Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Синтез, строение и биологическая активность комплексов меди (II) и никеля (II) с 1-(бета-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом

РГ6 ОА

" з СЕй 1ЯЯ7

На правах рукописи

КОКОРНИКОВА ОКСАНА ФЕДОРОВНА

СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСОВ МЕДИ (II) И НИКЕЛЯ (II) С 1-(Р-ОКСИЭТИЛ)-2-МЕТИЛ-5-НИТРОИМИДАЗОЛОМ

15.00.02. - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 1997

Работа выполнена в Московской Медицинской Академии имени И.М.Сеченова.

Научный руководитель: Доктор биологических наук

профессор Н.И.Калетина

Научный консультант: Доктор медицинских наук

Г.Е.Рубинов

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАО доктор фармацевтических наук профессор В.А.Попков

Академик ВАСХНИЛ доктор биологических наук профессор Б.А.Ягодин

Ведущее учреждение:

Государственный научно-исследовательский институт по стандартизации и контролю лекарственных средств (ГНИИСКЛС)

Защита состоится "_" _1997 г. в_часов

на заседании Диссертационного Совета Д-074.05.06. при Московской Медицинской Академии им.И.М.Сеченова (г.Москва, Никитский бульвар, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке ММА им.й.М.Сеченова (г.Москва, Зубовская пл., д.1).

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д-074.05.06., кандидат фармацевтических наук, доцент

Н.П.Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Достижения современной науки позволяют системно подойти к анализу многочисленных данных о микроэлементном составе живых и растительных организмов, представляющих собой сложную полиметаллическую и полилигандную структуру, для функционирования которой необходимо поддержание металло-лигандного гомеостаза / АЛ.Авцын, 1990, Б.А.Ягодин, 1993, Н.И.Калетина, 1982, 1996, E.A.Frieden, 1984, J.C.Kinq,1990 /. Исследования в области биохимии патологических процессов свидетельствуют о значительных изменениях в обмене и балансе микроэлементов на субклеточном, тканевом и оргшшзменном уровнях. Своевременная коррекция нарушенного обмена микроэлементов, согласно экспериментальным и клиническим данным, может привести к эффективному лечению / C.G.Coulson, 1983, J.B.Neilands, 1985, Л.Р.Ноздрюхина, 1985, Г.А.Бабенко, 1988, А.В.Концевой, 1990, С.Д.Алиев, 1990, В.И.Донцов, 1994 /.

Среди лекарственных препаратов выявлены определенные группы веществ, способные к образованию комплексов с металлами in vitro, что, в свою очередь может послужить причиной возникновения "вторичных" или ятрогенных микроэлементозов /Н.И.Калетина, 1978, 1995, В.К.Подымов, 1982, К.Б.Яцемирский, 1990, A.Grinder, 1990, В.И.Донцов, 1994, Л.ПЛазурина, 1995 /.

Исследования в этом перспективном направлении, к сожалению, еще малочисленны. Однако в последние годы повысился интерес к наиболее рациональному использованию известных лекарственных препаратов, к возможности их химической модификации, в том числе, к созданию комплексных соединений лекарственных веществ с эссенциальными микроэлементами / Е.Е.Крисс, 1990, Н.И.Калетина, 1991, А.Н.Юнусходжаев, 1991, Ю.^Владимиров, 1992, А.Б. Акбаров, Ю.Я.Харитонов, 1994/.

Изучение этиологической стуктуры гнойно-воспалительных процессов позволило к настоящему времени выявить и идентифицировать более 550 штаммов различных микроорганизмов. Как известно, использование широкого спектра новых антибиотиков и возрастание назначаемых доз этих препаратов адекватного результата лечения не дало / В.И.Покровский, 1991 /. В связи с этим заслуживает дальнейшего развития тактика применения лекарственных средств в малых дозах с учетом индивидуальных особенностей организма больного и состояния его иммунной системы. Металло-лигандный гомеостаз и сохранение баланса микроэлементов в организме являются надежными критериями активности иммунных реакций in vivo.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Настоящее исследование продолжает цикл работ, посвященных синтезу и изучению биокомплексов микроэлементов как новой генерации лекарственных средств, и выполнено в соответствии с планом НИР ММА им .И.М.Сеченова по теме "Создание эффективных лекарственных средств на основе комплексов металлов с биоактивными лигандами. Разработка методик анализа лекарственных средств" ( № Гос. регистрации 01930007679 )

Цель настоящей работы состояла в синтезе, изучении состава, строения и биологической активности новых координационных соединений меди (II ) и никеля (И) с 1-(Р-оксиэтил)-2-метил-5-1штроимидазолом.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- синтезировать комплексные соединения меди ( II ) и никеля ( II ) с l-(ß-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом;

- установить состав синтезированных соединений и способ координации металла в них;

- определить антимикробную и иммуномодулирующую активность комплексных соединений меди (II) и никеля ( II) с 1-(Р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом;

- установить острую токсичность синтезированных соединений;

- предложить методики определения содержания синтезировашшх соединений в мягких лекарственных формах;

- изучить влияние синтезированных соединений на процессы регенерации кожи и металло-лигандный гомеостаз организма.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Получено положительное решение ВНИИГПЭ ( № 97102649 ) о выдаче патента РФ на комплексные соединения меди (II) и никеля (II) с 1-(Р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом, обладающие значительной антимикробной активностью в отношении эталонных штамов грам-отрицательных, грамположительных аэробов и анаэробов, бактерий, бацилл, грибов, а также возбудителя трихомониаза, а также малой токсичностью.

Сравнение эффективности действия в ряду координационных соединений цинка, кобальта (II) / полученных в нашей лаборатории ранее /, меди (II) и никеля (II) / синтезированных нами / с 1-(Р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроими-дазолом, свидетельствует, что их антимикробная активность и токсичность связана как с природой центрального атома, так и со строением комплекса. Анализируемые соединения характеризуются высокой степенью избирательности по отношению к виду микроорганизма.

Применение в эксперименте синтезированных комплексных соединений показало, с одной стороны, их влияние на клеточном уровне - ускорение процессов регенерации кожи, пролиферации лимфоцитов селезенки мыши; с другой - на тканевом уровне - меньшее изменение содержание железа, меди, цинка, кобальта, никеля и др. металлов, а также их соотношений в крови животных по сравнению с действием метронидазола.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Синтезированные комплексные соединения меди (II) и никеля (II) с 1-(р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом обладают значительной антибактериальной активностью, особенно в отношении B.fragilis и B.uniformis, комплекс меди ( II ) с l-(ß-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом обладает иммуномодулирующим действием в малых дозах, ускоряет заживление полнослойной кожной раны, нормализует металло-лигандный гомеостаз.

Разработаны составы и подготовлена документация для выпуска лечебно-профилактического крема, содержащего комплексное соединение меди ( И ) с 1-(р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом и получен гигиенический сертификат, разрешающий выпуск и применение крема, содержащего комплекс цинка с 1-ф-оксиэтил)-2-метил-5-1Штроимидазолом.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы и положения диссертации докладывались на Российской национальной конференции "Формирование приоритетов лекарственной политики" ( Москва, 1995 ), У11 Международном Соловецком форуме "Экология человека: Будущее культуры и науки Севера" (Архангельск, 1995 ), II Международном симпозиуме по проблемам саноген-ного и патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма" ( Бишкек, 1995 ), III Конгрессе ассоциации морфологов ( Тверь, 1996 ), III и 1У Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" ( Москва, 1996, 1997 ), на Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств" ( Санкт-Петербург, 1996 ), на научно-практической межкафедральной конференции фармацевтического факультета ММА им.И.М.Сеченова

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, получено положительное решение ВНИИГПЭ по авторской заявке "Комплексы меди (П) и никеля (П) с 1- (р-оксиэтил)-2 - метил-5-нитроимидазолом".

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы и четырех глав собственных исследований, выводов, списка литературы и приложений.

Библиография включает 163 литературных источника, из них 97 отечественных и 66 зарубежных авторов. Работа содержит 12 рисунков, 34 таблицы и 15 диаграмм.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе обсуждены литературные данные о роли микроэлементов в поддержании металло-лигандного гомеостаза и участии их в иммунных реакциях организма, рассмотрена возможность использования реакций комплексообразования известных лекарственных средств с микроэлементами, изложены методы определения металлов в биообъектах и методы изучения строения комплексных соединений.

Во второй главе представлены методики синтеза и результаты анализа комплексных соединений меди (II) и никеля (П) с 1-(Р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроими дазолом.

Третья глава посвящена изучению антимикробной и противо-трихомонадной активности синтезированных соединений, а также острой токсичности комплексных соединений при внутрижелудочном введении животным, влияния комплексных соединений и неорганических солей металлов на культуру Paramecium caudatum.

В четвертой главе приведены методики экстракционно-фотометричес-кого и рентгено-флюоресцентного определения цинка и меди в мягких лекарственных формах, содержащих комплексные соединения цинка и меди (П) с 1-(р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом.

Пятая глава посвящена изучению влияния комплексных соединений на металло-лигандный гомеостаз организма и процессы регенерации раны при моделировании полнослойной кожной раны.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез, состав и строение комплексных соединений меди (II) и никеля ГШ с 1-(р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом.

Синтез комплексных соединений осуществляли взаимодействием сте-хиометрических количеств метронидазола с сульфатами меди и никеля в среде органического растворителя.

Полученные соединения представляют собой твердые кристаллические вещества окрашенные в голубой (комплексное соединение с сульфатом меди) и светло-зеленый (комплексное соединение с сульфатом никеля) цвета. Синтезированные соединения растворимы в воде и 30 % этаноле, практически нерастворимы в хлороформе, ацетоне, ацетонитриле, четыреххлористом углероде, диметилсульфоксиде и диметилформамиде.

Результаты элементного анализа приведены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты определения элементов в комплексных соединениях.

Комплексное соединение Результаты С Н N

Си-МЫ найдено, % 29,13 4,06 16,68

вычислено, % 28,61 3,93 16,10

найдено, % 27,81 3,49 16,13

вычислено, % 27,98 3,52 16,32

Определение содержания металлов в комплексных соединениях проводили методами атомно-абсорбционной спектроскопии, атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой после предварительного озоления. Содержание металлов в синтезированных соединениях находили по калибровочному графику. Для определения содержания металлов в комплексах также использовали комплексонометрическое титрование 0,05 моль/л раствором ЭДТА с индикатором мурексидом до перехода окраски от желтой в фиолетовую. Фотометрическое определение меди в комплексном соединении проводили после взаимодействия минерализата комплексного соединения с 10 % раствором аммиака. Фотометрическое определение никеля основано на реакции образовании окрашенного соединения металла с диметил-глиоксимом в среде окислителей.

Результаты определения металлов разными методами в комплексных соединениях приведены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты определения содержания металлов в комплексных соединениях

Комплексное соединение Метод определения Результат, %

Комплекс меди (И) с Фотометрия 11,59 + 0,16

1-(Р-оксиэтил)-2-метил-5- Титриметрия 11,51 ±0,04

нитроимидазолом ААС 11,54 ±0,37

АЭС-ИСП 11,31 ±0,43

Вычислено 12,17

Комплекс никеля (II) с Фотометрия 11,43 ±0,09

1-(р-оксиэтил)-2-метил-5- Титриметрия 11,35 ±0,05

нитроимидазолом АЭС-ИСП 10,96 ±0,38

Вычислено 11,40

Определение метронидазола в составе комплексных соединениях проводили фотометрическим методом, основанным на измерении оптической плотности основания Шиффа, окрашенного в красный цвет, полученного при взаимодействии метронидазола с п-диметиламинобензальдегидом после восстановления нитро-группы.

Фотометрическое определение содержания сульфат-иона в составе комплексных соединений проводили, измеряя интенсивность помутнения растворов комплексных соединений после добавления солей бария. Результаты определенней метронидазола и сульфат-иона в составе комплексных соединений приведены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты определения содержания метронидазола и сульфат-иона в комплексных соединениях

Определяемый компонент Результаты определения, % Комплексное соединение Си-МИ Комплексное соединение №-МЫ

Метронидазол найдено 69,30 ± 0,43 68,04 ± 0,99

вычислено 65,58 66,46

Сульфат-ион найдено 18,33 ±0,21 18,49 ±0,29

вычислено 18,40 18,65

Для определения способа координации металла в комплексном соединении использовали данные ИК, УФ и ЯМР'Н спектроскопии.

ИК спектры комплексных соединений регистрировали в НИФХИ им.Л.Я.Карпова на спектрофотометре "БЫтаски" модель 200-19527 в области от 400 до 4000 см"1 . При определении использовали методику растирания образца в вазелиновом масле.

В ИК спектре комплексного соединения Си-МЫ наблюдается дублет в области 1558 и 1550 см"1, который, по-видимому, относится к изменениям валентных колебаний связи С=И имидазольного кольца. Полосы кристаллизационной воды появляются при 3430 см"1. На асимметричные валентные колебания сульфо-группы указывают полосы 1040, 1080 и 1120 см"1, а полоса в области 620 см"1 - на асимметричные деформационные колебания сульфогруппы. Кислород гидрокси-группы метронидазола не принимает участия в комплексообразовании, т.к. полоса 3600 см"1 присутствует как в спектрах комплексного соединения, так и в спектрах лиганда.

В ИК спектре комплексного соединения появляющаяся полоса в

области 1556 см"1 свидетельствует об изменении валентных колебаний имидазольного кольца, полосы в области 630 см'1 указывают на асимметричные деформационные, а в области 1060 и 1080 см"1 на асимметричные валентные колебания сульфогруппы. Полоса в области 3450 см"1 доказывает наличие в структуре комплексного соединения кристаллизационной воды.

Предполагаемое отнесение полос в ИК спектрах комплексных соединений представлено в таблице 4.

Изучение ИК спектров комплексных соединений после хранения при комнатной температуре в банках оранжевого стекла с притертыми пробками в течение 6 месяцев, показало, что комплексы устойчивы в этих условиях.

Электронные спектры водных растворов комплексных соединений меди (II) и никеля (II) с 1-((3-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом регистрировали на приборе "Цшсат БР - 800" в кюветах с толщиной слоя 1 = 1,0 см. В качестве раствора сравнения использовалась вода дистиллированная. Оба соединения, так же, как и метронидазол имеют максимум поглощения при Хтах = 320 нм, что свидетельствует о вхождении лиганда в состав комплексных соединений в нейтральной форме, при этом растворы метронидазола и комплексных соединений равной концентрации (С = 0,0355 г/л) имеют

различные коэффициенты молярного погашения: е ш = 9133; е си-мы = 15000; е №-ш = 18899.

Таблица 4

Предполагаемое отнесение основных полос поглощения в ИК спектрах комплексных соединений и метронидазола

Отнесение полос Волновые числа, см

Метронидазол Комплекс Си-МЫ Комплекс Ni-MN

v ( ОН ) 3600 3600 -

Vas(N02) 1530 1530 1530

v(N02) 1370 1370 1370

v(CH) ЗОЮ ЗОЮ ЗОЮ

v(C-Nm) 822 822 822

V ( H20 кристал. ) - 3450 3450

V ( C=N ) 1540 1550, 1558 1556

Vas (SO/-) - 1040,1080,1120 1060, 1080

8Ш ( S042- ) - 620 620

Исследовалась устойчивость комплексных соединений при различных значениях рН. Растворы устойчивы при подкислении 1н и 6н растворами соляной кислоты, при хранении при комнатной температуре в течение недели, добавление кислоты вызывает смещение максимума поглощения до 277 нм и снижение величины оптической плотности по сравнению с первоначальным раствором. Добавление 1н раствора едкого натра вызывает разрушение комплексных соединений.

Спектры ЯМР'Н комплексных соединений меди ( П ) и никеля ( II ) с 1-(Р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом получены на приборе "\УМ -400" фирмы Вгикег в дейтерированной воде при 27°С с рабочей частотой 80 Гц/см. В качестве внутреннего стандарта измерений химических сдвигов

использовался тетраметилсилан. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР'Н проводилось на основании вида мультиплетов и значений констант спин-спинового взаимодействия. Результаты исследования представлены в таблице 5.

В спектрах ЯМР'Н комплексного соединения "№-МЫ не наблюдается каких-либо существенных изменений по сравнению со спектром лиганда.

В ЯМР1!! спектре комплексного соединения Си-МЫ наблюдается сильное смещение сигнала протона =С-Н в слабое поле ( до 30 м.д. сигнал отсутствует), что можно объяснить акцепторным влиянием иона металла при координации по атому азота N3.

Таблица 5

Химические сдвиги протонов и их отнесение в спектрах ЯМР'Н метронидазола и комплексных соединений

Отнесение химических сдвигов Величина химических сдвигов, 5, м.д.

Метронидазол Комплекс Си-МЫ Комплекс №-МЫ

Ш2- 3,94 4,36 4,02

-СН3 2,53 2,33 2,59

-СН20 4,54 5,07 4,61

=С-Н 8,09 - 8,14

По совокупности результатов, проведенных исследований получены комплексные соединения состава метронидазол : металл = 2 : 1 с координацией металла к атому азота в положении 3 имидазольного кольца с вхождением в координационную сферу воды.

2.Изучение биологической активности и острой токсичности комплексных соединений меди (II) и никеля (II) с 1-ф-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом.

Исследование острой токсичности метронидазола, его механических смесей с меди ( II ) сульфатом и никеля ( II ) сульфатом и комплексных соединений Си-МИ и проводилось на 240 мышах линии ВАЬВ/С

( самцы, масса тела 18,0 - 22,0 г ) и 240 крысах ( самцы, масса тела

180,0 - 200,0 г) при однократном внутрижелудочном введении.

Изучаемые вещества вводили в виде 2 - 4 % свежеприготовленных подогретых водных растворов. Наблюдение за подопытными животными проводили в течение 10 дней.

Результаты определения параметров токсичности изученных соединений представлены в таблицах 6, 7.

По принятой классификации токсичности, изучаемые вещества относятся к классу малотоксичных веществ .

Таблица 6

Показатели токсичности определяемых веществ для мышей

Изучаемые Показатели токсичности, мг/кг

вещества ЛД16 ЛДбО + т ЛД84

Комплекс Си-МЫ 316,0 443,0 + 39,9 625,0

Механич.смесь метронидазола с меди (II) сульфатом 509,0 705,0 ±61,1 982,0

Комплекс №-МЫ 369,0 536,0 ±47,6 738,0

Механич.смесь метронидазола с никеля (II) сульфатом 442,0 640,0 ± 63,4 933,0

Таблица 7

Показатели токсичности определяемых веществ для крыс

Изучаемые Показатели токсичности, мг/кг

вещесгва ЛД16 ЛД50 + Ш ЛДМ

Комплекс Си-МИ 1590,0 1855,0 + 74,9 2170,0

Механ. смесь метронидазола с меди (II) сульфатом 2310,0 2700,0 + 107,1 3140,0

Комплекс №-МЫ 1810,0 2125,0 + 96,8 2560,0

Механ. смесь метронидазола с никеля (II) сульфатом 2140,0 2565,0+ 122,6 3090,0

Изучение антимикробной активности метронидазола, комплексных соединений Cu-MN и Ni-MN, а таюке механических смесей метронидазола с меди (II) сульфатом и никеля (II) сульфатом с соотношением компонентов 2 : 1 проводили in vitro в соответствии с требованиями ГФ XI методом диффузии препаратов в питательный агар и методом лунок, при исследовании чувствительности возбудителя трихомониаза к препаратам использовали метод серийных разведений .

Изучение антимикробной активности препаратов проводили в интервале концентраций от 32,0 мг/мл до 0,006 мг/мл; антитрихомонадной активности в интервале концентраций от 0,5 до 0,05 мг/мл.

Минимальные ингибирующие концентрации изученных веществ представлены в таблицах 8 и 9.

При изучении антитрихомонадной активности учитывали подвижность трихомонад при обработке препаратами. Результаты определения приведены в таблице 10.

Полученные результаты свидетельствуют об усилении антимикробных свойств комплексных соединений Cu-MN и Ni-MN по сравнению с метрони-

дазолом и механическими смесями метронидазола с сульфатами металлов в отношении E.coli, S.aureus и B.subtilis. Изучение активности соединений в отношении P.aeruginosa выявило гетерогенность популяции Pseudomonas к метронидазолу. Антибактериальная активность метронидазола при изучении штамма NCTC 2134 не наблюдалась, тогда как в отношении штамма АТСС 9027 была умеренной. Поштаммовой резистентности Pseudomonas к комплексным соединениям Cu-MN и Ni-MN не наблюдалось, поэтому применение этих соединений может быть эффективным при лечении ран и ожогов, инфицированных данным возбудителем.

Таблица 8

Минимальные ингибирующие концентрации метронидазола, механической смеси метронидазола с меди (П ) сульфатом и комплексного соединения

Cu-MN

Изучаемый штамм микроорганизма Минимальная ингибирующая концентрация, мг/мл

MN Механ. смесь Cu-MN

Е. coli, штамм АТСС 25922 4,0 4,0 4,0

S. aureus, штамм АТСС 6538 Р 8,0 8,0 8,0

P.aeruginosa, штамм АТСС 9027 8,0 8,0 4,0

P.aeruginosa, штамм NCTC 2134 0 8,0 4,0

В. subtilis, штамм АТСС 6633 8,0 4,0 4,0

В. uniformis, штамм АТСС 8492 0,062 - 0,015

В. fragilis, штамм АТСС 25285 0,062 - 0,006

С. albicans, штамм АТСС 885-653 0 0 0

Таблица 9

Минимальные ингибирующие концентрации метронидазола, механической смеси метронидазола с никеля ( П) сульфатом и комплексного соединения

Изученные штаммы микроорганизмов Минимальная ингибирующая концентрация, мг/мл

MN Механ. смесь Ni-MN

Е. coli, штамм АТСС 25922 4,0 4,0 4,0

S. aureus, штамм АТСС 6538 Р 8,0 8,0 8,0

Р. aeruginosa, штамм АТСС 9027 8,0 8,0 4,0

Р. aeruginosa, штамм NCTC 2134 0 32,0 8,0

В. subtilis, штамм АТСС 6633 8,0 4,0 4,0

В. fragilis, штамм АТСС 25285 0,062 - 0,015

В. uniformis, штамм АТСС 8492 0,062 - 0,031

С. albicans, штамм АТСС 885-653 0 16,0 8,0

Условные обозначения:

"О" - активность препаратов отсутствует

"-" - изучение активности не проводили

Фунгицидная активность наблюдается только у комплексного соединения №-МЫ, что может быть использовано при лечении бактериальных инфекций с грибковым компонентом.

Увеличение в 10 раз активности в отношении В.й^Шз наблюдается у комплексного соединения Си-МИ и в 4 раза у комплекса №-МК Усиление активности в 4 и 2 раза соответственно наблюдается в отношении В.ишАэпшз. Анаэробные бактерии обуславливают значительную частоту возникновения абсцессов и других осложнений при оперативных вмешательствах. В 65 %

случаев высеваются Ва^епйёез, в частности, В.С^Шэ. Высокая эффективность метронидазола в отношении анаэробной микрофлоры объясняется его специфическим восстановлением в активные производные, а это возможно только у анаэробных микроорганизмов, содержащих доноры электронов.

Таблица 10

Оценка подвижности влагалищных трихомонад

Концентрация веществ, мг/мл МЫ Мех.смесь МЫ с меди (II) сульфатом Си-МЫ Мех.смесь МЫ с никеля ( П ) сульфатом м-мы

0,05 К К Я Я я

0,10 II К К И II

0,20 я И И И я

0,30 к к И И я

0,40 I I К I я

0,50 Б Б Б Б Б

Условные обозначения:

И - влагалищные трихомонады подвижны (резистентны ) I - помежуточная чувствительность влагалищных трихомонад (отдельные

движущиеся экземпляры) Б - чувствительность влагалищных трихомонад (трихомонады неподвижны)

4.Методы определения содержания комплексных соединений меди (Щ и цинка с 1-(р-оксиэтил1-2-метил-5-ннтроимидазолом в мягких лекарственных формах.

Изучение влияния синтезированных соединений и лиганда на пролифе-ративную активность лимфоцитов мыши проведилось совместно с НИИ Эпи-демиологиии и Микробиологии им.Н.Ф.Гамалея. Пролиферативную актив-

ность комплекса Си-МИ и лиганда оценивали по включению радиоактивной метки в ДНК клеток, культивируемых с исследуемыми веществами по отношению к включению метки в контрольных культурах (без митогенов).

Результаты исследования свидетельствуют, что комплекс Си-МЫ обладает иммуномодулирующей активностью в концентрации 0,1 мкг/мл.

Полученные данные об иммуностимулирующей и антимикробной активности комплексных соединений позволили совместно с фирмами "Мирра-Люкс" и "Мирра-Сапфир" разработать кремы "Мирра*Н2п" и "Мирра*!!01", обладающие антимикробной и иммуномодулирующей активностью.

Комплексные соединения Си-МЫ и 2п-МЫ вводили в крема в концентрации 0,20 - 0,25 % при перемешивании с помощью ультразвука.

С целью стандартизации процесса производства и контроля качества продукции были предложены методики экстракционно-фотометрического и рентгено-флюоресцентного определения комплексных соединений в кремах.

Методика фотометрического определения меди (II) в креме, содержащим комплексное соединение Си-МЫ основана на образовании окрашенного соединения при взаимодействии металла с дютилдитиокарбоматом свинца Относительная ошибка определения составляет г = 1,90 %.

Фотометрическое определение цинка в креме, содержащим комплексное соединение 7п-МК основано на определении оптической плотности раствора дитизоната цинка, окрашенного в красный цвет. Относительная ошибка определения составляет е = 1,91 %.

Рентгено-флюоресцентное определение меди и цинка в кремах было проведено на приборе "У11А-33" методом добавок. Относительная ошибка определения меди составляет е = 1,49 %, определения цинка - с = 1,75 %.

5.Изучение влияния синтезированных соединений на металло-лигандный гомеостаз.

Изучение изменения металло-лигандного гомеостаза при моделировании полнослойной кожной раны проведено на 49 крысах Wistar ( самцы, масса тела 180 - 200 г ). Определение уровня микроэлементов проводили у интактных животных, у животных, не получавших лечение ( серия 1 ), при лечении 0,3 % мазью метронидазола на ПЭО (серия 2 ) и при лечении 0,5 % мазью биокомплекса Cu-MN на ПЭО (серия 3) на 2 и 5 сутки эксперимента.

Содержание 5 микроэлементов в цельной крови определяли на плазменном спектрометре ICAP - 9000, результаты статистически обрабатывали с использованием пакета программы Paradox - 3.

Примеры изменения уровня металлов в цельной крови представлены на диаграммах 1-3.

Гистологическое изучение раны показало, что эпителизация раневой поверхности наступала на 7 сутки опыта по сравнению с 10 в контроле. В дерме ускорялось постгравматическое развитие лейкоцитарной и макро-фагической реакции. Применение мази с биокомплексом Cu-MN способствовало образованию на 7 сутки полноценной грануляционной ткани, богатой фибробластами и коллагеновыми волокнами, относительный объем которых в 2,5 - 3 раза превышает аналогичный показатель в контроле (1 и 2 серия).

Кроме абсолютных значений содержания металлов в крови нами были получены значения соотношений микроэлементов, для которых известны нормальные диапазоны, рассчитаны коэффициенты корреляции.

Изменение уровня микроэлементов в разные сроки наблюдения указывает на включение компенсаторно-приспособительных реакций организма, нацеленных на восстановление металло-лигандного гомеостаза и затрагивающих процессы перераспределения металлов, мобилизуя их из органов-депо.

Полученные нами данные свидетельствуют, что дисбаланс микроэлементов выражен сильнее при применении мази с метронидазолом, чем при использовании мази с биокомплексом Си-МК

Диаграмма 1

Изменение уровня гп в цельной крови при попнослойной кожной ране

12,00 -10,00

Сроки наблюдения

Диаграмма 2

Изменение уровня Си в цельной крови при полнослойной кожной ране

0,60 -г-

0,50

0,40 ■ ■

2

3 О 0,30

л

8 0,20

о

>. 0,10 ■

0,00 -

о

сч

-о. ь ^ Ь

) о и о " о > СМ Ю N

Сроки наблюдения

о 3 ш и

Диаграмма 3

Изменение уровня N1 в цельной крови при полнослойной кожной ране

0,014 -0,012-

N |\| Ю N N щ

Сроки наблюдения

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Синтезированы новые биологически активные комплексные соединения меди (П) сульфата и никеля (II) сульфата с 1-(Р-оксиэтил)-2-метил-5-нитро-имидазолом. Доказана их индивидуальность, изучен ряд физико-химических свойств. Методами элементного анализа, ААС, АЭС-ИСП, титримет-рическими и фотометрическими методами определен состав комплексных соединений.

2. По совокупности результатов, полученных методами ИК, УФ, ЯМР'Н спектроскопии установлено, что комплексы Си (II) и М (II) сульфата с 1-(Р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом имеют аналогичное строение, связь металл-лиганд реализуется через нуклеофильный атом азота имида-зольного кольца в положении 3, имеющий максимальную степень локализации электронной пары; кристаллизационная вода входит во внутреннюю сферу комплекса, сульфат-ион - во внешнюю. Методом УФ спектроскопии исследована устойчивость при различных рН водных растворов

комплексов Си-МЫ и М-МИ и показана их стабильность при комнатной температуре при хранении в течении недели.

3. Определена активность комплексных соединений Си-МИ и №-МЫ в отношении аэробных и анаэробных бактерий, бацилл и грибов. Доказано значительное возрастание антимикробной активности синтезированных соединений в отношении штаммов Е.соН, З.аигеиз, Р.аеги^пова, В.эиЫШя, С.аШюаш, В.&а^Нз и В.итПэггшБ. Минимальные ингибирующие концентрации комплексных соединений для исследованных тест-микроорганизмов достоверно ниже ( в 2-10 раз ) по сранению с лигандом и механическими смесями метронидазола с сульфатами меди и никеля. Синтезированные соединешш обладают также выраженной антитрихомонад-ной активностью.

4. Определена острая токсичность комплексных соединений Си-МИ и НьМИ. Установлены ЛД50 при внутрижелудочном введении мышам и крысам: комплекс Си-МИ - 443,0 ± 39,9; комплекс №-МИ - 536,0 ± 47,6. При внутри-желудочном введении крысам ЛД50 составляет ( мг/кг): комплекс Си-МЫ - 1855,0 ± 74,9; комплекс №МЫ - 2125,0 ± 96,8. Согласно классификации ВОЗ синтезированные соединения относятся к классу малотоксичных веществ.

5. Сравнение эффективности действия в ряду координационных соединение цинка, кобальта (II) / полученных в нашей лаборатории ранее /, меди (II) и никеля (II) / синтезированных нами / с 1-(Р-оксиэтил)-2-метил-5-нитроими-дазолом, свидетельствует, что их антимикробная активность и токсичность связана как с природой центрального атома, так и со строением комплекса. Анализируемые соединения характеризуются высокой степенью избирательности по отношению к виду микроорганизма.

6. Разработаны микроэмульсионные трансдермальные кремы для лечебно-профилактических целей, содержащие комплексные соединения гп-МЫ и

Cu-MN и обладающие антимикробной и иммуномодулирующей активностью. Для стандартизации и контроля качества продукции разработаны методики количественного определения комплексных соединений в кремах методами экстракционной фотометрии и рентгено-флюоресцентного анализа.

7. На модели полнослойной кожной раны установлено усиление процессов регенерации при использовании гидрофильных мазей на основе ПЭО, содержащих комплексные соединения Cu-MN и Zn-MN.

8. Методом АЭС-ИСП установлено, что применение комплексного соединения Cu-MN вызывает значительно меньшее, по сравнению с метронидазо-лом изменение уровня 5 металлов: меди, железа, цинка, никеля, марганца в крови экспериментальных животных и к 5 суткам эксперимента наблюдается отчетливая тенденция к нормализации содержания микроэлементов. Метронидазол вызывает большее нарушение баланса микроэлементов, что, по-видимому, связано с его способностью вступать в реакции комплексо-образования in vivo.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Лекарственные средства и эндоэкология организма / с соавт. // Тезисы докладов УП Международного Соловецкого форума "Экология человека: будущее культуры и науки Севера" - Архангельск, 1995, с.183.

2. Метронидазол и вторичные микроэлементозы / с соавт. // Тез.докладов Российской национ.конф. "Формирование приоритетов лекарственной политики" - Москва, 1995, сЛ 15.

3. Вторичные микроэлементозы и их коррекция / с соавт. // Там же, с. 116.

4. Сохранение баланса микроэлементов при использовании лекарственных средств - критерий адаптивного резерва органов и тканей / с соавт. // Материалы П Международн. симпозиума по проблемам саногенного и

патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма, Бишкек, 1995, с.38.

5. N-гликозилирование и комплексообразование с микроэлементами как способы получения препаратов направленного действия и сохранения эндоэкологии организма / с соавт.// Тезисы III Конгресса "Человек и лекарство", Москва, 1996, с.25.

6. Влияние комплекса цинка с метронидазолом на репаративную регенерацию кожи / с соавт. // Морфология, 1996, № 2, с.32.

7. Биокомплексы микроэлементов как новая генерация лекарственных средств / с соавт. // Тезисы докладов Всеросс. научн.конференции "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств", С-Пб, 1996, с.49

8. Изменение реактивности клеток и тканей под влиянием биокомплексов Zn и Си в очаге репаративной регенерации кожи / с соавт. // Тезисы докладов ГУ Российск.национ.Конгресса "Человек и лекарство", Москва, 1997, с.264.

9. Коррекция металло-лигандного гомеостаза - основа эффективности новых биокоординационных соединений эссенциальных микроэлементов / с соавт. // Там же

10.Положительное решение ВНИИГПЭ по авторской заявке "Комплексы меди (И) и никеля (II) с 1-(Р-оксиэтил)-2-мет1ш-5-шггроимидазолом" № 97102649.