Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Биофармацевтический анализ клофелина

БАШКИРСКИМ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ... „ - л п УНИВЕРСИТЕТ

; О 'о Л

1 и

На правах рукописи

ЛИСИОНКОВА Галина Артемьевна БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛОФЕЛИНА

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Уфа - 1996

Работа выполнена в Тюменской государственной медицинской академии на кафедре технологии лекарственных форм

Научные руководители:

кандидат фармацевтических наук, доцент Б .Н. Бекетов

доктор фармацевтических наук, профессор А .И. Сичко

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Г.Ф. Лозовая доктор фармацевтических наук, профессор Н.И.Чернобровин

Ведущая организация:

Сибирский государственный медицинский университет

Защита состоится " " ес-с¿1/зм £ 1996 г. в /¿^'на

заседании диссертационного совета К 084.35.02 при Башкирском государственном медицинском университете по адресу: 450000, г. Уфа,ул.Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного медицинского университета

Автореферат разослан "¿3 " ¿рс996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Э.Г.Давлетов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема лечения гипертонической болезни является одной из важных и сложных задач практического здравоохранения [Б.И. Шулутко, Ю.Л.Перов, 1993]. В медицинской практике при различных формах гипертонической болезни и купировании гипертонических кризов широко применяются препараты клофелина.. В связи с высокой биологической активностью клофе-лина даже незначительные колебания биологической доступности могут иметь нежелательные последствия с точки зрения терапевтического эффекта и побочного действия.

Оптимальная схема лечения клофелином при использовании его пероральных лекарственных форм возможна лишь в том случае, если используемые препараты содержат близкие значения количества лекарственного средства в отдельных дозах. Кроме того, различная степень всасывания, обусловленная влиянием фармацевтических факторов, может привести к тому, что в организм больного поступает слишком большое или слишком малое количество лекарственного вещества. В этой связи, проблема качества отечественных препаратов и доведение их до уровня мировых стандартов остается актуальной. С вводом Государственной фармакопеи СССР XI издания и таких показателей качества, как "Однородность дозирования" и тест "Растворение" особую актуальность приобретает разработка этих показателей для таблетиро-ваннных лекарственных форм с содержанием действующих веществ 0,05 г и менее. Однако, в действующей нормативно-технической документации до настоящего времени отсутствуют методики оценки качества таблеток клофелина по данным показателям.

Обладая высокой биологической активностью и широтой терапевтического действия, клофелин применяется и при других заболеваниях в лекарственных формах (глазные капли), дозы лекарственного вещества в которых значительно превышают дозы перо-рального приема и могут вызвать токсический эффект. Этим обоснована высокая актуальность химико-токсикологических исследований в отношении субстанции клофелина и его лекарственных форм.

В связи с вышеизложенным, фармацевтические исследования клофелина, включающие биофармацевтическую оценку качества его препаратов, вопросы фармакокинетики и токсикокинетики являются актуальными для практического здравоохранения.

Цель работы. Целью настоящей работы является теоретическое обоснование и разработка методов анализа, отвечающих современным требованиям оценки качества лекарственных форм кло-

фелина и пригодных для биофармацевтических и химико-токсикологических исследований.

Основные задачи исследования:

1. Разработать способы обнаружения и количественного определения клофелина в лекарственных формах.

2. Разработать методику оценки однородности дозирования клофелина в таблетках.

3. Разработать методику анализа таблеток клофелина по показателю "Растворение".

4. Провести биофармацевтическую оценку качества таблети-рованных лекарственных форм клофелина отечественного производства и зарубежных аналогов (гемитон, катапресан) по показателям "Распадаемость" и "Растворение".

5. Разработать методики идентификации и определения клофелина в биологических жидкостях (кровь, моча), пригодные для биофармацевтических и химико-токсикологических исследований.

6. Предложить способы очистки и идентификации клофелина в биологических жидкостях (кровь, моча) при наличии в объектах исследования лекарственных веществ сопутствующей терапии.

Научная новизна.

1. Выбраны оптимальные условия и предложены способы идентификации клофелина в лекарственных формах и биологических жидкостях (моча, кровь).

2. Разработаны методики количественного определения клофелина на основе экстракционной фотометрии, пригодные для современной оценки качества лекарственных форм клофелина и технологического процесса производства таблеток клофелина.

3. Впервые разработаны и введены в фармацевтическую практику способы оценки качества отечественных таблеток клофелина 0,000075 и 0,00015 г по показателям "Однородность дозирования" и "Растворение".

4. Изучены и объяснены УФ-, ИК-спектры поглощения, состав, физико-химические свойства продукта реакции клофелина с бромфеноловым синим.

5. Рассчитаны кинетические константы и проведена оценка высвобождаемости клофелина из таблеток в сравнении с зарубежными аналогами (гемитон, катапресан).

6. Обоснована методика идентификации клофелина в биологических жидкостях в присутствии других лекарственных средств.

Новизна исследований защищена авторским свидетельством

СССР № 1746314 и положительным решением о выдаче патента РФ на изобретение по заявке № 93053975/25 от 02:12.93 г.

Практическая ценность работы. Разработанные методики фармацевтического и биофармацевтического анализов клофелина позволяют повысить точность оценки качества его лекарственных форм (таблетки, глазные капли и раствор для инъекций) отечественного производства.

Предложенные методики с использованием электрофореза на бумаге и хроматографии в тонком слое сорбента позволяют проводить идентификацию клофелина в биологических жидкостях в присутствии ряда других препаратов, применяемых для лечения гипертонической болезни.

Разработанные оптимальные условия кинетики растворения субстанции клофелина из таблеток позволяют проводить сравнительную оценку качества таблеток отечественного производства и его зарубежных аналогов.

Внедрение результатов работы.

1. На химико-фармацевтических заводах акционерного общества "Органика" внедрены методики количественного определения клофелина в растворе для инъекций и оценки качества таблеток клофелина по тестам "Растворение" и "Однородность дозирования ".

2. Методики количественного определения клофелина в таблетках прошли апробацию в контрольно-аналитических лабораториях производственных объединений "Фармация" гг. Кургана и Омска.

3. Способ обнаружения клофелина в биологических жидкое-^ тях апробирован и внедрен- в судебно-химическом отделении Бюро судебно-медицинской экспертизы (г. Тюмень) и научно-клиническом отделении артериальной гипертонии Тюменского НИИ клинической и профилактической кардиологии СО РАМН.

4. Подготовлены методические рекомендации "Определение однородности дозирования клофелина в таблетках", которые рекомендованы к внедрению Всероссийским учебно-научно-методическим центром по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию Министерства здравоохранения РФ (протокол

№ 1 от 03.12.92 г.) в учебный процесс фармацевтических вузов (факультетов).

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит 234/страницы машинописного текста, включает 40 таблиц, 35 рисунков и состоит из введения, б глав, выводов, списка литературы, включающего 220 источников, из которых 61 - на иностранных языках,и приложения.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них одно авторское свидетельство СССР, положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение и методические рекомендации .

Апробация работы. Основные результаты научных исследований докладывались на областной конференции "Химические проблемы отраслей народного хозяйства Тюменского региона и пути их решения" (Тюмень, 1989 г), Всесоюзной научно-практической конференции "Медицинские, социальные, экологические проблемы при добыче, транспортировке и переработке газа" (Надым, 1991 г), заслушаны на региональном совещании Всероссийского общества судебных медиков" (Тюмень, 1992 г), научно-практической конференции "Актуальные проблемы фармации", посвященной 30-летию фармацевтического факультета Тюменского медицинского института (Тюмень, 1994 г), Международном симпозиуме "Медицина и охрана здоровья" (Тюмень, 1995 г).

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Теоретическое обоснование и результаты экспериментального исследования механизма взаимодействия клофелина с бром-феноловым синим и физико-химических свойств полученного ионного ассоциата.

2. Способы выделения, идентификации и количественного определения клофелина в лекарственных формах и биологических жидкостях (моча),

3. Результаты использования разработанных методов количественного определения для биофармацевтической оценки качества лекарственных форм клофелина и обоснование возможности использования методов идентификации клофелина в биологических жидкостях для совершенствования химико-токсикологической оценки объектов судебно-химического анализа и фармакотерапии клофелином.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обнаружение и определение клофелина в субстанции и лекарственных формах

Для решения поставленной задачи нами модифицирована капельная реакция на хроматографической бумаге с реактивом Дра-гендорфа по Бергоффу-Дельвиче. Предложенная методика позволяет обнаружить исследуемое лекарственное вещество в субстанции и лекарственных формах с чувствительностью в пределах 12,5 - 25,0 нг соответственно. Предлагаемая реакция спользована для идентификации зон клофелина после проведения электрофореза (бумага марки "М", 400 В, 1 ч, электролит - буферный раствор

Бриттона-Робинсона рН 1,8 10,0) в модифицированных камерах к прибору ПВЭФ-3. В качестве внутреннего стандарта использовали кодеина фосфат и хинина гидрохлорид.

Исследования показали, что клофелин можно идентифицировать в присутствии других лекарственных веществ, назначаемых совместно с ним при лечении гипертонической болезни. Установлено, что при рН 1,8 его можно обнаружить в присутствии анапри-лина, коринфара, курантила, фентоламина, агапурина, а при рН 10 - феназепама и реланиума.

Нами предложена методика экстракционно-спектрофотомет-рического определения клофелина в субстанции и лекарственных формах. Изучены УФ-спектры поглощения лекарственного вещества в различных растворителях. Установлено, что лучшим является хлороформ, в котором наблюдается высокое значение коэффициента экстинции (£ = 6868 ± 192) и хорошая растворимость основания клофелина. В оптимальных условиях экстрагирования хлороформом рассчитаны аналитические характеристики чувствительности (Ст1п = 0,39 мкг/мл; т = 1,95 мкг) и построен калибровочный график. Растворы подчиняются основному закону светопоглоще-ния в пределах концентраций 2,0 - 40,0 мкг/мл экстрагента. На основании данных опытов установлено, что относительная погрешность анализа равна ± 1,03%.

Предлагаемый экстракционно-спектрофотометрический способ определения клофелина прост в выполнении, требует минимальных затрат лекарственного вещества, реактивов и может быть использован при анализе лекарственных форм клофелина: глазных капель, раствора для инъекций и таблеток.

Предложен экстракционно-фотоколориметрический способ анализа клофелина по реакции его с бромфеноловым синим (БФС), позволяющий количественно определять лекарственное вещество в биологических жидкостях. В качестве экстрагента взят хлороформ, имеющий низкую диэлектрическую проницаемость, малую растворимость в воде, высокую температуру кипения и большую плотность. Извлекаемый ионный ассоциат(ИА) - продукт реакции клофелина с красителем, максимально поглощает свет при

Х= 410 нм. Теоретически с помощью диаграммы зависимости массовой доли ионизируемой и молекулярной форм лекарственного вещества и красителя в процентах от рН раствора предположено, что ИА будет максимально извлекаться при рН водного слоя 2,0 --6,0. При данных значениях концентрации водородных ионов оба компонента реакции находятся в ионизированном виде. Данное предположение подтверждено практически (рН 3,1 - 3,5). Экспери-

- б -

глентально найденные коэффициент распределения (Кр =82,7), степень однократной экстракции ИА (98,8%), время экстракционного равновесия(2 мин), устойчивость хлороформного экстракта

-8

во времени (более 50 мин), константа ионизации 5,3-10 аналитические характеристики чувствительности (8 = 22306 ± 487;

Ст1п = мкг//мл' т = 3,0 мкг) свидетельствуют о перспективности бромфенолового синего в исследовании клофелина.

С целью изучения механизма взаимодействия клофелина с БФС были сняты ИК-спектры твердых образцов лекарственного вещества, красителя и продукта их взаимодействия в таблетках КВг.

В ИК-спектре клофелина наблюдаются характерные полосы

-1

несвязанных (3311 см ) и связанных водородной (область 2500 -- 3200 см ) связью ИН групп. Полосы поглощения деформационного колебания 5[]н, вероятнее всего , сильно перекрываются, вследствие чего в области деформационных колебаний наблюдается

-1

одна полоса с максимумом 1647 см . Предположительно, в качестве донора протона в самоассоциатах клофелина выступает Ш группа имидазолинового кольца, т.к. вторая Ш группа, вероятнее всего, связана внутримолекулярной водородной связью (Ш- --01) и менее активна в образовании межмолекулярной Н - связи. В качестве акцептора протона может выступать атом азота гетероци-

-1

кла. В ИК-спектре БФС в области частот 1000 - 4000 см наблюдается широкая интенсивная полоса Уон комплексов с межмолеку-

-1

лярной водородной связью с максимумом около 3423 - 3470 см , форма которой предполагает наложение нескольких полос. Можно допустить, что эти полосы принадлежат самоассоциатам разных типов, в которых в качестве акцептора протона выступают различные протоноакцепторные центры: кислород сульфогруппы, гид-

-1

роксильный кислород. В области 2500 - 3700 см ИК-спектра продукта взаимодействия клофелина с БФС наблюдается наложение

-1

полос \,сн (2800 - 3000 см ) и широких интенсивных полос Уш

-1 -1 (2900 см ) и Уон (3250 см ) комплексов с межмолекулярной

водородной связью. Интерпретация спектров в области 8Ш и .5QH затруднена из-за наложения полос поглощения деформационных

колебаний СН групп. Полосы поглощения VNH и VQH несвязанных групп в спектре ионного ассоциата отсутствуют.

Таким образом, клофелин и БФС образует самоассоциаты посредством межмолекулярной водородной связи. В клофелине часть молекул находится в несвязанном по NH группе состоянии. В смеси клофелина с БФС все молекулы клофелина и БФС связаны между собой и друг с другом межмолекулярной водородной связью.

Для выяснениия реакционной формы БФС нами сравнительно изучены спектры поглощения красителя в водных растворах при различных значениях рН среды, концентрированной серной кислоте, в хлороформе, ацетоне, а также спектры поглощения водного раствора клофелина при рН 3,3 и хлороформного экстракта продукта взаимодействия клофелина с БФС при рН 3,3 и 5,0. Характер кривой поглощения БФС в 1 моль/л растворе серной кислоты в области рН 0 показывает, что положение максимума светопоглоще-ния соответствует 436 нм, что обусловлено ионизацией сульфо-

-1

группы и появлением однозарядных анионов БФС (RH ). При увеличении концентрации серной кислоты наблюдается значительный гипохромный эффект при незначительном гипсохромном сдвиге полосы с максимумом поглощения 436 нм. Появление новой полосы с максимумом абсорбции при 538 нм, вероятно, связано с уменьшением в сильнокислой среде ионизации сульфогруппы БФС и появлением в растворе биполярного иона.

Изучено поглощение БФС в слабокислой среде и установлена дополнительная полоса светопоглощения при 585 нм, что связано, очевидно, с ионизацией гидроксильной группы БФС и появлением

-2

двухзарядных анионов красителя (R ), хотя доминирующей формой являются однозарядные анионы, поглощающие при 436 нм. При увеличении рН до 5,0 преобладающей формой являются двухзаряд-ные анионы БФС.

Изучение светопоглощения водных растворов клофелина, БФС и хлороформного экстракта продукта их взаимодействия в УФ- и видимой области спектра при оптимальном значении рН среды показало, что они имеют максимумы поглощения при 271, 278 нм; 235, 280, 314, 436 и 585 нм; 240, 280, 315, 410 нм соответственно. Оптический спектр продукта реакции клофелина с БФС сходен со спектром абсорбции водного раствора красителя. Однако, полоса поглощения при 436 нм сдвинута гипсохромно на 26 нм. Это свиде-

тельствует о том, что продукт взаимодействия двух веществ можно отнести к ионному ассоциату. Данный вывод не противоречит литературными данными по образованию подобных соединений [A. Marquez и др.,1987].

Методами изомолярных серий, прямой линии, ограниченно-логарифмическим определен состав ИА. Установлено, что клофе-лин взаимодействует с бромфеноловым синим в молярном отношении 1 : 1. На основании изученных спектров поглощений, оценки физико-химических свойств ионного ассоциата, соотношения реагирующих компонентов предложена реакция клофелина с БФС. В оптимальных условиях протекания химической реакции был построен калибровочный график. Для проверки воспроизводимости и правильности разработанного нами способа было проведено количественное определение клофелина в субстанции. Данные представлены в табл.1.

Таблица 1

Результаты экстракционно-фотометрического анализа клофелина

Взято, мкг А ( 1= 3 мм ) Найдено Метрологические характеристики

мкг О. "О

75,00 0,354 73,55 98,06 х =100,09

75,00 0,367 76,25 101,67 S = 1,39

75,00 0,359 74,58 99,44 Sx= 0,57

75,00 0,367 76,25 101,67 Àx= 1,46

75,00 0,361 75,00 100,00 S = ±1,46%

75,00 0,360 74,79 99,72

Предлагаемый способ анализа дает хорошо воспроизводимые результаты. Относительная погрешность определения составила ± 1,46%. Это дало основание провести количественную оценку клофелина в лекарственных формах (таблетки, глазные капли, инъекционные растворы). Отклонения находятся в пределах допустимых норм.

Оценка качества таблеток клофелина на однородность дозирования

Оценку качества таблеток клофелина на однородность дозирования проводили с использованием разработанной методики анализа по реакции лекарственного вещества с БФС. Анализировали таблетки клофелина 0,000075 и 0,00015 г по заказу Новокузнецкого и Томского химико-фармацевтического заводов (АО "Органика") в связи с пересмотром фармакопейной статьи на таблетки.

Изучение времени экстракции ионного ассоциата в пределах

процесса дезинтеграции таблетки в делительной воронке показало, что при экстракции в течение 5 мин в органическую фазу переходит 85,0 - 97,0% клофелина. Учитывая, что по Гф XI нормируемое время распадаемости таблетки составляет 15 мин, за оптимальное принято время экстракции 20 мин. Результаты анализа 10 серий таблеток представлены в табл.2.

Таблица 2

Оценка качества таблеток клофелина на однородность _дозирования_п = 10

N серии Среднее содержание клофелина, г Количество таблеток по содержанию клофелина Максимальное отклонение от нормы (±20%) Диапазон отклонений (норма +30%)

отве -чает не отвечает мг о о

Таблетки клофелина 0,000075 г

1401089 0,0000605 7 3 0,0200 -26,67 22,17

1260488 0,0000657 10 - 0,0147 -19,60 17,30

1080388 0,0000718 10 - 0,0143 -19,07 21,87

60289 0,0000664 10 - 0,0108 -14,40 7,42

120289 0,0000709 10 - 0,0067 - 8,93 9,20

Таблетки клофелина 0,00015 г

790689 0,0001356 10 _ 0,0193 -12,87 10,79

1881288 0,0001291 10 - 0,0263 -17,53 9,25

1931287 0,0001541 10 - 0,0284 +18,93 28,57

1821287 0,0001432 10 - 0,0141 - 9,40 9,53

160189 0,0001537 10 - 0,0097 + 6,47 11,41

Установлено, что по результатам отклонений от среднего содержания лекарственного вещества в таблетках все исследуемые серии препаратов отвечают требованиям ГФ XI. Кроме того, из полученных данных видно, что среднее содержание клофелина в 8 из 10 анализируемых серий находится ниже средненормируемого значения, что свидетельствует о возможном занижении расходного коэффициента клофелина при данном технологическом процессе.

С целью установления причин снижения качества таблеток был проведен более углубленный расчетный анализ и найдены такие показатели, как максимальное отклонение от нормы и диапазон отклонений. Установлено, что в некоторых сериях эти показатели близки к предельным значениям или превышают допусти-

мые. Учитывая, что отклонение от нормы характеризует качество таблеток, а диапазон отклонений указывает на расхождение между отдельными результатами, следует считать, что данные показатели дают более глубокий анализ технологического процесса.

Для выяснения возможных причин значительного колебания дозы клофелина в таблетках мы провели корреляционный анализ зависимости между массой таблетки и содержанием клофелина в ней. Расчеты были произведены для обоих вариантов таблеток по трем выборкам в каждой. Ни в одной из анализируемых выборок не найдено корреляционной зависимости между анализируемыми параметрами, что свидетельствует о недостаточной однородности таблетируемой массы по содержанию клофелина.

Биофармацевтические и технологические исследования таблеток клофелина

Изучены такие основные физико-химические показатели качества таблетированной лекарственной формы как прочность, распадаемость и фармацевтическая доступность (растворение) на 14 сериях отечественных таблеток клофелина различных дозировок и двух сериях таблеток клофелина, выпускаемых зарубежными фирмами. Показано, что по тестам "Прочность" и "Распадаемость " они соответствуют требованиям ГФ XI.

Для исследования кинетики растворения субстанции клофелина из таблеток применили прибор "вращающаяся корзинка", предлагаемый ГФ XI. Высвобождение лекарственного вещества из таблетки контролировали разработанным экстракционно-фотоко-лориметрическим способом количественной оценки клофелина. Учитывая физико-химические свойства исследуемого соединения, в качестве среды растворения взят цитратный буферный раствор рН 3,3. Выбор данного растворителя является биофармацевтичес-ки обоснованным: получена оптимально возможная модель для минимальной ионизации лекарственного вещества с учетом рН среды всасывания клофелина (тонкий кишечник).

Ввиду высокой растворимости клофелина отбор проб анализируемого раствора осуществляли с интервалом времени не более 2,0 мин. Объем растворяющей среды с учетом анализируемых доз клофелина и чувствительности методики составил 30 мл при скорости вращения корзинки 50 и 100 об/мин. Установлено, что процесс высвобождения лекарственного вещества из таблетки при о

температуре (37 ± 1) С описывается кинетическим уравнением первого порядка. Константы скорости растворения субстанции клофелина из таблеток и время полурастворения при 50 и

100 об/мин для таблеток с дозой 0,000075 и 0,00015 г составили

-1

соответственно: 0,996 и 1,453мин , 0,70 и 0,48 мин; 0,185 и -1

■ 0,283 мин , 3,75 и 2,45 мин. Полученные результаты подтверждают хорошую растворимость клофелина в цитратном буферном растворе. При избранном режиме работы прибора в среду растворения за 15 мин переходит 89 - 95% действующего вещества.

Разработанную методику теста "Растворение" №1 использовали для сравнительной оценки фармацевтической доступности таблеток клофелина отечественного производства (АО "Органика) и его зарубежных аналогов: гемитона и катапресана (Германия). Результаты эксперимента, полученные при оценке высвобождения субстанции клофелина из таблеток гемитона и катапресана, показали, что процесс растворения действующего вещества из данных таблеток в выбранных условиях также подчиняется уравнению первого порядка. При режиме перемешивания 50 и 100 об/мин константы скорости растворения и время полурастворения клофелина из таблеток гемитона 0,000075 г и катапресана 0,00015 г

-1

соответственно составили: 0,220 и 0,355 мин , 3,15 и 1,95 мин;

-1

1,257 и 2,344 мин , 0,55 и 0,30 мин.

Полученные данные свидетельствуют о том, что различие в кинетике высвобождения клофелина из отечественных таблеток и его зарубежных аналогов обусловлено спецификой технологического процесса, включая влияние комплекса вспомогательных веществ и давления прессования. Однако высокий процент высвобождения лекарственного вещества (не менее 89%), достигаемый не позднее 15 мин у всех исследуемых таблеток, свидетельствует об их эквивалентной фармацевтической доступности.

Идентификация и определение клофелина в биологических

жидкостях

Изучена степень экстракции клофелина из водных растворов в зависимости от природы растворителя и значения рН среды. Оптимальное значение рН экстракции находится в пределах 8,0-10,0 Степень однократной экстракции диэтиловым эфиром, бензолом и хлороформом составила 50,0; 87,5 и 95,5% соответственно.

При исследовании крови и мочи (искусственные смеси) использовали частный метод изолирования (Б.Н. Бекетов, 1981). Экстракцию хлороформом проводили в оптимальных условиях рН после предварительного гидролиза (рН 1) при температуре кипящей водяной бани в течение 1 ч. В качестве основных методов

очистки и идентификации клофелина мы использовали электрофорез на бумаге, ТСХ и их сочетание. Чувствительность реакции обнаружения при проведении электрофореза и ТСХ составила 0,4 и 0,1 мкг соответсвенно. На основании проведенного эксперимента предел обнаружения клофелина в 10 мл крови и 100 мл мочи составил 50 мкг.

Идентификацию и определение клофелина в моче крыс проводили после перорального введения с помощью зонда водного раствора клофелина в дозе 5 мг /кг массы животного. Крыс содержали на свободном питьевом режиме в клетках с мочекалоразделите-лем. Через 20 мин после введения препарата у всех животных на фоне выраженной интоксикации отмечали выделение первичной мочи в объеме 6-10 мл. Исследования первичной, суточной и контрольной мочи проводили в равных условиях по разработанным методикам. Установлено, что клофелин надежно идентифицируется по ДПФ^ и Rf. Хроматографию проводили восходящим способом

на стандартных пластинках ВЭТСХ кизельгеля 60 F254 (Merck) в системе растворителей: ацетон-толуол-25% раствор гидроксида аммония-этанол-хлороформ (5:10:1:5:30). На основании проведенного анализа установлено, что предварительная очистка электрофорезом на бумаге позволяет получить высококачественную пробу, максимально очищенную от соэкстрактивных компонентов и продуктов биотрансформации (рис. 1). Обнаруженные на хрома-то грамме в пробах суточной и первичной мочи дополнительные зоны с Rf 0,85; 0,80; 0,56; 0,47 и 0,56 соответственно идентифицировать как возможные метаболиты клофелина не представлялось возможным из-за отсутствия "свидетелей" последних. Учитывая возможное наличие метаболитов и в зоне клофелина, была проведена дополнительная идентификация УФ-спектроскопией элюата после очистки экстрактов электрофорезом на бумаге (рис. 2). Высокая степень чистоты выделенного измочи клофелина послужила основанием его количественной оценки, которую проводили с использованием разработанной экстракционно-фотометрической методики на основе реакции клофелина с БФС после предварительной очистки проб ТСХ. Клофелин был количественно определен в моче крыс через 30 мин; 1; 3 ; 5 и 24 ч после перорального введения препарата. Для каждого интервала времени брали отдельное животное. Максимальное количество нативного клофелина было найдено в суточной моче.

Эксперименты по изучению влияния кислотного гидролиза на выход клофелина показали, что гидролиз незначительно увеличивает содержание лекарственного вещества в моче крыс.

А

240 250 260 270 280 290 А, нм

ТСХ элюатов с электрофоре гралм (животное s 1).

1-моча контроль;

2-моча модель;

3-суточная моча ;

4-первичная моча;

Рис. 2. уф-спектры 0,012% раствора клофелнна--"евкдетеля" (1), клофелина, выделенного иэ модели мочи (2) и мочи крыс (3). Растворитель - ОД моль/л раствор хлористоводородной кислоты. СФ- 26,1 ■ 1 см.

5-клофелин-"свидетель".

Проведены исследования на содержание клофелина в моче людей при фармакотерапии гипертонической болезни. Выбор мочи, как объекта исследования, обусловлен тем, что содержание в ней клофелина после перорального приема на два порядка выше, чем в крови [L.C. Chu и др., 1979]. Сведения о больных, находящихся на стационарном лечении в Тюменском НИИ клинической и профилактической кардиологии СО РАМН представлены в табл.3.

Таблица 3

Сведения о больных и назначении препаратов

Nn/n N истории болезни Терапевтическое назначение препаратов

доза (г) и количество таблеток клофелина в сутки Препараты сопутствующей терапии

706 0,000075x 3 Феназепам, коринфар,

анаприлин,адельфан, циннаризин.

503 0,000075x 4 Феназепам,коринфар,

триампур,циннаризин

В результате просмотра полученных электрофореграмм в УФ-свете ( %= 254 нм) и детекции реактивом Драгендорфа по Бергоф-

фу-Делызиче с последующей обработкой раствором хлористоводородной кислоты рН 2,0 были обнаружены зоны с близкими к клофе-

лину значениями ДПФ^. В связи с этим была проведена дополнительная идентификация электрофорезом на бумаге при рН 6,0 ; 10,0 и ТСХ после предварительной очистки электрофорезом. Данные представлены в табл.4.

Таблица 4

Идентификация клофелина в моче людей электрофорезом на бумаге и ТСХ__п = 3

Объект исследования дафсм хромато графические

системы*

рН 1,8 рН 6,0 рН 10,0 1 2 3

Моча больного N 1 9,84 8,95 6,61 0,63 0,60 0,77

Моча больного N 2 9,45 8,89 6,49 0,64 0,59 0,78

Моча-модель 9,49 8,62 6,45 0,64 0,60 0,75

Клофелин-"свидетель" 9,80 8,90 6,60 0,64 0,61 0,80

Дополнительная зона 8,90 4,80 5,20

Примечание*: хроматографические системы: 1-описана в тексте; 2-н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4 : 1 : 5); 3-хлоро-форм-метанол-25% раствор гидроксида аммония (8 : 3 : 0,1).

Разработанная методика позволила провести идентификацию клофелина в пробах мочи в присутствии продуктов биотрансформации таких лекарственных веществ, как феназепам, анаприлин, триампур, коринфар и адельфан. Сочетание электрофоретической очистки с идентификацией методом ТСХ значительно повышает объективность анализа.

ВЫВОДЫ

1. Предложена капельная реакция обнаружения клофелина на бумаге с реактивом Драгендорфа по Бергоффу-Дельвиче и последующей обработкой хлористоводородной кислотой рН 2,0 - 2,5. Предел обнаружения составил 12,5 нг в пробе.

2. Разработана методика количественного определения клофелина на основе спектрофотометрии хлороформного экстракта, содержащего основание препарата. Относительная ошибка определения составила ± 1,03%. Показана возможность использования данной методики при анализе лекарственных форм клофелина.

3. Впервые проведено теоретическое обоснование и экспериментально подтвержден механизм взаимодействия клофелина с бром-феноловым синим, изучен состав, физико-химические свойства

- 1D -

ионного ассоциата, разработана экстракционно-фотоколоримет-рическая методика количественного определения клофелина в субстанции и лекарственных формах. Относительная ошибка определения составила ± 1,46%. Данная методика позволяет проводить количественную оценку содержания клофелина в моче животных после перорального введения и проведения предварительной очистки экстрактов мочи методом ТСХ.

4. Впервые дана оценка качества таблеток клофелина АО "Органика" по однородности дозирования и проведен анализ технологического процесса производства на основе расчетных данных максимального отклонения от нормы, диапазона отклонений и корреляционного анализа зависимости содержания клофелина от массы таблетки.

5. Определены оптимальные условия кинетики растворения клофелина из таблеток в приборе "вращающаяся корзинка" и предложена методика оценки качества лекарственных форм по тесту "Растворение". Установлено, что не менее 89 % действующего вещества высвобождается из таблеток за 15 мин.

6. Впервые рассчитаны кинетические константы: скорость растворения и время полурастворения для таблеток клофелина

(АО "Органика"), гемитона и катапресана (Германия). Выявлены различия в кинетике высвобождения субстанций из таблеток, которые не являются лимитирующими в процессе всасывания лекарственных средств при пероральном приеме.

7. Найдены оптимальные условия очистки и идентификации клофелина от биосубстрата мочи и лекарственных веществ, широко применяемых в сочетании с клофелином при лечении гипертонической болезни (анаприлин, адельфан, реланиум, агапурин, фен-толамин, феназепам, циннаризин, триампур, коринфар, курантил) с использованием электрофореза на бумаге, хроматографии в тонком слое сорбента и их сочетания, пригодные для биофармацевтических и химико-токсикологических исследований.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. A.c. 1746314 СССР. Способ обнаружения клофелина в биологических жидкостях /Б.Н.Векетов, ГЛ. Лисионкова. Опубл. в Б.И., 1992.-N 25.

2. Лисионкова ГЛ., Бекетов В .Н. Электрофорез на бумаге в химико-клиническом анализе клофелина // Химические проблемы отраслей народного хозяйства Тюменского региона и пути их решения: Тез. докл. обл. конф. - Тюмень, 1989. - С. 120.

3. Лисионкова ГА., Бекетов Б .Н. Использование электрофореза на бумаге в биофармацевтическом анализе клофелина // Медицинские, социальные, экологические проблемы при транспортировке и переработке газа: Тез. докл. Всесоюз. научно-практ. конф. - Надым, 1991. - Т. 1.- С. 186 - 187.

4. Бекетов Б.Н., Лисионкова Г Л. Экстракция клофелина органическими растворителями. - Тюмень, 1991, - 5 с. - Деп. во ВНИИМИ, № 21692.

5. Бекетов Б .Н., Лисионкова ГА. Определение однородности дозирования клофелина в таблетках / / Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств: Тез. докл. Всесоюз. конф. - М., 1991. - Т. 2., 4.2. - С. 69 - 70.

6. Лисионкова ГА., Бекетов Б.Н. Фармакокинетика клофелина в эксперименте // Обмен веществ в норме и патологии: Тез.: докл. совещания руководителей отделений биохимических обществ Урала и Западной Сибири. - Тюмень, 1992. - С. 55.

7. Определение однородности дозирования клофелина в таблетках: Методические рекомендации /сост. Б.Н. Бекетов, Г.А. Лисионкова. - М., 1993. - 8 с.

8. Бекетов Б ,Н., Лисионкова Г А. Особенности реабилитации больных при отравлении клофелином // Социальная медицинская реабилитация больных и инвалидов: Сб. науч. тр. - Тюмень, 1994. -

- С. 92 - 97.

9. Бекетов Б ,Н., Лисионкова Г А. Биофармацевтический анализ клофелина // Решение актуальных задач фармации на современном этапе: Тез. докл. науч. конф., посвященной 50-летию НИИ фармации. - М., 1994. - С. 98.

10. Лисионкова ГА. Экстракционно-фотометрическое определение клофелина // Актуальные проблемы фармации: Тез. докл. научно-практ. конф., посвященной 30-летию фармацевтического факультета Тюменского медицинского института. - Тюмень, 1994.

- С. 68 - 69.

11. Бекетов в .Н., Лисионкова Г А. Способ количественного определения клофелина /Положительное решение № 01 ИЗ, ПМ-94

от 26.04.95 г. на выдачу патента РФ по заявке № 93053975/25 от 02.12.93 г.

Подписано.к.печати________02.9.6_г.______Печ. л ...1..

Заказ 15. Тираж 100. Компьютер.