Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Возрастная динамика цитологических показателей симпатических нейронов в условиях неонатальной андрогенизации

РГ6 од

О Ъ ф£В

На правах рукописи

ЦУВДЕВА АННА ЛЕОНИДОВНА

ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИМПАТИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ В УСЛОВИЯХ НЕОНАТАЛЬНОЙ АНДРОГЕНИЗАВДИ.

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических гаук

Москва, 1095

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете.

Научный руководитель:

академик РАМН,, " ' - .

доктор медицинских наук, профессор В. Н.Ярыгин.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.И.Козлов

доктор медицинских наук, профессор . " Т.Г.Боровая

Ведущее учреждение - Институт мозга РАМН.

Защита диссертации состоится " " 1997 г.

в ¡у часов на заседании слеодаливированного совета Д 084.. 14.04 при Российском государственном медицинском университете (117869", Москва,' ул. Островитянова', д. 1) '

С диссертацией можно ознакомиться в бибилиотеке РГМУ.

Автореферат разослан "3/ " 199^г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук, профессор

А.Н.Тихомиров

Актуальность проблемы. Экспериментальная гипертрофия периферического отдела симпатической нервной системы представляет собой важную, но недостаточно изученную модель, открывающую новые перспективы исследования ее физиологической роли в организме. Основой для создания такой модели явились представления о возможности затормозить процесс естественной запрограммированной клеточной гибели в онтогенезе узлов симпатической нервной системы и увеличить таким образом количество нейронов.

В настоящее время основной причиной гибели нервных клеток , происходящей^in vivo, считается дефицит эндогенного фактора роста нервоз (ФРН) (Крыжановский Г.Н., Луценко В. К.,1995). Предполагается, что нарушения синтеза и транспорта <£?Н в краниальном шейном ганглии (КШГ) и его'органах-мишенях.играют определенную роль в патогенезе диабетической нейропатии и мыпечной дистрофии Дюиена (Hellweg, Härtung, 1990; Hellweg et al., 1991; Hirota et al., 1994). Не вызывает сомнений важность дальнейшего изучения путей регуляции нервной трофики тканей и поиск фармакологических агентов, тормозящих программу апоптоза за счет усиления синтеза ФРН в организме. Возможно, именно такими вещества.™ являются половые стероидные гормоны, в частности, тестостерон. Показано, ^что введение тестостерона новорожденным животным оказывает ги-персимпатизирующий эффект и приводит к увеличения .популяции нейронов КШГ, причем предполагается опосредованный механизм действия гормона через повышение продукции ФРН в подчелюстной слюнной железе (ПЧСЖ) (Dibner, Black, 1978; Wright, Smolen, 1983). Однако необходимо более детальное изучение действия гормонов ка симпатическую систему; важно также выявить отдаленные последствия их неонатального введения, проявляющиеся в более поздние возрастные периоды.

В связи с этим целью нашего исследования явился анализ возрастной динамики ряда цитологических параметров нейронов КШГ у " неонатально андрогенизированных животных. Для достижения поставленной цели Предполагалось решение следующих задач:

1. Сравнить' возрастную динамику матричной активности хроматина ядер нейронов КШГ в норме и после воздействия тестостерона

на новорожденных-крыс. ' "

2. Выявить закономерности роста симпатических нейроцитов в условиях андрогенного- воздействия.

3. Исследовать взаимосвязь количества и размеров нервных клеток с показателями их медиаторного обмена.

_ о _

Научная новизна исследования. Впервые к изучению явления ги-персиыпатизации применен онтогенетический подход, то есть проведена оценка отдаленных последствий действия гормона, вводимого в лериод новорожденности, на.симпатическую нервную, систему. Впервые в рамках данной модели исследованы матричная активность хроматина, размеры перикарионов нейронов и количественно определена интенсивность флуоресценции катехоламинов з цитоплазме.

Выявлено, что тестостерон, вводимый неонатально, ускоряет рост симпатических нейронов в более поздние возрастные периоды. Установлен факт снижения матричной активности хроматина у гипер-симпатизировачных животных к 3-месячному возрасту и устойчивость данного эффекта на протяжении первого года жизнй. Показано отсутствие зависимости концентрации норадреналина в перикарионах от интенсивности процесса транскрипции в ядрах нейроцитов КШГ.

-Практическая значимость работы. Полученные в представленном исследовании результаты имеют значение для понимания закономерностей развития и функционирования симпатической нервной системы в условиях гипертрофии ее периферического отдела и могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах биологии и гистологии медицинских институтов.

'Модель' н'еонатальной андрогенизации может быть применена в научно-исследовательской работе для изучения механизмов действия половых стероидов на симпатические нейроны, а также для оценки жизнеспособности гиперсимпатизированных животных.

Данная модель может быть предложена для экспериментального • изучения тех патологических состояний, которые"связаны с изменением режима функционирования симпатической нервной системы: ги-пертензии, сахарного диабета, мышечной дистрофии Дюшена и т.д., что в сбою очередь будет, иметь непосредственный выход, в- клиническую практику.

\

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИЙ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Тестостерон . замедляет реализацию программы клеточной гибели-в КШР у новорожденных самок крыс и приводит к увеличению количества еьекивших нейронов.

- 2. Экзогенный тестостерон, применяемый з раннем постнаталь-•ном периоде, ускоряет процессы роста и дифференцировки нейроцитов КШГ.

. 3. Ускорение роста и дифференцировкн симпатических нейронов приводит к изменению режима матричной активности их хроматина.

4. Динамика показателей медиаторного. обмена сопоставима'у контрольных и неонатально андрогенизированных животных. ■ ■

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Конгрессе международной ассоциации морфологов (Тверь, июнь 199Б), на международной конференции "Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов" (Астрахань, сентябрь 1296) и на совместном научном заседании кафедр биологик,, морфологии, и цитологии 'МВФ й отдела.морфологии й электронной микроскопии РГЫУ (Москва, ноябрь 1996).

- Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 работы, - список которых приводится в конце автореферата.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (1 - Обзор литературы, 2 - Материал и методы исследования, 3 - Результаты собственных исследований, 4 - Обсуждение результатов), выводов и списка литературы. Содержание работы иллюстрировано 6 таблицами, 26 рисунками, и 9 микрофотографиями. Список литературы включает 38 отечественных и 117 зарубежных источников. /

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на нейронах краниального шейного симпатического ганглия самок крыс линии Вистар четырех возрастных групп: 1, 3, б и 12 месяцев. Был исследовал материал от 111 животных.

Масляный раствор тестостерона-пропионата вводили подкожно, в дозе 80 иг/кг, начиная с 3-го дня после рождения и далее через каждые 48 часов по схеме, предложенной Dibner и Black (1978). Часть экспериментальных животных получила различное число инъекций (от 1 до 14) с целью изучения дозового эффекта тестостерона; материал забирался в возрасте 30 дней под эфирным наркозом. Остальные животные получали тестостерон-пропионат весь первый месяц лизни (14 инъекций) и использовались для исследований в различных возрастных точках. Контрольным животным вводили стерильное оливковое масло по той же схеме.

Для оценки гипертрофического эффекта тестостерона на ПЧСК определяли отношение массы железы к массе тела животного'.

Подсчет клеток.проводили на серийных парафиновых срезах КШГ,.. окрашенных 0.1% раствором метиленового синего. На каждом пятом срезе считали общее число нейронов; полученные данные суммировались. С помощью винтового окуляр-микрометра при увеличении микроскопа 1500х измеряли наибольший и наименьший' диаметры клетки. Перемножив эти величины, получали значение профильного поля нейрона в относительных единицах. В обоих случаях для исследования выбирали срезы перикарионов, содержащие ядрышко. Профильное поле нейрона оценивали как среднее для'50 измеренных -клеток от каждо-" го животного.

С целью изучения возможности синтеза ДНК в ядрах симпатических нейронов у животных первого месяца жизни, мы применили параллельное введение тестостерона и 3Н-тимидина.

Метил-3Н-тимидин (уд. активность 25 кКи/ыоль) вводили подкожно в дозе 5 ыкКи/г 3 раза в день с интервалом между инъекциями 6-7 часов в течение первой, второй или четвертой недели после рождения. В каждой из трех, групп животных введение тестостерона начинали с 3-х'суток жизни. После поступления в организм 3Н-тй-" мидин включается в ДНК только тех клеток, которые находятся в состоянии S-периода клеточного цикла, и может затем быть обнаружен автсрадиографически.

Материал забирали у хивотных в возрасте 30 дней. Серийные срезы КШГ покрывали эмульсией типа М и экспонировали 14 дней. Окрашивание препаратов проводили 0. II раствором метиленового синего.

Для оценки уровня транифипции, отражающего интенсивность синтеза РНК в нейроцитах, был применен метод авторадиографического определения активности эндогенных PHfr-полимераз (Moore, 1978). В работе использовались криостатные срезы КШГ толщиной 8 мкм. Экспозиция всех препаратов проводилась одновременно, что позволяет сравнивать результаты, полученные в разных возрастных группах'. Активность транскрипции ядерного хроматина оценивали по количеству зерен восстановленного серебра над ядрышком и нукле-оплазмой при увеличении 1000х. Были исследованы ядра 50 нейроци-тов от каждого животного.

С целью изучения интенсивности флуоресценции катехоламинов в перикарионах нейроцигов КШГ, животным в условиях общей анестезии проводили перфузию через левый желудочек сердца смесью ГАЕЬи, ... содержащей 42 ларафармапьдегвда и 17. глутарового альдегида на. 0.1М фосфатном буфере (рН 7.0-7.2). Ганглии выделяли и инкубировали в той же смеси при +4°С от 6 до 24 часов. Криостатные срезы КШГ толщиной 15 мкм просматривали в люминесцентном микроскопе ЛШАМ-ИЗ с "зеленой" 'светоделительной пластинкой, используя фильтр возбуждения флуоресценции ФС-1-4 и запирающий фильтр ЖС-3. Количественное исследование интенсивности параформ-индуцированной флуоресценции катехоламинов производили с помощью приставки «ШЗЛ-2 к люминесцентному микроскопу. Измеряли интенсивность свечения цитоплазмы не менее 50 клеток от каждого животного зондом 0.5 при увеличении 40х.

Статистическую обработку полученных результатов и вычисление коэффициентов корреляции проводили при помощи компьютерной программы БТАТ0?АРН1С5. Достоверность различий средних величин опре-.деляги с использованием 1-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика количества нервных клеток КШГ

в нормальном развитии и после введения тестостерона.

По нашим данным, количество нейронов в КШГ 1-месячных контрольных самок крыс составляло в среднем 18092+921.

Введение тестостерона в первые 3 недели жизни не вызывало увеличения числа нервных клеток: у крыс, получивших от 1 до 9 доз тестостерона-пропионата, этот показатель не отличался от - контрольных значений. Только после 10-кратного введения гормона наш зафиксирован достоверный прирост количества нейронов в ганглии. При повышении суммарной дозы тестостерона количество клеток постепенно нарастало, хотя четкий дозозависимый эффект • выявлен ' не был. К концу первого месяца-жизни среднее значение данного показателя превышало соответствующее контрольное в 1.47 +0.18 раза (табл.1).

Таблица 1. Подсчет количества нейронов в КШГ при введении тес-' тостерона (возраст - 1 месяц).

количество инъекций гормона количество клеток достоверность отличия от контрольного. значения

контроль 18092 + 921 ' \

9 17394 + 863 р > 0.05

10 22478 +'490 р < 0.05

11 21951 + 1132 р > 0.05

1? 23106 + 791 р < 0.05

13 25657 + 1342 р < 0.05

14 26625 + 617 р < 0.05

2. Анализ влияния тестостерона на возможность включения 3Н-тимадина в ДНК ядер нейронов КШР.

Для того чтобы установить, имеет ли место пролиферация ней-робластов КШГ в раннем постнатальном онтогенезе в условиях анд-рогенного воздействия, • и если да, то в какой мере эффект увеличения количества нейронов зависит от процесса пролиферации, мы поставили эксперимент с параллельным 'введением тестостерона и 3Н-тимидина. При изучении.препаратсз не было обнаружено включения меченого предшественника -в ДНК ядер нейроцитов ни в одной из исследованных групп животных. Тем не менее мы допускаем вероятность пролиферации нейробластов в раннем постнатальном онтогенезе: возможно, доля делящихся клеток мала, и по этой причине не был зафиксирован синтез ДНК в нашем -¡кспериментг^ном материале.

Однако размножение малодифференцированных предшественников ней-роцитов, если таковое имеет место, не приобретает массового характера и не является определяющей причиной увеличения количества нейронов КШГ самок крыс в условиях неонагальной гидрогенизации.

3. Анализ влияния тестостерона на массу тела и массу ПЧСЖ крыс.'

Одним из наиболее объемных органов-мишеней для нейронов КШГ является ПЧСЖ, в тубулярной части которой вырабатывается ФРН, поступающий с помощью ретроградного аксональвого транспорта в лерикарионы нейроцитов (Калюнов B.H.-,''1984, 1986; Kaechi, 1992). Существует половой диморфизм у грызунов как в отношении массы ПЧСЖ,. так и в отношении количества синтезируемого ФРН. У самцов оба эти показателя значительно выше, чем у самок (Beaston-Wimmer, Smolen, 1991).

При введении тестостерона новорожденным самкам мышей и крыс наблюдается, с одной стороны, выраженная гипертрофия ПЧСЖ (Dib, пег, Black, 1976b, 1978); с другой стороны,- увеличение скорости синтеза эндогенного ФРН (Ishii, Shooter, 1975; Aloe, Levi-Mon-talcini, 1980; Black et al., 1992). В целях дальнейшего анализа механизма действия тестостерона-и для- оценки- устойчивости" гипертрофически изменений ПЧСШ в онтогенезе, мы определяли отношение массы ПЧСЖ к массе тела животного в 3- и 12-месячном возрасте. Поскольку,неонатальная гидрогенизация не оказала влияния на массу тела крыс в исследованных нами возрастных точках, а масса ПЧСЖ у опытных 3- и 12-месячных животных оказалась достоверно выше соответствующих контрольных значений, ,то' и отношение массы железы к массе тела было больше у 3-месячных опытных крыс по сравнению с контролем (р<0.05)г эффект сохранялся до конца первого года жизни (табл.2).

Этот факт может косвенно указывать на опосредованный механизм действия гормона, то есть через усиление синтеза эндогенного ФРН, который затем поступает в тела нейроцитов путем ретроградного аксонаДьно'го транспорта. ' Усиление трофической поддержки со стороны органов-мишеней и расширение площади иннервируемого поля для нейронов узла способствуют выживанию большего количества нейронов КШГ и/или ускорению их дифференцировки.

Таблица 2. Влияние введения тестостерона на массу ПЧСЖ самок крыс.

воэраот животных экспериментальная серия масса животного, (Г) масса . железы,„ (г х 10 3) масса желевы масса животного (х 10~4) достовер ность различий

3 мес. контроль 178.7 + 2.0 68.3 + 6.2 3.8 + 0.4 р < 0.05

опыт 176.0 + 4.2 97.7 + 6.8 Б.Б + 0.3

12 мес. 3 контроль 288.0 + 16.3 82.7.+ 6.4 2.9 + 0.2 р < 0.01

опыт 288.0 + 6.7 122.7 + 2.Ô 4.3 +0.1

- 9 -

4. Динамика размеров нейроцитов

у контрольных и андрогенизированных животных.

Результаты измерения лерикарионов нейронов КШГ у контрольных животных подтверждают полученные ранее данные других исследователей о продолжающемся росте симпатических нейронов в течение длительного периода постнатального онтогенеза. По нашим данным, наиболее интенсивный рост нейроцитов КШГ у самок приходится на период между 3-м и 7-м месяцем жизни (рис.1).

Следует отметить значительное разнообразие нейроцитов КШГ в отношении их размеров: например, у 1-месячных животных размеры нервных клеток колеблются от 10812 до,65372 относительных единиц. При гаком разбросе данных различия средних значений профильного поля (32064+826 для контрольной группа и 28399+614 для опытной) представляются незначительными, хотя и являются статистически достоверными (р<0.05). При сравнении гистограмм распределения нейронов КШГ 1-месячных крыс по размерам лерикарионов выявляется, что указанные выше средние значения находятся в пределах одного и того же класса вариационного ряда. У контрольных животных несколько реже встречаются мелкие клетки и чаще - крупные по сравнению с получавшими тестостерон животными.

Мы выделили два немаловажных, на наш взгляд, момента для объяснения того факта, что у 1-месячных опытных животных измеренные нами профильные поля нейронов в среднем ниже, чем б контрольной группе..Во-первых, в процессе нормально протекающей клеточной гибели элиминируются прежде всего те нейроны, которые выходят из пролиферативного пула последними (Hendry, 1977а). Возможно, это наиболее мелкие клетки, так как они позже вступают в период интенсивного роста. Поскольку прирост количества нейронов в условиях андрогенизации осуществляется главным образом за счет таких клеток, доля их в общей популяции ганглия повышается, а среднее значение величины профильного поля соответственно понижается по отношению к контролю. Во-вторых, сопоставляя результаты наших исследований, полученные разными методами, можно предположить, что введение тестостерона новорожденным самкам ускоряет дифференцировку симпатических нейронов- КШГ. В таком случае должен замедляться рост клеток, так как периоды роста и диффе-ренцировки закономерно чередуются в процессе индивидуального развития. Однако в более поздние Бозрастные периоды наблюдается увеличение темпов роста нейронов под влиянием тестостерона. Так,

уже к 3-месячному возрасту среднее значение размеров перикарио-нов у опытных самок крыс достоверно выше, чем в контроле; это соотношение сохраняется и в 6-месячном возрасте, а к концу первого года жизни .различия, нивелируются, (рис.1). При анализе гистограмм распределения нейроцитов КШГ по их размерам в 3-месячном возрасте можно отметить сдвиг вправо класса наиболее часто встречающихся размеров клеток у опытных животных по отношению к контролю. Кроме того, у 3- и 6-месячных крыс в условиях гормонального воздействия выше доля крупных нейронов и соответственно ниже доля мелких в общей популяции узла по сравнению с нормой. Характер распределения нейроцитов по размерам перикарионов у 12-месячных животных сходен для опыта и контроля.

Несмотря на очевидность факта роста симпатических нейронов в постнатальном онтогенезе, наблюдается неравномерность этого процесса у различных групп нейроцитов: мелкие клетки (менее 20000 отн. ед.) встречались во всех исследованных возрастах. Данный факт можно объяснить исходя из представлений о том, что реакция отдельных клеток на стимул к росту может быть избирательной (ЯрыгинВ.Н., Лебедев Д.Б., 1979; КогсМпг, 1993). г

5. 'Транскрипционная активность ядёр-нейронов.КШГ ' в нормальном развитии и в условиях неонатальной андоогенизаши.

При анализе интенсивности транскрипции, происходящей в нейронах КШГ, мы рассматривали три показателя: матричную активность нуклеоплазмы, матричную активность ядрышка и суммарную матричную активность хроматина ядра. Следует указать, что третий из перечисленных параметров не является арифметической суммой первых двух, так как определенный вклад в суммарную матричную активность вносят нейроны с двумя и тремя ядрышками, сравнительно часто встречающиеся в ткани КШГ (от 1 до 8 на каждые 50 исследованных клеток). При оценке активности ядрышкового хроматина в таких клетках данные по каждому ядрышку учитывались отдельно.^

В процессе нормального, онтогенеза наблюдалось увеличение суммарной матричной активности хроматина- между 1-м и 7-м месяцем жизни; к 12-месячному возрасту не происходило достоверных изменений среднего значения интенсивности"транскрипции (рис.2). Динамика транскрипционной активности на протяжении первого года жизни сходна для нуклеоплазмы и ядрышек контрольных животных

(рис.3, 4); коэффициент корреляции между данными параметрами высок (г=0.9б). У неонатально андрогенизированных крыс высокая степень корреляции здесь теряется (г=0.23).

Для объяснения стабилизации матричной активности между б- и 12-месячным возрастом можно привлечь данные Н.Н.Чучковой (1985), свидетельствующие о существовании периода устойчивых показателей функционирования аппарата биосинтеза белка, который приходится на стадии молодого и зрелого репродуктивного возрастов.

У 1-месячных опытных животных мы зафиксировали значительное превышение интенсивности транскрипции по отношению к контролю, причем рост мечения происходил главным образом за счет увеличения" активности синтеза РНК в нуклеоплазме, поскольку для этой возрастной группы различие в мечении ядрышек статистически недостоверно (рис.3. А). Этот факт можно объяснить ускорением процесса дифференцировки под влиянием тестостерона, расширением спектра синтезируемых белков и усилением общей метаболической активности нейроцигов КШГ, связанной) вероятно, с более ранним запуском ростовых процессов. Можно предположить, что начинают ■усиленно транскрибироваться РНК структурных белков и ферментов, обеспечивающих рост нервных клеток ганглия. И хотя в 1-месячной возрастной точке ускорение роста нейронов у опытных крыс еще не проявляется морфологически, может иметь место реализация этого процесса на уровне транскрипции генетического материала.

Бри анализе гистограмм распределения нейроцитов по интенсивности мечения в возрасте 1 месяц выявлены значительные различая между контрольной и опытной группой. В условиях гормонального воздействия происходит сдвиг гистограмм вправо для ядерной и нуклеоплазматической метки, то есть в сторону- значительного уменьшения доли'слабомеченых и соответствующего увеличения доли сильномеченых клеток. Гистограммы распределения для ядршкоЕж сайтов хроматина не выявляют различий в средних показателях матричной активности в данной возрастной группе.

•' При изучении влияния веонатальной андрсгенизацки на интенсивность транскрипции в ядрах нейронов КШГ в более поздние возрастные 'периоды, нами зафиксирована неожиданная, на первый взгляд, картина: резкий спад матричной активности хроматина всех ядерных структур к' 3-месячному Бсзрасту и сохранение у значительной части популяции нейронов менее напряженного по сравнению с контролем режима матричной активности до конца первого года

жизни. Графики динамики матричной активности хроматина (рис.2, 3, 4) характеризуют состояние аппарата транскрипции в 3-месячном возрасте как противоположное тому, что мы наблюдали у 1-месячных самок крыс. Гистограммы распределения нейронов по интенсивности.' меченая ядра, нуклеоплазмы и ядрышек для 3-месячной возрастной точки также демонстрируют значительные-различия между контрольной и опытной группами: . у опытных животных наблюдается резкое увеличение количества слабоыеченых клеток и отсутствие нескольких классов скльномеченых клеток, встречающихся в норме.

Для объяснения данного явления могно сопоставить наши результаты с - полученными ранее на десимпатизированных животных. Бри частичной "десимпатизации гуанетидзаом происходило увеличение " транскрипционной активности нейронов КШГ у крыс в молодом и зрелом возрасте (Чучкова H.H. с соавт., 1987). Этот эффект авторы объясняли адаптацией клеток к режиму повышенной функциональной нагрузки. Мсшю предположить, что в нашем эксперименте увеличение количества нейронов в популяции КШГ позволяет снизить функциональную нагрузку, приходящуюся на отдельно- взятую клетку, причем это, вероятно, происходит в условиях усиленной трофической поддержки фактором роста нервов, поступающим ретроградно из ПЧСЖ. Это, з свою очередь, дает возможность значительной части популяции нейронов сохранять менее напряженный ритм интенсивности транскрипции по сравнению с контролем на протяжении всего периода зрелости.

К 6-месячному возрасту наблюдается рост матричной активности хроматина как у контрольных, так и у гиперсимпатизированных животных, но опытная группа характеризуется по-прежнему более низкими абсолютными значениями данного показателя (рис.2, 3). Заметно увеличивалась интенсивность мечения ядрышек у опытных крыс на исследуемом отрезке онтогенеза, но она оставалась все же достоверно ниже соответствующих контрольных значений (рис.4).

У 12-месячных животных сохранялась сходная с ранее изученными возрастами картина интенсивности синтеза РНК как в нуклеоп-лазме и ядрышках, так и в ядре в целом.

' • Были рассчитаны коэффициенты корреляции между матричной активностью хроматина и размерами перикарионов в постнатальном онтогенезе самок крыс. Установлено наличие положительной корреляции сравниваемых параметров в норме (г=0.78) и полное ее отсутствие у опытных животных (г=-0.18).

а 1Ю>

51

43

3? 33 27

в 2 4 ( 8 И 12

Рис.1. Возрастная динамика размеров лерикарионов нейронов КШГ. 1"- опыт; 2 - контроль. По оси абсцисс - возраст животных, месяцы. По оси ординат - размеры в относительных единицах.

По оси абсцисс - возраст животных, месяцы. По оси ординат -количество зерен восстановленного серебра над ядром.

Рис.3. Возрастная динамика матричной.активности внеядрышкового.

хроматина нейронов КШГ. 1- опыт; 2 - контроль. По оси абсцисс - возраст животных, месяцы. По оси ординат -количество зерен восстановленного серебра над нуклеоплазмой.

Рис.4. Возрастная динамика матричной активности хроматина

ядрышек нейронов КШГ. 1 - опыт; 2 - контроль. По" оси абсцисс - возраст животных, месяцы. По оси ординат -количество зерен восстановленного серебра над ядрышком.

.- 15 -

6. Интенсивность йдуоресценции цитоплазмы норадренергических нейронов в нормальном развитии и после введения тестостерона.

■Интенсивность параформ-индуцированной флуоресценции тел ней-роцитов позволяет судить о концентрации катехоламинов в перика-рионе и в какой-то мере указывает на интенсивность метаболизма медиаторов, а также на уровень функциональной активности клетки в целом.

Для количественной оценки флуоресценции катехоламинов использовались нейроны с хорошо контурируемыми несветящимися ядрами. Интенсивность свечения цитоплазмы нейроцитов изменялась в широких пределах: от 10 до 130 относительных единиц. В ткани КШГ крыс разного возраста нам неоднократно встречались МИФ-клетки, одиночные или собранные в кластеры, интенсивность флуоресценции которых превышала средние показатели для нейропитов в 3-5 раз.

В контрольной группе между 1-м и 7-м месяцами жизни не происходило достоверных изменений средней интенсивности свечения (табл.3). Этот факт согласуется с результатами ряда авторов, по-'казыващими, что к 1-месячному возрасту устанавливается основные параметры сйнаптического проведения и концентрация катехоламинов в КШГ, .характерная для взрослых животных №ау1ез, 1979; Зю1еп, ВеаБ^п-Щттег, 1989-, 6ге1Г е1 а1., 1992).

Бри сравнении средних величин интенсивности свечения цитоплазмы нейронов у контрольных и андрогенизироваяных животных было отмечено, что' в возрасте 1 и 3 месяца эти показатели в опытной группе несколько ниже контрольных значений, а 6- и 12-месячнсы возрасте - наоборот. При проверке статистической значимости выявлена недостоверность различий средних величин во' всех исследованных возрастных точках. Наряду с этим наблюдалось существенное снижение интенсивности катехоламиновой флуоресценции в нейронах КШГ самок крыс к 12-месячному возрасту как контрольной, так и в опытной группе (табл.3).

- В целом динамика интенсивности флуоресценции не газррелирова-.ла ни с показателями роста клеток, ни с. изменениями матричной активности их хроматина. '

Следует уделить внимание то!ду обстоятельству, что введение нами тестостерона не Доказывало влияния -на содержание катехоламинов в нейроцитах ни в одной из исследованных возрастных точек. Отмечено, что при усилении функциональной нагрузки, в частности,

- 16 -

Таблица 3. Интенсивность катехолзминовой флуоресценции цитоплазмы нейронов КШГ.

возраст животных контроль опыт достоверность различий

41 мес! 64.8 ± 1.6 59.0 4 1.8 р > 0.05

3 мес. .65.7 4 1.9 58.7 4 1.8 р > 0.05

6 мес. 66.5 4 1.3 72.5 4 1.9 р > 0.05

12 мес. 39.4 4 1.4 , 44.0 4 1.5 р > 0.05

при холодовом стрессе усиливалась и флуоресценция в перикарионах нейронов КШГ (Costa, Егалко, 1973). Поскольку мы предполагаем снижение такой нагрузки, приходящейся в наших экспериментальных-условиях на отдельно взятую клетку, вполне объяснимо и отсутствие зффекта гормона на содержание норадренадина в цитоплазме. Следует'также иметь в виду, Что наши измерения не учитывают возможных изменезий метаболизма норадреналкна на уровне аксонных терминален, где содержание медиатора в сотни раз выше, чем в перикарионах нейроцитов.

Нами показано, что у опытных крыс к 6-месячному возрасту увеличивается доля сильно светящихся клеток и уменьшается процент слабосветящихся в общей нейрональной популяции узла, хотя средняя величина интенсивности флуоресценции при этом не отличается достоверно от контрольных значений. Возможно, это говорит о том, что реакция на воздействие проявляется со стороны незначительной части популяции нейронов ганглия.

Результаты нашего эксперимента не противоречат гипотезе о том, что изменения в размерах, количестве нейронов и некоторыми* нейрохимическими сдвигами в них являются независимыми (Messina, Bell, 1993). Установленное нами отсутствие как положительной, так и отрицательной корреляции между ростом клеток и интенсивностью флуоресценции их перикарионов также свидетельствует в пользу данного предположения.

ВЫВОДЫ

1. В условиях неонатальной гидрогенизации количество нейронов в КШР самок крыс возрастает более чем в 1.28 раза по отношению к контроля. Эффект тестостерона проявляется после 3-недель-ного воздействия и объясняется, главным образом, повышением выживаемости нейронов узла.

2. Увеличение количества нейронов не сопровождается пролиферацией нейробластов в ганглиях новорожденных животных.

г

3. Размеры перикариоков нервных клеток КШГ 1-месячных крыс в условиях гормонального воздействия не превышают соответствующих контрольных значений. В дальнейшем темпы роста нейроцитов у нео-натально андрогенизировакных животных увеличиваются по сравнению с контролем.

4. Суммарная матричная активность хроматина ядер симпатических нейронов у 1-месячных опытных крыс значительно выше, чем в контрольной группе.., Рост данного■показателя происходит преимущественно за счет активности нуклеоплазмы при сохранении уровня транскрипции в ядрышковых сайтах ДНК.

■ 5. К 3-месячному возрасту у неонатально андрогенизированных самок крыс, в отличие от контрольных животных, снижается матричная активность хроматина всех ядерных структур в значительной части популяции нейронов ЙЯР. Менее напряженный режим матричной активности сохраняется до конца первого года жизни.

6. Введение тестостерона не оказывает существенного влияния на уровень параформ-индуцированных флуорофоров, характеризующий содержание норадреналина в цитоплазме нейроцитов МОГ. Динамика концентрации норадреналина в перикарионе не коррелирует ни с параметрами роста' клеток, ни с изменениями матричной активности их хроматина.

>

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Модель неонатальной аядрогенизации, примененную в данной работе с целью изменения режима функционирования симпатической нервной системы, можно рекомендовать в, качестве экспериментальной основы для изучения механизмов развития патологий, связанных с нарушением нервной трофики тканей.

Выявленные з работе особенности влияния тестостерона на симпатическую нервную систему должны учитываться в клинической практике при назначении соответствующей гормонотерапии.

I

!

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TBE ДИССЕРТАЦИИ |

I

1. В.Н.Ярыгин, А.Л.Цуциева. Влияние неонатальной андрогени- ! зации на популяцию нейронов краниального шейного ганглия. //Ма- •; териалы Ш Конгресса международной ассоциации морфологов.- j Тверь, 1995.- Морфология.- Т.109, N 2.- С.110.

2. В.Н.Ярыгин, А.Л.Цуциева. Изменение количества и размеров нейронов краниального шейного ганглия крысы под воздействием тестостерона. //Материалы международной конференции "Структурные преобразования органов и ткачей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов".- Астрахань, 1996.-C.2Z4.

3. В.Н.Ярыгин, А.Л.Цуциева, О.Н.Хрущева. Влияние неонаталь-ного введения тестостерона на матричную активность хроматина и размеры перикарионов симпатических нейронов крыс. //Бюлл. экспе- 1 рим. биологии и медицины.- 1997.- N .- С.