Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биотехнология пробиотика лактобифадола (бифицидобактерина) и его лечебно-профилактическая эффективность

Министерство общего и профессионального образования Российской Федерации

Московский государственный университет прикладной биотехнологии

О'о 03 5'5; -^М) ' на правах рукописи

......октора!

ш^/тм/ша^__к

СУББОТИН ВЛАДИМИР ВИ^^* ОВ1ГЧ

/ /кО/па^

Биотехнология пробиотика лактобифадола (бифацидобактер! его лечебно-профилактическая эффективность

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Научный консультант Заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор М.А.Сидоров

Москва - 1999 г

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................14

1.1. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта животных и его роль в обеспечении жизнедеятельности организма хозяина.......................................14

1.2. Биологические особенности и физиологическое значение некоторых представителей кишечной микрофлоры животных..........................................41

1.3. Краткая история становления и современные аспекты метода бактериотерапии.................................................................................................60

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................66

2.1. Материалы и методы исследований...............................................................66

2.2. Результаты исследований...........................!....................................................75

2.2.1. Микробиоценоз кишечника клинически здоровых животных и его становление у новорожденных...........................................................................75

2.2.2. Изменения в кишечном микробиоценозе животных при желудочно-кишечных болезнях, сопровождающихся диареями.........................................93

2.2.3. Биологические свойства бифидобактерий, выделенных

от животных......................................................................................................108

2.2.3.1. Видовой состав бифидобактерий..........................................................108

2.2.3.2. Кислотообразующие свойства бифидобактерий..... ....................................114

2.2.3.3. Антагонистические свойства бифидобактерий.....................................117

2.2.3.4. Адгезивные свойства бифидобактерий..................................................128

2.2.4. Биологические свойства лактобактерий, выделенных

от животных......................................................................................................140

2.2.4.1. Видовой состав лактобактерий...............................................................140

2.2.4.2. Антагонистические свойства лактобактерий.........................................146

2.2.4.3. Адгезивные свойства лактобактерий......................................................156

2.2.5. Критерии отбора (селекции) производственных штаммов для изготовления пробиотиков ветеринарного назначения..................................169

2.2.6. Технология изготовления пробиотического препарата лактобифадол (бифацидобактерин).................................................................176

2.2.6.1. Подбор оптималиных питательных сред и режимов культивирования штаммовЬ. ас1<1орЫ1ит ЛГ-1 иВ. асЫезсепйвВ-1.........................................176

2.2.6.2. Отработка режима сушки биомассы......................................................183

2.2.6.3. Методы контроля препарата лактобифадол..........................................191

2.2.7. Лечебно-профилактическая эффективность лактобифадола (бифацидобактерина)........................................................................................195

2.2.7.1. Лечебно-профилактическая эффективность лактобифадола при желудочно-кишечных заболеваниях поросят..................................................195

2.2.7.2. Лечебно-профилактическая эффективность лактобифадола при желудочно-кишечных заболеваниях телят......................................................207

2.2.7.3. Лечебно-профилактическая эффективность лактобифадола при желудочно-кишечных заболеваниях птицы.....................................................217

2.2.7.4. Лечебно-профилактическая эффективность лактобифадола при дисбактериозах и иной патологии у собак......................................................223

2.2.7.5. Эффективность лактобифадола при профилактике дисбактериозов, связанных с гельминтозами и с применением антигельминтных препаратов.........................................................................................................237

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ....................................251

ВЫВОДЫ..........................................................................................................277

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...............................................................283

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...........................................285

ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................................................315

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Современная инфекционная патология животных характеризуется существенным изменением этиологической структуры заболеваний: расширился спектр условно-патогенных микроорганизмов; ежегодно появляются данные о новых возбудителях патологических процессов вирусной, бактериальной или иной природы; возрастает число инфекций, вызываемых ассоциацией микроорганизмов и атипичными штаммами. Все большее значение в патологии приобретает комбинированное воздействие микроорганизмов, их токсинов и ксенобиотиков различного происхождения. Реальную опасность начинают приобретать искусственно созданные генно-инженерные штаммы. Не потеряли своей актуальности и многие традиционные патогены, такие как энтеропатогенные эшерихии сальмонеллы, кампилобактеры и др.

При изыскании средств борьбы с инфекционными болезнями основное внимание уделяют возбудителям этих заболеваний и часто забывают о том, что в ряде случаев комплекс обычной микрофлоры способен блокировать пути и возможности развития инфекционного процесса, равно как и то, что при определенных условиях обычная микрофлора становится источником агентов, которые обуславливают эндогенное инфицирование, проявление секундарных инфекций и т.д. [46].

С современных позиций нормальную микрофлору следует рассматривать как совокупность многих микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих ту или иную экологическую нишу в организме животных и человека. В любом микробиоценозе различают постоянно встречающиеся виды (резидентная, аутохтонная флора) и добавочные или факультативные виды (транзиторная, аллохтонная флора).

Неспорообразующие облигатно-анаэробные бактерии составляют основу нормальной микрофлоры полости рта, желудка, кишечника, гениталий,

глубоких слоев кожи. Соотношение анаэробов и аэробов в этих биоценозах колеблется от 10:1 (в слюне) до 1000:1 (тонкий и толстый кишечник) [141].

Экологическая система «макроорганизм - его нормальная микрофлора» несет в себе элементы саморегуляции и способна противостоять в известных пределах изменениям внешней среды. Но несмотря на определенную стабильность, состав резидентной микрофлоры может изменяться. Если воздействующие факторы (фармакологические препараты, пестициды и другие яды, радиация, стрессы и т.д.) по своей интенсивности превышают компенсаторные механизмы экологической системы «макроорганизм - его нормальная микрофлора», то баланс микрофлоры нарушается в сторону преобладания транзиторной микрофлоры. Следствием такой трансформации может быть инфекционный локальный процесс либо даже генерализованная инфекция [273].

В структуре заболеваний животных раннего постнатального периода основное место занимают расстройства деятельности желудочно-кишечного тракта бактериальной и вирусной этиологии, клинически проявляющиеся диареей, дегидратацией и токсемией. Эта группа болезней наносит хозяйствам огромный ущерб, складывающийся из высокой смертности заболевших, затрат на лечение больных и проведение общих и специфических профилактических мероприятий.

Нерациональное использование химиотерапевтических средств при лечении желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных является одной из причин развития либо усугубления дисбактериозов, селекции антибиотикоустойчивых штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий, увеличения числа бактерионосителей среди животных и птицы. При этом формируются группы больных животных, безуспешное лечение которых затягивается надолго, а общепринятые лекарственные препараты не способствуют нормализации у них состава микрофлоры. В этих условиях в комплексе лечебных средств большое значение приобретает метод

бактериотерапии - применение препаратов из живых микроорганизмов, являющихся представителями нормальной кишечной микрофлоры и получивших название пробиотики.

Впервые антагонистическая активность нормальной микрофлоры к патогенным и условно-патогенным бактериям была установлена И.И.Мечниковым в 1908 году [237]. В нашей стране появились и первые пробиотические препараты (биологически активные препараты ПАБК, АБК и другие). Однако из-за ряда технологических, экономических, социальных и других факторов они не нашли своевременного и должного применения в ветеринарии.

Внедрение в животноводство промышленных технологий, предусматривающих ограничение контакта животных с почвой, растениями, другими естественными факторами, концентрацию значительного поголовья на ограниченных площадях, а так же химизация отрасли, широкое и не всегда оправданное применение химиотерапевтических средств способствовали широкому распространению желудочно-кишечных болезней животных. Поэтому в последние 15-20 лет интерес к пробиотическим препаратам во всем мире резко возрос. Во многих зарубежных странах разработана концепция применения пробиотиков, показаны схемы их применения при различных физиологических состояниях организма и в различные возрастные периоды [86].

Наметившееся в нашей стране отставание в данной области исследований ликвидируется, прежде всего, благодаря сотрудникам лаборатории контроля и стандартизации пробиотиков, препаратов против кокковых инфекций и микозов ВГНКИ (Н.И.Малик, Е.В.Малик и др.) под руководством доктора ветеринарных наук, профессора, члена корреспондента РАСХН А.Н.Панина. Благодаря исследованиям этого коллектива, направленным на изучение механизмов действия пробиотиков, физиолого-биохимических характеристик представителей нормальной флоры организма животных, разработку и

внедрение в ветеринарную практику новых пробиотических препаратов, пробиотики в нашей стране в настоящее время переживают «второе рождение».

Однако этот процесс сопровождается и некоторыми негативными явлениями. Для ветеринарной практики предлагаются препараты, штаммовый состав которых случаен, не обоснован научно, часто активно применяются медицинские и пищевые пробиотики, эффективность которых для животных и птицы неизвестна. Нередкими являются случаи, когда препараты, специально созданные для ветеринарии, показывают вариабельность лечебно-профилактического эффекта или вовсе не дают ожидаемых результатов [87, 88].

В этих условиях разработка научно-обоснованных требований к производственным штаммам, система оценки, потенциальных возможностей таких штаммов в поддержании кишечного нормобиоза должны стать теми факторами, которые позволят дать производству действительно эффективные препараты для бактериотерапии и профилактики желудочно-кишечных болезней.

Не менее важное значение при разработке пробиотиков ветеринарного назначения имеет и технологический аспект. Необходимы такие технологии, которые позволили бы получать высокоэффективные препараты при минимальных затратах на производство, что обеспечило бы их доступность для потребителей. Последнее является особо актуальным в сложившейся в нашей стране экономической ситуации. Кроме того, необходимы такие лекарственные формы пробиотиков, которые были бы технологичны не только в производстве, но и в применении в условиях животноводческих и птицеводческих хозяйств. Решению этих основных вопросов, актуальных для ветеринарии, и посвящена настоящая работа.

Цели и задачи исследований. Целью нашей работы является: разработка научно обоснованных критериев отбора штаммов для изготовления пробиотиков ветеринарного назначения, селекция производственных штаммов и разработка

на их основе технологии изготовления высокоэффективного пробиотического препарата.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: ♦ изучить становление кишечного микробиоценоза у основных видов сельскохозяйственных и домашних животных;

•изучить состав кишечной микрофлоры у здоровых животных и определить видовую принадлежность основных представителей резидентной микрофлоры, обеспечивающих колонизационную резистентность у животных;

•изучить изменения в кишечном микробиоценозе животных при желудочно-кишечных болезнях, сопровождающихся диареями;

•изучить основные биологические свойства и свойства, обеспечивающие антагонистические функции основных представителей резидентной микрофлоры кишечника животных;

•разработать и научно обосновать критерии отбора производственных штаммов для пробиотиков ветеринарного назначения, провести селекцию этих штаммов;

•разработать технологию пробиотического препарата ветеринарного назначения;

•изучить лечебную и профилактическую эффективность нового пробиотического препарата для основных видов сельскохозяйственных и домашних животных.

Научная новизна.

Определен видовой состав и выявлены доминирующие виды бифидо- и лактобактерий у свиней, крупного рогатого скота и собак.

Определены количественные и качественные изменения в кишечном микробиоценозе животных при желудочно-кишечных болезнях, сопровождающихся диареями.

На основе изучения антагонистической активности показано отсутствие корреляции между кислотообразующими и антагонистическими свойствами у лакто- и бифидобакгерий при их совместном культивировании с тест-бактериями in vitro.

Установлено, что видоспецифичность адгезии у лакто-и бифидобакгерий не имеет абсолютного характера и среди микроорганизмов данных видов имеются штаммы с выраженной поливидовой адгезией к клеткам макроорганизмов. Кроме того показано, что адгезивные свойства лакто- и бифидобакгерий усиливаются в кислой и ослабевают в щелочной среде.

На основании проведенных исследований предложены научно обоснованные критерии отбора штаммов для изготовления пробиотиков ветеринарного назначения.

Впервые установлена антибактериальная активность ряда антигельминтных препаратов и потенциальная возможность развития дисбактериозов у животных при их применении.

Изучена рецепггорная активность клеток организма млекопитающих (собак), установлена коррелятивная связь между активностью рецепторного аппарата эритроцитов и энтероцитов и показано влияние рецепторной активности энтероцитов на процесс колонизации кишечника лакто- и бифидофлорой.

В отличие от существующих сухих пробиотических препаратов технология изготовления лактобифадола впервые в нашей стране предусматривает не лиофильную или распылительную, а контактно-сорбционную сушку биомассы на естественных растительных носителях. Данное технологическое новшество позволяет удешевить препарат и значительно снизить значимость такого требования к производственным штаммам как быстрая реактивация за счет ре гидратации и репарации сухой биомассы в желудочно-кишечном тракте животных.

Практическая значимость. На основании научно обоснованных требований к штаммам для пробиотиков ветеринарного назначения проведена селекция, в результате которой были отобраны в качестве производственных два штамма: представитель рода ВШс1оЬас1егшт, штамм ВШёоЬа^епит аёо1е8сепйз В-1 и представитель рода Ьас1оЬас1епит, штамм Lactobacterium acidopЫIum ЛГ-1. Оба штамма паспортизированы и депонированы во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ).

По итогам первого этапа исследований разработаны и утверждены в установленном порядке ТУ 10-07-63-92 на препарат бифацидобактерин, зарегистрированные Государственным комитетом стандартов 29.10.92 за № 4278. Разработана инструкция по изготовлению и контролю препарата, а также Временное наставление по его применению в ветеринарии (№ 22-5/99 от 2.10.92 г.),

На базе предприятия ООО М-ТЕХ организовано серийное производство бифацидобактерина и в течение 5 лет (1992-1997) выпущено 60 серий препарата. Рекламаций на его использование не поступало. Серии, проверяемые непосредственно в ВГНКИ, были признаны соответствующими требованиям ТУ 10-07-63-92.

Широкие производственные испытания препарата на различных видах сельскохозяйственных и домашних животных показали его высокую лечебную и профилактическую эффективность, неспецифическую иммуностимулирующую активность. Были уточнены дозировки и схемы применения препарата, доработана технологическая схема. Данная работа нашла свое отражение в переработанных и утвержденных в установленном порядке ТУ 9384-001-02068640-98 на препарат лактобифадол, в инструкции по изготовлению и контролю препарата и в наставлении по его применению в ветеринарии (№ 13-5-2X1255 от 1.06.98 г.).

и

В соответствии с порядком регистрации в�