Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармацевтический анализ лекарственных средств группы фторхинолонов с использованием метода ВЭЖХ

Автореферат отсутствует в библиотеке
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертация отсутствует в библиотеке
ДИССЕРТАЦИЯ
Сюбаева, Светлана Евгеньевна Москва 2005 г.
Ученая степень
кандидат фармацевтических наук
ВАК РФ
15.00.02
 
 

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Фармацевтический анализ лекарственных средств группы фторхинолонов с использованием метода ВЭЖХ

На правах рукописи

СЮБАЕВА СВЕТЛАНА ЕВГЕНЬЕВНА

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ГРУППЫ ФТОРХИНОЛОНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ВЭЖХ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Кандидат фармацевтических наук Дорофеев Владимир Львович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор фармацевтических наук, доцент

Белобородов Владимир Леонидович

Доктор фармацевтических наук

Дегтерев Евгений Викторович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт государственного контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» МЗ и СР РФ

диссертационного совета Д.208.040.09 при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (119019, Москва, Никитский бульвар, д. 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.208.040.09,

доктор фармацевтических наук Садчикова Наталья Петровна

Защита состоится «_»

2005 г. в 14 часов на заседании

cd. scsöjs^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на значительные успехи в области микробиологии и создания противомикробных лекарственных средств, проблема инфекционных заболеваний до настоящего времени не потеряла свою актуальность. Фторхинолоны являются высокоактивными противомикробными соединениями, применяемыми при тяжелых формах инфекций разнообразной этиологии и локализации. Эти лекарственные средства характеризуются чрезвычайно высокой эффективностью и ультрашироким спектром активности.

Данные лекарственные средства вошли в медицинскую практику в середине 70-х годов XX столетия (флумехин), и к настоящему времени накоплен обширный материал, касающийся фармакологических свойств и клинического применения фторхинолонов [Падейская E.H., Яковлев В.П., 1998].

В современном фармакопейном анализе метод ВЭЖХ находит широкое применение для установления подлинности, анализа чистоты и количественного определения лекарственных средств. Используется данный метод и при анализе субстанций и лекарственных препаратов фторхинолонов [Европейская фармакопея 2005 г., Фармакопея США 27 изд.]. Но, во-первых, не все фторхинолоны описаны в отечественной и зарубежных фармакопеях. Во-вторых, в анализе фармакопейных фторхинолонов применяются неунифицированные методики пробоподго-товки и условия хроматографирования и используются различные критерии пригодности хроматографической системы. Поэтому актуальной является проблема разработки унифицированной методики контроля качества лекарственных средств группы фторхинолонов методом ВЭЖХ.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка унифицированной методики анализа лекарственных средств группы фторхинолонов с использованием метода ВЭЖХ.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработка методики пробоподготовки субстанций и лекарственных препаратов фторхинолонов;

- разработка хроматографических условий, оптимальных для установления подлинности, анализа чистоты и количественного определения фторхинолонов;

- подбор и оценка параметров пригодности хроматографической системы;

рос. национальная ! •; ГКА

200t, PK_

- оценка возможности использования разработанной методики для анализа

чистоты фторхинолонов;

- разработка методики количественного определения фторхинолонов методом ВЭЖХ.

Научная новизна. В результате систематического исследования получены данные о влиянии состава компонентов хроматографической системы на закономерности удерживания и селективность разделения фторхинолонов в обращено-фазовой ВЭЖХ.

На основании данных о растворимости изучаемых лекарственных средств, их кислотно-основных свойствах и хроматографическом поведении обоснован выбор растворителя для экстракции (пробоподготовки) фторхинолонов из лекарственных препаратов.

Впервые разработана унифицированная методика установления подлинности и количественного определения фторхинолонов методом ВЭЖХ. Изучена возможность использования данной методики для анализа чистоты фторхинолонов.

Практическая значимость работы. Разработана методика пробоподготовки субстанций и лекарственных препаратов фторхинолонов для анализа методом обращено-фазовой ВЭЖХ.

Впервые разработана унифицированная (для изученного ряда веществ) методика установления подлинности и количественного определения фторхинолонов методом обращено-фазовой ВЭЖХ.

Показана возможность использования разработанной хроматографической методики для анализа чистоты фторхинолонов.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003 г.), на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004 г.) и на Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России 2004» (Москва, 2004 г.). Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 17 ноября 2004 г.).

Публикация результатов исследования. По результатам проведенных исследований опубликовано 5 печатных работ.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фарма-

цевтической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М.Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01.200.110545).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты исследований по разработке методики пробоподготовки субстанций и лекарственных препаратов фторхинолонов для анализа методом ВЭЖХ.

2. Результаты исследований влияния состава подвижной фазы (содержание органического модификатора, буферного раствора, его значения рН и содержание) на хроматографические характеристики фторхинолонов.

3. Унифицированная методика установления подлинности фторхинолонов методом обращено-фазовой ВЭЖХ.

4. Результаты изучения возможности использования разработанной методики для анализа чистоты фторхинолонов.

5. Результаты исследований по разработке унифицированной методики количественного определения фторхинолонов методом ВЭЖХ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы из 107 названий (76 из которых зарубежные). Работа иллюстрирована 22 таблицами и 31 рисунками.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В литературном обзоре приведены данные по фармакологической активности фторхинолонов, рассмотрены их строение и физико-химические свойства, проанализированы фармакопейные требования к качеству субстанций и препаратов фторхинолонов, освещены их фармакопейные и нефармакопейные методы анализа.

Экспериментальная часть посвящена оценке растворимости фторхинолонов, разработке методики пробоподготовки для анализа фторхинолонов методом ВЭЖХ, изучению возможности использования разработанных условий хромато-графирования для анализа чистоты фторхинолонов, разработке методики количественного определения фторхинолонов методом ВЭЖХ.

Выводы завершают диссертационную работу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объекты исследования.

Объектами исследования являлись стандартные образцы, субстанции и препараты фторхинолонов (табл. 1).

Таблица 1. Структурные и молекулярные формулы фторхинолонов, химические

названия, относительные молекулярные массы.

мнн Структурная формула Химическое название, примечание

Норфлоксацин Norfloxacin нО " рХ^соон О 4-Оксо-7-{1 -липеразинил)-6-фтор-1 -этил-1,4-дигидрохи но лин-3-карбо новая кислота, С1вН18РЫзОз, М.м 319,33 Фарм. субстанции: норфлоксацин

Пефлоксацин Pefloxacin гсн3 Р^Ч^соон О 7-(4-Метил-1-пиперазинил)-4-0ксо-6-фтор-1-этил-1,4-дигидрохинолин-З-карбоновая кислота, C17H20FN3O3, М.м. 333,36 Фарм субстанции, лефлоксацина ме-тансульфоната (мезилата) дигидрат, c17hz„fn3o3, ch3so3h. 2Н20, М.м. 465,50

Офлоксацин Ofloxacin О З-Метил-10-(4-метил-1 -пиперазинил)-7-оксо-9-фтор-2,3-дигидро-7Н-пиридо[1,2,3-cfe]-1,4-бензоксазин-6-карбоновая кислота, CieH2oFN304, М.м. 361,37 Фарм. субстанции, офлоксацин

Ципрофлоксацин Ciprofloxacin нО ^ pXXjjXcooH о 4-Оксо-7-(1-липеразинил)-6-фтор-1-циклолропил-1,4-дигидрохинолин-З-карбоновая кислота, c^hiefnsoa, М.м. 331,34 Фарм. субстанции: ципрофлоксацин; цилрофлоксацина гидрохлорида моногидрат, c17h1efn3o3.HCI.H2O, М.м. 385,82 (М.м. для Ci7HieFN303.HCI - 367,80)

Ломефлоксацин Lomefloxacin чп 1 г"снз Нз ХХ1 О 6,8-Дифтор-7-(3-метил-1-пиперазинил)-4-оксо-1-этил-1,4-дигидрохинолин-З-карбоновая кислота, Ci7H,bF2N303, М.м. 351,35 Фарм субстанции: ломефлоксацина гидрохлорид, Ci7HieF2N303. HCl, М.м. 387,81

Условия эксперимента.

Исследование проводили в обращено-фазовом варианте ВЭЖХ. В работе использовали градиентный ВЭЖХ хроматограф BISCHOFF (Швейцария), колонку PRONTOSIL AQ-120 (250 мм х 4 мм, С18, 5 мкм), предколонку PRONTOSIL AQ-120 (14 мм х 4 мм, С18, 5 мкм). Условия хроматографирования: температура колонки 40°С (термостат VARIOTHERM), скорость потока 1 мл/мин, объем пробы 20 мкл (инжектор Rheodyne). Условия детектирования: диодно-матричный детектор DAD 3L при длинах волн: норфлоксацин, пефлоксацин, ци-профлоксацин X = 277 нм, ломефлоксацин X = 288 нм, офлоксацин X = 294 нм.

Управление прибором и расчет хроматографических параметров осуществляли с использованием программы «Мультихром» (версия 2,1 для Windows®, Ampersand Ltd.).

Разработка методики пробоподготовки.

Выбор растворителей для приготовления испытуемых растворов был основан на данных о растворимости изучаемых лекарственных веществ и на их кислотно-основных свойствах. Основания фторхинолонов растворимы в 95 % этан-ле, однако использование данного экстрагента приводит к снижению эффективности, раздвоению пиков и ухудшению симметрии (рис. 1).

1 1 1 1 1 1 > 1 1 1 1 1 I 1

I 1 1 1

»— - 1 1 — Д--i--- 1 1 1 1 < 1 yf s г

1 1 1 I ч: : , г м

278 jim -1--Н-1 Ь— 1 -1 -1-1-1 — — —t-

01 23456789 10 11 12 мин

Рис. 1. Хроматограмма спиртового экстракта из таблеток «Нолицин» в подвижной фазе ацетонитрил: раствор Н3Р04 (15:85).

При значениях рН около изоэлектрической точки данных соединений (рН от 7,0 до 8,0) растворимость оснований фторхинолонов в воде минимальна (прак-

тически нерастворимы). При значениях рН менее 5,0 и более 10,0 растворимость данных соединений за счет ионизации алифатического атома азота или карбоксильной группы, соответственно, резко увеличивается. Поскольку при анализе методом ВЭЖХ на обращенной фазе необходимо исключить использование сильнощелочных растворов, нами была выбрана экстракция фторхинолонов из таблеток с использованием экстрагента с кислым значением рН.

При анализе методом ВЭЖХ в разработанных хроматографических условиях оптимальным является использование единого растворителя - 0,01 М раствора кислоты хлористоводородной, который имеет значение рН, близкое к таковому у водного компонента подвижной фазы (ПФ), что не приводит к искажению хроматографических пиков.

Требования к пригодности хроматографической системы. В табл. 2 представлены требования к параметрам пригодности хроматографической системы, принятые в данной работе.

Таблица 2. Требования к параметрам пригодности хроматографической системы,

принятые в данной работе.

Параметр Базовое требование Более строгие требования

Эффективность колонки (N) по пику анализируемого соединения Не менее 1500 - 2000 т.т. Не менее 4000 т.т

Фактор симметрии пика (As) анализируемого соединения От 0,8 до 2,0 От 0,8 до 1,5*

Относительное стандартное отклонение (RSD) площади пика анализируемого соединения при 5 повторных введениях Не более 2,0 % " Не более 1,5 %

Разрешение (R) между пиками основного вещества и примеси Не менее 1,5 Не менее 2,0

Отношение сигнал/шум (S/N) как предел детектирования Не менее 3 * Не менее 3

Отношение сигнал/шум (S/N) как предел количественного определения Не менее 10 * Не менее 30 для примесей. Не менее 1000 при количественном определении.

* Общее требование ЕР

** Общее требование ивР

При этом опирались на базовые требования, ряд из которых регламентируется зарубежными фармакопеями, но для повышения точности и воспроизводимости анализа стремились к достижению более строгих требований.

Разработка состава подвижной фазы.

В выбранном обращено-фазовом варианте ВЭЖХ в качестве органического компонента использовали ацетонитрил, который имеет ряд преимуществ: более высокая температура кипения (при 40 °С меньше вероятность парообразования), меньше вязкость (соответственно ниже рабочее давление и часто выше эффективность колонки). Таким образом, в данной работе варьировали природу, количество и значение рН водного компонента. Его выбор был основан, в первую очередь, на кислотно-основных свойствах фторхинолонов. Было исследовано влияние ПФ различного состава на хроматографические характеристики исследуемых соединений. При этом соотношение ацетонитрила и водного компонента (с заданным значением рН) в наиболее приемлемых для анализа фторхинолонов элюентах составляло обычно от 25:75 до 10:90, соответственно, что говорит о высокой хрома-тографической подвижности данных соединений на обращенной фазе. Это связано с относительно высокой полярностью молекул фторхинолонов, наличием заряженных функциональных групп и, соответственно, их слабым удерживанием на неполярной неподвижной фазе.

Поскольку фторхинолоны являются амфолитами, для получения оптимальных параметров удерживания необходимо создание такого значения рН ПФ, при котором молекулы данных веществ будут находиться преимущественно в одной ионной форме, чтобы предотвратить размывание хроматографической зоны. Так как использование ПФ со значением рН более 8,0 на стандартной колонке с привитой фазой исключено, то необходимо применять ПФ с кислыми значениями рН.

Таблица 3. Параметры пиков фторхинолонов (5 мкг/мл в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной) в подвижной фазе ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 4,4 (20:80).

Лекарственное вещество Время удерживания (и), мин Эффективность (»0 Фактор симметрии (А3)

Норфлоксацин 5,2 7000 1,49

Пефлоксацина мезилат 6,6 7700 1,49

Ципрофлоксацина гидрохлорид 5,8 7300 1,41

Ломефлоксацина гидрохлорид 6,8 8500 1,39

В табл. 3 представлены параметры пиков, полученные при использовании ПФ ацетонитрил : фосфатный буферный раствор (рН 4,4). Эти значения были получены при концентрации испытуемого раствора 5 мкг/мл. Известно, что при увеличении концентрации эффективность хроматографической колонки обычно падает и симметрия пиков ухудшается. Достигнутое в этих условиях значение эффективности хроматографической колонки (И = 7000 - 8500) является относительно высоким. Однако симметрия пиков (А, = 1,39 - 1,49) всё же невысокая.

При низких значениях рН подавляющее большинство молекул фторхиноло-нов протонируется по алифатическому атому азота, то есть находится в растворе в виде катионов. Это позволяет использовать «режим подавления ионизации» карбоксильной группы с одновременной фиксацией ионизированной формы основания.

Рис. 2. Хроматограмма раствора ципрофлоксацина гидрохлорида (20 мкг/мл, 0,01 М НС1,^ 9,59 мин) в подвижной фазе ацетонитрил : раствор Н3Р04, рН 2,5 (15:85).

Простое снижение значения рН водного компонента до 2,5 или до 2,3 с использованием кислоты ортофосфорной не улучшило симметрию пиков (табл. 4, рис. 2), хотя относительно высокие значения эффективности сохранились. Соотношение ацетонитрил : водный раствор кислоты ортофосфорной составляло при этом 15:85.

Таблица 4. Хроматографические характеристики фторхинолонов при использовании ПФ на основе водного раствора кислоты ортофосфорной и фосфатного буферного раствора с низкими значениями рН (Ы - эффективность, А3 - фактор симметрии).

Лекарственное вещество Концентрация раствора, мкг/мл Модификация подвижной фазы

н3ро4 рН 2,5 Н,Р04 рН 2,3 Фосфатный буферный раствор рН 2,5

аз N аз N А» N

Норфлоксацин 5 1,60 11800 1.57 12800 - -

20 1,81 8300 - - 1,54 7300

50 - - 2,38 5800 - -

100 - - - - 2,28 5600

Пефлоксацин 5 1,65 10300 - - - -

20 1,80 8800 - - 1,70 7600

50 - - 2,51 7100 - -

100 - - - - 2,07 6300

Ципрофлоксацин 5 1,58 11500 - - - -

20 1,98 10400 - - 1,49 9100

50 - - 2,59 6300 - -

100 - - - - 2,02 5700

Офлоксацин 5 1,46 8200 - - - -

20 2,35 7600 - - 1,57 8700

50 - - «раздвоение» - -

100 - - - - 2,23 6000

Ломефлоксацин 5 1,52 12400 1,28 12600 - -

20 1,59 9700 - - 1,40 5100

50 - - 1.90 8600 - -

100 - - - - 2,21 5700

Как видно из табл. 4, наблюдается характерная зависимость: при увеличении концентрации испытуемого раствора эффективность снижается, и симметрия пиков ухудшается.

Для уменьшения размывания хроматографической зоны, была использована ПФ, содержащая в качестве водного компонента фосфатный буферный раствор со значением рН 2,5 (15:85). Очевидно, что фосфатный буферный раствор улучшает форму пиков анализируемых соединений (рис. 3, табл. 4).

Тем не менее, значения фактора симметрии для большинства концентраций в условиях данной ПФ являются неприемлемыми. Таким образом, простое использование режима подавления ионизации карбоксильной группы не позволяет достичь высокой симметрии пиков фторхинолонов.

Рис. 3. Хроматограмма раствора ципрофлоксацина гидрохлорида (20 мкг/мл, 0,01 М НС1, 9,97 мин) в подвижной фазе ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 2,5 (15:85).

Зарубежные фармакопеи в ряде случаев для улучшения хроматографиче-ских характеристик фторхинолонов используют введение в состав ПФ ион-парных реагентов. В данной работе было решено сравнить ПФ, содержащую три-этиламин (ТЭА) с ПФ, в состав которой в различных концентрациях входит ион тетрабутиламмония (ТБА) и подобрать оптимальную концентрацию динамического модификатора.

Механизм действия ион-парных реагентов до сих пор однозначно не установлен. Обычно ТБА, заряженный положительно, используется как ион-парный реагент при анализе отрицательно заряженных соединений. Тогда образование ионной пары наиболее полно происходит в слабо-щелочной среде при значениях рН около 7,4. Для фторхинолонов это соответствует или находится близко к изо-электрической точке. Следовательно, несмотря на образование ионной пары за счет карбоксильной группы, будет отсутствовать фиксация ионизированной или неионизированной формы основания. Поэтому ТБА был добавлен в фосфатный буферный раствор со значением рН 2,5. При этих условиях ионная пара с положительно заряженным сорбатом (молекула фторхинолона) не образуется. Но ТБА, вероятно, связывается неполярной частью молекулы с октадецильными радика-

лами неподвижной фазы, за счет чего последняя приобретает положительный заряд, обращенный в сторону ПФ. Аналогично ведет себя и ТЭА.

Ввиду отталкивания одноименных зарядов при таком модифицировании время удерживания положительно заряженного сорбата уменьшается, И это особенно характерно для ПФ с ТБА. Поэтому для сохранения приемлемого времени удерживания при использовании ТБА была уменьшена элюирующая сила ПФ за счет снижения содержания в её составе ацетонитрила до 10 %.

При использовании высоких концентраций ТБА - 5 ммоль/л и более - происходит интенсивное пенообразование. Поэтому была поставлена задача достижения оптимальных хроматографических характеристик при использовании минимальных концентраций ТБА: 1 и 3 ммоль/л.

На рис. 4-6 представлены хроматограммы растворов ципрофлоксацина гидрохлорида в концентрациях 20 мкг/мл при использовании трех ПФ:

- ацетонитрил : 0,025 М раствор Н3Р04 + ТЭА до рН 3,0 (15:85);

- ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 1 ммоль/л (10:90);

- ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 3 ммоль/л (10:90).

Рис. 4. Хроматограмма раствора ципрофлоксацина гидрохлорида (20 мкг/мл, 0,01 М НС1, (я= 7,03 мин) в подвижной фазе ацетонитрил : 0,025 М раствор Н3Р04 + ТЭА до рН 3,0 (15:85).

Рис. 5. Хроматограмма раствора ципрофлоксацина гидрохлорида (20 мкг/мл, 0,01 М НС1, 7,47 мин) в подвижной фазе ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 1 ммоль/л (10:90).

Рис. 6. Хроматограмма раствора ципрофлоксацина гидрохлорида (20 мкг/мл, 0,01 М НС1, 1а= 5,76 мин) в подвижной фазе ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 3 ммоль/л (10:90).

В табл. 5 представлены значения эффективности и фактора симметрии, полученные для ПФ с ион-парными реагентами.

Данные в табл. 5 являются средними значениями, рассчитанными для нескольких последовательных введений одного и того же испытуемого раствора. Из

представленных данных видно, что использование ТЭА и ТБА значительно улучшает симметрию пиков фторхинолонов.

Таблица 5. Хроматографические характеристики фторхинолонов в ПФ с различными динамическими модификаторами

(Ы - эффективность, А3 - фактор симметрии, ^ - время удерживания).

Лекарственное вещество Концентрация раствора, мкг/мл Модификация подвижной 4 >азы

ТЭА pH 3,0 ТБА 1 ммоль/л pH 2,5 ТБА 3 ммоль/л pH 2,5

A« N «R А» N А» N

Норфлоксацин 20 1,20 3900 7,3 1.23 6600 1,29 5300

100 1.15 4700 6,6 1,19 3700 1.24 5300

Пефлоксацина мезилат 20 1,06 4200 7,0 1,27 6800 1,23 5300

100 1,30 4000 7,2 1,08 5400 1,36 5500

Ципрофлоксацина гидрохлорид 20 1,17 4700 7,8 1,03 6000 1,32 4800

100 1,29 5900 7,4 1,06 6000 1.27 4200

Офлоксацин 20 1.19 4300 6.1 1,00 5100 1,30 8000

100 1,23 6100 6,3 1,05 4500 1,41 7600

Ломефлоксацина гидрохлорид 20 1,16 4600 7,8 1,05 7100 1,05 7400

100 1,11 4600 7,9 1,29 7500 1,01 4500

Можно сказать, что ПФ с ТЭА уже приемлема для анализа фторхинолонов методом ВЭЖХ, поскольку значения эффективности колонки составили не менее 3900 т.т., а фактора симметрии при использовании данной ПФ находится в диапазоне от 1,0 до 1,3. Но следует отметить, что при изученных соотношениях растворителей шум базовой линии при использовании ТЭА по сравнению с такими же количествами ТБА, значительно выше. Отношение S/N для колебаний базовой линии в ПФ с ТЭА составило от 7 до 40, для ПФ с ТБА - от 5 до 20. Это значит, что точность и воспроизводимость количественного определения при использовании ПФ с ТЭА будет ниже, чем для ПФ с ТБА.

При использовании ПФ с ТБА в концентрации 1 ммоль/л симметрия пиков либо немного улучшается, например, для ципрофлоксацина (табл. 5) либо находится примерно на том же уровне, что и при использовании ТЭА. Растет при использовании ТБА и эффективность.

Таким образом, при анализе фторхинолонов методом ВЭЖХ более предпочтительной является ПФ с ТБА. Сравнение данных для ПФ с ТБА с концентрациями 1 и 3 ммоль/л позволяет сделать следующие выводы. Использование ТБА в концентрации 3 ммоль/л не приводит к значительному повышению эффективности и симметрии пиков по сравнению с концентрацией 1 ммоль/л. Более того, для

ряда фторхинолонов данные параметры даже ухудшаются. Также при концентрации ТБА 3 ммоль/л значительно уменьшается время удерживания. Это немного затрудняет управление подвижностью анализируемых соединений, так как изменение концентрации ацетонитрила даже на 1% приводит к изменению времени удерживания фторхинолонов на несколько минут.

Анализ чистоты фторхинолонов с использованием метода ВЭЖХ.

Разработанные методики ВЭЖХ были испытаны применительно к анализу чистоты фторхинолонов с использованием модельных смесей. При этом использовали ПФ, содержащую фосфатный буферный раствор со значением рН 2,5 без динамических модификаторов, и ПФ с ТБА (1 и 3 ммоль/л). Как уже указывалось выше, использование ПФ с ТЭА приводит к появлению выраженного шума (периодических колебаний) базовой линии при выбранных в данной работе соотношениях растворителей. Поэтому ПФ с ТЭА не использовалась для разделения примесей.

Были выбраны две пары соединений: пефлоксацин и норфлоксацин; ци-профлоксацин и этилендиаминовый аналог. Данные вещества имеют близкую структуру внутри каждой пары. Пефлоксацин отличается от норфлоксацина (примесь А в пефлоксацине по Европейской фармакопее) только присутствием метальной группы в 4 положении пиперазинильного радикала. Аналогично сходные структуры имеют и ципрофлоксацин и его этилендиаминовый аналог (примесь С в ципрофлоксацине по Европейской фармакопее) (рис. 7). В связи с этим разделение данных пар веществ методом ВЭЖХ позволяет найти подход к разработке методики анализа чистоты фторхинолонов.

Рис. 7. Примесь С. Этилендиаминовый аналог.

Известно, что на хроматографическое разрешение веществ оказывают влияние эффективность (Л*), селективность (а) и коэффициент емкости (ку.

Как следует из представленного уравнения, увеличение этих параметров приводит к увеличению разрешения. Из полученных для различных ПФ результатов (табл. 6) видно, что наилучшее разделение пиков пефлоксацина и норфлокса-цина наблюдается в ПФ, содержащей ТБА в концентрации 1 ммоль/л. Введение в состав ПФ ион-парного реагента увеличивает эффективность колонки, а снижение концентрации ацетонитрила увеличивает коэффициент емкости, что проявляется в улучшении разрешения (Я = 2,7). Соответствующая хроматограмма представлена на рис. 8.

Таблица 6. Разделение смеси с содержанием норфлоксацина (нор) 0,5 % от пефлоксацина мезилата (пеф) (Ы - эффективность, Ах - фактор симметрии, а - селективность, к' - коэффициент емкости, Я - коэффициент

разделения).

Подвижная фаза Я а N А8 к'

нор пеф нор пеф нор пеф

Ацетонитрил: фосфатный буферный раствор, рН 2,5 (15:85) 0,96 1,10 6900 2900 0,87 1,72 1,43 1,58

Ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 1 ммоль/л (10:90) 1,02 1,09 9500 4800 0,98 2,48 1.21 1,33

Ацетонитрил: фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 3 ммоль/л (10:90) 1,19 1,14 4300 8600 0,84 1,67 0,78 0,88

Ацетонитрил: фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 1 ммоль/л (7:93) 2,74 1,11 14400 21500 1,30 2,22 3,40 3,77

Ацетонитрил: фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 3 ммоль/л (7:93) 1,75 1,09 14100 9200 0,93 2,17 2,59 2,83

0Л15-0.010-0Л05-0Л00--0Л05-

0 1 Z 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 мин

Рис. 8. Хроматограмма раствора, содержащего норфлоксацин 1,5 мкг/мл (tR= 12,35 мин) и пефлоксацина мезилат 300 мкг/мл, в подвижной фазе ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 1 ммоль/л (7:93).

Из данных, представленных в табл. 6, следует, что содержание ацетонитри-ла в ПФ при разделении норфлоксацина и пефлоксацина должно быть около 7 %, но вследствие высокой подвижности фторхинолонов в выбранных условиях концентрация органического компонента может быть уменьшена на несколько процентов при проведении каждого конкретного анализа.

Для норфлоксацина и пефлоксацина наиболее приемлемые хроматографи-ческие результаты получаются при модификации подвижной фазы ТБА (1 ммоль/л). При разработке конкретной методики анализа чистоты для устранения искажения пиков фторхинолонов может потребоваться введение ТБА в концентрации 3 ммоль/л.

Разработанная методика была испытана применительно к анализу чистоты таблеток «Абактал» (пефлоксацина мезилат). На рис. 9 представлена соответствующая хроматограмма. Пик с временем удерживания 14,75 мин соответствует норфлоксацину, что определяли по относительному времени удерживания. Содержание примеси норфлоксацина - 0,04 %. На хроматограмме определялись также две неидентифицируемые примеси с временами удерживания 9,55 мин и

15,40 мин. Содержание неидентифицируемых примесей 0,06 % и 0,12 % соответственно, суммарное содержание всех примесей 0,22 %.

Рис. 9. Хроматограмма раствора таблеток «Абактал», содержащего пефлоксацина мезилат 500 мкг/мл, в подвижной фазе ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 1 ммоль/л (8:92).

Рис. 10. Хроматограмма раствора, содержащего ципрофлоксацин (20 мкг/мл, ^ = 5,49 мин) и его этилендиаминовый аналог (20 мкг/мл, = 3,99 мин), в подвижной фазе ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 3 ммоль/л (10:90).

Аналогичную серию экспериментов провели для ципрофлоксацина и его этилендиаминового аналога.

На рис. 10 представлена хроматограмма модельного раствора этой пары соединений в ПФ, модифицированной ТБА (3 ммоль/л). Разрешение составило 7,7. В этом случае увеличение коэффициента емкости для улучшения разделения не требовалось.

В случае хроматографирования раствора таблеток «Сифлокс» (ципрофлоксацина гидрохлорид) (рис. 11) пик с временем удерживания 11,37 мин соответствует этилендиаминовому аналогу ципрофлоксацина, что определяли по относительному времени удерживания. Содержание данной примеси составило 0,07 %. На хроматограмме определяются также четыре неидентифицируемые примеси с временами удерживания 7,49 мин; 13,48 мин, 14,0 мин и 15,97 мин. Содержание неидентифицируемых примесей 0,05 %, 0,07 %, 0,13 % и 0,25 % соответственно, суммарное содержание всех примесей 0,57 %.

0Л25-0.0200.0150.0100.0050.000-0.0050 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 мин

Рис. 11. Хроматограмма раствора таблеток «Сифлокс», содержащего ципрофлок-сацин 500 мкг/мл, в подвижной фазе ацетонитрил : фосфатный буферный раствор, рН 2,5 + ТБА 1 ммоль/л (8:92).

Таким образом, представленная методика и соответствующий подход к разделению родственных веществ могут рассматриваться как базовые при разработке конкретных условий анализа чистоты фторхинолонов.

Количественное определение фторхинолонов с использованием метода ВЭЖХ.

При разработке методики количественного определения фторхинолонов методом ВЭЖХ выбрали две группы препаратов в форме таблеток: содержащие действующее вещество в виде соли («Ципробай», ципрофлоксацина гидрохлорид) и содержащие фгорхинолон в виде непротонированного соединения («Таривид», офлокса-цин) и использовали разработанные и описанные выше хроматографические системы с ПФ: ацетонитрил: фосфатный буферный раствор, pH 2,5 + ТБА 1 ммоль/л (10:90).

В процессе исследования были проанализированы соответствующие хрома-тограммы и рассчитаны параметры пригодности хроматографической системы, представленные в табл. 7.

Из табл. 7 видно, что рассчитанные параметры соответствуют более строгим требованиям, указанным в табл. 2.

Таблица 7. Параметры пригодности хроматографической системы при 5 последовательных введениях стандартных растворов в концентрации 50 мкг/мл (S/N - отношение сигнал/шум, RSD% - относительное стандартное отклонение площади пика анализируемого соединения при 5 повторных введениях, As - фактор симметрии, N - эффективность).

Лекарственное вещество S/N RSDV. As N

Ципрофлоксацина гидрохлорид 1800 1,27 1,26 6000

Офлоксацин 2700 1,36 1,43 9000

В табл. 8 представлены результаты изучения зависимости площади пика определяемого соединения от концентрации его стандартного раствора.

Таблица. 8. Результаты изучения зависимости площади пика анализируемого соединения от концентрации стандартного раствора (проверка линейности) (8 - площадь пика, АУхсек, С - концентрация, мкг/мл).

Лекарственное вещество Диапазон концентраций Уравнение R

Ципрофлоксацина гидрохлорид 5,0 - 250 мкг/мл S = 0,09879хС + 0,02427 0,9998

Офлоксацин 5,0 - 250 мкг/мл S = 0,07502хС + 0,03296 0,9999

Как видно из представленных данных, линейная зависимость (Я > 0,9998) наблюдается во всем изученном диапазоне концентраций: от 5 до 250 мкг/мл.

Результаты метрологической оценки разработанных методик количественного определения препаратов ципрофлоксацина гидрохлорида и офлоксацина представлены в табл. 9.

Таблица 9. Метрологическая оценка методик количественного определения фтор-хинолонов в таблетках с использованием ВЭЖХ.

Препарат Г X ном, мг Хер, мг в а% ДХ £%

Ципробай 4 500,0 496,9 67,32 8,205 3,669 95 2,78 10,2 2,06

Таривид 4 200,0 197,6 3,193 1,787 0,7991 95 2,78 2,3 1,17

На рис. 9 представлены соответствующие графики для анализируемых соединений.

Как видно из представленных рисунка 12 и табл. 9, линейная зависимость наблюдается во всем изученном диапазоне концентраций препаратов: от 5 до 250 мкг/мл для ципрофлоксацина и офлоксацина.

>0 1« 29

Рис. 12. График зависимости площади пика ципрофлоксацина гидрохлорида и офлоксацина от концентрации раствора (проверка линейности).

Относительная погрешность определения ципрофлоксацина составила 2,06 %, офлоксацина - 1,17 %. Полученные средние значения близки к номинальным. Поскольку в общем случае ГФ XI при дозировке таблеток от 0,1 г и более дает допуск на отклонение в содержании действующего вещества ± 5 %, разработанные методики пригодны для анализа таблеток, содержащих указанные дейст-

вующие вещества, по разделу нормативной документации «количественное определение».

Можно предположить, что рассмотренная методика пригодна для определения и других фторхинолонов в лекарственной форме «таблетки».

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что использование 0,01 М кислоты хлористоводородной для растворения стандартных образцов фторхинолонов, испытуемых субстанций и для извлечения фторхинолонов из таблеток является оптимальным для проведения пробоподготовки, поскольку не приводит к искажению хромато-графических пиков и способствует полному растворению действующего вещества. Использование для этой цели этанола приводит к снижению эффективности, ухудшению симметрии и искажению пиков анализируемых соединений. Показано, что при объеме пробы 20 мкл оптимальная концентрация испытуемого раствора составляет при установлении подлинности и количественном определении фторхинолонов 50 мкг/мл, а при анализе чистоты - 500 мкг/мл.

2. Установлено, что в условиях обращено-фазовой ВЭЖХ оптимальные значения параметров хроматографических пиков фторхинолонов (ципрофлокса-цин, офлоксацин, норфлоксацин, пефлоксацин и ломефлоксацин) наблюдаются в ПФ, содержащей в качестве водного компонента фосфатный буферный раствор со значением рН 2,5 с добавлением ТБА в концентрации 1 ммоль/л. Оптимальное соотношение ацетонитрил - водный компонент составляет около 10:90.

3. В разработанных хроматографических условиях эффективность колонки составила 3500 - 7500 теоретических тарелок, фактор симметрии от 1,0 до 1,3, относительное стандартное отклонение при 5 повторных введениях не более 1,5 %. Это соответствует современным фармакопейным требованиям к параметрам пригодности хроматографической системы.

4. Показано, что при разработке методик анализа фторхинолонов по разделу нормативной документации «посторонние примеси» с применением обращено-фазовой ВЭЖХ необходимо использовать в качестве базовой ПФ, содержащую фосфатный буферный раствор со значением рН 2,5 с ТБА в концентрации от 1 до 3 ммоль/л. Для улучшения разделения близких по строе-

нию примесей следует снижать концентрацию ацетонитрила в ПФ примерно до 7 %.

5. Показано, что разработанную хроматографическую методику можно использовать при анализе фторхинолонов в лекарственной форме «таблетки» по разделу нормативной документации «количественное определение». Относительная погрешность количественного определения ципрофлоксацина составила 2,06 %, офлоксацина - 1,17 %. Полученные средние значения содержания действующих веществ близки к номинальным.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Дорофеев B.JI., Арзамасцев А.П., Коновалов A.A., Сюбаева С.Е. Фармацев- ^ тический анализ лекарственных средств группы фторхинолонов с использованием метода ВЭЖХ // Человек и лекарство: Тез. докл. X Российского национального конгресса. - Москва, 2003. - С. 711.

2. Сюбаева С.Е., Дорофеев B.J1. Метод ВЭЖХ в контроле качества лекарственных средств группы фторхинолонов // Хроматография и хроматографи-ческие приборы: Тез. докл. Всероссийского симпозиума. - Москва, 2004. -С. 290.

3. Сюбаева С.Е., Дорофеев B.JI. Оценка качества лекарственных средств группы фторхинолонов

методом ВЭЖХ // Аналитика России 2004: Тез. докл. Всероссийской конференции по аналитической химии. - Москва, 2004. -С. 195.

4. Сюбаева С.Е., Дорофеев B.JI., Арзамасцев А.П. Использование метода ВЭЖХ в анализе лекарственных средств группы фторхинолонов // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация.-2004.-№2.-С. 258-263. jfi

5. Дорофеев В.Л., Сюбаева С.Е., Арзамасцев А.П. Использование метода ВЭЖХ для анализа чистоты лекарственных средств группы фторхинолонов // % Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2004. - № 2. - С. 199 - 204.

í I ! S

Заказ Л*Й 11 Отпечатано в типографии «Полиарт» Подписано и печать 18.01.2005 Объем 1,5 н.л. Формат 60x84/16. Тираж 100 Бумага офеетиая 80 г/м2

РНБ Русский фонд

2005-4 46294

• . s i

11 ФЕВ 2005

 
 

Оглавление диссертации Сюбаева, Светлана Евгеньевна :: 2005 :: Москва

 
 

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Сюбаева, Светлана Евгеньевна, автореферат

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Фармацевтический анализ лекарственных средств группы фторхинолонов с использованием метода ВЭЖХ"

 
 

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2005 года, Сюбаева, Светлана Евгеньевна