки МЧР присутствовал продукт амплификации, что говорит о метилировании всех исследуемых сайтов (рис. 3, образцы 271, 451, 456 и клетки НеЬа и вШа). В одном го 22 образцов продукт ПЦР отсутствовал (рис. 3, образец 275). Наличие метилированных аллелей СрО-островка 32 в большинстве лейкоцитов, опухолевых н нормальных тканях шейки матки предполагает

271Л 2710 275Л 2750 НЛл 8Шв МЧР - + - + _+ _+ _ + - 4-М

451Н 45Ю 456Н 4560 МЧР - + - + - + _ +

Рисунок 3, Ашяш статуса ютдцюмния CpG деукямпяпов, входящих в «остав сайт» МЧР (ГОД Hpall н HbaD в пределах CpG острогав 32 исто дои МЧ-ПЦР. Вверху указаны номера образцов, где Л - ДНК ю яейкоимпм, Н - ДНК т ворютынто эпителия, О - ДНК ю опухоли шейки мппг, М - маркер 100 Ьр, спрт унвмы размеры маркерных фрагменте*

расположение CpG-островка 32 в подверженном имприктингу локусе хромосомы 13. Как известно, юшрннтннг гена сопровождается метилированием СрО-островка в одном из аллелей гена и моноаллельиой экспрессией гена в нормальных клетках. Для опухолевых клеток характерна утрата импрннтиига, сопровождающаяся изменением статуса метилирования CpG-островка в районе импрингированного гена я нарушением моноаллельиой экспрессии гена. Недавно было обнаружено, что потеря нмпринтннга гена IGF-II наблюдается не только в опухолях кишечника, но и в нормальных тканях

(леВкоцетах) этих же пациентов (Сш et al. 1998). Возможно, тго отсутствие метилирования CpG-островка 32 у пациента 275 в опухолевой ткани и в лейкоцитах периферической крови связано с утратой нмпринтинга.

Таким образом, CpG-островок 32 действительно дифференциально метилировал в некоторых опухолевых и нормальных тканях. Предположение о том, что CpG-островок 32 локализовав в подверженном импринтингу районе хромосомы 13, указывает на необходимость соответствующего детального исследования этого района в дальнейшем.

3,4. Определение полного размера CpG-ocrpoBifo гена рз А-ядяптдр^.

Для дальнейшего более детального исследования СрО-островок гена /ВА-адаптина был выбран как единственный, ассоциированный с геном, функция которого известны. Продукт гена {ЗЗА-адаптит представляет собой большую субьедишщу гстеротетрамерного адаятерного белкового комплекса АР-3, участвующего в транспорте белков к лкзосомам и родственным им органетяам (у млекопитающих меланосомы и плотные тельца тромбоцитов). Ген рЗА-адапгтта локализован на хромосоме 5 в зоне 5ql4.1 и экспрессируется во всех исследованных тканях (DetT Angelica et al. 1997). АР-3 комплекс располагается на мембранах внутриклеточных компярментов, таких как транс сеть аппарата Гольджи и зндосомы, хотя, данные об исключительной локализации (J3A-адзптииа только в этой части аппарата Гольджи противоречивы (см. обзор Boehm and Boni&cioo 2002), АР-3 комплекс взаимодействует с цнтозольными доменами траисыембрааных белков. Показано, что связывание с сигналами сортировки в транспортируемых белках могут выполнять ц и р субъединицы (см. обзор Robinson and BooifacmoiZOOl).

Предварительный анализ нуклеотидных последовательностей выделенного фрагмента 26 и кДКК гена рЗА-адаптина показал, что в состав первого экзона входят 220 н.п,, а последующая иуклеотидаая последовательность не имеет гомологии с последовательностью кДНК ш представляет собой начало первого интропа. Установленные нами границы нового эюоаа совпали с экзои-интрониой структурой полней последовательности ДНК гена (ВА-адаптина, опубликованной позднее. Оказалось, <по в состав CpG-островке входят весь первый экзон и начало первого нитрона. С 3* конца он ограничен повтором HERVK14CI. Таким образом, СрО-островок гена рЗАчздатина заканчивается в первом нитроне.

Дня определения 5' границы CpG-островка гена рЗА-адагтина использовали один из вариантов метода "прогулки по геному", позволяющего амшшфэтшровать, клонировать и определять неизвестную нуклеотвдяук) последовательность, фланкирующую известный фрагмент ДНК. В результате этой работы мы определили 5' нетранскрвбируюмую последовательность гена /ЗЗА-адаптина размером 597 н.п. Анализ объединенной

i¡оследовательносiи 5* области jeiiaß3A-адаттша (идентификационный номер в GenBank - Ab 247736-2) по ¡воли л определить размер его СрО-островка, который составит 868 н п (рис. 4) и имеет следующие характеристики; значение параметра Н/Т равно 0 74, GC состав - 0.60 (см. габл. I). Наибольшая плотность CpG дннуклеопшов (24 нз 56 обнаруженных в составе CpG-островка) и сайтов МЧР ПЗ из 20} наблюдается в 5' транскрибируемо« зоне размером 238 п н, непосредственно примыкающей к первому

Л, 1 >юов 1 ннтрои

Н Н Н ¡1 Н Н Н S» Н И Sc Н $с Н

+■111 n'tiin^W^

Hh Hb Hb Hh N

Б. Alu __HERVK14CI

-----"" k44VV44VWJ -

... __sag _

II II Hill III liliil Hl HillliimiBII ПМШИШМ —4t

Рисунок 4. Расположение вновь клонированного фрагмента в 5' области гена ßSA-адаптша по отношению к раже известный районам А. Рестршгтнгя карта 5' области гена Вертикальная черта обозначает «гстоположение сайтов МЧР Н - Hpall, Hb - Hhal, Sm - Smal, St - Scall. N - Karl Б. Распределение CpG дннуклеотидов и расчоложение CpG островка — CpG островок, Hl - norrop, ¡S3 -эоон, С] - нтрон. - вновь клонированная последовательность Вертикальная черта обозначает единичный СрС днкуклейтнд

Таким образом, мы установили полный размер и последовательность СрО-островка гена ßiA-адапшна, который располагается в 5' области гена и включает в себя нетршгскрибируемый район, первый экзон и начало первого нитрона.

Исследование экспрессии и статуса метилирования гена ß3A-adanmma при раке шейки матки.

После установления полного размера CpG-островка гена ß3A -адаптина мы провели исследование взаимосвязи между метилированием этого CpG-островка и транскрипцией ассоциированного с ним гена. (Сак известно, метилирование CpG-островка обычно сопровождается инактивацией транскрипции.

3,5. Исследование экспрессии мРНК гена (33А-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки.

Изучение уровня чРНК [¡ЗЛ-адаптина в образцах нормы и опухоля шенкн матки проводили на препаратах тотальной РНК. Всего с помощью блот-гибридизашот исследовали пятнадцать случаев рака шейки матки И только и одном образце было обнаружено заметное снижение количества мРНК /Ш -адаптина в опухоли по сравнению с нормой (рнс. 5А) Небольшая частота снижения уровня мРНК гена ß3A-adanmwia в опухолях по сравнению с нормой можеэ быть связана с тем, что, с одной стороны, это дейс! вшельно редкое событие, а с другой - с убиквитарной экспрессией гена

(MI'Angélica et al 1997) и присутствием в образцах опухоли и кормы стромальных элементов (фибробластов, клеток крови и кровеносных сосудов) и возможной контаминацией нормальными клетками опухоли и наоборот.

А. НО Б. lleLa SiHa

Рисунок ^ Анати.' экспрессии мРНК гена 03А-адаптина А. Уровень мРНК в образце рака игейки матки Верхний ряд - результат гибридизации тотальной РНК радиоактив помеченным зоилом к первому экзону гена Нижний ряд - фотография агарозного геля с тотальной РНК после электрофореза H - РНК из нормального зтпшлт; О - РНК из опухоли шейки матки одной и той же больной Справа указано расположение рибосомалькых РНК (2SS и 1SS) Б. Уровень мРНК в клеточных линиях HeLa и SiKa зо н после обработки 5-азаштгиаином (î-azaC) Результат мектрофорета в агарозвом геле продуктов обратной транскрипции в сочетании с ГТЦР

В связи с этим, мы исследовали изменение количества мРНК гена рЗА-адаптина в клеточных линиях рака шейки матки Не1л и SiHa после обработки их деметилирующям агентом *5-азацитидином с помощью обратной транскрипции в сочетании с ПЦР и блот-гибридизации. 5-азацитидин является ингибитором ДНК-метилтраясферазы 1. Ее инактивация приводит х репликативно-зависимому деметютрованию ДНК, включая и аберрантно-метилированные CpG островки, что сопровождается восстановлением экспрессии мРНК гена, если она подавляется за счет метилирования ДНК. Сравнение уровня мРНК проводили в необработанных и обработанных клетках одной и той же культуры. Результаты типичного опыта, полученные при применении обратной транскрипции в сочетании с ГЩР, представлены на рисунке 5Б. Из представленных данных следует, что в клетках HeLa после обработки 5-азацктидином происходит реактивация транскрипции гена рЗА-адаптина В клетках SiHa наблюдали двукратное увеличение уровня мРНК. Исследование методом Нозери-блотгинга подтвердило эти результаты (данные не представлены) Таким образом, мы установили, что при обработке клеток рака шейки матки HeLa и SiHa деметилирующи м агентом происходит реактивация экспрессии гена ¡ЗЗА-адаптипа. На основании этих данных можно сделать вывод о том. что экспрессия мРНК гена рЗА-адаптина существенно снижена в клеточных линиях и можп быть активирована дшетилирующим агентом.

-143-6- Изучение статуса метилирования СпО-островка гена 11 шейки матки р в клеточных линиях рака шейки царей.

Исследование статуса метилирования СрО динуклеотндов, входящих в состав CpG-островка гена fiЗА-адатмаш, в клепочных линиях HeLa и SiHa проводили с использованием трех методов: МЧ-ПЦР, блот-гибридизации и определения нуклеотидной последовательности бисульфитно-модифицнрованной ДНК. При использовании первых двух методов ДНК обрабатывают МЧР, и, таким образом, исследуются CpG дануклеотиды, входящие в состав сайтов рестрикции МЧР. Статус метилирования сайтов МЧР Hhal и SacII изучали с помощью МЧ-ПЦР, МЧР НраП - блот-гибрвднзацией. В случае бнсульфитпого сиквенса определяют статус метилирования всех СрО дгоуклеотядов в исследуемом фрагменте ДНК.

На рисунке б представлен результат исследования статуса метилирования СрО динуклеотндов в составе семи сайтов МЧР Hhal Отсутствие продуктов ПЦР при амплификации обработанной ДГОС говорит о том, что хотя бы в одном из исследованных сайтов рестрикции СрО дннуклеотид ие подвергается метялнровашю. Исследование меньшего числа сайтов рестрикции н, таким образом, уменьшение числа исследуемых за один раз CpG дннуклеотвдов ситуацию не изменило. Отсутствие продукта ПЦР наблюдалось всегда, т.е. сайты Мчк Н1ш1 оказывались рестрвцировйинымн. Таким образом, при исследовании статуса метилирования сайтов МЧР Hhal в границах CpG-островка гена рЗА-адвптина мы установили, что СрО динукяетнды, входящие в состав этих сайтов не метилированы в клеточных линиях HeLa и SiHa.

HeLa SiHa

МЧР - + + м

Рвсувм 6. Авали статуса нетяяяромшп CpG ливукямуппм, ахошша в состав cattrm МЧР Hhal ■ фж&ях CpG-ocipuua гена /ЗЗА-адвптши. Резухижт эжктрофоре» в тярозном гене продуспя шплщфшаиищ ДНК к> ыеточис ляннй. М - mapiep 100 bp. Справа указаны размеры маркерных фршмяпа.

При изучении статуса метилирования СрО дннуклеотидов в сайтах МЧР НраП ДНК из клеточных линий обрабатывали как МЧР НраП, так в отдельно ферментом рестрикции Mspl, который является изошизомером МЧР НраП, во не чувствителен к критическому для МЧР НраП метилированию. Дополнительно исследовали ДНК из клеток культур HeLa И StHa, обработанных 5-азаципщином. Результат блот-гибрндизации представлен на рисунке 7. При рестрикции ДНК ферментом Mspl (расщепление всех сайтов Hpall/Mspl)

наблюдается единственный продукт минимального размера 444 и.п. Видно, что в клетках НеЬа при рестрикции как НраП, так и Мзр! наблюдается один и тот же продукт (отмечен толстой стрелкой), что говорят об отсутствии метилирования сайтов НраП в этих клетках. В случае клеточной линии 5Ша возможно частичное метилирование одного-двух Срв дянуклеотядов, так как при рестрикции ДНК ферментом НраП отмечается дополнительна« полоса большего размера, чем основной продукт (отмечен тонкой стрелкой). Таким образом, при изучении статуса метилирования Срв дянуклеотидов в составе сайтов рестрикции фермента НраП мы установили, что в клеточных линиях НеЬа и 5 ¡На большинство СрО динуклеотвдов не метилировано.

1 2 3 4

Рисуем 7. Анализ статуса иггвяиромни СрО динучкотадо», пходчцн* * состо сайтов рестрикции мештувствтелыгаго фермента НраП в пределах СрО островка гена р]А-адагтина. Результат блот-гнбрялкмцив кулыур клеток роса шейхи натки до и после обработки 5-азаштщнном Вверху рисунка обозначены: 1 - Не!*, 2 - Не)а+5*зяС, 3 - ЗЗш, 4 - Б0н1+5а1вС. Рмгрикш* образцов ДНК Мзр! (М) или НраП 01). Слева указаны рюмеры шржеряьп фрю-мс(гтое.

Так как СрО-Остро во к гена $ЗА-Ышптина был выявлен по метилированию сайтов МЧР ЗасИ, то представлялось возможным, что транскрипция гена (¡ЗА-адаптина регулируется метилированием сайта какого-либо специфического транскрипционного фактора, содержащего сайт МЧР 8асП. В последовательности СрО-островка гена рЗА-адаптина присутствуют два сайта этой МЧР (см. рис. 4). При исследовании статуса метилирования сайта МЧР 5ас!1, расположенного в экзоне, оказалось, что продукт ГГТ(Р после обработки МЧР присутствует не только в двух клеточных линиях и опухолях, яо к в большинстве образцов ДНК из нормальной ткали (данные не представлены) Тогда как в случае сайта МЧР ЗасП, расположенного в тгтроне, продукта ПЦР для большинства этих же образцов не было ни в норме, ни в опухоли. Такой результат может быть связан с одной стороны с метилированием рестрикцианного сайта, расположенного в ккзоне, не

только в опухоли, во и в нормальной ткани, а с другой стороны с тем, что данный сайг является трудиорестрщируемым,

В связи с этим мы использовали бисульфитный сиквенс ДНК, который позволяет точно установить статус метилирования каждого СрО дннуклеотила, я не ограничен рам каин сайтов МЧР. При обработке ДНК бисульфитом натрия в молекуле цитозина происходит замещение атома водорода на гидросульфитную группу по углероду в шестом положении. Эта модификация приводит к резкому возрастанию скорости дезамннирования в к превращению после десульфоиации остатка цитозина в остаток урацнла. 5-метнлцитозин таким превращениям не подвергается. Поэтому, после амплификации обработанной ДНК в продукте ПЦР происходит замена неметалл ровашого остатка цитозина на остаток тимнна, в то время как метилированный остаток цитознна остается остатком цитозина. Исследование статуса метилирования ÇpG-островка гена рЗА-адалтина таким способом мы проводили в клеточной линии HeLa и в двух образцах опухоли, одни из которых представлял собой случай подавления уровня мРНК гена ¡¡ЗА-адттина. Амплификацию проводили полугнездоиыы способом с помощью трех праймеров, подобранных к модифицированной ДНК. Продукт ПЦР очищали и проводили определение его нуклеотидвой последовательности. На рисунке 8 приведены немодифицированная нуклеотидвая последовательность участка CpG-остронка длиной S6 н.п. и пример хроматограммы сиквенса этого же участка в клетках HeLa. Видно, что во всех шести приведенных CpG динуклеотидах остаток цитозина оказался заметенным на тимин, т.е. был неметелированвыы. Представленный на рисунке сайт МЧР SacD расположен в экзоие гена и по результатам МЧ-ПЦР имел метилированный статус. Здесь же оба CpG дннуклеотнда, входящих в состав сайта, находятся в аеметеяированном состоянии, Таким образом, мы столкнулись с труднорестрицнруемьш сайтом рестршггазы SacII.

Обобщенные результаты, полученные щи изучении статуса метилирования участка CpG-островка гена рЗА-одаптшш размером 411 нл. с помощью бнсуЛьфнтного сиквенса, выглядят следующим образом. Во всех трех случаях мы исследовали 26 СрО динуклеотидов. В клетках линии HeLa немстилнрованный статус имели 21 СрО динуклеотед. В образцах опухоли неметилированное число CpG динуклеотидов составило 23 и 24 CpG дяиуклеотида. При этом следует заметить, что, в противоположность неметелированным СрО динуклеотндам, статус метилирования остальных исследованных СрО двиуклеотидов однозначно определить было невозможно, так как хроматографнческая картина сиквенса этих СрО динуклеотидов н окружающих их районов не имела достаточной четкости н ясности. Исходя из результатов, полученных трон разными методами, можно заключить, что CpG островок гена /ЗЗА-адаятина не

аодвергается существенному метилированию в клеточных линиях рака шейки матки и в плоскоклеточных карциномах шейки матки.

ААСОСС£2(ЗС А<ЮАССААСС С&гСАСССОС САОСАСЩШ ОСААТСТССА ОСААТАОПТ ТССТТАСААТ ОЛОСАСТСШ ОАООАС

V * V ТУ

* ат с тЩЦив* *т «,е ттттиртт »ф* х т & с же

Рисунок в. Сетвевс продукта ГТЦР учэст*а СрО-остроаха гена рЗА-одапипта, полученного при шпявфлплшш обработанной бисульфитом ДНК ю клеток НеЬа А. Неноднфнцироввинш йукдеоиииая пооядоввгеяьиостъ секювнрогаиного участка. Б. Хроыатограмма сиивеяс» Модифицированные вемсимярианивс остатки цигошва (С-УГ) закяочеш в серий прямоугольник. Нетюотккяыо молнфшифманные остепя циннию заключены ■ окружность. Сайты МЧР НраП и $асП отмечены пр*моупмвлов ранкой. СрО лхиукяеоглдн внделет подчеркиванием (при пеметеивроваином ожютиие доцстадоат Трй ливуклеотшим).

Таким образом, с одной стороны экспрессия мРНК гена рЗА~адаптина снижена в клеточных линиях рака шейки матки, и ее можно реактивировать деметилирующиы агентом. С другой стороны СрО-островок самого гена не подвергается аберрантному метилированию в этих же клеточных линиях, Эти данные позволяют сделать вывод о том, что экспрессия мРНК рЗА-адаптина подавлена в клетках НеЬа и 8Ша, и в одной из 15 опухолей шейки матки, но это подавление экспрессии не связано с метилированием исследованного района Срв-островка гена рЗА-адаптина.

4. Заключение

Использованный в работе метод мстнлчуиствнтелыюй ПЦР со статистическими ОС-богатыми праймерами позволяет эффективно выявлять Срй-островки, в том числе и непредставленные в банках известных последовательностей генома, и может быть полезен для заполнения "белых шгген" в геноме человека. Отбор дифференциально метилированных в нормальных и опухолевых тканях Ср&-островков данным методом возможен, но в сочетании с дополнительным анализом сшгуса метилирования

идеятифицированньк CpG-островков в исследуемых тканях, который включает болыпой набор МЧР в методы, основанные на прямом определении 5-метилпитоаина в последовательности.

Для гена j}3A-adanmuxa был обнаружен следующий феномен. С одной стороны, обнаружено подавление экспрессии мРНК рЗА-адалтина в одной из опухолей и в двух клеточных линиях рака шейки матки, что в опухолевых клетках ранее не было описано. При этом экспрессия мРНК рЗА-адаптина может бьпь активирована в клеточных линиях обработкой деметилируюпшм агентом 5-азацитидином. С другой стороны, анализ статуса метилирования СрО-островка гена рЗА-адаптина с использованием МЧР и прямым определением 5-мстнлцвтозина секвенированием ДНК, обработанной бисульфитом натрия, выявил отсутствие существенного метилирования в клеточных линиях и первичных опухолях шейки матки в районе промотора и первого экзона. Феномен непрямой активации экспрессии гена (в отсутствие метилирования CpG-осгровка гена) в результате обработки опухолевых клеток деметнлирующнмн агентами 5-азацитидином и 5-аэа-2'-дезоксшштидашом бьш описан также для генов Apqf-l {Soengas et а]. 2001), ПМР-2 (Cappabianca et al. 2003), TGF-p (Shin et al. 1992) и TGF-fiRII (Ammanamanchi et aL 1999).

Непрямая активация транскрипции ¡¡ЗАчгдатшна и других генов под действием деметилирующих агентов может быть связано с двумя их свойствами. Вполне возможно, что зга агенты, вызывая демешднрованне ДНК, приводят к активации экспрессии регулятора транскрипции рЗА-адатпина, который был ивактивйрован метилированием в опухолевой клетке, по н стало причиной подавления транскрипции (ЗЗА-адаттта. Во-вторых, недавно было показано, что 5-аза-2'-дезоксэтштядни, независимо от его деметняирующего действия на ДНК, обладает также способностью подавлять лизин-специфическое метилирование гистонов и индуцировать быструю деконденсадию гетерохроматина (Takebayashi et al. 2001; Nguyen et al. 2002; Kondo and Issa 2003), Нельзя исключить, то обработка деметшшрующими агентами, обладающими такими свойствами, может при наличии соответствующих транскрипционных факторов в обрабатываемых клетках активировать транскрипцию генов, инактивация которых не связана с метилированием их промоторов.

В последнее время появились свидетельства того, что белки везикулярного транспорта, к которым относится рЗА-адаптин, вовлечены в канцерогенез (см. обзор Floyd aodDeCamilli 1998).

Недостаток знаний о функциях комплекса АР-3 не позволяет пока однозначно ответить на вопрос о том, какие последствия для опухолевой клетки может иметь подавление экспрессии одной иг его субъедннип - рЗА-адаптяпа. Этот вопрос требует дальнейшего исследования.

1. С помощью метода метилчувствителыгой ПЦР со статистическими ОС-богатыми прайыерами было выявлено семь (ЗО-богатых фрагментов ДНК, пять из которых (более двух третей) обладают свойствами С рв-островков. Из шгги выявленных Срв-островков два оказались непредставленными в опубликованных версиях генома человека (т.е. являются неизвестными ранее последовательностями генома человека).

2. С помощью компьютерного анализа установлено, что для Срв-островка 22 (ОепВапк АР218212) гомологичная последовательность в базах данных не представлена; СрО-островки 32 и 34 локализованы соответственно на 13 и X хромосомах, ассоциация с известными генами отсутствует; СрО-островок 36 имеет гомологию с 3.3-кЬ талдемным повтором, располагающимся в прителомерной области длинного плеча хромосом 4 и 10, н с кДНК гена ПиХ4, кодируемой одной копией этого повтора; СрО-островок 26 (ОепВапк АР24Т736) имеет частичную гомологию с кДНК гена /¡ЗЛ-адаптта.

3. Экспериментально определена нуклеотидвая последовательность 5* регуляторной зоны и граница 1 экзона гена {ВА-адаптина (ОепВапк АК24Т736.2), и установлен размер (868 п.н.) и местоположение СрО-олровка гена /ЗЗА-адагипина. СрО-островок гена включает 5' нетранскрибируемую область, первый жзов и 5' конец первого интрова.

4. Методами гибридизации по Саузерну н ПЦР в сочетании с мегнлчувствительиой рестрикцией и методом секвенирования обработанной бисульфитом натрия ДНК установлено, что СрС-островок гена рЗА-адсттина не подвергается метилированию в плоскокяеточных карциномах шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки.

5. Впервые показано, что экспрессия гена рЗА-адатгшна снижена в клеточных линиях рака шейки матки и может быть активирована обработкой деметилирующим агентом 5-азацнгидияом, несмотря на отсутствие метилирования Срв-островка гева.

Список иабогг. опубликованных по теме диссертации

1. Петренко ДА, Епшлев ЕМ, Киселева Ш1. Идентификации CpG-островков, гиперы сталированных в опухолевых и трансформированных клетках, методом иетилчувствнгельлой ПЦР со лктнсгнческнмн праЙмерамнУ/ Молекулярная биология, 2000,34(3), 474-479.

2. Киселев ФЛ, Маэуренко НН, Киселева НП, Кобзева BJI, Семенова ЛА, Павлова JIC, Беляков ИС, Блиев АЮ, Ешилев ЕМ, Иванова ТА, Петренко АА. Молекулярные маркеры рака шейхи маяси.// Вестник РАМН, 2002,1,8-14.

3. Petrenko А, Ivanova Т, Gritsko Т, Vißokoarova S, Eshilev Е, Kobzeva V, Kisseljov F, Kisseljova N. Metiiylatknt and silencing of retinoic seid receptor-beta2 gene in cervical саосстУ/ BMC Cancer, 2002,2:4,1-7.

4. N Kisseljova, E Eshilev, T Ivanova, A Pebeoko, S Viookourova, F Kisseljov. The geile hypermethylaöon proffie of cervical сагсшотаэУ/ AACR Conference: Oncogenomics, Jan-Feb. 2003, Phoenix, Arizona. USA.

5. N Kisseljova, A Petrenko, T Ivanova, S Vmokourova, E Eshilev, F Kisseljov. Gerne hypeimethylation profile of cervical caicinomas expressing E6 and E7 genes of high risk HPV groupJ/ ICGEB DNA Tnmor Viru» Meeting, iuly 2003, Trieste, Italy.

6. Ivanova T, Vinokurova S, Petreako A, Eshikv E, Solovyova N, Kisseljov F and Kisseljova N. Frequcnt hypermdhylation of 5' flanlang regio» of TIMP-2 gene in cervical oaac&J/ InL J. Cancer, 2003 (aeeepted for publication).

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 21.10.03 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,25 Печать авторефератов (095) 730-47-74

РНБ Русский фонд

2006-4 37538

 
 

Оглавление диссертации Петренко, Анатолий Анатольевич :: 2003 :: Москва

 
 

Введение диссертации по теме "Онкология", Петренко, Анатолий Анатольевич, автореферат

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки"

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2003 года, Петренко, Анатолий Анатольевич