Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Зависимость реализации программы экстракорпорального оплодотворения от количества и средства гестагенных рецепторов мононуклеаров крови к прогестерону и дидрогестерону у пациенток с бесплодием

На правах рукописи

Сукновалова Мария Владимировна

Зависимость реализации программы экстракорпорального оплодотворения от количества и сродства гестагенных рецепторов мононуклеаров крови к прогестерону и дидрогестерону у пациенток с

бесплодием

14.03.06 - «Фармакология, клиническая фармакология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005554712

Москва-2014

6 НОЯ 2014

005554712

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

(ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава России) Научный руководитель:

доктор медицинских наук, КАРЕВА Елена Николаевна

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, начальник СЮБАЕВ Рашид Даутович

управления №4 Центра экспертизы и контроля готовых лекарственных средств ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России

доктор медицинских наук, профессор ВОРОНИНА Татьяна Александровна

заведующая лабораторией

психофармакологии ФГБУ

«Научно-исследовательский институт

фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «08» декабря 2014 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997 г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте: http://rsmu.ru/13523.html ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997 г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «_»_20_г.

Ученый секретарь диссертационного

совета доктор медицинских наук, профессор ДУХАНИН Александр Сергеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Бесплодный брак является одной из наиболее актуальных проблем современной гинекологии. Отмечается постоянная тенденция к росту частоты трубных и трубно-перитонеальных форм бесплодия, доля которых составляет 2040% в структуре причин женского бесплодия. У женщин с непроходимостью маточных труб единственным способом реализации генеративной функции является экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) [Кулаков В.И., 2007].

Однако, эффективность указанного метода не достаточно высока, а частота наступления беременности в программе ЭКО составляет в среднем 32,3% [РАРЧ. Регистр центров ВРТ. Отчет за 2009 год; European IVF-Monitoring Program 2006]. Параллельно с этим возрастает количество самопроизвольных выкидышей, составляя 50-75% у женщин старше 40 лет. Так на 1 перенос эмбриона в программе экстракорпорального оплодотворения, шанс на рождение ребенка у женщин младше 35 лет составляет около 41%, в возрасте 35-37 лет - 35%, для возрастной группы 3840 лет - 25%, 41-42 года - 15%, 43 года - 6% и ниже 3% для женщин старше 43 лет [Савельева Г.М., 2008]. Следовательно, значительная доля женщин несут напрасные моральные и материальные потери, что диктует необходимость повышения эффективности ЭКО.

Под понятием эффективности ЭКО подразумевают отношение числа успешных имплантаций к общему числу попыток. Применение критерия прогноза успеха имплантации, ограничит введение пациенток в программу ЭКО, что с одной стороны повысит эффективность метода экстракорпорального оплодотворения, а с другой - позволит исключенным пациенткам избежать чрезмерной гормональной нагрузки и нежелательных побочных эффектов, таких как синдром гиперстимуляции яичников. Необходимым условием реализации программы ЭКО является получение большого числа (10-20) зрелых жизнеспособных ооцитов для дальнейшего оплодотворения их in vitro. Для чего осуществляется стимуляция суперовуляции, большими дозами гонадотропинов [Kidd S.A., 2001].

Эффективность вспомогательной репродуктивной технологии (ВРТ) в первую очередь определяется успехом имплантации. При этом залогом успешной имплантации, а так же последующего нормального развития беременности является полноценная подготовка эндометрия к приему бластоцисты, что характеризуется морфофункциональной полноценностью эндометрия [Михнина Е.А., 2009]. В настоящее время признаками морфофункциональной зрелости эндометрия и одновременно критерием прогноза эффективности ЭКО являются толщина и морфологическая структура эндометрия. Однако нет абсолютной зависимости между благополучным исходом ЭКО и толщиной эндометрия [Klentzeris L.D., 1990, Nocí I., 1997, Noyes N., 2001, Dekel N., 2010]. В свою очередь, процесс имплантации эмбриона зависит от адекватного действия женских половых гормонов (прогестерона и эстрадиола), что связано как с количеством стероидов, так и с работой рецепторного аппарата. Рецепторы женских половых стероидов относятся к суперсемейству ядерных рецепторов.

Эффективность гормональной терапии зависит от рецепторного статуса ткани-мишени. С одной стороны, уровень рецепторов эстрадиола (РЭ) и рецепторов прогестерона (РП), а так же их соотношение (РП/РЭ) в эндометрии перед подготовкой к имплантации влияет на эффективность переноса бластоцисты [Побединский Н.М., 2000]. С другой стороны, ответная иммунная реакция организма матери на отцовские антигены эмбриона находится под контролем женских половых гормонов [Розен В.Б. 1994, Groome N., 1996]. В частности под влиянием прогестерона активируются лимфоциты и начинают вырабатывать белок -прогестерониндуцированный блокирующий фактор (ПИБФ), который оказывает антиабортивное действие в организме женщины и способствует сохранению беременности [Funder J.W. 2000]. В литературе представлены скудные данные о рецепции женских половых стероидов в эндометрии и отдельных фракциях клеток белой крови при имплантации [Chien E.J., 2007, Dosiou С., 2008, Dekel N., 2010]. Строго координированный гормональный контроль функции как эндометрия, так и иммунокомпетентных клеток является абсолютно необходимым условием успешной имплантации.

Следовательно, параметры указанной рецепции имеют значительный информативный потенциал [Christin-Maitre S., 1998, Funder J.W., 2000, Mertens HJ., 2001, Яманова M.B., 2003]. Однако наличие имплантации не является гарантией деторождения, успех которого во многом связан с правильным применением препаратов гестагенной поддержки. Проведение поддерживающей гестагенной терапии является обязательным этапом в перечне процедур, предусмотренных циклом ЭКО. Для этой цели используют препараты натурального прогестерона или дидрогестерон, но они, к сожалению, не всегда эффективны. Кроме того, в настоящее время не существует четких рекомендаций по выбору гестагенного препарата при проведении ЭКО и врач назначает лечение эмпирически [Савельева Г.М.,2008]. При этом структурные различия молекул прогестерона и дидрогестерона, с одной стороны, и индивидуальные колебания аффинитета рецепторов прогестерона конкретных женщин, с другой, могут обеспечить персонализованный подход к назначению гормональной терапии с целью повышения ее эффективности [Карева E.H., 2012].

Поэтому динамический количественный анализ рецепции эстрадиола и прогестерона в клетках эндометрия и МНФК в предимплантационный период в зависимости от исхода ВРТ, а так же поиск возможности персонализованного подхода к назначению гормональной терапии с целью поддержания гестации на ранних сроках и повышения эффективности ЭКО, является весьма актуальным.

Цель работы:

Изучение роли специфического связывания половых стероидов в эндометрии и мононуклеарах периферической крови пациенток в реализации программы ЭКО. Поиск фармако-биохимических критериев для персонализации гестагенной терапии у пациенток на ранних сроках беременности, включенных в программу ЭКО.

Задачи:

1. Определение уровня прогестерона и эстрадиола в плазме крови до начала стимуляции суперовуляции и в предимплантационный период у пациенток программы ЭКО.

2. Определение уровня цитозольных рецепторов прогестерона и эстрадиола радиолигандным методом в эндометрии до начала стимуляции суперовуляции у пациенток программы ЭКО в зависимости от ее успеха.

3. Определение уровня специфического связывания 3Н-прогестерона и 3Н-эстрадиола радиолигандным методом в мононуклеарной фракции клеток периферической крови пациенток, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения в динамике.

4. Анализ специфического связывания 3Н-прогестерона и 3Н-эстрадиола радиолигандным методом в мононуклеарной фракции клеток периферической крови на 21-23 день менструального цикла, у пациенток программы ЭКО в зависимости от ее успеха.

5. Анализ специфического связывания дидрогестерона в мононуклеарах периферической крови пациенток программы ЭКО.

Научная новизна:

Впервые была определена количественная составляющая рецепторной емкости МНФК у пациенток, участвующих в программе ЭКО.

Продемонстрирована тесная положительная корреляция между уровнем рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и цитозоле эндометрия пациенток программы ЭКО.

Предложен алгоритм введения пациенток в длинный протокол программы ЭКО для повышения ее эффективности, основанный на малоинвазивном методе определения специфического связывания половых стероидов в МНФК.

Предложен способ персонализации гестагенной поддержки первого триместра беременности у пациенток программы ЭКО.

Практическая значимость работы.

Предложен новый малоинвазивный способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбриона (ПЭ) в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции (патент на изобретение №2430379).

Положения, выносимые на защиту.

1. Концентрация прогестерона и эстрадиола в плазме крови пациенток, включенных в программу ЭКО, не влияет на исход лечения.

2. Количество рецепторов к женским половым стероидам в цитозоле эндометрия пациенток программы ЭКО не может служить надежным критерием прогноза эффективности проводимого лечения.

3. Наблюдается тесная положительная корреляция между уровнем рецепторов прогестерона в цитозоле эндометрия и в клетках мононуклеарной фракции периферической крови пациенток программы ЭКО, что дает возможность разработать малоинвазивный метод определения специфического связывания прогестерона.

4. Специфическое связывание прогестерона с клетками мононуклеарной фракции периферической крови имеет прогностическое значение для наступления беременности в программе ЭКО и ПЭ. При значении выше 1,3 фемтомоль/млн клеток можно с достаточной уверенностью прогнозировать успешную имплантацию. При значениях ниже данного порога, целесообразно проведение предгравидарной подготовки.

5. Для поддержки лютеиновой фазы первого триместра беременности у пациенток цикла ЭКО, целесообразно применять персонализованный подход, основанный на определении специфического связывания дидрогестерона и прогестерона в клетках мононуклеарной фракции периферической крови.

Внедрение полученных результатов исследования в практику.

Результаты исследования по повышению эффективности лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ, основанном на анализе специфического связывания прогестерона в мононуклеарной фракции периферической крови пациенток программы ЭКО, внедрены в практическую деятельность ЭКО КДО ГБУЗ ЦПСиР ДЗ, а так же используются в материалах лекций для студентов кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева медико-биологического факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены на заседании совместной научно-практической конференции коллектива кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. акад. П.В. Сергеева ГОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ, 07 марта 2012года, протокол № 20.

Публикации.

Основные положения диссертации отражены в 7 публикациях, из них 5-в изданиях рекомендуемых ВАК Минобрнауки. Получен патент на изобретение №2430379.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4-х глав: обзора литературы (глава 1), материалы и методы исследования (глава 2), результатов собственных исследований (глава 3), обсуждения полученных результатов (глава 4), выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 6 рисунками, 10 диаграммами, 32 таблицами и 1 схемой. Список литературы включает 147 наименований, в том числе 28 на русском и 119 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В исследование вошли 50 женщин от 26 до 39 лет, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения, которые наблюдались на базе отделения ЭКО (зав. отделением ЭКО КДО - врач высшей категории Лебедева Е.Г.) Центра Планирования Семьи и Репродукции (главный врач центра - главный акушер гинеколог г. Москвы, чл.-корр. РАМН, профессор Курцер М.А.). Условиями включения в исследование явилось отсутствие у пациенток тяжелой соматической патологии и выраженных метаболических нарушений, а также бесплодный брак.

Пациенток ретроспективно разделили на 2 группы в зависимости от результатов лечения: в I группу вошли 28 пациенток с наступившей беременностью, во II - 22 пациентки с безуспешной попыткой ЭКО и ПЭ. Дальнейший анализ результатов проведенных исследований проводился по группам.

Анализ анамнестических данных показал, что возраст пациенток составил в среднем 33,1 ± 3,4 года. Большее количество женщин, включенных в исследование, относится к позднему репродуктивному возрасту (после 37 лет), тогда как к репродуктивному возрасту относятся - 44% исследуемых (до 37 лет).

Дальнейший анализ анамнестических данных показал, что пациентки также могут быть разделены на группы по фактору бесплодия, количеству попыток ЭКО, наличию или отсутствию синдрома гиперстимуляции яичников и длительности бесплодия. Описанные данные отражены в таблице 1.

Таблица 1. Анализ частоты распределения пациенток по данным анамнеза (количество пациенток (%)).

тип бесплодия первичное 13 (26%)

вторичное 37 (74%)

фактор бесплодия трубный 28 (56%)

неясный 7 (14%)

мужской 10(20%)

сочетанный 5 (10%)

количество попыток одна 28 (56%)

две и более 22 (44%)

Синдром гиперстимуляции яичников есть 11 (22%)

нет 39 (78%)

длительность бесплодия До 2 лет 15 (30%)

более 2-х лет 35 (70%)

Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Эндометрий получали путем пайпель биопсии эндометрия у пациенток при первичном обследовании. Цитозоль эндометрия получали с помощью ультрацентрифугирования при 10500(^ (Ультрацентрифуга 11Р-65М).

МНФК из периферической крови получали стандартным методом по Boyum А. (1968) с использованием центрифуги с охлаждением (РС-6).

В цитозольной фракции биоптатов эндометрия и МНФК периферической крови определение связывания 3Н-эстрадиола и 3Н-прогестерона проводили радиолигандным методом [Бассалык JI.C., 1987]. Специфическое связывание дидрогестерона в МНФК определяли согласно рекомендациям по доклиническому исследованию новых лекарственных препаратов [Фисенко В.П., 2000]. Количество мРНК подтипов рецепторов прогестерона и эстрадиола определяли методом РТ-ПЦР согласно стандартным протоколам на амплификаторе iQ5 (BioRad). Праймеры синтезированы в компании «Синтол», схема амплификации подобрана с помощью программы Primer Express Software (Applied Biosystems).

Содержание В- и Т-лимфоцитов и моноцитов в МНФК оценивали с помощью проточного цитофлюориметра сортера FACSAria (Becton Dickenson Со), показатели клеточного состава находились в пределах референсных значений.

Статистическую обработку материала проводили с помощью программы "Biostat" версия 6.0 и GraphPad Prism 5. Достоверность различий между группами по изучаемым параметрам оценивалась с помощью непараметрических критериев статистики (Уилкоксона, Манна-Уитни).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование уровня рецепторов половых стероидов в цитозоле эндометрия пациенток программы ЭКО до начала стимуляции.

Из общего числа пациенток (50 человек) нами выделена группа, состоящая из 31 женщины, у которых была взята биопсия эндометрия (пайпель) на 21 - 23 день менструального цикла для определения уровня цитозольных РП и РЭ. Биопсия эндометрия является травматичной и болезненной процедурой, что в ряде случаев является причиной отказа пациенток от нее. Также не всем пациенткам удаётся произвести данную процедуру в связи со спазмом внутреннего зева, стенозом или особенностями направления хода цервикального канала [Михнина Е.А., 2009].

Независимо от результатов исследования, всем пациенткам реализовали вспомогательную репродуктивную технологию по длинному протоколу. По

10

окончании цикла оценивали эффективность лечения по наличию имплантации и ретроспективно разделили пациенток на две группы. Разделение пациенток на группы по признаку успешной имплантации не привело к выявлению достоверной разницы в рецепции женских половых стероидов в цитозоле эндометрия в зависимости от эффекта терапии.

У пациенток I группы с успешной имплантацией уровень цитозольных РЭ равнялся 30,6+14,3 фемтомоль/мг белка. У женщин II группы с отсутствием имплантации величина этого показателя была ниже и соответствовала 9,3+9,3 фемтомоль/мг белка. Средняя концентрация РП у пациенток с успешной имплантацией составляла 152,9+65,7 фемтомоль/мг белка, тогда как при ее отсутствии - 164,3+107,0 фемтомоль/мг белка (р>1).

Индивидуальный анализ полученных данных показал, что у пациенток с успешной имплантацией частота встречаемости нулевых значений уровня стероидных рецепторов в цитозоле эндометрия достоверно ниже по сравнению со второй группой: для РП - 37% против 57% (р<0,05), для РЭ - 12% против 42% (р<0,01) Не удивительно, что это правило распространяется и на отрицательные по обоим рецепторам образцы эндометрия: 12% в первой группе (успех имплантации) против - 29% во второй (р<0,01).

Таким образом, окончательный анализ результатов нашего исследования не подтвердил гипотезу о достаточной информативности рецепции стероидов в эндометрии для прогноза успеха ЭКО. При этом, биопсия эндометрия является травматичной и болезненной процедурой, что в ряде случаев является причиной отказа пациенток от нее. Более того, массированная инфильтрация эндометрия иммунокомпетентными клетками в период имплантационного окна [Оеке! К., 2010] позволяет переместить наше внимание на рецепцию женских половых стероидов именно в этих клетках.

Результаты исследования содержания эстрадиола и прогестерона в плазме крови у пациенток в процессе лечения.

Результаты проведенных клинических исследований содержания половых стероидов в плазме крови пациенток в динамике цикла ЭКО отображены в таблице 2.

Таблица 2. Концентрация половых стероидов в плазме крови пациенток в динамике лечения.

гормон Эстрадиол Прогестерон Соотношение эстрадиол/ прогестерон

точка цикла (пикомоль/л) (наномоль/л)

Контроль 447Д±14,7 43,7±4,7 10,2

Пункция 3984,6±86,0* 25,7+4,4* 155,0*

Трансфер 4585,6±103,8* 428,1±19,3* 10,7

Нормативные значения Овуляторный пик 124,8-1468,4 1,53-5,47 0,23

Нормативные значения II фаза м.ц. 99,1-903,1 3,0-66,8 10,5

Примечание: * - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной точки (р<0,001)

Таким образом, как видно из представленной выше таблицы, при исследовании уровня эстрадиола и прогестерона в плазме крови пациенток в динамике цикла ЭКО и ПЭ выявлена достоверная разница между значениями в контрольной точке и в момент пункции и трансфера эмбриона, что по всей видимости является ответной реакцией организма на стимуляцию суперовуляции и соответствует литературным данным [Савельева Г.М., 2008].

Дальнейший анализ уровня гормонов в плазме крови пациенток в зависимости от успеха ЭКО не продемонстрировал достоверных различий (р>0,05), так как гормональная стимуляция вызывает одинаковое увеличение концентрации гормонов

в плазме крови у пациенток обеих групп, что соответствует литературным данным [Светлаков A.B., 2002]. То есть, уровень половых гормонов в плазме крови не может служить надежным критерием успеха ЭКО.

Специфическое связывание меченого прогестерона в МНФК периферической крови пациенток программы ЭКО в динамике лечения.

Анализ полученных данных показал, что средняя концентрация РП в контрольной точке была минимальной и равнялась 23,4 ± 3,3 фемтомоль/млн. клеток, с вариациями от 8,7 до 40,7 фемтомоль/млн. клеток. Уровень РП изменялся в зависимости от гормональной стимуляции суперовуляции. Так, в день пункции яйцеклетки величина этого параметра увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контрольной точкой и составила в среднем 36,5 + 7,4 фемтомоль/млн. клеток с индивидуальными колебаниями от 11,6 до 63,4 фемтомоль/млн. клеток. А в момент трансфера - также в 1,3 раза и равнялась 32,4 ± 9,2 фемтомоль/млн. клеток с изменениями от 9,9 до 78,9 фемтомоль/млн. клеток.

Результаты анализа рецепторного статуса прогестерона в МНФ клеток периферической крови исследуемых пациенток представлены на диаграмме 1:

Диаграмма 1. Специфическое связывание прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у пациенток включенных в программу ЭКО в динамике лечения.

Примечание: + - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной точки ( р < 0,005)

Следовательно, введение препаратов для стимуляции суперовуляции у пациенток программы ЭКО вызывает увеличение чувствительности МНФК к прогестерону.

Специфическое связывание эстрадиола в МНФК периферической крови у пациенток включенных в программу ЭКО в динамике лечения.

Анализ полученных данных показал, что средняя концентрация РЭ в контрольной точке была минимальной и равнялась 5,9 ± 1,5 фемтомоль/млн. клеток, с вариациями от 0,2 до 16,8 фемтомоль/млн. клеток. Уровень РЭ изменялся в зависимости от гормональной стимуляции суперовуляции. Так, в день пункции яйцеклетки величина этого параметра увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контрольной точкой и составила в среднем 7,3 ± 1,8 фемтомоль/млн. клеток с индивидуальными колебаниями от 1,4 до 20,6 фемтомоль/млн. клеток, а в момент трансфера - в 2 раза и равнялась 9,6 ± 3,6 фемтомоль/млн. клеток с изменениями от 1,0 до 26,4 фемтомоль/млн.клеток.

Результаты анализа специфического связывания эстрадиола в МНФК периферической крови исследуемых пациенток представлены на диаграмме 2:

Диаграмма 2. Специфическое связывание эстрадиола в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у пациенток включенных в программу ЭКО в динамике лечения.

Примечание:"^- значение статистически достоверно отличается от показателей контрольной точки (р < 0,001)

Следовательно, введение препаратов для стимуляции суперовуляции у пациенток программы ЭКО вызывают увеличение чувствительности МНФК к эстрадиолу.

Соотношение уровней специфического связывания прогестерона и эстрадиола в МНФК пациенток цикла ЭКО в динамике лечения.

Анализ полученных данных показал, что среднее соотношение РП/РЭ в контрольной точке равнялось 10,9 ± 3,4, с вариациями от 0,6 до 33,7. Уровень РП/РЭ изменялся в зависимости от гормональной стимуляции суперовуляции. В день пункции яйцеклетки величина этого параметра практически не изменилась по сравнению с контрольной точкой и составила в среднем 7,06 ± 1,3 с индивидуальными колебаниями от 3,0 до 11,5. А в момент трансфера - увеличилась в 2 раза и равнялась 14,21 ± 7,8 с изменениями от 0,8 до 47,7.

Результаты соотношения специфического связывания прогестерона и эстради: в МНФК периферической крови исследуемых пациенток представлены на диаграк

Диаграмма 3. Соотношение специфического связывания прогестерона эстрадиола в мононуклеарной фракции клеток периферической крови пациент включенных в программу ЭКО в динамике лечения.

Примечание:^ - значение статистически достоверно отличается от показате^ контрольной точки (р < 0,05)

Следовательно, введение препаратов для стимуляции суперовуляции у пациенте программы ЭКО вызывают увеличение соотношения специфического связываш: прогестерона и эстрадиола в МНФК в момент подсадки эмбриона и снижение -момент пункции.

Экспрессия генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК периферической крови пациенток программы ЭКО.

В настоящее время доказано существование 4 типов рецепторов прогестеро? - 2 из них известны как ядерные рецепторы РЯ-А и РЯ-В, третий тип - 7 р.: пронизывающий мембрану §-белок связывающий рецептор именуемый гп-РЯ, и тип - белок один раз пронизывающий мембрану под именем РСЯМС1. Д] последних варианта рецепторов опосредуют быстрые не геномные эффект стероида. И 3 типа рецепторов эстрадиола - один из которых мембранный рецепте

т-ЕЯ, и два типа ядерных рецепторов - ЕЯ-а и ЕЯ-р. Используя метод РТ-ПЦР мы показали, что связывание прогестерона мононуклеарной фракцией осуществляется

, рецепторами четырех основных типов, которые распределяются по убыванию активности связывания в следующем порядке: РЯ-В, РОЯМС1, ш-РЯ и РЯ-А. Связывание эстрадиола мононуклеарной фракцией клеток осуществляется рецепторами следующих типов (в порядке убывания по активности связывания): т-ЕЯ, ЕЯ-(3, ЕЯ-а.

Специфическое связывание половых гормонов в МНФК периферической крови пациенток, включенных в программу ЭКО с успешной имплантацией и

без нее.

Общую выборку (50 пациенток) составили две группы женщин. В первую группу (успешная имплантация) вошло 28 женщин, во вторую (отсутствие имплантации) - 22. Среднее значение емкости связывания прогестерона в МНФК у пациенток I группы в середине лютеиновой фазы предшествующей циклу ЭКО составило 4,8 ± 2,2 фемтомоль/млн клеток. В случае отсутствия имплантации (II группа) данный параметр был в 1,5 раза ниже и составил 3,3±1,4 фемтомоль/млн.клеток, что оказалось статистически значимо ниже, чем в I группе (р=0,043).

Среднее значение объема связывания эстрадиола в МНФК у пациенток I группы в середине лютеиновой фазы предшествующей циклу ЭКО составило 2,7±0,7 фемтомоль/млн клеток. В случае неудачной попытки ЭКО (И группа) данный параметр составил 2,6±0,8 фемтомоль/млн. клеток, что оказалось статистически не значимо (р>1). Анализ концентрации рецепторов стероидных гормонов в МНФК пациенток включенных в программу ВРТ в зависимости от успеха имплантации мы провели также с поправкой на внеэндометриальные причины отсутствия имплантации, в частности такого фактора, как «эмбрионы сомнительного качества». Уровень специфического связывания прогестерона в группе пациенток с наступившей беременностью был достоверно выше - 4,7±2,2

,! фемтомоль/млн клеток, по сравнению с уменьшенной на 7 пациенток 11 группой -

¡1

^ 0,7±0,4 фемтомоль/млн клеток (р=0,0024). При этом специфическое связывание

17

эстрадиола в МНФК клеток периферической крови пациенток до начала стимуляци) даже с учетом фактора «эмбрионы сомнительного качества» статистически достоверно не различался в группах обследованных больных (р>1). Результат]? данного исследования представлены на диаграмме 4.

Диаграмма 4. Специфическое связывание меченых стероидных гормонов МНФК пациенток, включенных в программу ЭКО в зависимости от успех\ имплантации (с поправкой на качество эмбрионов).

Примечание:"^" - значение статистически достоверно отличается от показател контрольной группы р=0,0024

Надо отметить, что у всех пациенток, которым подсадили плохие эмбрионь имплантация завершилась безуспешно. Возможно, это доказывает отрицательнс влияние плохих эмбрионов на исход.

Специфическое связывание дидрогестерона с мононуклеара1У периферической крови пациенток, включенных в программу ЭКО, до нача.г стимуляции.

Проблема выкидышей и невынашивания беременности является весьи актуальной в современной гинекологической практике. Частота этой патологии популяции колеблется от 10% до 20-25%, а в группе беременных после ЭКО и П достигает 30% [Савельева Г.М., 2010].

Поскольку одной из основных причин невынашивания на ранних стадиях беременности после программы ЭКО является недостаточность желтого тела, обусловленная длительной десенситизацией гипофиза, пониженной выработкой прогестерона, а также аспирацией части клеток гранулезы вместе с фолликулярной жидкостью во время пункции, целесообразность назначения препаратов прогестерона после ПЭ не вызывает сомнения [Анынина М.Б.,2000]. В связи с тем, что инъекционному применению масляного раствора прогестерона сопутствует ряд негативных последствий в виде образования олеом, постинъекционных абсцессов и др., то целесообразно рассмотреть возможность применения в программах ЭКО неинъекционного аналога прогестерона - дидрогестерона.

Исходя из этих данных нами было проведено исследование связывающей активности дидрогестерона с мононуклеарами у пациенток программы ЭКО до включения в цикл. Показано, что специфическое связывание дидрогестерона с мононуклеарными клетками периферической крови пациенток, включенных в программу ЭКО, до начала стимуляции варьирует от 0 до 298%, при этом у 38% женщин дидрогестерон уступает прогестерону в конкуренции за гестагенные рецепторы, а 62% - превышает. Выявленные вариации специфического связывания дидрогестерона с МНФК являются резервом повышения эффективности вспомогательной репродуктивной технологии за счет индивидуального подбора препаратов гормональной терапии. Данные отражены в таблице 3.

Таблица 3. Характер распределения пациенток по группам, в зависимости от связывающей активности дидрогестерона с рецепторами прогестерона в МНФК(%).

Показатель I группа II группа

Количество пациенток 19(38%) 31 (62%)

Связывающая активность дидрогестерона с РП 28,57±8,17 298,32±49,68*

Примечание - *различие между группами статистически достоверно (р<0,0001) Исследование корреляции между уровнем РП и РЭ в МНФК периферической крови и цитозоля эндометрия пациенток программы ЭКО до

начала стимуляции.

Сравнительный анализ уровня рецепторов половых стероидов в цитозоле эндометрия и МНФК, проведенный с помощью метода Спирмена, выявил сильную корреляцию между уровнем РП в цитозоле и МНФК (г = 0,76 (р = 0,000976)).

При этом коэффициент корреляции между уровнями РЭ в цитозоле и МНФК г = 0,23 (р = 0,395987), т.е. не отклоняется гипотеза о нулевом коэффициенте корреляции, что говорит об отсутствии линейной связи.

В результате нашей работы выявлена положительная корреляция между уровнем РП в цитозоле и МНФК периферической крови пациенток программы ЭКО, что является основанием для введения нового критерия прогноза эффективности и позволит отказаться от проведения операции биопсии эндометрия матки.

На основании полученных данных с целью повышения эффективности ЭКО нами разработан алгоритм введения пациенток в программу.

Создание алгоритма отбора пациенток для включения в программу ЭКО.

При соблюдении всех требований к включению пациенток в программу ЭКО, первым этапом предлагается проведение анализа специфического связывания прогестерона в МНФК периферической крови на 21 - 23 день менструального цикла. Уровень специфического связывания прогестерона в МНФК менее 1,3 фемтомоль/млн. клеток будет расцениваться как негативный прогностический признак, а пациентки не должны быть допущены к стимуляции суперовуляции. Пациенткам со сниженным уровнем связывания прогестерона необходимо провести терапию гормональных нарушений, вызывающих снижение уровня РП, пока уровень РП не будет приведен к норме (что требует лабораторного подтверждения). Использование указанных этапов обследования в стандартной схеме (схема 1) вспомогательных репродуктивных методов является залогом повышения эффективности.

Схема 1. Алгоритм введения пациенток в программу экстракорпорального оплодотворения.

Выводы:

1. Уровень прогестерона и эстрадиола в плазме крови пациенток включенных в программу ЭКО в 21-23 день менструального цикла находился в пределах нормальных значений и не влиял на исход лечения.

2. Концентрация цитозольных рецепторов прогестерона и эстрадиола в эндометрии пациенток включенных в программу ЭКО, до начала стимуляции суперовуляции, выявленная радиолигандным методом, составила: 152,9 и 30,6 фемтомоль/мг белка соответственно в I группе (с успехом имплантации), и 164,3 и 9,3 фемтомоль/мг белка во 2 группе (с отсутствием имплантации), (р>1). Не выявлено достоверной разницы в уровне рецепции эстрадиола и прогестерона в цитозоле эндометрия у обследованных пациенток обеих групп.

3. Специфическое связывание 3Н-прогестерона и 3Н-эстрадиола, определенное радиолигандным методом,в мононуклеарной фракции клеток периферической крови

пациенток программы ЭКО до начала стимуляции составило: 23,4±3, фемтомоль/млн. клеток и 5,9+1,5 фемтомоль/млн. клеток соответственно. В ден пункции яйцеклетки величина специфического связывания стероидных гормоно увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контрольной точкой. В день подсадк эмбриона в полость матки уровень специфического связывания 3Н-прогестерон увеличился- в 1,3 раза, а 3Н-эстрадиола в 2 раза по сравнению с контрольной точко (р< 0,005).

4. Уровень специфического связывания 3Н-прогестерона, определенны радиолигандным методом, с клетками мононуклеарной фракции крови в 21-23 ден менструального цикла у пациенток I группы (с успешной имплантацией), состави 4,7±2,2 фемтомоль/млн. клеток, во II группе (отсутствие имплантации) - 0,7±0, фемтомоль/млн. клеток, р=0,0024. Уровень специфического связывания 3 эстрадиола, выявленный радиолигандным методом, с мононуклеарами крови пациенток обследованных групп, не отличался: 2,79±1,2 ув 2,72±1,1 фемтомоль/мл! клеток в первой и второй группах соответственно, р=1,056.

5. У 31 пациентки (62%), включенной в программу ЭКО, отмече преимущественное связывание дидрогестерона с гестагеновыми рецепторам мононуклеаров периферической крови, превышающее связывание прогестерона среднем в 10,6 раз.

Практические рекомендации:

1. Рецепторный статус эндометрия не имеет положительной корреляции успехом ЭКО, поэтому проведение данного, трудоемкого исследован нецелесообразно.

2. Пациенткам планирующим участвовать в программе ЭКО, рекомендует определение уровня РП в МНФК перед началом стимуляции суперовуляции. П] уровне рецепции прогестерона в МНФК ниже 1,3 фемтомоль/млн клет пациенткам показана предварительная гормональная подготовка.

3. В первом триместре беременности необходима гестагенная поддержка, п]

этом эффективность данной процедуры зависит от индивидуального подбо

препаратов. При связывающей активности РП с дидрогестероном превышающ

22

порог в 100%, рекомендуется использование дидрогестерона, а при более низких значениях адекватную гестагенную терапию предлагается проводить препаратами натурального прогестерона.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Сукновалова М.В. Параметры рецепции женских половых гормонов в мононуклеарной фракции периферической крови, как маркер эффективности экстракорпорального оплодотворения // Материалы II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, Москва, -2007- С.314.

2. Сукновалова М.В. Состояние рецепции женских половых гормонов и эффективность экстракорпорального оплодотворения / Савельева Г.М., Карева E.H., Сукновалова М.В. и др. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологин -2011.-том 10-№1 - С. 24-28.

3. Сукновалова М.В. Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции / Савельева Г.М., Шимановский Н.Л., Сукновалова М.В. и др. // Бюллетень Изобретения Полезные Модели. Москва. - 2011. - № 27 (IV ч.) - С. 940

4. Сукновалова М.В. Связывающие свойства рецепторов прогестерона с дюфастоном у пациенток включенных в программу экстракорпорального оплодотворения / Сукновалова М.В., Крамаренко М.П., Карева E.H. // Вестник Российского Государственного Медицинского Университета. Специальный выпуск -2011.-№1 - С. 217.

5. Сукновалова М.В. Способ прогнозирования наступления беременности у пациенток, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения в стандартном длинном протоколе. / Савельева Г.М., Шимановский H.JL, Сукновалова М.В. и др.// Лечащий врач - 2013.- №3 - С. 46-50.

6. Сукновалова М.В. Относительная связывающая активность дидрогестерона с рецепторами прогестерона мононуклеарных клеток периферической крови пациенток, включенных в программу ЭКО. / Сукновалова М.В., Бехбудова JI.X.,

Клименко М.П. и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология - 201 -том 76-№7-С. 24-26.

7. Сукновалова М.В. Фармакологическое обоснование применен дидрогестерона в длинном протоколе программы экстракорпорально оплодотворения. / Сукновалова М.В., Клименко М.П., Нефёдова И.В. // Материал II Молодежного международного форума медицинских наук "Мес^АУБ": Сборн тезисов научно-практической конференции. Москва - 2013, - С. 187.

Подписано в печать 11.10.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 60 Экз. Заказ № 1981-8-14 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39