Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Взаимодействие амино- и гидрокси(оксо)производных гетероциклов с полисахаридами - новый путь синтеза БАВ

На правах рукописи

ТШЦЕНКО Екатерина Владимировна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АМИНО- И ГВДРОКСИ(ОКСО) ПРОИЗВОДНЫХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ С ПОЛИСАХАРИДАМИ - НОВЫЙ ПУТЬ СИНТЕЗА

БАВ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических науж

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2003

Диссертационная работа выполнена на кафедре органической химии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПХФА) Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор A.A. Иозеп

засл. деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор химических наук,

профессор Б.А. Ивин

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор В.Н. Куклин доктор биологических наук, кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Л.Б. Пиотровский

Ведущая организация: НИИ токсикологии МЗ РФ

Защита состоится 25 июня 2003 г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.088.01 при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПХФА по адресу: Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д.4/6.

Автореферат разослан 22 мая 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат фармацевтических наук

М.В. Рыжкова

\o2jS~ 3

I. Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Многие гетероциклические соединения входят в состав молекул, отвечающих за функционирование живых организмов, и широко применяются в синтезе биологически активных, в том числе лекарственных, веществ, например фторурацил, метотрексат, идоксурин и др. К сожалению, они обладают побочным действием, токсичностью и быстро выводятся из организма. Вместе с тем известно, что химическая фиксация лекарственных субстанций на полисахаридной матрице позволяет создавать препараты пролонгированного действия с низкой токсичностью и необходимым балансом липофильно - гидрофильных свойств, а также позволяет осуществлять доставку действующего лекарственного вещества к биомишеням. Полисахариды, как правило, нетоксичны, не вызывают аллергических реакций, легко выводятся из организма. Они в наибольшей степени отвечают требованиям, предъявляемым к матрицам при создании физиологически активных полимеров (ФАЛ), доля которых среди применяемых лекарственных препаратов с каждым годом возрастает. Примерами могут служить выпускаемые промышленностью отечественные и зарубежные полисахаридные препараты стрептодеказа, терридеказа, пирогенал, поликапран и др.

В связи с этим актуальность разработки методов по химической модификации полисахаридов гетероциклическими соединениями с целью создания новых и совершенствования уже известных биологически активных веществ не вызывает сомнений.

Среди известных направлений создания ФАЛ производных полисахаридов «альдегидная схема» является наиболее технологичной. Она заключается в окислении полисахаридов периодатом натрия и использовании полиальдегидов в реакциях с 14-, С-, О- и Б-нуклеофилами. Ранее была показана возможность использования таких полиальдегидов для конструирования ФАП взаимодействием их с алифатическими аминами (в том числе антибиотиками, ферментами и другими БАВ), в то время как систематическое изучение реакции полиальдегидов с ароматическими и гетероциклическими аминами не проводилось.

Цель и задачи исследования. Целью исследования была разработка общего метода химической модификации полисахаридов ароматическими и гетероциклическими аминами для создания новых и совершенствования уже известных биологически активных веществ. Для достижения поставленной цели необходимо было: а) исследовать свойства декстранполиальдегида (ДПА) в зависимости от условий синтеза и выделения; б) исследовать реакции ДПА и карбоксиметилдекстранполиальдегида с ароматическими и: гетероциклическими аминами; в) изучить биологическую активность некоторых из синтезированных соединений; г) разработать методы анализа и стандартизации синтезированных веществ.

Научная новизна. В работе впервые подробно изучены реакции декст-ран- и карбоксиметилдекстранполиальдегидов с ароматическими и гетерозис. НАЦИОНАЛЬНАЯ

Библиотека

С. Петербург , 1 09 100.3 «ту/^

^«■•мчмма^^^в, гг г г »/

циклическими аминами и показано, что при проведении их в воде, варьируя рН среды, температуру и время реакции, можно получать полимеры с заданным числом низкомолекулярных фрагментов. Ароматические и гетероциклические амины, не содержащие других функциональных групп, реагируют с декстран- и карбоксиметилдекстранполиальдегидами, образуя только азоме-тины, тогда как их амина- и гидрокси(оксо)производные затем подвергаются гетероциклизации взаимодействием амино и гидроксигрупп с электрофиль-ными центрами полисахарида. 6-Аминоурацилы, в отличие от 5-аминоаналогов, взаимодействуют с декстранполиальдегидом и ароматическими альдегидами, как С-, а не 1<Г-нуклеофилы, с образованием на первой стадии соответствующих бис(6-аминоурацил-5-ил)метилдекстранов, аминогруппы которых затем реагируют с карбонильными группами полисахарида.

Практическая значимость. Разработаны технологичные методы окисления декстрана и карбоксиметилдекстрана метапериодатом натрия, позволяющие получать полиальдегид с заданным числом и соотношением 2,4-и 2,3(3,4)-окисленных фрагментов и модификации декстран- и карбоксиме-тилдекстранполиальдегида физиологически активными аминами для получения физиологически активных полимеров. Разработаны методики стандартизации синтезированных нминополисахаридов, которые позволили сократить время и трудоемкость анализа.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 3 международных и всероссийских конференциях и симпозиумах: 66 Итоговая конференция студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы медицины и фармации» (Курск, 2001 г.); Первая международная конференция «Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов» (Москва, 2001 г.); Третья молодежная школа-конференция по органическому синтезу «Органический синтез в новом столетии» (Санкт-Петербург, 2002 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликованы три статьи и тезисы трех докладов на конфереециях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и библиографии. Работа изложена на 111 стр., содержит 42 табл., 31 рис. Библиография включает 135 источников, из них 61 на иностранном языке.

II. Содержание работы

Для создания новых и совершенствования уже известных биологически активных веществ нами предложена химическая модификация полисахаридов ароматическими и гетероциклическими аминами по схеме, включающей синтез карбоксиметилдекстрана (II), декстранполиальдегида (III), карбоксиметилдекстранполиальдегида (IV) и реакцию этих полиальдегидов с аминами, а также восстановление полученных азометинов (схему 1).

Схема 1

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ

К = ОН, С6Н5, СН2СбН4) СбН4Ж>2-4, С6Н4Вг-4, С^СНзЛ С6Н4ОС2Н5-4, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил

рН рн ОН , ОН , рн

1. он Л. .СИ Л V >1 гг "-V у ^ к*

""он но

рн ОН | | рн

НО-ЧД- нАг

-аХ нД6 „Л

I

си Н(

си

НСХУ -Л

ЛНг

¿О

Ос^.. Гп п-?

ХС а

N-п—С.

ОСИ

^сОт

си

снсоон

1. Свойства декстранполиальдегида (ДПА) в зависимости от условий

синтеза и выделения

В литературе имеются сведения о том, что спектральные характеристики образцов ДПА, полученных окислением декстрана в разных условиях, отличаются. Поэтому задачей нашего исследования было определение условий получения стандартных образцов ДПА.

Декстран окисляли 48 ч метапериодатом натрия (0.012-0.185 моль/л №го4) по стандартной методике в 0.1 М формиатном, ацетатном, фосфатном буферных растворах или в воде с рН 1.9 — 5.6.

ИК спектры образцов ДПА, полученных в разных буферных растворах и воде и при разных значениях рН, отличаются лишь интенсивностью полосы поглощения валентных колебаний группы С=0 (1740 см"1). В ИК спектре образца ДПА, полученных в формиатном буферном растворе, она наиболее интенсивна.

ДПА стандартизовали по степени замещения См - числу альдегидных групп, приходящемуся на моносахаридный фрагмент полимера. Число альдегидных групп в ДПА определяли гидроксамным (УФ спектроскопия) и ок-симным (по элементному анализу) методами. Число 2,4-окисленных фрагментов в полиальдегиде определяли по количеству образовавшейся в результате окисления муравьиной кислоты. Число 2,3(3,4)- окисленных фрагментов х рассчитывали по формуле: х = а-2Ь,

где а — число молей вступившего в реакцию метапериодата натрия;

Ь — число молей выделившейся муравьиной кислоты, в расчете на моль моносахаридного звена декстрана.

Оказалось, что окисление декстрана в формиатном буферном растворе приводит к образцам ДПА, у которых степень замещения Сза определенная экспериментально и Сза, рассчитанная по расходу иериодата натрия, практически совпадают. В ацетатном и фосфатном буферных растворах и в воде получаются образцы ДПА, у которых найденное число альдегидных групп ниже теоретического ~25 % (табл. 1.1).

Таблица 1.1

Характеристики образцов ДПА, полученных в разных буферных __растворах__ ^

0.1 м буферный раствор рН 4 Расход КаЮ4, моль/ моль Число фрагментов С ' ^ за > моль/моль ~ С за У /С Б- •100%, %

2,4-окисленных 2,3(3,4)-окисленных А Б

Формиатный 0.75 0.23 0.29 1.00 1.04 4

Ацетатный 0.74 0.11 0.52 0.93 1.26 26

Фосфатный 0.75 0.20 0.35 0.80 1.10 27

Вода 0.92 0.33 0.25 0.89 1.17 24

'Степень замещения определена оксимным методом (А) и рассчитана по расходу периодата натрия (В)

Природа буферного раствора влияет также и на соотношение 2,3(3,4)- и 2,4-окисленных фрагментов в ДПА. Так, например, полимер, полученный в формиатном буферном растворе, содержит почти одинаковое число 2,4- и 2,3(3,4)-окисленных фрагментов, в то время как в ацетатном - 2,4 -окисленных фрагментов почти в 5 раз меньше, чем 2,3(3,4).

Как и ожидалось, величина рН реакционной массы при периодатном окислении декстрана существенно влияет на направление и скорость реакции. С увеличением рН реакционной массы число 2,3(3,4) - окисленных мо-носахаридных фрагментов в ДПА почти линейно увеличивается, а 2,4- окисленных фрагментов также линейно уменьшается (рис. 1.1). В связи с этим, полученные при рН 1.9 образцы ДПА содержат больше моносахаридных звеньев, не вступивших в реакцию с периодатом натрия, а соотношение 2,4- : 2,3(3,4)-окисленных фрагментов в них приближается к 2. В образцах ДПА, полученных при рН 5.6, наоборот, число 2,3(3,4)-окисленных фрагментов примерно в 2 раза выше, чем число 2,4-окисленных фрагментов.

0.4 0.35

^

§ 0.3-1 а

1 0.25

I 0 2

0.15 0.1

= 0 983£Ц| -I

(Г = 0.9835

1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 рН

Рис. 1.1. Изменение числа 2,3(3,4)- (/) и 2,4-окисленных моносахаридных фрагментов (2) в ДПА в зависимости от величины рН буферного раствора, использованного при окислении декстрана.

Вероятно, увеличение кислотности среды при периодатном окислении декстрана настолько увеличивает активность образующихся альдегидных групп (кислотный катализ), что образующиеся а-гидроксиальдегиды реагируют с окислителем быстрее, чем а-гликольные группы. Наоборот, при уменьшении кислотности среды они окисляются медленнее а-гликольных групп, накапливаются в полисахариде и образуют устойчивые циклические лактолы. Этим объясняется и тот факт, что по данным периодатного окисления при повышении рН среды от 1.9 до 5.6 число альдегидных групп в образцах ДПА линейно увеличивается (С„ = 0.0627рН + 0.7756; п=8, Я2 = 0.9815), но число альдегидных групп, способных реагировать с гидроксила-мином, во всех образцах почти одинаково.

Для исследования влияния исходной концентрации периодата натрия, взятого для окисления декстрана, на строение декстранполиапьдегида, полисахарид окисляли в 0.1 М формиатном буферном растворе с рН 4, варьируя

концентрацию периодата натрия в пределах 0.012-0.185 моль/л.

2.5

1.5

1 -<1 0.5

о

0.05 0.1 0.15

Концентрация ЫаЮ* моль/л

0.2

Рис. 1.2. Зависимость С*,, рассчитанной по расходу периодата (1) и найденной оксимным методом (2), от концентрации периодата (0.1 М формиатный буферный раствор, рН 4, 48 ч).

Из рис. 1.2 видно, что с повышением концентрации периодата натрия число альдегидных групп, в полисахариде возрастает. Однако линейная зависимость Сза от концентрации окислителя наблюдается только в случае Сза, определенной оксимным методом.

Рис. 1.3. Зависимость числа 2,4- (7) и 2,3(3,4)- (2) окисленных моносахарид-ных фрагментов от концентрации периодата натрия (0.1 М формиатный буферный раствор, рН 4, 48 ч).

0.05 0.1 0.15 Концентрация №Ю4, моль/л

Зависимость числа 2,3(3,4)- и 2,4-окисленных фрагментов в ДПА от концентрации N8104 носит более сложный характер (рис. 1.3). С повышением концентрации окислителя от 0.012 до 0.093 моль/л число 2,3(3,4)-окисленных фрагментов в образцах ДПА возрастает быстрее, чем 2,4-окисленных фрагментов. При этом периодат натрия расходуется на окисление полисахарида без остатка. При концентрации окислителя 0.185 моль/л образуется ДПА, практически полностью состоящий из 2,4-окисленных фрагментов.

Для определения влияния условий выделения образцов ДПА из растворов на число альдегидных групп в них, реакционную массу, полученную после периодатного окисления декстрана в 0.1 М формиатном буферном растворе при рН 4, очищали, концентрировали, делили на части и в каждой из них создавали определенное значение рН (от 2.8 до 5.6). Через 10 мин ДПА выделяли и определяли число альдегидных групп (Сза) гидроксамовой реакцией.

Оказалось, что максимальное число альдегидных групп, способных реагировать с гидроксиламином, имели образцы, осажденные при рН 3.6-4.0. Не соблюдение этих условий приводило к уменьшению Сзлна 8-10 %. Кроме того, в 0.02 М растворе гидроксида натрия при 15-20 °С за 1.5 ч число альдегидных групп в ДПА уменьшилось в 2 раза, что объясняется, вероятно, не только альдо-енольной таутомерией, но альдольной и кротоновой конденсациями и окислительными процессами.

Таким образом: .

1.Структура ДПА и число альдегидных групп, способных реагировать с нуклеофильными реагентами, сильно зависит как от условий окисления: типа буферного раствора, рН среды, концентрации №104, так и от условий выделения. Для получения стандартных образцов ДПА необходимо четко подбирать условия их синтеза.

2.0кисление декстрана в 0.1 М формиатном буферном растворе и выделение ДПА при рН 3.5-4.0 позволяет получить образцы с наибольшим числом свободных альдегидных групп.

3.Для синтеза образцов ДПА с примерно равным числом 2,3(3,4)- и 2,4-окисленных фрагментов декстрана необходимо окислять при рН 3.5-4.0. Образцы ДПА, полученные при более низких значениях рН, содержат больше 2,4-, а при более высоких - 2,3(3,4)- окисленных фрагментов.

4.В щелочных средах число альдегидных групп ДПА уже за 1.5 ч при 15-20 °С необратимо уменьшается в 2 раза.

2. Реакции декстранполиальдегида с ароматическими аминами

Полисахаридальдегиды широко используют в синтезе ФАП, но, к сожалению, отсутствует единый подход к выбору условий их взаимодействия с аминами. Проведенные ранее в СПХФА исследования показали, что наибольшее влияние на протекание этой реакции оказывает рН реакционной среды. Нашей задачей было определить условия, позволяющие получать полимеры с заданным числом азометиновых групп. В связи с этим мы исследовали влияние рН среды на результаты взаимодействия ДПА с аминами.

Реакцию ДПА с аминами вели 2 часа при 15-20 °С, рН реакционной среды от 0.5 до 12 и соотношении реагентов 2-3 моль амина на альдегидную группу полимера.

В ИК спектрах продуктов реакции были обнаружены полосы валентных колебаний связи С=И (1640-1660 см'1) и полосы, характерные для полисахарида и замещенного бензольного кольца (1600, 690, 750, 810 см"1).

Синтезированные образцы характеризовали степенью замещения С3 -числом азометиновых групп, приходящихся на моносахаридное звено полимера, а реакцию - степенью превращения альдегидных групп в азометино-вые:

С„а= (Жау 100 %,

Степень замещения рассчитывали по данным элементного анализа и кондуктометрического титрования образцов после гидролиза азометинов 0.1 М соляной кислотой.

Рис. 2.1. Влияние рН среды на степень превращения альдегидных групп в реакциях ДНА с л-нитроанилином (1), п-толуидином (2) и бензиламином (3).

0 5 10

рН

Анализ полученных результатов (рис. 2.1, табл. 2.1) позволяет сделать вывод о том, что для каждого амина существует значение рН, при котором степень превращения альдегидных групп в азометиновые наибольшая. При этом в реакциях ДПА с относи гельно сильными и слабыми основаниями (бепзиламин, и-нитроанилин, и-толуидин) незначительное изменение рН среды от «оптимального» (±1.5) приводит к весьма резкому уменьшению Ст (в 1.5-2 раза). При взаимодействии ДПА с анилином и и-броманилином зависимость степени превращения альдегидных групп ДПА от рН среды менее выражена.

Таблица 2.1

Степень превращения альдегидных групп в реакциях ДПА с аминами

при «оптимальных» значениях рН среды.

Амин рКвн рН «оптимальная» спа,%

«-нитроанилин 1.02 1.1 50

и-броманилин 3.91 4.6 84

анилин 4.63 5.9 89

и-толуидин 5.12 6.6 92

гидроксиламин 5.97 7.5 95

бензил амин 9.33 10.5 83

«Оптимальные» значения рН среды близки к значениям рКвн+ используемого амина. Каталитическое действие кислоты тем необходимее, чем меньше нуклеофильность реагента (я-нитроанилин, и-броманилин, анилин). Наоборот, более сильные основания (л-толуидин, гидроксиламин, бензила-мин) лучше реагируют с ДПА в нейтральной и щелочных средах. Чем больше рКВн амина, тем при больших значениях рН среды достигается наибольшая степень превращения альдегидных групп ДПА в азометиновые.

Оказалось, что в реакциях ДПА с аминами между «оптимальными» значениями рН среды и рКВ!!+ амина наблюдается линейная зависимость: рН = (1.150 ± 0.020) рКвн+ + (0.280 ± 0.005) (п = 6, R2= 0.9822).

Используя это уравнение можно установить оптимальные значения рН в реакциях ДПА с ароматическими аминами без проведения предварительных опытов.

При проведении реакций ДПА с ароматическими аминами при одном и том же значении рН (например, 7) наблюдается линейная зависимость степени превращения альдегидных групп в азометиновые от рКВн+ амина (Ст = 20.45 рКвн+ - 12.91; п = 5, R2= 0.9858) и от стд-констант заместителя арила-минов (Спа = -85,80стя+ 78,42; п = 5, R2= 0.9958).

Таким образом,

1. Для каждого амина в реакциях с ДПА существует определенное значение рН среды, при котором степень превращения альдегидных групп в азометиновые максимальная. Незначительное отклонение значения рН от «оптимального» может резко уменьшить Сла.

2. Между «оптимальными» значениями рН среды и рКвн+ амина наблюдается линейная зависимость: рН = (1.150 ± 0.020) рКВн + (0.280 ± 0.005) (п = 6, R2 = 0.9822), которую можно использовать для определения условий реакции ДПА с любым амином без проведения предварительных опытов.

3. В реакциях ДПА с ароматическими аминами при одном и том же значении рН наблюдается линейная зависимость Спа от рКВи+ амина и от стд-констант заместителя ариламинов.

3. Взаимодействие карбоксиметилдекстранполиальдегида с ароматическими аминами

Азометины, полученные реакцией ДПА с ароматическими аминами, нерастворимы в воде, спирте, эфире и большинстве других органических растворителях, что сильно затрудняет их исследование и использование. В то же время известно, что карбоксиметилирование полисахарида повышает его растворимость в воде. В связи с этим нашей задачей было исследовать влияние карбоксиметильных групп в ДПА на его реакционную способность и на растворимость в воде его азометинов.

Натриевую соль карбоксиметилдекстрана (КМД Na) получали алкили-рованием декстрана монохлоруксусной кислотой по стандартной методике. Степень карбоксиметилирования Сгм (число карбоксиметильных групп, приходящихся на моносахаридный фрагмент полимера) рассчитывали по данным объемного и кондуктометрического титрования образцов КМД в-Н1"- и Na- форме. Для получения образцов КМД с разными степенями карбоксиметилирования С«, изменяли время реакции и соотношение реагентов.

Периодатное окисление КМД, анализ и характеристику полученного карбоксиметилдскстранполиальдегида (КМД-ПА), а также реакцию КМД-ПА с аминами и характеристику азометинов проводили, как описано ранее (см.

разделы 1 и 2). Для удаления ионно-связанного амина азометин переосаждали из 0.2 М раствора гидроксида натрия.

В УФ спектрах продуктов реакции КМД-ПА с ароматическими аминами в 0.02 М растворе №ОН обнаружены максимумы поглощения характерные для амина, отсутствующие в спектрах исходного полиальдегида.

Как и ожидалось, с увеличением числа карбоксильных групп Ст растворимость Шиффовых оснований КМД-ПА с аминами увеличивается. Если продукты реакции ДПА с ароматическими аминами лишь набухают в воде, то азометины КМД-ПА с Сы< от 0.14 до 0.69 являются мало растворимыми (по ГФ XI), а с Скм = 1.24 - растворимьми (табл. 3.1). В связи с этим, для получения растворимых в воде полимерных азометинов мы использовали КМД-ПА сС™= 1.24.

Повышение Сш от 0.14 до 0.69 в образцах КМД-ПА, имеющих примерно одинаковое число альдегидных групп (Сза= 0.91-1.1), увеличивает также и Сш в реакциях с п-броманилином с 40 до 80 %. Однако, дальнейшее повышение С«*, до 1-24 уменьшает степень превращения альдегидных групп КМД-ПА до 37 %, вероятно, из-за экранирования альдегидных групп карбоксильными и карбоксилатными.

Таблица 3.1

Растворимость продуктов реакции КМД-ПА (Скм 1.24, Сза 1.1) с арома-

тическими аминами (рН «оптимальное»)

Амин С„а, моль/моль Растворимость, мг/мл

и-нитроанилин 17 38

и-броманилин 37 43

анилин 43 46

и-толуидин 55 43

бензил амин 40 42

Как и в случае ДПА, степень превращения альдегидных групп КМД-ПА в реакциях с аминами линейно зависит как от рКвн+ амина (Ст = 8.40 рКВн+ + 6.68; п = 5, Я2 = 0.97), так и от оконстант Гаммста (С,ш = -39.36стя + 45.52; п = 5, К2 = 0.97). Однако, степени превращения альдегидных групп КМД-ПА в азометиновые несколько ниже, чем Спа в ДПА. По-видимому, это происходит из-за экранирования альдегидных групп карбоксильными и карбоксила шыми.

Таким образом:

1. Введение карбоксиметильных групп в ДПА увеличивает растворимость его азометинов в воде. Продукты реакции ароматических аминов с КМД-ПА с С™ более 1 полностью растворимы в воде, что является одним из важных требований к биологически активным веществам.

2. Реакционная способность КМД-ПА с С^ > 1 ниже, чем ДПА, поэтому С„м КМД-ПА должна быть около 1.

4. Исследование реакции декстранполиальдегида с а.минопириди-

нами

Многие биологически активные вещества являются производными аминопиридинов, поэтому синтез, анализ и изучение производных полисахаридов, содержащих остатки аминопиридинов, является перспективным направлением поиска новых лекарств. В связи с этим нашей задачей была разработка метода связывания 2-, 3- и 4-аминопиридинов с ДПА в качестве модельных реакции.

Реакцию ДПА с аминопиридинами проводили либо в воде в течение 0.5+5 ч при 20+80 °С, 3-х кратном мольном избытке амина и рН 1.1+12.8, либо в кипящем диоксане 2 ч. Выход азометинов колеблется от 50 до 75 %.

В ИК спектрах продуктов реакции наблюдаются интенсивные полосы валентных колебаний (1630 см"1) связей С=К гетероциклического фрагмента, и полоса колебаний пиридинового кольца (1590 см"1). В УФ спектрах растворов этих соединений в 0.02 М растворе №ОН обнаружены максимумы поглощения характерные для аминопиридинов, отсутствующие в спектре исходного полиальдегида.

Полученные образцы азометинов и реакционную способность ДПА исследовали и характеризовали, как указано ранее. Степень замещения С, рассчитывали по результатам элементного анализа и разработанной нами методике, которая включает спектрофотометрическое определение количества выделившегося свободного амина после щелочного гидролиза азометина.

Условия введения в молекулу полиальдегида аминопиридинов определяли, изучая влияние температуры, времени реакции и величины рН на степень замещения в продуктах реакции ДПА с 2-аминопиридином.

При повышении температуры от 20 до 80 °С степень превращения альдегидных групп ДПА в азометиновые линейно увеличивается с 55 до 93 % (Ст = 0.6861 + 39.143; п = 7, Я2 = 0.974).

При изменении рН реакционной среды от 1.1 до 12.8 Ст сначала уменьшается почти до 0 (рН 4-5), а затем увеличивается до 55 % (рис. 4.1), т.к. с повышением кислотности среды от рН 4 до 1.2 увеличивается концентрация более реакционной протонированной карбонильной группы, а при рН > 5 повышается концентрация свободного амина.

Рис. 4.1. Зависимость степени превращения (Сда) альдегидных групп в азометиновые в реакциях ДПА с 2-аминопиридином от рН среды (20 °С, 2 ч).

рН

Оказалось, что уже при 20 °С и рН 10.5 изменение длительности реакции с 0.5 до 2.5 ч позволяет увеличить Ст с 53 до 98 %. Следовательно, реакцию 2-аминопиридина с ДПА в воде лучше всего вести при рН 10.5, 80 °С, 1 ч или при 20 °С в течение 2.5 ч.

Для сравнения реакционной способности 2-, 3- и 4-аминопиридинов реакцию ДПА с аминами проводили 2 ч при 40 °С, рН 8. Оказалось, что легче всего с ДПА взаимодействует 3-аминопиридин (С„а= 66 %). 2-Аминопиридин реагирует с ДПА с С„а= 60 %, а Спа в реакциях ДПА с 4-аминопиридином достигает лишь 30 %.

При проведении реакции ДПА с аминопиридинами наибольшие потери продукта наблюдаются при выделении его из раствора. С целью повышения выхода ФАП и упрощения выделения их из реакционной массы мы исследовали реакцию ДПА с 2-аминопиридином в кипящем диоксане. При этом было обнаружено, что в безводном диоксане реакция не идет. Учитывая то, что добавление воды в диоксан ускоряет реакцию эфиров и лактонов карбок-симетилдекстрана с аминами, мы изучили влияние концентрации воды в диоксане на результаты реакции ДПА с 2-аминопиридином.

Оказалось, что наибольшая степень замещения Спа (84 %) в реакциях ДПА с 2-аминопиридином наблюдается при содержании воды в диоксане более 5 %. По-видимому, в твердом образце ДПА большинство альдегидных групп находятся в виде полуацеталей. В безводном диоксане с аминопириди-ном реагируют только свободные альдегидные группы, которых в таких образцах ДПА мало, и реакция практически не идет (С„а менее 10 %). Добавление воды в диоксан приводит к гидратации полисахаридного образца, установлению равновесия между полуацеталями и альдегидными группами, что способствует протеканию реакции ДПА с аминопиридином. Выход целевого продукта реакции ДПА с 2-аминопиридином увеличился до 95 %.

Рис. 4.2. Зависимость степени превращения альдегидных групп ДПА в реакциях с 2-аминопириди-ном от концентрации воды в диоксане (101 °С, 2 ч).

% воды в диоксане

Модификация декстранполиальдегида 2-этокси-6-нитро-9-аминоакри-дином (А) и 2-этокси-6,9-диаминоакридином (основанием риванола) (Б) проводили с учетом результатов исследования реакций ДПА с ароматическими аминами и аминопиридинами.

А Б

Реакцию проводили в кипящем диоксане 24 ч с 3-х кратным избытком акридинового производного и в воде при 80 °С и рН 10, 24 ч. Продукт выделяли и анализировали как описано выше.

Оказалось, что ДПА в данных условиях не взаимодействует с 2-этокси-б-нитро-9-аминоакридином. По-видимому, нуклеофильность аминогруппы из-за влияния на нее гетероциклического атома азота и нитрогруппы слишком мала. В реакции ДПА с основанием риванола степень превращения альдегидных групп в азометиновые достигла 40 %. В связи с этим мы предполагаем, что реакция протекает по аминогруппе, находящейся во втором полноженин акридинового цикла. Анализ ИК спектров 2-нитро-6-этокси-9-аминоакридина, основания риванола и его продукта реакции с ДПА также позволяют нам сделать такой вывод. Полоса поглощения аминогруппы в положении 2 (1640 см"1) в ИК спектре продукта реакции ДПА с основанием риванола сдвинулась на 10 см"1, что, вероятно, связано с образованием азоме-тиновой связи.

Таким образом:

1. ДПА реагирует с аминопиридинами как в воде, так и в водном диоксане, что можно использовать для конструирования новых физиологически активных полимеров, например, на основе ДПА и риванола основания. Реакцию ДПА с аминопиридином в воде лучше всего вести при рН 10.5 1 ч при 80 °С или 2.5 ч при 20 °С, а в диоксане, содержащем более 5 % воды, 2-3 часа при 101 °С.

2. В реакциях ДПА с 3-аминопиридином достигается наибольшая степень превращения альдегидных групп в азометины (Ст 66 %), тогда как 2- и 4-аминопиридины реагируют с ДПА труднее (Спа 60 % и 30 %).

5. Реакции декстранполиальдегида с амино- и гидрокси-(оксо)пиримидинами

Многие пиримидиновые соединения входят в состав молекул, отвечающих за функционирование живых организмов, и широко применяются в синтезе лекарственных веществ. Последние, к сожалению, часто обладают побочным действием, токсичностью и быстро выводятся из организма. В связи с этим целью нашей работы была разработка метода связывания серии аминогидроксипиримидинов с декстранполиальдегидом.

Реакцию ДПА с гетероциклическими аминами проводили в воде при 20+80 °С рН 4 + 10.2 в течение 0.5+48 ч и мольном соотношении аминогете-

роцикла и альдегидных групп ДПА 3:1. После завершения реакции нерас-творившийся избыток исходных веществ отфильтровывали и продукт выделяли, как описано выше. Условия введения в молекулу полиальдегида ами-ногидроксипиримидинов определяли, изучая влияние температуры, времени реакции и величины рН на степень замещения в продуктах реакции ДПА с 6-аминоурацилом.

Как и следовало ожидать, число гетероциклических фрагментов в продуктах реакции ДПА с 6-аминоурацилом увеличивается с 0.01 до 0.58 моль/моль при повышении температуры от 20 °С до 80 °С. Практически линейно (с 1.4 до 63.6 %) увеличивается степень превращения альдегидных групп декстранполиальдегида в реакции с 6-аминоурацилом при повышении рН реакционной среды от 4 до 10.2. При 20 °С увеличение времени реакции мало влияет на степень замещения. Через 45 ч величина С„а достигает максимального значения (21.1 %). Увеличение времени реакции при 50 °С приводит к значительно более быстрому увеличению числа гетероциклических фрагментов в полисахаридальдегиде. Степень превращения альдегидных групп через 24 ч составляла 65 % (рис. 5.1).

время,час

Рис. 5.1. Зависимость степени превращения альдегидных групп ДПА в реакциях с 6-аминоурацилом от времени: (1) - при 50 °С, (2) -при 18-20 °С.

На основании полученных результатов были выбраны условия реакции ДПА с 6-аминоурацилом: 80 °С, 2 ч, рН реакционной среды 10, соотношение реагентов 3 моль амина на моль альдегидных групп. Результаты модификации декстранполиальдегида различными аминогетероциклами в этих условиях приведены в таблице 5.1.

В ИК спектрах продуктов реакции обнаружены интенсивные полосы поглощения в области 1600-1700 см"1, которые сложно идентифицировать, однако, полосы поглощения при 1630 см"1 и 1720 см"1 можно отнести к валентным колебаниям связей С=Ы и С=0 гетероциклического фрагмента, введенного в молекулу полисахаридальдегида.

УФ спектры растворов полученных соединений в 0.02 М КаОН имеют максимумы поглощения, характерные для исходных аминов и которые отсутствуют в спектре полиальдегида, но положение их аналогично положению максимумам поглощения в спектрах исходных аминогидроксипиримидинов.

Таблица 5.1

Результаты реакции декстранполиальдегида с аминогидроксипиримидинами._

№ Аминогетероциклы С„ моль/моль С„а, %

1 урацил следы следы

2 6-метилурацил следы следы

3 5-аминоурацил 0.61 92

4 6-аминоурацил 0.60 87

5 3 -метил-6-аминоурацил 0.36 36

6 2-амино-4,6-дигидроксипиримидин 0.15 23

7 цитозин следы следы

8 5-гидроксицитозин 0.40 59

9 5 -нитроцитозин 0.22 22

10 6-метилизоцитозин 0.14 20

11 5-гидроксиизоцитозин 0.51 51

12 4-гидрокси-6-аминопиримидин 0.55 55

13 2-тио-4,6-диаминопиримидин 0.55 81

14 2-тио-4,5-диамино-6-метилпиримидин 0.36 36

15 8-тиоаденин 0.17 17

16 2-аминобензимидазол 0.17 25

17 2-аминотиазол 0.32 47

18 основание гуанина следы следы

В спектрах ПМР растворов ДМСО-^ продукта взаимодействия ДПА с 6-аминоурацилом появились сигналы И-Н протонов пиримидинового кольца (5 10.19 м.д.) и СаН (1.76 м.д.). В спектре исходного ДПА сигналы в области 8 10 м.д. отсутствуют. Поскольку относительные интенсивности сигналов ДПА в области 5 4.39 и 4.67 м.д. в спектрах ДПА и продукта одинаковы, можно говорить о почти полном отсутствии молекул б-аминоурацила не связанных по С5. Судя по соотношению интенсивности протонов СаН и N-11 групп пиримидинового кольца 1 : 2.4, подавляющее число молекул 6-аминоурацилам (~ 90 %) связано с углеродами альдегидных групп в соотношении 2 : 1. О присутствии свободных ^Шг-групп 6-аминоурацила по спектрам ПМР судить трудно, так как сигналы этих протонов закрыты сигналами ДПА. Судя по форме и соотношению интенсивности двух основных групп сигналов в области 5 3-4 м.д. и 5 4.5-5.2 м.д. можно также полагать, что кон-формация полисахаридного остова продукта резко изменяется по сравнению с конформацией исходного ДПА. В спектре ЯМР 13С продукта исчезают сигналы беспротонных углеродов 5 48.63, 79.53, 86.9, 91.0, 93.6, 96.5, 99.5 м.д. и сигналы атомов углерода связанных с прогонами 5 94.6 и 100.2 м.д. и сохраняются сигналы атомов углерода таутомерных форм полиальдегида (8 96.5 м.д. и 8 98.4 м.д.). Кипячением 6-аминоурацила с и-нитробензальдегидом в

уксусной кислоте был получен бис(6-аминоурацил-5-ил)я-нитрофенил-метан.

Таким образом, можно полагать, что первоначально образующиеся бис(6-аминоурацил-5-ил)метилдекстранполиальдегиды (I) могут затем претерпевать гетероциклизации в пирролопиримидины путем дегидратации (взаимодействие аминогруппы с (3-атомом углерода Са-Ср-ОН групп) или с образованием макроцилов (П), например, взаимодействие аминогруппы со

свободными альдегидными группами и т.п.

н н сн2о—

ны 2-

О. ны

т т

гы 1!—

нсн2о-

о

НС II

^ 0

Такое строение полученных соединений подтверждается и тем, что при кислотном гидролизе с рН 3 в присутствии формальдегида отщепляется лишь относительно небольшая часть аминогидроксипиримидина (табл. 5.2).

На основании полученных данных нами были проведены реакции по модификации ДПА биологически активными соединениями (цефотаксимом и метотрексатом). Степень превращения альдегидных групп в реакциях достигает 40 %.

Таблица 5.2

Результаты гидролиза продуктов реакции производных

г г % гидроли-

№ Аминогидроксипиримидины моль/моль пач % зованных

связей

1 3 -метил-6-аминоурацил 0.36 36 40

2 5-аминоурацил 0.61 92 37

3 6-аминоурацил 0.60 87 30

4 5-гидроксицитозин 0.40 59 30

5 4-гидрокси-6-аминопиримидин 0.55 55 30

6 6-метилизоцитозин 0.14 20 30

7 2-тио-4,6-диаминопиримидин 0.55 81 30

8 5 -нитроцитозин 0.22 22 10

9 5-гидроксиизоцитозин 0.51 51 0

10 2-тио-4,5-диамино-б-метилпиримидин 0.36 36 0

Таким образом, 6-аминоурацил реагирует с декстранполиалъдегидом с образованием на первой стадии бис(6-аминоурацил-5-ил)метилдекстран-полиальдегида, который затем претерпевает гетероциклизацию в пирролопи-римидмны путем дегидратации или образует макроцилы, например, взаимодействием аминогруппы со свободными альдегидными группами. 5-Аминоурацил реагирует с ДПА подобно Ы-нуклеофилу, атакуя альдегидные атомы углерода экзоциклическим атомом азота, с образованием азометинов и «аминалей» - бис(урацил-5-амино)метилдекстранполиальдегидов.

б. Восстановление продуктов реакции ДПА с аминопиридинами и амннопиримидинами

Азометиновая связь легко гидролизуется, что не всегда удовлетворяет требованиям при синтезе ФАЛ. Самым удобным методом повышения прочности связи БАВ с полимерной матрицей является восстановление азометинов или проведение восстановительного аминирования. Зачастую, образующиеся вторичные амины обладают большей биологической активностью по сравнению с исходными продуктами. В связи с этим, нашей задачей являлось получение вторичных аминов из азометинов.

Восстановление азометинов боргидридом натрия проводили в воде при 18-20 °С 24 ч, либо восстановитель добавляли непосредственно в реакционную массу после синтеза азометинов. В случае цианборгидрида натрия восстановитель добавляли одновременно с ДПА и амином. Выход продукта со. ставляш 50-90 %.

В ИК спектрах продуктов реакции отсутствуют полосы поглощения валентных колебаний азометиновой связи, но появляются полосы деформационных колебаний связи "М-Н вторичных аминов(1490 см"1).

Образовавшиеся вторичные амины характеризовали степенью замещения С3 и, - числом аминогрупп, приходящемся на моносахаридное звено, которое рассчитывали по результатам элементного анализа.

Оказалось, что восстановление азометинов боргидридом натрия уменьшает число азотсодержащих групп в полисахариде примерно в 2-3 раза. 11ри добавлении восстановителя в реакционную массу после синтеза азометинов без их выделения позволяет все азометины превратить в амины. Вероятно, избыток первичного амина в реакционной массе препятствует гидролизу азометинов. Однако, наиболее удобным восстановителем является циан-борпщрид натрия. Его можно добавлять к смеси ДПА с амином, при этом значение рН среды достигает 10, и отпадает необходимость в щелочи. Это значительно упрощает синтез вторичных аминов.

При восстановлении азометинов цианборгидридом натрия не затрагиваются альдегидные группы. Образующийся при восстановлении полимер содержит вторичные амины и альдегидные группы, и может быть подвергнут дальнейшей модификации, а полученный при этом физиологически актив-

ный полимер будет содержать как стабильные, так и легко гидролизующиеся связи.

Таблица 3.6.3

Результаты восстановления продуктов реакции ДПА с аминами циан_ борщцридом натрия _

Амин с; с ^зам

и-толуидин 0.66 0.54

бензиламин 0.75 0.72

2-аминопиридин 0.63 0.58

* - С3, достигаемая при синтезе азометинов

Таким образом, наибольшее число вторичных аминов в полимере образуется при восстановлении продуктов реакции ДПА с аминами боргидридом натрия без выделения азометинов из реакционной массы. Однако при синтезе полимерных вторичных аминов наиболее удобно использовать восстановительное аминирование ДПА в присутствии цианборгидрида натрия, что позволяет получать полимер, пригодный для дальнейшей модификации.

7. Разработка и совершенствование методик анализа производных

декстрана

Традиционные методы анализа низкомолекулярных органических соединений не всегда применимы для количественных исследований полимеров. В связи с этим возникла необходимость в совершенствовании существующих и разработке новых методов анализа синтезированных веществ.

7. /. Совершенствование оксимного метода анализа полиальдегидов

Основным недостатком оксимного метода является зависимость полноты превращения альдегидных групп в оксимные от условий реакции. В связи с этим нами была проведена оптимизация процесса синтеза оксимов ДПА методом крутого восхождения.

На основании исходной методики синтеза оксима ДПА была выбрана область в пространстве факторов (температура 80-г100 °С, значения рН 5-^7, соотношение реагентов ДПА : гидроксиламин 1:34-1:5). В связи с тем, что исследуемая система 3-х факторная, на первом этапе выполнено 16 экспериментов, которые были реализованы в случайном порядке, что позволило избежать существенных ошибок в оценках коэффициентов.

После проведения экспериментов и анализа полученных образцов, с помощью программы «ББ» были проверены гипотеза воспроизводимости, значимости коэффициентов и адекватности модели. По данным расчета программы «ГВ» дисперсия воспроизводимости равна 0.0008813, что меньше 0.05. Полученные экспериментальные данные не противоречат гипотезе об однородности, т.к. рассчитанное значение О-статистики Кохрена (0.6709) не превышает табличное значение Ст-статистики (0.6798).

После вычисления коэффициентов регрессии, проверки их значимости и исключения переменных, у которых оценки коэффициентов регрессии незначимы, модель в нормированных переменных имеет вид:

у = 0.5169-0.0319х + 0л10б^-0.023цл~. (7.1.1) Для проверки адекватности модели были рассчитаны дисперсия адекватности (0.001369), дисперсия воспроизводимости (0.000881), Р-статистика (1.553191). РКр для данного случая равно 3.58 (число степеней свободы числителя N-(1 = 6, число степеней свободы знаменателя М(т-1) = 8). Р-статистики меньше Ркр, и, следовательно, модель адекватна.

После приведения подобных членов модели (7.1.1) получили следующее уравнение:

Сза = -117.55 + 1.301+ 20.90 рН- 0.23 I рН , (7.1.2)

Анализируя полученную модель необходимо отметить, что Сза зависит от температуры, которую надо понижать, и от рН реакционной среды, которую необходимо повышать.

Далее была реализована процедура крутого восхождения, которая в своей основе использует градиентный метод поиска экстремума. Оказалось, что в последующих экспериментах температуру необходимо уменьшать на 5 °С, значение рН увеличивать на 1.73 единицы. Принимаем рН равным 7.73. Дальнейшее его увеличение не целесообразно, так как известно, что оксимы в сильнощелочных растворах неустойчивы.

После выполнения процедуры крутого восхождения было установлено, что при 50 °С, рН 7.73 и соотношении реагентов 1:5 Сза экспериментальная совпала с Сза теоретической. Следовательно, эти условия являются оптимальными для проведения реакции ДПА с гидроксиламином.

7.2. Разработка методик стандартизации азометинов

Определение числа азометиновых групп в образцах полисахаридов элементным анализом весьма продолжительно. Поэтому нами предложена методика анализа аминопиридиновых фрагментов в полисахаридальдегиде, которая основана на щелочном гидролизе азометинов в присутствии гидро-ксиламина и спектрофотометрическом определении концентрации аминопи-ридинов в растворе.

Оптическую плотность полученных растворов 2-, 3- и 4-аминопиридинов измеряли на спектрофотометре при длине волны Я.МШСс= 286, 288 и 266 нм соответственно. Измерения проводили против 14 % щелочного раствора гидроксиламина. Число молей аминопиридинов в исследуемых образцах рассчитывали по уравнениям калибровочных графиков, для построения которых использовали растворы с точными навесками 2-, 3- и 4-аминопиридинов в 14 % щелочном растворе гидроксиламина.

Для определения условий полного гидролиза азометинов изменяли рН щелочного раствора гидроксиламина, время и температуру реакции. Анализ

проводили на образце азометина, синтезированного из ДПА и 2-аминопридина (Ст 45 %).

Оказалось, что полный гидролиз азометинов протекает липа при рН > 13, за 4 ч при 18-20 °С или за 45 мин при 100 °С.

Результаты определения аминопиридиновых фрагментов в полисаха-ридальдегидных образцах по содержанию в них азота и по предложенной нами методике отличаются не более чем на 5 % (табл. 7.2.3).

Таблица 7.2.3

Результаты анализа продуктов реакции ДПА и аминопиридинов

Образец Методы анализа Метрологические характеристики спектрофотометриче-ской методики (п = 5, Р = 0.99)

Элементный Спектрофото-метрический

ДПА-2-АП 0.5110.02 0.48+0.02 0.24+0.01 0.50±0.01 0.47+0.03 0.25±0.01 е = 2.0%, 82 = 2.5-10"5 6=1.8%, Б2 = 4.0-10"5 б = 2.2%, Э2 = 3.0-10"5

ДПА-З-АП 0.63±0.03 0.6210.02 8=1.6%, Б2 = 5.0-10*5

ДПА-4-АП 0.28±0.02 0.28+0.01 е = 2.4%, Б2 = 3.0-10"5

Таким образом, разработанная нами методика позволила сократить время и трудоемкость анализа 2-, 3- и 4-аминопиридинов в полисахаридных образцах при сохранении точности определения.

7.3. Кондуктометртеское титрование азометинов

Для определения числа азометиновых групп в продуктах реакции ДПА и КМД-ПА с ароматическими аминами нами предложена методика кондук-тометрического титрования. Образцы растворяли в 0.1 М соляной кислоте и через 1 ч титровали 0.1 М раствором шдроксида натрия. Результаты анализа образцов разными методами отличаются не более чем на 5 % (табл. 7.3.1.).

Таблица 7.3.1

Результаты анализа продуктов реакции ДПА с ароматическими _аминами различными методами_

Ароматический амин Степень замещения С,, определенная методом

элементного анализа кондуктометрического титрования

я-толуидин и-броманилин и-нитроанилин 0.75Ю.03 0.5410.03 0.3610.02 0.78+0.02 0.5210.03 0.37Ю.01

Таким образом, предложенная нами методика удобна, проста, значительно сокращает трудоемкость и время анализа азометинов полиальдегидов. Она дает воспроизводимые результаты, которые подтверждаются другими методами анализа.

8. Биологическая активность синтезированных соединений

Для изучения биологической активности синтезированных соединений на кафедру микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГМУ им. И.П. Павлова (зав. профессор В.В. Тец) было передано 26 образцов. По предварительным данным 10 из них проявляют антимикробную активность в дозах >100 мкг/мл. Продукт конденсации ДПА с цефотаксимом подавляет рост St. aureus в дозе 25 мкг/мл. По данным НИИ Фтизиопульмонологии МЗ РФ производные ДПА и ароматических аминов проявляют противотуберкулезную активность в дозах 50 мкг/мл. Азометин, синтезированный из декстран-полиальдегида и и-броманилина обладает противотуберкулезной активностью в дозе 25 мкг/мл.

ВЫВОДЫ

1. Взаимодействие декстран- и карбоксиметилдекстранполиальдегидов с ароматическими и гетероциклическими аминами в воде при рН раствора близких к значениям их рКвн+ - удобный метод модификации полисахаридов для создания физиологически активных полимеров, позволяющий варьировать не только число аминов, вводимых в полимерную цепь, но и баланс ли-пофильных и гидрофильных свойств потенциальных лекарств.

2. Вариация рН буферного раствора и отношения количества метаперио-дата натрия на мономерное звено декстран- и карбоксиметилдекстранов и условий выделения продуктов окисления позволяет получать соответствую. щис полиальдегиды с заданным числом и соотношением 2,4- и 2,3(3,4)-окисленных фрагментов.

3. Ароматические и гетероциклические амины, не содержащие других функциональных групп, реагируют с декстран- и карбоксиметилдекстранпо-лиальдегидами образуя только азометины, тогда как их амино- и гидро-кси(оксо)производные кроме того подвергаются и последующей гетероцик-лизации за счет взаимодействия нуклеофильных групп амина с электрофиль-ными центрами полисахарида.

4. 6-Аминоурацилы, в отличие от 5-аминоаналогов, взаимодействуют с декстранполиальдегидом и ароматическими альдегидами, как С-, а не N-нуклеофилы, с образованием на первой стадии соответствующих бис(6-аминоурацил-5-ил)метилдекстранов, аминогруппы которых затем реагируют с карбонилами полисахарида.

5. Наибольшее число вторичных аминов в полимере образуется при восстановлении продуктов реакции ДПА с аминами боргидридом натрия без выделения азометинов из реакционной массы при их синтезе.

6. Спектрофотометрическое определение количества аминов, выделившихся после гидролиза полимерных азометинов щелочным раствором гидро-ксиламина, или кондуктомстрическое титрование растворов азометинов в соляной кислоте - простые и удобные методы определения числа азометино-вьтх фрагментов, приходящихся на моносахаридное звено полимера, позво-

ляющие сократить время и трудоемкость анализа ароматических и гетероциклических иминополисахаридов.

По предварительным данным ряд синтезированных соединений проявляют противомикробную активность в дозах >100 мкг/мл. Продукт конденсации ДПА с цефотаксимом подавляет рост St. aureus в дозе 25 мкг/мл. Азоме-тины, полученные из ДПА и ароматических аминов, обладают противотуберкулезным действием в дозах 50 мкг/мл.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Тищенко Е.В., Иозеп A.A., Ивин Б.А. Реакции декстранполиальдегида с аминогидроксипиримидинами // Ж. прикл. химии. - 2002. - Т. 75. Вып. 4.-С. 694-696.

2. Новикова Е.В., Тищенко Е.В., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Свойства декстранполиальдегида в зависимости от условий синтеза и выделения // Ж. прикл. химии. - 2002. - Т. 75. Вып. 6. - С. 1003-1006.

3. Суворова О.Б., Тищенко Е.В., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Влияние кислотности среды и рКа амина на ход реакции декстранполиальдегида с аминами // Ж. прикл. химии. - 2002. - Т. 75. Вып. 8. - С. 1391-1393.

4. Суворова О.Б., Тищенко Е.В. Исследование реакции декстранполиальдегида с ароматическими и алифатическими аминами. // Тез. докл. 66 итоговой конференции студентов и молодых ученых «актуальные проблемы медицины и фармации». Курск, 2001. С. 343-345.

5. Сибикина О.В., Иозеп A.A., Тищенко Е.В., Пассет Б.В., Ивин Б.А. Ацилирование гетероциклических аминов полисахаридкарбоновыми кислотами и их производными. // Материалы первой междунар. конф. «Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов», Москва, 9-12 октября 2001. С. 273.

6. Тищенко Е.В., Иозеп A.A., Ивин Б.А. Синтез декстранполиальдегида и его реакции с аминопиримидинами. // Тез. докл. третьей молодежной школы-конференции по органическому синтезу «Органический синтез в новом столетии», Санкт-Петербург, 24-27 июня 2002. С. 259-260.

На правах рукописи

ТИЩЕНКО Екатерина Владимировна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АМИНО- И ГИДРОКСИ(ОКСО) ПРОИЗВОДНЫХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ С ПОЛИСАХАРИДАМИ — НОВЫЙ ПУТЬ СИНТЕЗА БАВ

15.00.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ЛР № 021251 «г 23.10.97. Подписано в печать 21.05.2003. _Тираж 100. Заказ 473.___

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия. Издательство СПХФА - - член Издательско-полиграфической ассоциации вузов Санкт-Петербурга, 197376, С.-Петербург, ул. Профессора Попова, 14

t

«»1 0238

2оо5-/1

Полисахариды применяются в биотехнологии, медицине, пищевой, косметической, фармацевтической, нефтяной и других отраслях промышленности. С каждым годом все большее число полисахаридов и их производных применяют для лечения различных заболеваний, а также при создании полимерных пролекарств. В ряде случаев полисахариды обладают собственной физиологической активностью и повышают неспецифическую резистентность человека и животных к бактериальным и вирусным инфекциям, действию рентгеновских лучей, возникновению и развитию опухолей. Полисахариды в наибольшей степени отвечают требованиям, предъявляемым к полимерным матрицам при создании физиологически активных полимеров. Они, как правило, не токсичны, не вызывают аллергических реакций, не накапливаются в организме. Химическая фиксация лекарственных субстанций на полимерной матрице позволяет совершенствовать уже известные лекарственные препараты и создавать новые средства пролонгированного действия с низкой токсичностью и необходимым балансом липофильно-гидрофильных свойств. Примерами могут служить выпускаемые промышленностью отечественные и зарубежные препараты: пирогенал, поликапран, стрептодеказа и др.

Цель работы заключалась в разработке методов получения декстран-полиальдегидов с заданным числом 2,3(3,4)- и 2,4-окисленных фрагментов и их химической модификации алифатическими, ароматическими и гетероциклическими аминами с образованием как гидролитически лабильной C=N, так и прочной ковалентной C-N связи. Для этого необходимо было решить следующие задачи: исследовать влияние природы буферных растворов, рН реакционной массы, концентрации окислителя и условий выделения на строение образующегося декстранполиальдегида; определить условия модификации декстранполиальдегида аминами с образованием лабильной азометиновой связи; исследовать влияние рКвн+ ароматического амина на степень превращения альдегидных групп в азометиновые, а также степени карбоксиметилиро-вания на растворимость образующихся азометинов; синтезировать аминополисахаридные производные с прочной ковалент-ной связью; разработать методики стандартизации полученных соединений.

Научная новизна. В работе впервые подробно изучены реакции декст-ран- и карбоксиметилдекстранполиальдегидов с ароматическими и гетероциклическими аминами и показано, что проведением их в воде варьируя рН раствора, температуру и время можно получать полимеры с заданным числом низкомолекулярных фрагментов. Ароматические и гетероциклические амины, не содержащие других функциональных групп, реагируют с декст-ран- и карбоксиметилдекстранполиальдегидами образуя только азометины, тогда как их амино- и гидрокси(оксо)производные кроме того подвергаются и последующей гетероциклизации за счет взаимодействия с электрофиль-ными центрами полисахарида. 6-Аминоурацилы, в отличие от 5-аминоаналогов, взаимодействуют с декстранполиальдегидом и ароматическими альдегидами, как С-, а не N-нуклеофилы, с образованием на первой стадии соответствующих бис(6-аминоурацил-5-ил)метилдекстранов, аминогруппы которых затем реагируют с карбонилами полисахарида.

Практическая значимость, заключалась в разработке технологичных методов окисления декстрана и карбоксиметилдекстрана, позволяющих получать полиальдегид с заданным числом и соотношением 2,4- и 2,3(3,4)-окисленных фрагментов и модификации декстран- и карбоксиметилдекст-ранполиальдегида физиологически активными аминами для получения физиологически активных полимеров. Разработаны методики стандартизации синтезированных иминополисахаридов, которые позволили сократить время и трудоемкость анализа.

2. Обзор литературы

5. ВЫВОДЫ

1. Взаимодействие декстран- и карбоксиметилдекстранполиальдегидов с ароматическими и гетероциклическими аминами в воде при рН раствора близких к значениям их рКвн+ - удобный метод модификации полисахаридов для создания физиологически активных полимеров, позволяющий варьировать не только число аминов, вводимых в полимерную цепь, но и баланс ли-пофильных и гидрофильных свойств потенциальных лекарств.

2. Вариация рН буферного раствора и отношения количества метаперио-дата натрия на мономерное звено декстран- и карбоксиметилдекстранов и условий выделения продуктов окисления позволяет получать соответствующие полиальдегиды с заданным числом и соотношением 2,4- и 2,3(3,4)-окисленных фрагментов.

3. Ароматические и гетероциклические амины, не содержащие других функциональных групп, реагируют с декстран- и карбоксиметилдекстранпо-лиальдегидами образуя только азометины, тогда как их амино- и гидро-кси(оксо)производные кроме того подвергаются и последующей гетероцик-лизации за счет взаимодействия нуклеофильных групп амина с электрофиль-ными центрами полисахарида.

4. 6-Аминоурацилы, в отличие от 5-аминоаналогов, взаимодействуют с декстранполиальдегидом и ароматическими альдегидами, как С-, а не N-нуклеофилы, с образованием на первой стадии соответствующих бис(6-аминоурацил-5-ил)метилдекстранов, аминогруппы которых затем реагируют с карбонилами полисахарида.

5. Наибольшее число вторичных аминов в полимере образуется при восстановлении продуктов реакции ДПА с аминами боргидридом натрия без выделения азометинов из реакционной массы при их синтезе.

6. Спектрофотометрическое определение количества аминов, выделившихся после гидролиза полимерных азометинов щелочным раствором гидро-ксиламина, или кондуктометрическое титрование растворов азометинов в соляной кислоте — простые и удобные методы определения числа азометино-вых фрагментов, приходящихся на моносахаридное звено полимера, позволяющие сократить время и трудоемкость анализа ароматических и гетероциклических иминополисахаридов.

По предварительным данным ряд синтезированных соединений проявляют противомикробную активность в дозах > 100 мкг/мл. Продукт конденсации ДПА с цефотаксимом подавляет рост St. aureus в дозе 25 мкг/мл. Азоме-тины, полученные из ДПА и ароматических аминов, обладают противотуберкулезным действием в дозах 50 мкг/мл.