Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка, получение и применение поливалентной сыворотки против псевдомоноза животных

Автореферат отсутствует в библиотеке
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертация отсутствует в библиотеке
ДИССЕРТАЦИЯ
Дубровин, Иван Игоревич Краснодар 2007 г.
Ученая степень
кандидат ветеринарных наук
ВАК РФ
16.00.03
 
 

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Разработка, получение и применение поливалентной сыворотки против псевдомоноза животных

На правах рукописи

ДУБРОВИН ИВАН ИГОРЕВИЧ

РАЗРАБОТКА, ПОЛУЧЕННИЕ И ПРИ М Е ПЕНИЕ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ПСЕВДО-МОНОЗА ЖИВОТНЫХ

16 00 03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

ииои си 72Э

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Краснодар 2007

003070729

Работа выполнена в ГНУ ский ветеринарный институт»

« Краснодарский научно - исследователь-

Научный руководитель Заслуженный деятель науки Кубани

доктор ветеринарных наук, профессор Болоцкий Иван Александрович

Официальные оппоненты доктор ветеринарных наук, профессор

Тутов Иван Кириллович

доктор ветеринарных наук, профессор Малышева Людмила Александровна

Ведущая организация Северо - Кавказский зональный научно -исследовательский ветеринарный институт (СИЗНИВИ)

Защита диссертации состоится «Зс?» мая 2007 года в I О часов на заседании диссертационного совета Д 220 038 07 в Кубанском государственном аграрном университете (350044, г Краснодар, ул Калинина 13)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного университета

Автореферат разослан «2$> апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ. В России возбудитель псевдомоноза Р aeruginosa выделяется из патологического материала сельскохозяйственных животных и птиц во всех регионах, в том числе и в Краснодарском крае ( Казеев Г В 1972, Шипицын А Г 1982, Васильев А К 2003, Болоцкий И А 2006, Марченко Т.В 2006.)

Некоторыми авторами Homma ID et al (1982), Matthews -Greer LV (1987) Седов H К (1987), на уровне лабораторных исследований предлагались гипериммунные сыворотки против псевдомоноза, но для массового использования основным видам сельскохозяйственных животных пока не предложено ни одного эффективного специфического биопрепарата Высокая инфициро-ванность сельскохозяйственных животных возбудителями псевдомоноза, заболеваемость их, а также контаминация кормов, продуктов животноводства Р aeruginosa и постоянная угроза заражения человека, наносит не только громадный экономический ущерб, но имеет и социальное значение Поэтому исследования направленные на решение обозначенных проблем являются весьма актуальными

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Целью нашей работы являлось изучение эпизоотологии и этиологической структуры псевдомоноза животных в крае, изучение основных биологических свойств выделенных изолятов Р aeruginosa и на их основе разработать технологию получения в лабораторных и производственных условиях гипериммунной поливалентной сыворотки, испытать ее в лабораторных условиях и на практике при энзоотиях псевдомоноза

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи

- изучить распространение и этиологическую структуру псевдомоноза свиней и крупного рогатого скота в хозяйствах Краснодарского края,

- изучить некоторые биологические свойства выделенных культур Р aeruginosa,

- разработать технологию лабораторного/фомышленного изготовления гипериммунной поливалентной сыворотки против псевдомоноза животных,

- провести испытания опытных микросерий сыворотки / при псевдонозе животных в производственных условияч,

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Изучена эпизоотология и этиологическая структура псевдомоноза свиней и крупного рогатого скога в Краснодарском крае Отобраны 10 культур Р aeiugmosa десяти серотипов наиболее часто выделяемых от животных в крае с наиболее выраженными антигенными и иммунот еппыми свойствами, на которые оформлены паспорта Данные штаммы Р aeruginosa использованы в лабораторных и производственных условиях для получения гипериммунных поливалентных сывороток Впервые разработана технология лабораторного и производи венного получения гипериммунной поливалентной сыворотки против псевдомоноза животных Разработаны методы контроля активности полученной сыворотки, которая успешно испытана в производственных условиях при псевдомонозе поросят и телят

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. В результате изучения этиологии заболевания, установлены наиболее часто выделяемые от животных культуры Р aeiugmosa, из них Olобраны Юизолятов десяти серотипов с выраженными антигенными, иммунногенными и вирулентными свойствами Штаммы можно исполыовать для приготовления поливалентных сывороток и вакцин против псевдомоноза.

Разработана и испытана технология получения и контроля в лабораторных и производственных условияч поливалентной гипериммунной сыворотки против псевдомоноза животных

Изготовленная поливалентная сыворотка показала хороший профилактический и лечебный эффект на поросятах, телятах и свиноматках при энзоотиях псевдомоноза, и можи быть рекомендована для широкого производственного изготовлении и применения

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения и результаты исследований изложенные в диссертационной работе, доложены и одобрены

- на 7™ региональной научно - практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», Краснодар 2005,

- на международной научно - практической конференции, посвященной 60-летию ГНУ Краснодарскою НИВИ «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», Краснодар, 2006,

- на заседаниях Ученого совета НИВИ 2005 - 2007гг

ПУБЛИКАЦИИ по материалам исследований опубликовано 6 научных работ.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: - эпизоотология псевдомоноза в Краснодарском крае,

- биологические свойства изолятов Р aeiugmosa, выделенных от животных,

- получение в лабораторных условиях микроесрий i ипериммун-ной поливалентной сыворотки против псевдомоноза животных и их испытание,

- получение в производственных условиях па волах гипериммунной поливалентной сыворотки против псевдомоноза и изучение ее свойств

- испытание опытной гипериммунной поливалет пой сыворотки против псевдомоноза на свиньях и телятах

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕР IАЦИИ Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 таблицами, состоит из введения, обзора литсра1уры, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и практических предложений Список цитируемой лшературы включает 175 источников, из них 104 отечеа венных и 71 иностранных авторов

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в соотвоствии с государственным планом научных работ по заданиям, утвержденным Российской Академии сельскохозяйственных наук в 2004 — 2007 годах в лаборатории эпизоотологии Краснодарского научно - исследовательского ветеринарного института, Краснодарской межобластной ветеринарной лаборатории, на Армавирской биофабрике, в хозяйствах Краснодарского края

При выполнении работ было поставлено 8 научно производственных опытов, при этом использовано 2456 белых мышей, 195 морских свинок, 24 кролика, 855 поросят разного возраста, 111 телят в возрасте 1 - 2 месяцев, 238 свиноматок и 9 волов -продуцентов

Всего проведено 480 бактериологических исследований проб различных материалов из хозяйств края и опьп ных животных, 340 серологических исследований, 65 гематологических, 65 биохимических

Распространение, вопросы сезонности и зональности псевдомоноза животных изучали путем анализа данных собственных исследований, данных межобластной и некоторых районных ветеринарных лабораторий, за последние 5 лет

При бактериологических исследованиях 480 проб материала от животных, используемых кормов, проб воды, навоза, объектов животноводческих ферм было изолировано 672 различных микроорганизмов, из них 105изолятовР аешцтоэа Культураль-ные, различные биологические свойства выделенных культур, изучали проведением бактериологических, биохимических, серологических и других исследований

Для проведения исследований пользовались известными методами, изложенными в руководствах «Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии» (1985), « Медицинские лабораторные технологии» (1999), а также руководствовались «Методическими рекомендациями по диагностике, профилактике и лечению псевдомоноза сельскохозяйственных животных» (2003)

В процессе проведения бактериологических исследований были использованы материал от животных павших и вынужденно убитых и пробы объектов окружающей среды, вода, корма и др

Посевы делали в пробирки с МПА, МГ1Б, МППБ, а также на чашки Петри с агаром Эндо Пробирки и чашки Петри с посевами инкубировали в термостате при 37°С в течении 24 - 48 часов, после чего отдельные колонии характерные для. Р aeiugmosa пересевали на другие среды для дальнейших исследований

Культурально - морфологические свойства изолятов, а также биохимическую и протеолитическую актвпость изучали общепринятыми методами

Серологические исследования проводили методом постановки реакции агглютинации на стекле и пробирочным методом по общепринятым методикам, описанным в «Методических указаниях по лабораторным исследованиям на псевдомоноз животных и птиц» (1988года) Серотипизацию выделенных изолятов Р aeiugmosa проводили с типоспецифическими сыворотками изготовленными ГИСК им Тарасевича в Москве, а также с сыворотками, изготовленными Армавирской биофабрикой (20 серотипов) Постановкой реакции агглютинации пробирочным методом мы также определяли уровень специфических антител в сывороп<ах крови кроликов и волов, гипериммунизированных определенными культурами Р aeiugmosa

Вирулентные свойства выделенных изолятов Р aeruginosa определяли на беспородных белых мышах весом 18 - 20грамм За меру вирулентности культуры синегнойной палочки считали среднюю смертельную дозу микроорганизмов LD50 (доза микробов вызвавших гибель 50% зараженных мышей), которую вычисляли по методу Кербера

Полученные дозы LD50 и ЬОЮОиспольювали при определении антигенных и иммунногенных свойств изучаемых изолятов, и превентивной активности опытных сывороток крови

С использованием вышеописанных методов исследований было изучено 105 изолятов, из них были отобраны 10 наиболее часто выделяемых от свиней и крупно рогатого скота культуры Р aeruginosa, наиболее вирулентные и активные в анжгенном и иммуногеном отношении, на них оформлены паспорта

Антигеном для получения гипериммунпой моно и поливалентной сывороток служили эти 10 штаммов Р aeiitgmosa №18 (Ol), №47(02), №37 (03), №19 (04), №2 (06), №13 (OlO), №70 (Ol 1), №66 (013), №29(018), №28(019), изолированные нами

Получение гипериммунных сывороюк в предварительных опытах проводили в лаборатории КНИВИ и кролиководческом хозяйстве ООО « Усть - Лабинскгазстрой» Ус i ь - Лабинского района, на беспородных здоровых кроликах, массой по 3 0 - 3 5кг Иммунизацию кроликов, проводили моно и поливалентными антигенами инактивированными-0,3% формалина Поливалентные антигены составляли из моноантигенов, добавляя каждого десятую часть В 1см1 смешанного антигена содержалось 1 миллиард микробных тел каждого серотипа

Было использовано 24 кролика, которых разделили на 6 групп и им по группам вводили антигены из дссяш есротипов

Активность сыворотки определяли но уровню (титров) специфических антител к каждому серошпу в реакции агглютинации с антигенами используемыми для получения сывороток и по уровню защитных свойств на белых мышах, с последующим их заражением каждым из исходных штаммов используемых для получения сывороток

Опыты по получению гипериммунных сывороток на волах проводили на Армавирской био^забрике Руководствуясь методикой Пруцакова С В (2000) Для это.и'было отобрано дсвя1ь волов четырех летнего возраста, массой 750 - 800 кг

Антиген для гипериммунизации волов готовили поливалентный Культуру каждого штамма Р aeiugmosa выращивали на бульоне Хоттингера отдельно, доводили концентрацию до 10 миллиардов микробных тел в 1см1 ннактивировали 0 3 % формалина, все 10 антигенов смешивали в равных обьемах инактивировали 14 суток

В производственных условиях эффективность (активность) гипериммунной сыворотки проверяли на свиньях (поросятах и свиноматках) и на телятах, в хозяйствах неблл! онолучных по псевдомонозу

Цифровые данные полученных результатов собственных исследований подвергали биометрической обрабо!ке с помощью программ Microsoft Excel 2ООО на компьютере с процессором

Pentium 3, степень достоверности « Р» устанавливали по распределению Стыодента.

2.2. ЭПИЗООТОЛОГИЯ ПСЕВДОМОНОЗА ЖИВОТНЫХ В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ.

2 2 1 РАСПРОСТРАНЕНИЕ И КЛИ11ИЧССКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ ПСЕВДОМОНОЗА Чтобы внести более полную ясность в Э1и вопросы, мы подвергли анализу результаты бактериологических исследований материалов от разных видов животных, а также кормов, смывов с животноводческих объектов и окружающей среды, проведенных в лаборатории эпизоотологии Краснодарскою НИВИ, ветеринарных лабораториях края, (в том числе и межобластной), за последние 5 лет При этом бы то установлено, что Р aetugmosa выделяется в 10 7 -12% от количества выделенных микроорганизмов

Инфицированность синегнойной палочкой животных, птиц, кормов и объектов внешней среды, в крас имеет широкое распространение

На протяжение ряда лет идет постоянное интенсивное инфицирование кормов, животных, объектов окружающей среды, а следовательно и продуктов животноводства, мяса, молока и других продуктов получаемых из зерновой основы и т д

Нами в лаборатории КНИВИ и хозяйе1вах края исследовано 480 проб патологического материала от животных разных видов, в том числе 171 проба от крупного рогатого скот а 197 проб патологического материала от павших и больных свиней Исследовано 68 проб различных кормов, используемых па животноводческих фермах и 44 пробы материала из самых различных объектов внешней среды вода, навозные стоки, смывы со оанков и кормушек в животноводческих корпусах и т д

Общая обсемененность изучаемых объектов была очен высокой Из общего количества изолированных кулыур было выделено Е coli - 26,2%, Streptococcus albus ssp, - 23,7%, P vulgaris,? subtilis ssp, - 16,7%, P aetuginosa- 15,6%, различные грибы - 8,4%, Salmonella - 7,3%, различные анаэробы - 2,1% Как видно из результатов исследований выделение изолятов Р aeiuginosa в общем из всех учтенных объектов стоит на четвертом месте, причем от 25 до 32% выделение культур было в чистом виде, а большей частью в

ассоциациях с другими микроорганизмами по 2, 3, 4 и более Выделение изолятов из патологического материала от свиней составляло 19,5%, от крупного рогатого скота 16,3%, а из кормов 12,4%

Отмечено повышенное выделение культур возбудителя в районах с наиболее интенсивным животноводством и птицеводством в Тимашевском, Брюховецком, Ленинградском, городе Краснодаре

Установлено наибольшее количеиво выделение культур в осеннее - зимнее - весенний период с ноября по март месяцы по 11 -12% В летние же месяцы выделение культур Р aeiuginosa резко сокращалось, достигая минимума в июле - августе - 5 - 6%

Источниками псевдомонозной инфекции па животноводческих фермах являлись молодые животные (поросята, телята и т д ) больные псевдомонозом, а так же взрослые свиноматки, коровы больные эндометритами, маститами, хряки - производители и пробники псевдомононосители

Заболевание поросят и телят псевдомонозом регистрировали в Брюховецком, Щербиновском, Каневском, Ейском, Павловском и Выселковском районах чаще в хозяйсшах с низкой санитарной культурой, с длительным и неправильным хранением кормов Во всех случаях диагноз подтверждали лабораторными исследованиями

2 2 2 БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТ ВА ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗОЛЯТОВ Р AERUGINOSA

Выделенные 105 изолятов Р aeiuginosa в лабораторных условиях подвергали всесторонним исследованиям Бактериальные клетки Р aeruginosa представляли собой грамофица1ельные, подвижные, короткие, прямые с закругленными концами палочки, расположенные одиночно, иногда парами, а изредка короткими цепочками

Выделенные культуры спор и капсул не образовывали, но активно продуцировали слизь, которая выявлялась при окраске по Гинсу

Продуцирование сине-зеленого пигмента пиоционина отмечено у 102 (97 1%) изолированных кулмур

Гемолитическими свойствами Р aeuiginosa, в нашем случае 93 культуры (88.6%) обладали В - гемолизом и только 12 культур (11 4%) обладали а - гемолизом

Все полученные изоляты пептонизировали молоко Кислотообразующие свойства активно проявлялись только при ассимиляции глюкозы (68 5%), Не очень активно выделенные культуры образовывали сероводород (43 8%), еще меньше индол (21 0%)

Типизацию полученных изолятов Р aeiugmosa проводили в реакции агглютинации на стекле иногда пробирочным способом Типированию поддались 103 культуры (98%), оставшиеся 2 культуры не дали положительной реакции ai глютинации ни с одной из 20 типоспецифических сывороток Установлена положительная реакция агглютинации с 14 сыворотками Изоляты от свиней относились к 11 серотипам, наибольший процент изолятов следующих серотипов 04, 010, 018, 019 по 12,5%, Об, 013 - по 10,1 %,ОП -8,3%

От крупного рогатого скота изолировано 9 серотипов Р aeruginosa 019-20%, ОЗ - 17,1%, Ol 1 - 14,3%, Ol, Об и 018 по 11,4%, 013-8,6%

Изоляты выделенные из кормов 01, 03, О 19 по 23%, 013

- 15,4%, 011 и 018 по 7,7%) Из объектов внешней среды изолированы культуры серотипов 01, 02, 03, 013, и 012

Не все изоляты Р aeruginosa обладали одинаковой вирулентностью, 9 из 105 (8,6%) вообще были авирулептны По степени вирулентности отмечено, что высоковируленгпых изолятов, т е вызывающих гибель белых мышей от 125 миллионов микробных тел, было 54,3%), вирулентных -21% и слабовирулентпых - 16,1%> Наибольшее количество вирулентных изолятов получено от свиней

- 95,9%), от крупного рогатого скота - 94,4% Ог лгих же видов животных больше всего выделено высоковируленгпых культур 63,2 и 63,9% соответственно

Исследованиями не отмечено четкой зависимости между серогрупповой принадлежностью и уровнем вирулентности выделенных изолятов

С целью определения иммуногенности подобранных 10 культур Р aeruginosa мы из каждого изолята готовили убитый моноангиген и вводили их белым мышам Напряженность

иммунитета проверяли заражением опытных мышей LD100 исходными монокультурами через 21 день после иммунизации

Опьпы показали, чю все испьпуемые культуры Р aeruginosa оказались достаточно иммуногенными, создавали протективную защиту в 85 - 95% опытных животных

Окончательно отобрали 10 культур Р aeiuginosa, десяти се-ротипов 01,02,03,04,06,010,011,013,018,019, которые использовали в дальнейшей работе для приготовления гипериммунных сыворогок

2.3. ПОЛУЧЕНИЕ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК ПРОТИВ ПСЕВДОМО-НОЗА И ИХ ИЗУЧЕНИЕ.

Работу проводили на кроликах и белых мышах Антиген для иммунизации кроликов готовили по описанной выше методике с содержанием 1 миллиарда микробных тел на миллилитр

Использовано 24 кролика В первых четырех i руппах кроликам вводили мопоантиген Первая группа серотигш 02 штамма №47 Вторая группа серотипа 04 штамма № 19 Кроликам третьей группы серотипа 013 штамма №66, кроликам четвертой группы моноантиген серотипа 013 штамма №66, по две последние инъекции делали с иммуностимулятором - левамизолом по 0,3 см1 подкожно

В пятой и шестой группах использовали 10 кроликов по 5 в каждой группе Кроликам пятой группы вводили полиантиген состоящий из 10 моноантигенов десяти серотипов 01, 02, 03, 04, 06, 010, Ol 1, 0,13, 018, 019 с содержанием 1 миллиард микробных тел на см1

Пяти кроликам шестой группы вводили такой же полиантиген, но во время двух последних (6-й и 7 - й) иньекций вводили левамизол по 0,3 см1 на кролика

Кроликам всех групп антиген вводили по одной схеме первые две инъекции через 4 дня по 1 миллиарду микробных тел третью и четвертую по 2 миллиарда микробных тел, а пятую, шестую и седьмую по 3 миллиарда микробных тел каждого серотипа

Специфические антитела кроликов уже после третьей иммунизации досшгали средних титров 1 213 - 1 320 После пятикратного введения 1 512-1 640 После семикратной инъекции антигенов титры антител утроились по сравнению с предыдущим исследованием, а у кроликов, которым вводили антигены с левамизолом - титры были на 33 - 40% выше, чем у кроликов, которым левамизол не вводили

Изучали динамику формирования защитных свойств после грех, пяти и семикратного введения антигена, с лево(мизолом и без тевДмизола Сыворотку кроликов каждой группы смешивали в равных количествах и вводили мышам внугрибрюшинно в разных дозах, а через сутки их заражали гомологичными культурами в дозе ЬЭЮО,

Дозы в 0,2 см1 защищали 36 - 60% мышей от гибели А дозы 0,5 см1 защищали все 100% мышей

После пятикратного введения антигена защитные свойства в дозе 0,1 миллилитр стали выше в 2 - 4 раза по сравнению с первым исследованием Доза 0,2 миллилитра предохраняла все 100% мышей от заралсешш кроме серотипа 02, где защита составила 80% У кроликов после семикратного введения антигенов защитные свойства в дозе 0,1 миллилитр выражались 80 - 100%, а у гех которым вводили левамизол, они были 100% Сыворо1ки кроликов всех групп после семикратного введения ан гш епов в дозе 0,2 миллилитра защищали всех мышей взятых в опьп

2.4. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИВАЛЕНТНЫХ ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК ПРОТИВ Г1СЕВДОМОНОЗА НА ВОЛАХ И ИХ ИЗУЧЕНИЕ.

В цехе №3 Армавирской биофабрики было отбрано 9 здоровых волов черно - пестрой породы, 4 - 4,5 летнего возраста, массой 750 - 800 кг У волов предварительно определили фоновые показатели крови и сыворотки

Была разработана схема гипериммунизации волов поливалентным псевдомонозным антигеном, сосюящим из тех же 10 серотипов как и для кроликов

Было сформировано две группы волов Первая - 5 волов, и вторая -4 вола, которым кроме антигена после грундиммунизации вводили левомизол

Согласно используемой схемы грундиммунизация продолжалась 34 дня Всего было сделано 10 иньекций через 3-4 дня каждая Начали вводить антиген с дозы в 5,0 см1 постепенно увеличивая ее на определенный объем В одном см1 содержалось 1 миллиард микробных клеток каждого их 10 серотипов Р aeruginosa После грундиммунизации проводили основную иммунизацию -гипериммунизацию антигеном в дозе 150 см1 всего три раза через 3 -4 дня Волам обеих групп во время грундиммунизации вводили только поливалентный антиген Волам второй группы после окончания грундиммунизации, с одиннадцатой иньекции вводили подкожно по 10 см1 раствора левамизола Антиген для гипериммунизации волов готовили в условиях Армавирской биофабрики по описанной методике

У волов кровь для контроля брали до опыта, на седьмой день после первого введения антигена, через 21 день после начала иммунизации, через 32 дня после начала введения антигена После окончания основной гипериммунизации спустя 8 дней у волов взяли кровь для получения сыворотки из расчета 16 грамм на килограмм веса вола Из взятой крови получили сыворотку, консервировали 0,5% раствором фенола, выдерживали 30 суток, подвергли фильтрации через фильтроэлемент «Мелипор», а за1ем фасовали во флаконы, проверяли по внешнему виду, а также на безвредность, стерильность и активность

Поливалентные сыворотки подвергали исследованию на активность по уровню титров специфических антител и по защитным (превентивным) свойствам

До введения антигена у волов не.было выявлено специфических антител к Р aeruginosa После двукратного введения поливалентного антигена титры антител достигли "литров 1 34 ±4,86 После шестикратного - титры возросли в14раз Антитела формировались ко всем 10 антигенам входящим в общий полиантиген с некоторой разницей в величине титра После десятикратной иммунизации титры увеличились в среднем в 30 раз. После тринадцатикратной иммунизации титры антител повысились до уровня 1 1820 Антигены всех 10 серотипов вызывали интенсивное образование специфических антител, в титрах 1 '720-1 2560, но более активны оказались антигены серотипов Ol, 04, Об, 018 и О 19

В группе волов, которым вводили левамизол титры антител были выше на 28%

Отобранные для гипериммунизации волов ш гаммы Р aeruginosa оказались с высокими антигенными свойствами, активно способствовали образованию специфических антител

Превентивные (защитные) свойства сывороток крови гипе-риммунизированных волов определяли на белых мышах весом 18 -20 грамм В опыт взяли 180 мышей, на каждый серот ип по 15 зверьков, и 30 контрольных Полученную сыворотку исследовали после 13 инъекций антигена без левамизола Брали дозы сыворотки по 0,05 - 0,1 и 0,2 см3 и каждую вводили внутрибрюшинно мышам, а затем через одни сутки всех 15 мышей заражали 2LD50 культурой каждого серотипа внутрибрюшинно, используемого для получения сыворотки Контрольным вводили сыворотку от здорового крупного рогатого скота в дозе 0,2 миллилитра

Гипериммунная сыворотка после 13 кратною введения антигена приобрела, высокие превентивные свойства и в дозе 0,2 миллилитра защищала 86% мышей от заражения гомологичными культурами 10 серотипов Р aeruginosa Доза в 0,1 миллилитра защищала 72% мышей Наиболее высокие иммуногснные свойства показали антигены серотипов Ol, Об, 013, 019 В контроле пали все 30 мышей

Затем мы проверили как шло увеличение защитных свойств по мере иммунизации волов и как на это влияло введение левамизола

После шестикратного введения антигена, гипериммунные сыворотки защищали только 60% опытных мышей После десятикратного введения антигена защита мышей увеличивалось до 74%о, а тринадцатикратное введения антигена предотвращала гибель 86%) белых мышей Еще выше защитные свойст ва сыворотки были выражены у волов, которым вводили левамизол Они возросли до 94%

Отмечена закономерность, чем выше титры специфических антител, тем выше защитные свойства гипериммупной сыворотки Культуры серотипов Ol, Об, 013, 019 вызывали более интенсивное проявление защитных свойств сывороток крови

№ п/п серотип антигена 35 0 £ а - 1 г i¿ 6 г после введения антигена

со * 2 а ° 5 а С" h О с ГГ С 6-ти крашо! о 10-ти Kpai IIO- 13 — ги кратного

без левамизола с левамизолом

1 01 20 02 2/3 1/4 -/5 -/5

2 02 20 02 2/3 2/3 1/4 -/5

3 ОЗ 20 02 2/3 2/3 2/3 1/4

4 04 20 02 2/3 1/4 1/4 -/5

5 Об 20 02 1/4 -/5 -/5 -/5

6 010 20 02 3/2 1/4 1/4 1/4

7 011 20 02 3/2 2/3 1/4 1/4

8 013 20 02 2/3 1/4 -/5 -/5

9 018 20 02 2/3 2/3 1/4 -/5

10 019 20 02 1/4 1/4 -/5 -/5

контроль 30 Пр - - 30/- -

Всего мышей 23 20/30 13/37 7/43 3/47

% 10 40/60 26/74 14/86 6/94

Примечание в числителе к-во павших мышеи, в знаменателе к-во выживших

Выясняли сроки проявления зашитых свойств гпериммун-ной сыворотки от момента введения Группам мышей по 5 штук вводили по 0,2см1 исследуемой сыворотки без левамизола, а другим группам, также по 0,2 см1 с левамизолом Затем мышей каждой группы заражали культурой каждого из 10 серотипов 2ЬП)50 на 5, 10, 14, 16 дни после введения сыворотки В контроле мышам вводили обычную сыворотку КРС

Опытные сыворотки уже через пять дней после введения, защищали 86% зараженных мышей, через 10 дней 80%, через 14 дней - 58%, а через 16 дней - 18%

В группе мышей, которым вводили сыворотку, полученную с левамизолом, на 14 день живыми остались 66% зараженных мышей, а на 16 день - 22%

Данный опьп был повторен на морских свинках, которым гипериммунную сыворотку, вводили внутримышечно по 1см

Результаты были аналогичными с предыдущим опытом На десятый день после введения сыворотки защитные свойства проявлялись активно, сохранено 84% зверьков На четырнадцатый день они составляли лишь 62 - 68%, а на 16 день после введения сыворотки, ее защита составляла всего лишь 20 - 24%

Мы разработали и предлагаем контроль на активность сыворотки ставить на белых мышах или на морских свинках Для этого брать 5 мышей 18-20 грамм весом на каждый серошп используемою антигена, вводить внутрибрюшинно по 0,3 миллилитра готовой сыворотки и через сутки заражать их внутрибрюшинно или подкожно по 0,3 миллиарда микробных тел вирулсшного используемого штамма Учет вест и 10 суток Если выживает 80% мышей, при гибели 80% в контроле, то сыворожу счшать активной, и она проходит контроль Белых мышей можно заменить морскими свинками 250-300 грамм весом

На каждый штамм антигена брать 5 свинок, подкожно вводить им по 2 миллилитра испытуемой сыворотки, через 1 сутки заражать внутрибрушинно 2 ЬО50 каждого серо I и па Срок наблюдения 10 суток Если выжило 4 свинки из 5, при гибели в контроле 4 из 5 - сыворотку считать активной, прошедшей контроль Нами установлено, что в процессе гипериммунизации, за период в 50 дней от начала до конца опыта в крови волов на 10 % уменьшились показания гемоглобина, количеспзо эритроцитов на 5%, но возросло количество лейкоцитов па 9 5%

Уменьшилось количество эозинофилов и моноцитов, но на 18% увеличилось палочкоядерных и на 26% се1 мепюядерных лейкоцитов, в основном обеспечивающих фа! ацитоз в организме животного

Содержание общего белка сыворотки крови за период гипериммунизации возросло на 8,3%, причем у волов, которым антшен вводили с левс1мизолом это увеличение выше па 2% Произошел сдвиг в соотношении белковых фракций сыворопси доноров Содержание у - глобулинов за период гипериммунизации увеличилось на 16,4%, содержание альбуминов за экн же период уменьшилось на 17,6%

2. 5. ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГИПЕРИММУННОЙ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ПСЕВДО-МОНОЗА НА СВИНЬЯХ.

В СГ1К «Щербиновский», на СТФ№1 сразу после отъема начали болеть поросята 50 - 60 дневного возраста

Отмечали повышение температуры тела на 0,5 — 1,0 °С, иногда диарея, чаще кашель, прогрессирующее исхудание, значительный падеж (до 35%) Лечение стрептомицином, тетрациклиновыми давало низкую эффективность В лаборатории эпизоотологии КНИВИ были изолированы вирулентные культуры Р aeruginosa серогипа 02 Из больных и здоровых поросят были сформированы группы и по группам начали их лечить и профилак-тировать заболевание разными методами Лечение поросят стрептомицином и тетрациклином давало эффективность 61,5%

Лечение гипериммунной поливалентной сывороткой против псевдомоноза изготовленной на Армавирской биофабрике серия № 1 в дозе 0,3 миллилитра на килограмм веса два раза с интервалом 5 -7 дней давало эффективность 71%.

Применение гипериммунной сыворотки подкожно в дозе 0,5 смЗ/мл дважды с интервалом в 5 - 7 днейдавало эффективность 86%, а применение сыворотки по 1 смЗ/-мл эффективно в 81%. Применение гипериммунной сыворотки здоровым поросятам с профилактической целью по 0,5 смЗ на кило! рамм веса животного даже однократно обеспечило сохранность поросят на 90,6%

Установлено, что из 58% проб материалов от поросят, лечившихся сывороткой удавалось выделить Р aeiugmosa Это удавалось и у 26% проб мочи от вылечившихся поросят. Применение сыворотки не обеспечивало стерилизацию организма поросят от возбудителя болезни

В тоже время из материала павших и вынужденно убитых поросят лечившихся антибиотиками, возбудитель Р aeruginosa удавалось изолировать только в 12% случаев, а из мочи вылечившихся атнибиотиками поросят изолягы Р aeruginosa выделить не удалось

Группа к-во по- дозы и пало выздо- % эф-

животных (поросята) росят В опыте кратность сыво-ро 1 ки в мл/кг голов ровело голов фективности

Больные 62 0,3x2 18 44 71,0

Больные 64 0,5x2 9 55 86,0

Больные 63 1,0x1 12 51 81,0

Больные 26 Стрепт-мицин, тетрациклин 10 16 61,5

Здоровые 53 0,5x1 5 48 90,6

контактные

Здоровые 14 - 8 6 42,8

контактные

контроль

Второй опыт провели в ЗАО «Дружба» На СТФ№1 начались массовые аборты и мертворождения свиноматок Абортировали матки за 15-20 дней до опоросов У плодов отмечали кровоизлияние на сердце, селезенке, даже по коже, в пахах У свиноматок отмечали мертворождения Часть приплода была мертвой, а иногда мумифицированной, разложившейся У таки\ свиномаюк отмечали трудно излечимые, катарально - гнойные эндомстрп гы Часть поросят, родившихся нормальными, были слабыми, с плохим сосательным рефлексом, весом 700 - 800 грамм При лабораторных исследованиях выделяли Р aeruginosa, серо 1 ипа 02 Схема и результаты опыта сведены в таблицу № 3

Высокую эффективность 96,8% показало комбинирование^ применение супоросным свиноматкам поливалет ной сыворотки Армавирской биофабрики серии №1 и антибиотиков (стрептомицин, полимикс/Ih) за 20 - 25 дней до ожидаемо! о опороса Затем (по убывающей) была группа свиноматок, которым применяли гипериммунную сыворотку по 0,5 миллилтра на kilioi рамм веса двукратно через 7-10 дней Аборты и мертворождения у животных этих групп не pei истрировали Хороший терапевтический эффект по профилактике и лечению эндометритов (84,2%) отмстили в группе

опоросившихся свиноматок, которым применяли препарат жироформ вместе с гипериммунной сывороткой

В этом же хозяйстве при распространении заболевания на поросят группы доращивания, была проверена зффиктивность сыворотки опытной серии №1

Наиболее эффективным было применение больным поросятам сыворотки по 0,5 миллилитра на килограмм веса в комбинации с антибиотиком полимиксином - 96,3% Хорошие результаты получены при применение здоровым порося 1ам сыворотки с профилактической целью — 89% и применение больным поросятам сыворотки по 0,5 см^/кг дважды с интервалом в 5 - 7 дней - 80,1 %

ТаблицаЖЗ

Группы к-во сыво аборт ЭНДО- выздо- %эф-

свиноматок сви- ротка мертво- мет ровело фек -

нома- доза рождие риг тив-

ток кратность ности

Супорос 54 0,5x2 - 6 48 88,9

ные

Супорос 62 0,5x1 - 2 60 96,8

ные Г10ЛИ-миксин

Супоросны 48 110ЛИ- 2 9 37 77,1

контроль мик-сип ст репго-мицин

Эндомет 38 0,5x1 - 6 32 84,2

ритные жир-рм

Опоросив 36 жиро- - 1 1 25 69,4

шиеся форм

конроль

В племзаводе ЗАО«Краснодонское» Волгоградской обласш заболели поросята 2-3 месячного возраста Заболевание сопровождалось диареей, кашлем, исхуданием, иногда у порося г отмечали судороги

В лаборатории племзавода изолирована Р аеш^тоза высокой вирулентности (серотип Об)

Для-профилактики и лечения больных применили опытную поливалентную сыворотку против псевдомоноза, серии №1,

изготовленную на Армавирской биофабрике Сыворотку вводили подкожно по 0,5 мл/ кг больным поросятам двукратно через 10 дней и 1 раз здоровым Параллельно была сформирована группа больных, которых лечили антибиотиками

Лечением установили, что сыворотка предо!вращала заболевание у здоровых поросят в 96,0% При лечении явно больных поросят сывороткой эффективность составила 84,5% При лечении традиционными методами эффективность составила 46,1%

2.6. ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГИПЕРИММУННОЙ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ПСЕВДО-МОНОЗА НА ТЕЛЯТАХ.

В ООО « Атаманское» на МТФ№ I началось заболевание телят 4-15 дневного возраста Болезнь характеризовала острым течением, потерей аппетита и слабостью Температура тела повышалась до 41 °С, учащался пульс и дыхание, у некоторых появлялось слюнотечение, нервные явления, серозный ринит

Бактериологическими исследованиями подтвержден диагноз на псевдомоноз серотипа 01 Отобрали 38 больных телят разделили их на группы и начали лечить различными методами, в том числе и сывороткой, изготовленной на Армавирской биофабрике серия №1 Результаты опыта отражены в таблице № 4 Наиболее эффективным оказалось применение гипериммуннон сыворотки телятам с профилактической целью по 0,5см1 веса 2 раза с интервалом в 10 дней Из 18 телят, которым применяли сыворотку заболело только 2 и то в легкой форме, коюрые бысфо выздоровели Сохранность в группе составило 100%

Применение гипериммунной сыворожп больным телятам подкожно по 0,5 м"Укг 2 раза с интервалом 5-7 дней оказалось эффективным на 81,2 % Ниже эффективное!!» была в группе телят, которых лечили стрептомицином, полимиксипом в течение 3 -4 дней, выздоровело 8 (66,7%)

№ Группы телят к-во опыте введение сыворотки забо-тело гелят поло (елят выздоровело юлов % Эффе- тивиос- сги

доза кратность

1 Больные 16 0,5 2 16 3 13 81,2

2 Больные 12 анти- отики 12 4 8 66,7

3 Здоровые 18 0,5 2 2 - 18 100,0

4 Контроль 2 - 2 1 1 50,0

Второй опыт провели в феврале 2007 года на предприятии «Колос» ЗАО фирмы «Агрокомплекс» на МТФ № I Заболевание телят началось с признаков поражения органов дыхания и пищеварения Болели телята в возрасте 10-20 дней Температура тела повышалась до 41,3 °С Одышка, кашель, иногда пенистые истечения из носа, вялость, потеря аппетита, быстрое исхудание, у некоторых телят диарея Падеж доходил до 38%

Выделена культура Р aeruginosa, серотипа 03 Отобрали 38 больных телят в возрасте 12-15дневного возраста, разделили их на группы и начали лечшъ, сывороткой изготовленной на Армавирской биофабрике /Традиционные методами лечения

Наибольшая эффективность получена при лечении больных телят сывороткой по 0,5см1, дважды и антибиотиками - 100% Высокие результаты 91,7% получены при лечение одной сывороткой по 0,5 см1 дважды с интервалом в 5 дней

Введение сыворотки здоровым телятам с профилактической целью, предохраняло 90% поросят это на 20% выше, чем применение одних антибиотиков

3. выводы

1 Инфицированность свиней в крае возбудителем псевдо-моноза составляет 8,7 - 13,1 %>, крупного рогатою скота - 9,8 - 12,9 %, птиц 10,3% - 11,1%) Такая эпизоотическая стуация способствует проявлению как самостоятельному заболеванию молодняка, так и абортам, мертворождениям, ММА у маток, высокой контаминации кормов, а это в свою очередь - массовым осложнениям при отравленях и незаразных заболеванях

2 а) Выделенные из различных объектв изоляты Р aeruginosa были высоковирулентными - 54,3%, вирулентными - 21,0%), слабовирулентными - 16,1%>, и авирулентными - 8,6% Наибольшей вирулентностью обладали культуры выделенные от свиней - 99,9%, и от крупного рогатого скота - 94,4%

б) Серологические исследования показали, что в крае животных инфицируют 14 серотипов Р aeruginosa У свиней 11, у крупного рогатого скота - 9 Наиболее часто выделячи изоляты от данных видов животных следующих серотипов 01, 02, ОЗ, 04,Об, 010,011,013,018,019

3 Используемые 10 штаммов Р aeruginosa десяти серотипов для получения гипериммунных поливалентных сывороток против псевдомоноза животных проявляли высокие антигенные и иммуногенные свойства В процессе гипериммупизации они способствовали образованию специфических атитсл в титрах 1 2515 ±123 у кроликов, и 1 • 1820±68,36 у волов, а также стимулировали формирование защитных свойств сывороток крови у кроликов и волов

4 Защитные свойства гипериммунных поливалентных сывороток против псевдомоноза четко проявлялись при введении лабораторным животным с последующим их заражением гомологичными пламмами Сохранность последних составляла от 90 до 100%

5 Введение кроликам и волам в период гипериммунизации иммуностимулятора левамизола способствовало более интенсивному накоплению специфических антител и повышению превентивных свойств сывороток на 18 - 29%

6. Гипериммунизация волов антигенами Р aeruginosa вызывала в организме последних существенную перестройку отмечено уменьшение эритроцитов на 5 % и гемоглобина на 10%, увеличи-

лось количество лейкоцитов на 9,5% и особенно сстмепгоядерныч и палочкоядерных на 26% Увеличилось содержание общего белка сыворотки крови на 8,3%, содержание у - глобулинов на 16,4%, а содержание альбуминов снизилось на 17,6%

7 а) Применение гипериммунной поливалентной сыворотки при энзоотиях псевдомоноза поросят профилактировало заболевание в 89,0 - 96,0 % , излечивало больных в 80,1 - 86,0 %, ч го на 24,0 -30,4 % выше традиционной терапии антибиотиками. У свиноматок применение сыворотки значительно сокращало аборты, мертворож-дения и заболевание эндометритами

б) Применение гипериммунной пол и вален i ной сыворотки телятам при энзоотиях псевдомоноза профилактировало заболевание на 90,0 - 100,0 %, при лечении больных показало эффективность 81,2-91,7%

в) Профилактическая и терапевтическая эффективность сыворотки повышалась на 8-20 %при комбинированном применении ее с антибиотиками (полимиксип, имрациклин)

8 Высокая терапевтическая эффективность сыворотки проявлялась до 10 дня, затем начинала снижаться, па 14 день составляла 62 - 68%, а к 16 дню всего 20 - 24%

9 Общая экономическая эффективность от применения гипериммунной поливалентной сыворотки при энзоотиях псевдомоноза поросят и телят составила 7 рублей на кажцый вложенный рубль

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Отобраны по антигенным и иммуногепным свойствам культуры Р aeruginosa Юсеротипов наиболее часто выделяемых у сельскохозяйственных животных для гипериммунизации волов с целыо получения в производственных условиях поливалентной сыворотки против псевдомоноза

2 Разработана и испытана технология промышленного производства и методы контроля гипериммунной поливалентной сыворотки против псевдомоноза на волах

3 Подготовлена Н1Д тта гипериммунную поливалентную сыворотку против псевдомоноза животных

4 Разработана инструкция по применению i ипериммунной сыворотки против псевдомоноза с профилактической и лечебной целыо для поросят и телят при знзоотиях псевдомоноза

5.СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Дубровин И И Вопросы опизоотоло! пп псевдомоноза сельскохозяйственных животных в Краснодарском крае / Васильев А К , Болоцкий И А , Семенцов В И , Пруцаков С (3 , Дубровин ИИ// Материалы международной научно-практической конференции "Ветеринарна медицина-2005 сучасний стан та амуальж проблеми забезпеченнл ветеринарного благополуччя гварппппц!ва"„ / Васильев А К , Болоцкий И А , Семенцов В И , Пруцаков С В , Дубровин И И , Харыв, 2005, с 198 - 202

2. Дубровин И И Экспериментальное получение и испытание эффективности гипериммунной сыворотки против псевдомоноза животных / Пруцаков С В , Дубровин И И , Болоцкий И А , Семенцов В И , Васильев А К И А , Семенцов В И , Васильев А К //Материалы международной научно-практической конференции "Профилактика и меры борьбы с лейкозом крупнот рогатого скота в Российской Федерации", Екатеринбург, 2005., ар 192 -196

3 Дубровин И И Испытание гипериммунных сывороток при псевдомонозе сельскохозяйственных живо 1 ных /Дубровин И И //Материалы 7 региональной научно - практической конференции молодых ученых « Научное обеспечение аг ропромышленного комплекса»Краснодар, 8-9 декабря 2005 г ар 204 -205

4 Дубровин И И Эпизоотология псевдомоноза животных в России и южном федеральном округе / Пруцаков С В , Семенцов

В И , Болоцкий И А , Васильев А К , Дубровин И И // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию ГНУ Краснодарского НИВИ «Актуальные проблемы ветеринарии в совреме! шых условиях» г Краснодар, 2006, стр 204 - 207

5 Дубровин И И Изыскание методов специфической терапии животных, больных псевдомонозом /Дубровин И И , Болоцкий И А , Семенцов В И , Пруцаков С В , Васильев А К , //Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию ГНУ Краснодарского 11ИВИ «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях» г Краснодар, стр 137-139

6 Дубровин И И Распространение псевдомоноза свиней и специфическая терапия приданюм заболевании /Болоцкий И А , Васильев А К , Дубровин И И , Семенцов В И , Пруцаков С В // Свиноводство -2007 -№3

Полписано в печать 27 04 2007 г. Формат 60x84 ^

Бумага офсетная Офсетная печать

Печ л 1 Заказ №257 Тираж 100 экз

Отпечатано в типографии КубГАУ 350044, г Краснодар, ул Калинина, 13

 
 

Оглавление диссертации Дубровин, Иван Игоревич :: 2007 :: Краснодар

 
 

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Дубровин, Иван Игоревич, автореферат

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка, получение и применение поливалентной сыворотки против псевдомоноза животных"

 
 

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2007 года, Дубровин, Иван Игоревич