Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Молекулярно-генетический анализ классов I и II главного комплекса гистосовместимости в связи с устойчивостью и восприимчивостью к гемобластозам крупного рогатого скота айрширской породы

Министерство сельского хозяйства и продовольствия Лп Российской Федерации

Го 0 " Московская академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина

' Б ЦЮП 1-998

На правах рукописи

Карамышева Елена Евгеньевна

МОЛЕНУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛАССОВ I И II ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ В СВЯЗИ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ И ВОСПРИИМЧИВОСТЬЮ К ГЕМОБЛАСТОЗАМ НРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА АЙРШИРСКОЙ ПОРОДЫ

16.00.02. - патология, онкология, морфология 06.02.01. - разведение, генетика, селекция и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в Московской государственной Академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, в лаборатории по изучению гемобластозов животных и иммуномодуля-торов и на базе лаборатории сравнительной генетики животных Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Научные руководители:

академик РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор Шишков В.П. кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Орлова А.Р.

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук Гулюкин М.И. Доктор биологических наук, профессор Шнхов И.Я.

Ведущая организация - Московский государственный

университет прикладной биотехнологии

Защита диссертации состоится » ИЮ/СлР 1998 г. в « » на заседании диссертационного совета Д 120.36.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Московской государственной Академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23, тел. 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан «

» 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного Совета:

Слесаренко Н.А.

1. Общая характеристика работы.

1.1. Актуальность темы. Гемобластозы сельскохозяйственных животных представляют актуальную проблему современной науки и имеют общебиологическое, медико-ветеринарное, социальное и народнохозяйственное значение.

Заболевание наносит большой экономический ущерб народному хозяйству (ограничения реализации племенного молодняка, утрата генофонда высокопродуктивных животных и недоброкачественная продукция). Установлено, что основным этиологическим фактором лейкоза является вирус лейкоза крупного рогатого скота (BJI КРС). Изучены структура, химические, биологические, иммунологические свойства данного вируса, найден метод его культивирования в лабораторных и промышленных условиях. Инфицированность животного не всегда приводит к развитию заболевания. Для этого необходимо определенное состояние иммунной системы животного и его генетическая восприимчивость к заболеванию.

Разработка селекционно-генетических подходов к оздоровлению стад животных в отношении лейкоза включает изучение ассоциативных связей антигенов Главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота (Bovine leukocyte anligens-BoLA) с устойчивостью и восприимчивостью к гемобластозам. Анализ литературных данных показывает, что ассоциация между восприимчивостью и маркерами BoLA к одной и той же болезни у разных пород животных различны, что может быть обусловлено плейотропным эффектом генов, а также распространением различных гаплотипои BoLA.

Изучение нуклеотидных последовательностей генов класса II BoLA-системы у крупного рогатого скота позволило описать аллели гена DRB3 (методом полимеразной цепной реакции с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов) и выявить аллели, ответственные за устойчивость и восприимчивость к лейкозу. Особенно актуальна задача использования информации о ВоЬА-фенотипе каждого животного для установления интегральной оценки его иммуногенети-ческого статуса и классификации животных по группам «устойчивых» или «восприимчивых » к лейкозу крупного рогатого скота. Поиск генетических маркеров у больных и здоровых животных приобретает практическое значение для разработки селекционно-генетических методов борьбы с лейкозами и создания здоровых стад.

1.2. Цель и задачи исследования.

1. На основе гематологических, вирусологических и патоморфологических исследований выделить группы здоровых, инфицированных ВЛ КРС и больных лейкозом животных айрширской породы для молекулярно-генетического анализа классов I и II Главного комплекса гистосовместимости в связи с устойчивостью и восприимчивостью к гемобластозам крупного рогатого скота.

2. Охарактеризовать здоровых, инфицированных ВЛ КРС и больных лейкозом животных айрширской породы по антигенам класса I (ВоЬА-А).

3. Получить интегральную оценку влияния конкретного ВоЬА-А антигена, присутствующего в фенотипах животных айрширской породы, на устойчивость и восприимчивость к лейкозу.

4. Провести патоморфологические исследования в группах больных лейкозом, инфицированных ВЛ КРС и здоровых животных айрширской породы для подтверждения диагноза на лейкоз.

5. Охарактеризовать группы здоровых, инфицированных В Л КРС и больных животных айрширской породы по разнообразию аллелей гена ВоЬА-ББЯЗЗ и их частотам.

6. Выявить спектр аллелей гена ВоЬА-ШШЗ, ответственных за устойчивость и восприимчивость к лейкозу в айрширской породе.

1.3. Научная новнзна работы. Впервые дана характеристика особенностей распространения серологически определяемых антигенов гистосовместимости ВоЬА-А (класса I) у больных, вирусоносите-лей и здоровых животных айрширской породы. Методом полимераз-ной цепной реакции с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) проведен молекулярно-генетический анализ аллелей гена ВоЬА-ОИВЗ (класса II) в связи с восприимчивостью и устойчивостью к лейкозам в выборках крупного рогатого скота айрширской породы.

Для айрширской породы на основе анализа антигенов ВоЬА-А разработан метод индивидуальной интегральной оценки иммуногене-тического статуса животных (методом статусметрии), который позволяет контролировать риск заболеваемости лейкозами для каждого животного.

1.4. Практическая ценность работы. Получены новые данные о генетическом полиморфизме серологически определяемых антигенов класса I ВоЬА-системы в группах больных, вирусоносителей и

здоровых животных айрширской породы крупного рогатого скота. Индивидуально для каждого животного айрширской породы по антигенам ВоЬА-А (методом статусметрии) получена интегральная оценка его иммуногенетического статуса. Выявлены особенности распределения аллелей гена ВоЬА-БКВЗ у айрширской породы крупного рогатого скота, а также охарактеризован спектр аллелей, влияющих на устойчивость и чувствительность к лейкозу, что является важным вкладом в разработку проблемы "ВоЬА и болезни".

Полученные методом статусметрии данные о резистентности и предрасположенности к лейкозу животных, обладающих определенным набором антигенов ВоЬА-А, позволяют выделить группу животных, предрасположенных к развитию лейкозного процесса с целью исключения их из воспроизводства стада.

Определение генотипов животных относительно устойчивых и восприимчивых к лейкозу аллелей гена Во1>А-011ВЗ ставит борьбу с лейкозом на новый этап развития, то есть позволяет формировать устойчивые к данному заболеванию стада, а также продавать и покупать здоровое племенное поголовье.

1.5. Научные положения, выносимые на защиту.

1. Особенности генетического полиморфизма серологически определяемых антигенов ВоЬА-А в группах здоровых, инфицированных и больных лейкозом животных айрширской породы.

2. Молекулярно-генетический анализ аллелей гена ВоЬА-1ЖВЗ в связи с устойчивостью и восприимчивостью крупного рогатого скота айрширской породы к гемобластозам.

3. Интегральная оценка иммуногенетического статуса здоровых и больных гемобластозами крупного рогатого скота животных айрширской породы.

4. Ассоциативная связь антигенов ВоЬА-А и аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ с гемобластозами крупного рогатого скота.

5. Патоморфологическне исследования в группах больных, ви-русоносителей и здоровых животных айрширской породы в связи с устойчивостью и восприимчивостью к гемобластозам крупного рогатого скота по антигенам ВоЬА-А и аллелям гена Во1.А-1ЖВЗ.

1.6. Апробация работы. Основные материалы работы доложены на научно-практической конференции "Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с лейкозом сельскохозяйственных животных и птиц" (Москва, 1997), на международных конференциях:

«Агробиотехнология растений и животных» (Киев, 1997), «ДНК-технологии» (Киев, 1997) и «Биотехнология животных» (Китай, Пекин, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

1.7. Объем и струк^ра диссертации. Диссертация изложена на 189 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы (122 отечествешшгх и 214 зарубежных источников) и приложения. Работа содержит 23 таблиц и иллюстрирована 22 рисунками и 8 диаграммами.

2. Материалы и методы исследования.

Объектом исследований являлись коровы айрширской породы ГППЗ «Смены» Сергиев Посадского района Московской области в возрасте от 4 до 12 лет и средней продуктивностью 6237 кг (п=129).

Гематологические и патоморфологические исследования проводили по общепринятым методикам, а серологические исследования - в реакции иммунодиффузии (РИД).

Материалом для исследования антигенов BoLA-A являлись чистые лимфоциты, выделенные из крови крупного рогатого скота, в двухступенчатом микролимфоцитотоксическом тесте по Kissmeyer-Nielson (1970) в модификации для крупного рогатого скота (Shmid D.O. et al., 1972, Слепченко А.Р., 1979), с использованием 62 мои о- и олигоспецифических антилимфоцитарных сывороток (МГАВМиБ).

Материалом для исследования аллелей гена BoLA-DRB3 служили препараты геномной ДНК, выделенные из цельной крови с использованием NucleoS-cop6eHTa ("Биоком", г. Москва).

Аллели экзона 2 гена BoLA-DRB3 изучали методом полимераз-ной цепной реакции с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) (Van Eijk et al., 1992), с модификациями (Сулимова Г.Е. и др., 1995), с использованием олигонуклеотидных праймеров HL030 (5'-TCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-3'), HL031 (5'-ATTCGCGCTCACCTCGCCGCT-3') и HL032 (5'-TCGCCGCTGCA CAGTGAAACTCTC-3'). Для амплификации экзона 2 гена BoLA-DRB3 использовали метод как двухэтапной ПЦР (с праймерами HL030, HL031 и HL032), так и одноэтапной (с праймерами IIL030 и HL032). В обоих случаях конечные продукты реакции представлены

одним фрагментом размером 284 и.н., исходя из нуклеотидной последовательности гена.

Рестрикцию ДНК эндонуклеазами Rsal, НаеШ и XhoII ("Бион", г. Москва) осуществляли при оптимальных для каждого фермента условиях: температуре и отжиге. Электрофорез проводили в 2% - ном агарозном, 6% - ном или 9% - ном полиакриламидном гелях и трисбо-ратном буфере (Маниатис и др., 1984).

Полимеразную цепную реакцию с аллелъспег^ифическгши прай-мерами (ER-17 и VD-19) использовали в спорных случаях для идентификации устойчивых (DRB3.2*23 и *28) и восприимчивых к лейкозу (DRB3.2*8, *16, *22 и *24) аллелей гена BoLA-DRB3.2 (Xu et al., 1993). Праймер ER-17 (5'-GCCCGCCTCTCCTCCAG-3') взаимодействует с устойчивыми по отношению к лейкозу аллелями, несущими общую нуклеотидную последовательность GIu-Arg в 70-71 положении белковой молекулы, а праймер VD-19 (5'-GTCTGCAGTACGTGTCCA С-3') взаимодействует с чувствительными адлслями, также имеющими общие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислоты: Val-Asp-Thr-Tyr (Val) в 75-78 положении.

Результаты исследований обрабатывали статистическими (Jla-кин Г.Ф., 1980; Зайцев Г.Н., 1984) и статусметрическими методами (Разоренов Г.И., Поддубский Г.А., 1985).

3. Результаты исследований.

3.1. Характеристика исследованных животных.

В изученной выборке айрширского скота диагноз на лейкоз ставили согласно методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденным 27 июня 1985 г., с дополнениями от 31 октября 1985 г. (табл. 1).

Таблица 1.

Гематологические показатели в исследованных группах животных айрширской породы.

Группа жипотпых п ; Лейкоциты (абс.) Лимфоциты (%):

Х + т - ; ■ S . Cv - - Х+т S . Cv."

; Здоровые : 40 6.7 ±0.28 2.16 32.24 58.2+1.6 12.33 21.19

Вирусттос. 31 7.8 + 0.5 2.62 33.6 68.5 ±2.41 13.43 19.61

Больные 58 18.8± 0.99 6.24 33.2 83.4 + 0.99 6.64 7.96

Патоморфологические исследования проводили на 14 коровах ПШЗ "Смена" убитых на мясокомбинате города Сергиев Посад Мое-

ковской области. Материал обрабатывали на кафедре патологической анатомии и физиологии имени В.М. Коропова. Животных айрширской породы, по ранее проведенным клинико-гематологическим и серологическим исследованиям, разделили на три группы: здоровые - 1, вирусоносители - 5, больные - 8. У 8 больных коров в органах и тканях наблюдали изменения, характерные для лейкоза. Диагноз был подтвержден гистологическими методами. У виру-соносителей и здоровых животных клинических проявлений лейкоза не обнаружили. Патоморфологических изменений характерных для лейкоза у животных здоровой и инфицированной групп не обнаружили.

На основании клинических, гематологических, серологических и патоморфологических исследований выборку айрширского скота (п=129) разделили на три группы: здоровые (п=58), инфицированные вирусом лейкоза крупного рогатого скота (п=31) и больные лейкозом (п=40) животные.

3.2. Особенности распространения ВоЬА-А антигенов в популяции айрширской породы в связи с заболеваемостью лейкозом крупного рогатого скота.

Распределение антигенов ВоЬА-А (класса I) в выборке айрширского скота (п=129) приведено в таблице 2. Сравнение спектров антигенов ВоЬА-А у восприимчивых и резистентных животных традиционными статистическими методами выявило положительную связь с лейкозом для антигенов М8ИА21 (БЖ=2.842; х 2 =5.248; Р<0.05; ¿>=0.260) и М8ЫА1 (М1=2.320; ^ 2=4.069; Р<0.05; ¿=0.310) и с устойчивостью к лейкозу крупного рогатого скота для антигена МБиА7 (№=0.073; / 2 =9.458; Р<0.01; ¿=-0.320), который имел достоверно более низкую частоту встречаемости в группе животных больных лейкозом по сравнению со здоровыми животными (табл. 2). Следовательно, антиген М81М7 коррелирует с устойчивостью, а антигены М8иА1 и МЯиА21 - с восприимчивостью к лейкозу.

Предрасположешюсть к заболеванию имеет строго индивидуальную иммунологическую основу и определяется персональным набором ВоЬА-А антигенов для каждого животного. Теоретическую основу нового подхода оценки восприимчивости или устойчивости животного к заболеванию представляет собой статусметрия. В результате обработки данных типирования антигенов класса I (ВоЬА-А) у айрширского скота методом статусметрии получили дискриминант-ную модель в виде полинома (Х)\

Z=-3.662+YV20,7.33(MKj2-8.368+\V44,9.662+A2*6.940 -^5'4.794+A7'7.922-.4S'9.380+AU«6.662+A13'18.211+A17«6.492

-уШ-14.464

Таблица 2

Сравнительная характеристика антигенов BoLA-A по степени влияния на заболеваемость лейкозом (п=129).

Антн- Частота Крите- Сте- Этноло- Атрибу-

гены Антигена, рий со- пень гическая тивный

f ответст- риска фракция риск

вия

Во LA больные п=40 .здоровые п=58 г2. RR EF 5

W2 0.200 0.172 0.120 1.203 0.017 0.034

W6 0.200 0.241 0.233 0.787 -0.011 -0.054

\V8 0.225 0.138 1.252 1.813 0.038 0.100

W21 0.100 0.172 1.014 0.535 -0 047 -0.087

W10 0.175 0.276 1.341 0.556 -0.097 -0.140

W20 0.125 0.190 0.724 0.609 -0.045 -0.080

W31 0.050 0.130 0.902 0.352 -0.038 -0.092

W44 0.100 0.172 1.014 0.535 -0.046 -0.087

W.14 0.050 0.086 0.468 0.559 -0.038 -0.040

W19 0.200 0.121 1.149 1.816 0.062 -0.090

W1S 0.450 0.397 0.278 1.243 0.053 0.088

Al 0.550 0.345 4.069* 2.320 0.225 0.310

Л 2 0.050 0.155 2.628 0.287 -0.075 -0.120

АЗ 0.250 0.328 0.684 0.683 -0.064 -0.120

А6 0 100 0.224 2.544 0.385 -0.117 -0.160

- ■ А-7 0.025 0.259 9.458** 0.073 -0.154 -0.320

А 8 0.300 0.155 2.949 2.336 0.079 0.170

А 9 0.125 0.224 1.552 0.495 -0.055 -0.130

AI0 0.225 0.207 0.047 1.112 -0.020 0.023

АН 0 375 0.328 0.235 1 229 0.040 0.070

А12 0.325 0.310 0.024 1.072 -0.012 0.022

А13 0.125 0.224 1.552 0.495 -0.036 -0.130

А14 0.150 0.138 0.028 1.102 0.030 0.014

А15 0.525 0.500 0.059 1.105 0.042 0.050

А16 0.150 0.172 0.087 0.850 -0.034 -0.027

А17 0.175 0.224 0.352 0.735 -0.035 -0.063

AIS 0.250 0.379 1.800 0.546 -0.052 -0.210

А19 0.250 0.276 0.081 0.874 -0.042 -0.036

А21 0.400 0.190 5.248* 2.842 0.211 0.260

-А22 0.150 0.190 0.260 0.752 -0.065 -0.050

А23 0.075 0.172 1.953 0.390 -0.084 -0.120

А24 0.550 0.397 2.245 1.856 0.194 0.250

Примечание: *Р<0.05 (;к2=3.841). **Р<0.01 (/2=6.635)

Дискриминантная модель позволяет учесть влияние

конкретного антигена в фенотипе животного айрширской породы на его индивидуальную устойчивость или чувствительность к лейкозу. Для каждого животного айрширской породы получили индивидуальную интегральную оценку (Z) его предрасположенности или устойчивости к лейкозу крупного рогатого скота:

если Z > - 0.0502 - животное устойчиво к гемобластозам; если Z < - 1.0201 - предрасположено к гемобластозам; если - 1.0201<Z< - 0.0502 - неопределенное решение. В формулу модели по результатам статусметрической обработки вошли 11 информативных антигенов. Антигены W31, A3, А8 и А21 являются неблагоприятными, то есть их присутствие в фенотипе животного указывает на его предрасположенность к лейкозу, а антигены W20, W44, А2, А7, All, А13 и А17 - благоприятными, наличие которых влияет на резистентность коров к лейкозу (табл. 3). Антиген MSUA21 является наиболее неблагоприятным с точки зрения устойчивости к гемобластозам.

Таблица 3

Степень влияния антигенов BoLA-A на развитие лейкозного процесса у коров айрширской породы.

Частота антигена в группах Ассоциативные связи

животных

Анти- боль- здо- ВИ- Об- мезду антигенами BoLA и бо-

гены ные ров. РУ^ щая лезиью

N=40 N=58 N=31 • N=129

BoLA f f '.? f f RR кк И Bi

. •■ 1 - . it Благоприятные антигены" . -. .'- й- -

W20 ' 0.125 0.190 0.161 0.163 0.609 -0.045 0.724 7.330

W44 0.100 0.172 0.129 0.140 0.535 -0.046 1.014 9.662

■ -А2 0.550 0.155 0.129 0.116 0.287 -0.075 2.628 6.940

А7 - - 0.025 0.259 0.129 0.155 0.073 -0.154 9.458 7.922

All 0.375 0.328 0.355 0.349 1.229 0.040 0.235 6.662

А13 0.125 0.224 0.065 0.155 0.495 -0.036 1.552 18.211

"Неблагоприятные антигены"

W31 0.050 0.130 0.097 0.085 0.352 -0.038 0.902 -8.368

A3 0.250 0.328 0.290 0.295 0.683 -0.064 0.684 -4.794

А8 0.300 0.155 0.323 0.240 2.336 0.079 2.949 -9.380

А21 • 0.400 0.190 0.129 0.240 2.842 0.211 5.248 -14.464

Примечание: обозначения см. табл.2. Ш - сила влияния антигена на устойчивость и восприимчивость к лейкозу.

З.З.ГГЦР-ПДРФ типирование больных лейкозом, вирусоносите-лей и здоровых животных айрширской породы по локусу RoLA - DRB3.

3.3.1. Анализ рестрикциопного полиморфизма экзона 2 гена BoLA-DRB3. Экзон 2 гена BoLA-DRB3 кодирует участок белковой молекулы, ответственный за узнавание антигена, и представляет собой высокополиморфную область гена BoLA-DRB3. Распределение сайтов рестрикции эндонуклеаз Rsa I, Нае III, Xho II в экзоне 2 у ал-лельных вариантов гена BoLA-DRB3 различно, что приводит к образованию разных наборов рестриктных фрагментов, отличающихся по количеству и их длине (ДНК-паттернов). Из 30 ранее описанных аллелей (Van Eijk et al., 1992) в выборке айрширского скота (п=129) идентифицировано 18 аллелей (табл. 4), среди которых широко распространены BoLA-DRB3. 2*7 (0.376), *28 (0.136), *8 (0.112),*10 (0.093) и *24 (0.054). Аллель BoLA- DRB3.2*7 особенно широко представлен у вирусоносителей (0.548).

3.3.2. Анализ аллелей гена BoLA-DRB3 ассоциированных с устойчивостью и чувствительностью к лейкозу крупного рогатого скота. Из 18 аллелей гена BoLA-DRB3, выявленных в выборке айрширского скота, два аллеля определяют устойчивость к лейкозу (BoLA-DRB3. 2 *23 и *28) и четыре (BoLA-DRB3. 2*8,*16, *22 и *24) связаны с восприимчивостью к лейкозу (табл. 4). Остальные аллели относятся к нейтральным аллелям (Van Eijk et al., 1992 и Xu et al., 1993). В популяции айрширского скота не отмечен аллель *11, ответственный за устойчивость к гемобластозам крупного рогатого скота. Частоты аллелей, которые были описаны как аллели, обуславливающие чувствительность к лейкозу (*8 и *24), в выборке животных больных лейкозом присутствуют в 1.4 раза чаще (0.163 и 0.088, соответственно), чем в выборке здоровых животных (0.103 и 0.043).

В группах больных лейкозом, вирусоносителей и здоровых животных айрширской породы исследованы генотипы по локусу BoLA-DRB3. Наиболее часто в группе вирусоносителей встречается генотип *7/*28 (45.3%), в то время как у больных и здоровых он присутствует у отдельных коров (7.5% и 1.7%, соответственно). Генотип *7/*7 широко представлен в группе вирусоносителей (25.8%) и в равной мере у больных и здоровых животных (около 15%). У больных животных наиболее распространен генотип *8/*10 (17.5%), и генотип *7/*10 с

частотой 12.1% встречается только у здоровых животных. Генотип *7/*26 присутствует у больных коров с частотой 12.5%.

Таблица 4

Распределение аллелей ВоЬА-ОКВЗ в группах больных, вирусоносителей и здоровых животных айрширской породы.

Аллс.тп ДНК-ria ггерны Группы животных Общая

больные здоровые вирусоно- популя-

BoLA- N= =40 N=58 сителн. ции

DRB3* =31 =129

Rsal | HacIII n 1 P " I p n. | P л.I P

Восприимчивые . >

8 f a 13 0,163 12 0.103 4 0.065 29 0.112

.22 m a - - 4 0.035 - - 4 0.016

24 . n b 7 0.088 5 0.043 2 0.032 14 0.054

Устойчивые

23 n a 4 0.050 1 0.009 2 0.032 7 0.027

28 0 b 7 0.088 13 0.112 15 0.243 35 0.136

Нейтральные

2 ■ b a - 8 0.069 - - 8 0.030

' 3 b b 4 0.050 2 0.017 - - 6 0.023

''': 7 . e с 22 0.275 41 0.354 34 0.548 97 0.376

10 f a 10 0.125 12 0.103 2 0.032 24 0.093

12 h a - 1 0.009 - - 1 0.004

13 h a - 1 0.009 - - 1 0.004

- 14 h b 1 0.012 - - - - 1 0.004

15 i a 1 0.012 - - 1 0.016 2 0.008

18 1 f - 3 0.026 - - 3 0.012

20 1 b 2 0.025 2 0.017 - - 4 0.016

.21 1 e 2 0.025 5 0.043 1 0.016 8 0.030

26 0 b 6 0.075 4 0.034 1 0.016 11 0.043

29. p с 1 0.012 2 0.017 - - 3 0.012

Сумма 80 116 62 258

Примечание: Номенклатура Rsal- и НаеШ-паттернов и аллелей гена BoLA-DRB3 дана в соответствии с приведенной в статье Van Eijk et al. (1992),

В связи с присутствием в выборке большого количества разных генотипов, их объединили в группы, в которых один из аллелей был следующим: *2, * 10, *3, *7, *8 и *28 (диаграмма 1). Генотипы, в которых присутствует аллель *7, у вирусоносителей составляет 0.843, а у здоровых и больных животных - 0.534 и 0.401, соответственно. У вирусоносителей широко распространены генотипы с аллелем *28 (0.490). Аллель *8 чаще обнаруживали в генотипах больных коров (0.351) по сравнению с вирусоносителями и здоровыми животными (0.132 и 0.173, соответственно).

и

Диаграмма 1. Объединенные частоты генотипов в группах больных, вирусоноснтелей и здоровых животных айрпнфской породы (п=129).

,. 1"';! О Больные (п-40) ''} □Вирусомосители (п~31) , ■■ —

и Здоровые (и—58) |. ..... — •.. -

*2 *ю *3 *7 *8

Аллели, входящие в генотипы гена ВоЬА-ШШЗ

Анализ генотипов, определяющих различную чувствительность животных к гемобластозам в группах больных, внрусоносителей и здоровых показал, что у больных и здоровых коров чаще встречаются генотипы с нейтральными аллелями (42.5% и 48.3%, соответственно). В то время как у внрусоносителей наиболее распространен генотип с устойчивыми и нейтральными аллелями (48.5%) (табл. 4).

Таблица 4

Частоты генотипов, определяющих различную чувствительность к лейкозу в группах больных, внрусоносителей и здоровых животных айрширской породы.

Группы животных

Генотип больные здоровые внруеоносителн

% % %

ЧЛ1 2.5 - 3.2

Ч/У 15.0 8.8 6.4

Ч/Н 30.0 32.3 6.5

У/11 7.5 10.6 48.5

У/У 2.5 - -

н/н 42.5 48.3 35.4

Примечание: Ч - чувствительный, У - устойчивый, Н — нейтральный аллели.

13 выборке айрширского скота было установлено, какие генотипы, и в каком статусе присутствуют в группах, различающихся по своему статусу в отношении лейкоза. Показано, что у больных животных чаще всего встречается генотип *8/*10 (ч/н) (17.5%), *7/*7 (н/н) (15%), *7/*26 (12.5%) и *8/*28 (ч/у) (7.3%), а генотипы *3/*3 (н/н) и

*23/*24 (ч/у) присутствуют в равной мере (5%). В здоровой группе наблюдается более равномерное распределение генотипов, среди которых наиболее распространены генотипы *7/*7 (н/н) (15.5%) и *7/*10 (12.3%). Необходимо отметить, что в данной группе встречаются единичные генотипы, которых нет в других группах: *2/*2, *2/*7, *2/*18, *2/*21, *12/*13, *3/*7, *2/*22, *3/*8, *7/*8, *8/*18, *10/*28, *26/*28, *3/*28 и *8/*22. В группе инфицировагаых животных распространены генотипы *7/*28 (н/у) (43.5%) и *7/*7(н/н) (25.8%). Генотип *8/*10 присутствует в больной лейкозом фуппе животных, что подтверждает влияние *8 аллеля на чувствительность к лейкозу. Широкое распространение у здоровых животных генотипов *7/*10 и *7/*7 свидетельствует о том, что в популяции айрширского скота аллель *7 выступает в роли кандидата на «устойчивый» к лейкозу аллель.

3.3.3. Анализ аллелей гена ВоЬА-ПЯВЗ ассоциированных с устойчивость и чувствительностью к лейкозу крупного рогатого скота у коров в возрасте 5 лет и старше. В связи с тем, что клинические признаки лейкоза наиболее часто проявляются у коров в 5 - 6 - нем возрасте, ввели возрастное ограничение. Для определения частот аллелей гена ВоЪА-БКВЗ использовали коров старше 5 лет. Распределение частот аллелей гена ВоЬА-ГЖВЗ в этой выборке (п=95) было аналогично общей популяции (п=129). Наиболее часто встречающимися в популяции айрширского скота в возрасте старше 5 лет являются аллели ВоЬА-В11ВЗ. 2 *7 (0.355) и *28 (0.128), а редкими - *10, *12, *13 и 14 (0.004). Аллель ВоЬА-Б1Ш3.2 *8 чаще отмечен у больных (0.154), чем у здоровых коров (0.136).

3.3.4. Определение аллельных вариантов гена ВоЬА-ОКВЗ, ассоциирующихся с устойчивостью или чувствительностью к лейкозу, с помощью аллельспецифичпой полимеразной цепной реакции. Методом ПЦР с аллельспецифичными праймерами (ЕК-17 и \D-19) были ти-пированы 112 проб ДНК коров айрширской породы. Проведение эксперимента ставило цель проследить присутствие мотивов С1и-Аг§ в положениях 70-71 в последовательностях аллелей, обуславливающих устойчивость к лейкозу и присутствие мотивов Уа1-Азр-ТЬг-Туг в положениях 75-82 в аллелях, обуславливающих чувствительность к лейкозу (Хи е! а1., 1993). В популяции айрширской породы крупного рогатого скота выявлены аллели гена ВоЬА-1ЖВ3.2*8, *22 и *24, ответственные за чувствительность к лейкозу и аллели *23 и *28 - за ус-

тойчивость. В ходе работы был обнаружен положительный ответ на чувствительность к лейкозу аллеля BoLA-DRB3. 2 *7 и *3 в выборке айрширского скота. Полученный результат предполагает неоднородную структуру *7 аллеля. Для подтверждения гетерогенности этого аллеля на основе тщательного семейного анализа из больной группы выделили одно животное (проба 3), а из группы вирусопосителей два животных (пробы 1 и 2). Генотипы исследованных животных, имели в своем составе два аллеля DRB3.2*7. Анализ их нуклеотидных последовательностей (Sanger F. et al., 1977) выявил в первой пробе нуклеотидные замены в кодонах 21, 23, 36, 38, 43 и 61 по сравнению с ранее описанной последовательностью аллеля *7 (Sigurdardoltir S. et al., 1991а).

3.3.5. Анализ антигенов BoLA-A и аллелей гена DRB3 у айрширского скота. В результате анализа антигенов BoLA-A и аллелей гена BoLA-DRB3 у айрширского скота выявлена группа здоровых животных, имеющих высокий иммуногенетический статус на основе вычисления интегральной оценки (Z). Фенотипы здоровых животных содержат «благоприятные» к гемобластозам BoLA-A антигены, и их влияние не перекрывается «неблагоприятными» BoLA-A антигенами (W31, MSUA3, MSUA8 и MSUA21). В генотипах данной группы не отмечены «чувствительные» аллели. Следовательно, данные животные являются устойчивыми к гемобластозам крупного рогатого скота и могут быть рекомендованы для проведения селекции.

3.6. Оценка уровня гетерозиготности у айрширского скота.

В проведенной работе изучили гетерозиготность в популяции айрширского (п=129) и черно-пестрого скота (п=104) (табл. 6).

Таблица 6

Гетерозиготность в группах больных, вирусоносителей и здоровых животных айрширской (п=129) и черно-пестрой (п=104) пород.

Группы Животных Гете Наблюдаемая юзиготность Ожидаемая

Айрширская порода (п=129) 0.770 "- 0.810

Больные (п=40) Вирусоноситеяп(п=31) Здоровые(п-58) 0.720 0.742 0.810 0.854 0.633 0.828

Черно-пестрая порода (п=104) 0.836 ' . - 0.881 -

Больные (п-28) Здоровые (п=76) 0.750 0.857 0.826 0.881

В работе сопоставили выборки больных,

вирусоносителей и здоровых животных айрширской породы с ранее изученной популяцией черно-пестрой породы по уровню гетерозигот-ности. Для айрширской популяции показана более низкая оценка уровня гетерозиготности (0.770) по сравнению с черно-пестрой популяцией (0.836). Это отражает выраженную консолидацию породы. Для больных животных айрширской и черно-пестрой пород отмечено падение гетерозиготности по сравнению с ожидаемым уровнем и со здоровыми группами. Данный факт сильнее проявляется у айрширской породы, у которой в здоровой группе наблюдается противоположная тенденция. Таким образом, особенности распределения уровня гетерозиготности в изученных группах животных предполагает важную роль фактора гетерозиготности в устойчивости к лейкозу.

3.7. Продуктивность коров айрширской породы и ее связь с устойчивостью и восприимчивостью к гемобластозам крупного рогатого скота.

Ученых волновал вопрос о взаимосвязи МНС с продуктивностью (Савай Ы.7.. й а1., 1991; ВаПа Т.К.. ег а1., 1989 и т.д.). Существует мнение, что лейкозом крупного рогатого скота заболевают именно высокопродуктивные коровы. В связи с этим мы поставили перед собой цель изучить взаимодействие ВоЬА-системы с продуктивностью коров айрширской породы и ее связь с гемобластозами. Популяцию айрширского скота анализировали по наивысшей лактации. Коров разделили на три группы: высокопродуктивные с продуктивностью 7000 кг и выше, среднепродуктивные - от 5500 кг до 7000 кг и низкопродуктивные - 5500 кг и ниже. Изучено 35 больных, 46 здоровых и 27 инфицированных животных. Выявили, что именно в больной группе находится почти в 2 раза больше высокопродуктивных коров (37.1%), в отличие от здоровой группы (15.2%). Среди инфицированных животных количество высоко- и низко продуктивных коров одинаково (25.9%). Количество животных со средней продуктивностью в группах вирусоносителей и здоровых животных равнозначно и составляет 48.2% и 47.8%, соответственно. Взаимодействие аллелей гена ВоЬА-ВЯВЗ с продуктивностью коров айрширской породы изучали по трем лактациям и не выявили достоверных различий. Необходимо отметить, что в анализе продуктивности по наивысшей лактации наблюдалась тенденция взаимосвязи высокой продуктивности с аллелями ВОЬА-Б1Ш3.2*23 и *28.

4. Выводы

1. В популяции айрширской породы наибольшее распространение имеют следующие антигены класса I BoLA-системы: MSUA15 (0.504), MSUA24 (0.442), MSUA1 и W15 (0.419). Редко встречаются антигены W31 и W14 (0.085). Изучение спектра антигенов BoLA-A позволило выявить антигены MSUA7 "(Р<0.01), MSUA21 и MSUA1 (Р<0.05) достоверно чаще встречающиеся в группах больных животных по сравнению со здоровыми.

2. В результате статусметрической обработки больных лейкозом, здоровых и инфицированных животных получена модель имму-ногенетического статуса (Z) для каждого изученного животного: при значении Z<-0.0502 - животное устойчиво, а при Z<-1.0201 - восприимчиво. В рамках данной модели выявили "благоприятные" (W20, W44, MSUA2, MSUA7, MSUA11, MSUA13 и MSUA17) антигены BoLA-A, присутствие которых способствует устойчивости животного к заболеванию, и "неблагоприятные" (W31, MSUA3, MSUA8 и MSUA21), влияние которых определяет восприимчивость животного к болезни.

3. Методом ПЦР-ПДРФ и аллельспецифичной ПЦР изучено распределение аллелей гена BoLA-DRB3 в группах больных лейкозом, здоровых и инфицированных животных айрширской породы. Отмечен несколько обедненный спектр аллелей (18 аллелей) и неоднородный профиль их частот: на долю аллелей *7, *28, *8 и *10 приходится 71%. Впервые изучена группа инфицированных животных, у которой чаще всего встречаются аллели *7 (54.8%) и *28 (24.3%).

4. Анализ частот аллелей гена BoLA-DRB3, определяющих устойчивость к лейкозу, показал, что в исследуемой выборке айршир-ского скота отсутствует аллель *11, ответственный за резистентность к лейкозу. Аллель*28, у инфицированных животных (0.228) встречается достоверно чаще, чем у больных лейкозом животных (0.097) (¿2=5.802; Р<0.05), а величина относительного риска имеет низкое

значение (RR=0.875). Это свидетельствует о том, что аллель *28 выполняет «защитную» функцию по отношению к лейкозу крупного рогатого скота.

5. Аллель BoLA-DRB3.2*7 (RR=0.450), отмеченный ранее как нейтральный по отношению к лейкозу, может рассматриваться в роли "кандидатного" аллеля, определяющего устойчивость айрпгарского

скота к лейкозам. Методом определения нуклеотидной

последовательности выявлена неоднородная структура аллеля *7.

6. У аллелей ВоЬЛ-Б1Ш3.2*8 и *24, ответственных за чувствительность к лейкозу, отмечено высокое значение относительного риска (1111=1.188 и Ш1=2.736, соответственно), что подтверждает наибольшую вероятность развития лейкоза у животных, содержащих данные аллели в своем генотипе.

7. В популяции айрширской породы крупного рогатого скота определены гематологические показатели крови у больных лейкозом животных: количество лейкоцитов (тыс./мкл) 18.8±0.99 и лимфоцитов (%) 83.4±0.99; и у здоровых животных: количество лейкоцитов (тыс./мкл) 6.7+0.28 и лимфоцитов (%) 58.2 ± 1.6. Проведенные пато-морфологические исследования подтвердили диагноз на лейкоз, который в больной группе согласуется с «неблагоприятным» распределением ВоЬА-А антигенов и аллелей гена ВоЬА-БКВЗ, определяющих чувствительность к лейкозу.

8. В популяции айрширского скота выявлено снижение уровня гетерозиготности (0.770) по сравнению с черно-пестрым скотом (0.836). В группах больных животных обеих пород наблюдается снижение уровня наблюдаемой гетерозиготности (0.720 и 0.750, соответственно) по отношению к ожидаемому (0.854 и 0.826). Уровень гетерозиготности может рассматриваться, как неспецифический фактор, влияющий на устойчивость животных к лейкозам.

9. В результате комплексной оценки популяции айрширского скота по ВоЬА-А антигенам и аллелям гена ВоЬА-БШЗЗ с подтверждением патоморфологическими исследованиями диагноза на лейкоз выявлена группа животных, рекомендуемая для селекции.

5. Практические предложения и рекомендации по использованию научных выводов.

1. Хозяйству ГШ 13 «Смена» Сергиев Посадского района Московской области, которому принадлежит исследованная популяция айрширской породы, представлена характеристика больных лейкозом, инфицированных и здоровых животных по антигенам ВоЬА-А и аллелям гена ВоЬА-ОЯВЗ в связи с устойчивостью и восприимчивостью к гемобластозам. Проведен семейный анализ, в результате которого по 18 потомкам выявлен бык-производитель - «ухудшатель» и определен его генотип: ВоЬА-ПКВ3.2*7 - ВоЬА-БКВ3.2*8. Рекомен-

дуется ввести в селекционную работу быка-производителя, генотип которого содержал бы устойчивый аллель BoLA-DRB3.2* 11.

2. Выявленные фенотипы устойчивых к лейкозу животных по классу I и II BoLA-системы рекомендуются для использования в селекционных программах.

3. Методы, использованные в диссертационной работе: выделение чистых лимфоцитов, постановка двухступенчатого микролимфо-цитотоксического теста, выделение ДНК, постановка полимеразной цепной реакции с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов и анализ аллелей аллельспецифичной полимеразной цепной реакцией можно использовать в научных исследованиях и в учебном процессе.

4. Материалы диссертационной работы вошли в Методические рекомендации по диагностике лейкоза крупного рогатого скота (Москва, 1998), рассматриваемые Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Карамышева Е.Е., Орлова А.Р., Шишков В.П. Антигенный спектр и генетический анализ BoLA-антигенов айрширской породы крупного рогатого скота. Бюл. ВИЭВ, 1996, вып.77, с.63.

2. Карамышева Е.Е. Связь антигенов BoLA-A и аллелей гена BoLA-DRB3 с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу крупного рогатого скота. Тезисы докл. межд. конф. по агробиотехнологиям растений и животных, Киев, 1997, с. 20.

3. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Карамышева Е.Е., Туркова С.О., Павленко С.П., Орлова А.Р. BoLA-DRB3 у черно-пестрой и айрширской пород крупного рогатого скота. Тезисы докл. межд. конф. по агробиотехнологиям растений и животных, Киев, 1997, с. 19.

4. Sulimova G.E., Udina I.G., Karamysheva Е.Е., Turkova S.O. and Orlova A.R. BoLA-DRB3-associated resistence to persistance lympho-cytisis in Russian dairy cattle. The International Conference on Animal Biotechnology, China, 1997, p. 110-114.

6. Удина И.Г., Карамышева E.E., Сулимова Г.Е., Павленко С.П., Туркова С.О., Орлова А.Р. Сравнительный анализ внутри- и межпородной генетической дифференциации у айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота по маркерам гистосовмести-мости. Тезисы, докл. межд. конф. ДНК-технологии, Киев, 1997, с. 6263.