Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Восстановление кожных покровов у обожженных с помощью культивированных фибробластов человека

1*1 и V "

_ 2 нив 1395

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи

ГЛУЩЕНКО Евгений Викторович

ВОССТАНОВЛЕНИЕ КОЖНЫХ ПОКРОВОВ У ОБОЖЖЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ ФИБРОБЯАСТОВ ЧЕЛОВЕКА

14.00.15 - Патологическая анатомия 14.00.27 - Хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена в Институте хирургии им.А.В.Вишневского РАМН

Научные консультанты - Лауреат Государственной премии

СССР, академик РАМН,заел.деятель науки РФ, профессор Д.С.САРКИСОВ

Доктор медицинских наук А.А.АЛЕКСЕЕВ

Официальные оппоненты - Доктор медицинских наук, профессор

Ю.Л.ПЕРОВ

- Доктор медицинских наук, профессор Л.В.КАКТ'УРСКИЙ

- Доктор медицинских наук, профессор С.И.ВОЗДВИЖЕНСКИЙ

Ведущее учреждение - Московская медицинская академия

им. И.М.Сеченова

Защита состоится 1995 г. и /Л1 часов

на заседании диссертационного совета ( Д.001.04.01 ) Института морфологии человека РАМН.

Адрес: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан "¿(.¡/(

1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук И.Н.ЕМЕЛЬЯНЕНКО

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Рост числа термических поражений в промышленно развитых странах,трудности лечения обожженных, высокая летальность у пациентов с обширными термическими поражениями, нерешенные социальные аспекты реабилитации обожженных ставят ожоговую болезнь в ряд наиболее важных проблем современной медицины.

Одним из основных методов лечения обширных ожогов является метод аутодермопластики( В.В.Юденич 1980;В.Рудовский с со-авт. 1980;Б.С.Вихриев,В.М.Бурмистров, 1986 ).Однако дефицит донорских ресурсов аутокожи, имеющий место у пациентов с обширными термическими поражениями резко снижает эффективность аутодермопластики, обуславливает ее многоэтапность, увеличивает риск развития фатальных осложнений, что в конечном итоге ухудшает результаты лечения таких пациентов. Именно поэтому особую актуальность для дальнейшего прогресса комбустиологии имеют исследования,направленные на разработку новых эффективных методов восстановления целостности кожных покровов у обо-женных (А.А.Алексеев,1992;В.Д.Федоров с соавт.1994)

Новые перспективы в лечении обширных ожогов открыли методы, основанные на использовании культивированных клеток кожи человека. Н. Green et all (1978,1979,1989 ) разработали методы получения больших объемов кератиноцитов человека в условиях in vitro. В начале восьмидесятых годов были предприняты первые успешные попытки закрытия ожоговых ран с помощью выращенного в культуре тканей эпителия (T.F.Burke, I.V.Yannas 1981; T.F.Burke 1982; E.Bell et al. 1981;1983;N.E. O'Connor et al.1981; I.V.Yannas 1983;1984). Однако анализ дальнейшего опыта использования культивированных кератиноцитов в лечении обожженных свидетельствует о том, что данный метод обладает рядом существенных недостатков. В частности, использование аутокератиноци-тов препятствует созданию банков клеток, увеличивает сроки, необходимые для изготовления достаточного по площади трансплантата до 3-4 недель (М.Eisinger et al.1979;Н.Green 1979; Y.Kuronayangi et al.1993). Это повышает риск развития осложнений и удлиняет время пребывания пациентов в стационаре. Одновременно этот метод оказался мало эффективным при лечении гранулирующих ожоговых ран (E.Bell et al.1983; M.De Luca et al.1989 ). Трансплантация культивированных кератиноцитов на

раны после хирургической некрэктомии, оказывается успешной в 20 - 80 % случаев tM.De Ьиса et а1.1989; С.С.Сошр1оп а1.1989; 1*.С.С.Теере е! а1.1990; Ь.И.Кие et а1.1993 ). Кроме того, метод характеризуется высокой себестоимостью,требует использования специальных ростовых сред и биологически активных стимуляторов роста клеток. Вышеперечисленные недостатки ограничивают использование данного метода в клинической практике и свидетельствуют о необходимости проведения дальнейших разработок по использованию клеточных культур при лечении обожженных.

Известна роль фибробластов в процессах регенерации. Продуцируя углеводно-белковые комплексы основного вещества соединительной ткани, участвуя в образовании ее волокон,синтезируя многочисленные факторы роста клеток и вступая в межклеточные, коллаген-фибронектин-клеточные взаимодейсткия, фибробласты являются важным звеном системы короткодистантных регуляторов процессов регенерации (Н.Г.Хрущов 1977; А.Б.Шехтер с соавт. 1977,1978,1984,1990; В.В.Серов,А.Б.Шехтер 1982;А.И.Струков, В.С.Пауков, О.Я.Кауфман 1990 ). Работами Д.С. Саркисова с соавт. (1983,1984,1987) показано, что клетки периваскулярной локализации - перициты обладают полипотентными свойствами в отношении формирования грануляционной ткани. Такие факты свидетельствуют о целесообразности выполнения исследований,направле нных на выявление возможностей использования культивированных клеток соединительной ткани, и в частности фибробластов, в комплексе местного лечения ожоговых ран. Положительное значение имеет и то обстоятельтво, что получение фибробластов в культуре не требует дорогостоящих питательных средств, стимуляторов роста, больших материальных затрат. Фибробласты в культуре легко подвергаются пассированию, частично утрачивая поверхностные антигены гистосовместимости (Е.Ве11 е! а1.1981;3.МапсЬаЬа1 е! а1.1989). Это открывает возможности использования для изготовления трансплантатов аллоклеток и создания клеточных банков,необходимых для быстрого изготовления и широкого клинического применения таких трансплантатов.

Разработок по использованию монослойных культур фибробластов для лечения обожженных в нашей стране и за рубежом до настоящего времени не существует. Не разработаны методики получения трансплантатов из монослойных культур фибробластов че-

/

ловека, их морфофункциональные характеристики, условия его хранения и транспортировки. Требуют уточнения и изучения механизмы влияния фибробластов на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов как in vitro, так и in vivo. И наконец - отсутствует опыт клинического использования монослойных культур фибробластов человека при лечении обожженных.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: На основании морфологического исследования разработать и обосновать методику восстановления целостности кожных покровов у обожженных с помощью трансплантации культивированных фибробластов человека и оценить эффективность ее применения.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести комплексную морфофункциональную оценку культур фибробластов человека на этапах получения трансплантата.

2. С помощью методов световой и электронной микроскопии, радиоавтографии изучить возможные пути влияния фибробластов на адгезию и пролиферацию кератиноцитов человека в культуре.

3. Разработать методику применения культированных фибробластов человека при местном лечении ожогов.

4. С помощью морфологических и клинических методов изучить эффективность применения культивированных фибробластов человека при лечении:

а) пограничных ожогов III степени;

б) глубоких ожогов III6 - IY степени;

в) длительно незаживающих ран донорских участков после аутодермопластики.

5. Изучить морфологическую динамику реакций тканей после трансплантации культивированных фибробластов на раны.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

1. В настоящей работе впервые на основании комплексного клинико-морфологического исследования научно разработан и предложен для практического использования метод восстановления кожных покровов у обожженных с помощью монослойных культур фибробластов человека. Метод защищен двумя авторскими свидетельствами, патентом России.

2. Проведено клинико-морфологическое изучениё и доказана высокая эффективности использования трансплантата из монослойных культур фибробластов человека в комплексном лечении обож-

- б -

женных:

- при лечении обширных пограничных ожогов III степени;

- при лечении обширных глубоких ожогов III6-IY степени;

- при лечении длительно незаживающих ран донорских участков.

3. Впервые определены пути наиболее эффективного получения трансплантатов из культивированных фибробластов человека, дана их комплексная морфологическая характеристика, определены сроки трансплантации на рану, наиболее благоприятные условия их хранения и транспортировки.

4. Выяснены некоторые механизмы влияния фибробластов на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов in vitro и in vivo.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. На основании полученных данных разработаны методологические вопросы получения трансплантатов на основе культивированных фибробластов человека: определены адекватные методики приготовления первичных культур фибробластов, необходимые этапы субкультивирования клеток, сроки трансплантации их на раны, условия храненния готовых трансплантатов.

Разработаны показания и противопоказия к трансплантации культивированных фибробластов при лечении обожженных.

Разработаны методики применения культивированных фибробластов при лечении пограничных ожогов III степени, глубоких ожогов III6-IY степени, длительно незаживающих ран донорских участков.

Определены гистологические критерии эффективности лечения ожоговых ран.

Вышесказанное позволило улучшить результаты лечения тяже-лообожженных.

ВНЕДРЕНИЕ. Основные положения и результаты работы внедрены в клиническую практику отделения патологической анатомии института хирургии им.А.В.Вишневского РАМН, Научно-практического центра термических поражений института хирургии им.А.В.Вишневского РАМН, детской клинической больницы N9 г.Москвы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены и обсуждены на: 12-ом французском национальном конгрессе комбус-тиологов (Бордо,1991),международной конференции " Интенсивное

лечение тяжелообожженных" (Москва, 1992), на заседании Ученого совета Института хирургии им.А.В.Вишневского. ( Москва, 17 . 12 . 1992 ; 22 . 09 . 1994),международной конференции "Раны и раневая инфекция"(Москва,1993),на симпозиуме "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации"(Москва,1993), на заседании общества патологоанатомов г.Москвы и Московской области (Москва,16.02.93 ), на 2-ой международной конференции "Лечение тяжелообожженных" (Пущино,1993),на 9-ом международном конгрессе по ожоговой травме (Париж,1994),на заседании президиума Академии медицинских наук РФ ( Москва, 22.06.1994 ).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации подготовлено 20 печатных работ, опубликованых в центральных медицинских журналах, сборниках научных - работ. Получено два авторских свидетельства и патент России на изобретения.

СТРУКТУР И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 224 страницах машинописи; состоит из введения, семи глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 85 источников на русском языке и 201 источник - на иностранном. Работа иллюстрирована 109 фотографиями и 17 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование включает в себя три основных раздела. В первом разделе основным объектом исследования были культуры фиб-робластов и кератиноцитов человека, на которых изучались основные закономерности развития клеток, оценивалась динамика их пролиферативной активности, изучались морфологичекие показатели экскреторной активности клеток, возможные пути влияния фиб-робластов на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов. Было исследовано более 500 образцов культур клеток.

Во втором разделе нашей работы основным объектом исследования были результаты 174 клинических наблюдений. У 97 больных в комплексном лечении с целью восстановления целостности кожных покровов была использована трансплантация культивированных фибробластов. У 77 пациентов (контрольная группа) применялось аналогичное лечение с помощью многокомпонентных мазей, управляемой антибактерильной среды, кроватей "Клинитрон",

традиционной аутодермопластики.

В третьем разделе представлены результаты сравнительного морфологического анализа материалов 130 биопсий, полученных из ожоговых ран пациентов вышеназванных клинических групп.

Первичную культуру фибробластов получали методом органного культивирования (Р.Фрешни,1989) из фрагментов кожи, полученных при. аутодермопластике. Плотность посева клеток при получении субкультур фибробластов человека составляла 20 х 103 на см2 поверхности и оставалась постояннной на всех этапах исследования.

Для изучения влияния фибробластов и их экскреторных белков на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов нами был проанализированы особенности морфологии и пролиферации этих клеток на субстратах из коллагена I, III типа и фибронектина (Sigma, США ),в совместной культуре с фибробластами человека; в культуре с фибробластами человека, подвергнутыми предварительной 10 минутной фиксаций 96° этиловым алкоголем.Кератино-циты человека получали из фрагментов кожи обожженных, взятой во время операции аутодермопластики (Eisinger М. et all 1980). Плотность посева кератиноцитов составляла 50x1О3 клеток на см2. В каждом случае опытные данные сопоставлялись с контрольными, полученными при культивировании кератиноцитов на пластике. Эти работы выполнены в лаборатории культивирования тканей института хирургии им.А.В.Вишневского РАМН - руководитель проф.В.П.Туманов.

Переживаемость клеток трансплантата изучалась с помощью морфологического и авторадиогарфического анализа , клеточных культур трансплантата через 2,6 и 24 часа его хранения при температуре равной +20° С, +4°С и +36°С.

Для специальных исследований часть культур клеток- фиксировали в зависимости от дальнейших задач в 10% растворе нейтрального формалина, 96° этиловым алкоголем или 1% раствором глутарового альдегида через 2,24 часа 3 и б суток от начала культивирования. Культуры клеток окрашивались толуидиновым синим, гематоксилиномом и эозином. С целью верификаций синтетической активности фибробластов культур, последние окрашивались альциановым синим с постановкой соответствующих контролей, по методу Ван-Гизон ( Пирс Э, 1960). Радиоавтографические иссле-

дования выполнялись в лаборатории авторадиографии отдела патологической анатомии Института - руководитель профессор А.А.Пальцын, электронномикроскопические исследования - в лаборатории электронной микроскопии - руководитель профессор Б.В.Втюрин.

Изучена эффективность применения в комплексном лечении обожженных трансплантации монослойных культур фибробластов :

1. При лечении пограничных ожогов III степени - 27 пациентов

2. При лечении глубоких ожогов III6-IY ст - 38 пациентов

3. При лечении длительно незаживающих ран донорских участков, сформировавшихся после забора кожных трансплантатов во время операции аутодермопластики - 32 пациента.

У 97 обследованных пациентов имели место ожоги пламенем, контактные ожоги, ожоги кипятком. Возраст пациентов колебался от 2 до 63 лет. 81,75% составляли мужчины и 18,25% -женщины. Площадь ожогов составляла от 1 до 8055 поверхности тела, из которых глубокие ожоговые раны занимали от 3 до 70 % поверхности тела. В результате применения трансплантатов из культивированных фибробластов на этапах хирургического лечения тяжелообож-женных была восстановлена целостность кожных покровов на площади от 28 до 1600 смг. У 95 пациентов трансплантация культур клеток выполнялась после химической некрэктомии раны и лечения с использованием водорастворимых мазей на полиэтиленгликолевой основе, управляемой антибактериальной среды, кроватей "Клинит-рон". В двух случаях трансплантация культур фибробластов была проведена на раневую поверхность после хирургической некрэктомии .

Контроль за результатами лечения пациентов всех групп осуществлялся с периодичностью в 3-4 дня в момент перевязок от момента начала лечения и до выписки пациентов. В эти же периоды проводилось цитологическое и гистологичекое исследование.

Клинические исследования были выполнены нами в Научно-практическом центре термических поражений Института хирургии им. А.В.Вишневского РАМН под руководством д.м.н. А.А.Алексеева .

Морфологическая оценка эффективности примененеия культур

фибробластов осуществлялась с помощью методов гистологического, гистохимического, иммунногистохимического, электронномик-роскопического, радиоавтографического, цитологического исследования биопсийного, аутопсийного материала, мазков отпечатков с поверхности ран до проведенного лечения и в различные сроки после него - на 3,7,14, 21 сутки. Цитологические исследования выполнены врачом клинической лаборатории Института З.Г.Гончаровой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологическая характеристика трансплантата

Клеточному составу монослойных культур фибробластов и формируемому ими экстрацеллюлярному матриксу присуща определенная динамика, выражающаяся в смене структурно-функциональных типов фибробластов, изменении их пролиферативной активности, вариабельности синтеза гликозаминогликанов, коллагена и фибронектина.

Динамическоя морфофункциональная оценка показала, что через два часа после начала субкультивирования,культура фибробластов состояла в основном из округлых клеток, интенсивно окрашиваемых толуидиновым синим. Синтеза ДНК, гликозаминогликанов, коллагена, фибронектина в них не определялось. Ядро таких клеток характеризовалась округлой формой и занимало почти весь объем клетки. Цитоплазма - имела вид узкого ободка. Пластинчатый комплекс был развит слабо, так же как эндоплазмати-ческий ретикулум. Митохондрии клеток были мелкими, обнаруживались в небольшом количестве.

К исходу первых суток преобладали клетки, характеризующиеся веретеновидной формой, хорошо дифференцируемым ядром с 2-3 гиперхромными ядрышками. Процентное содержание фибробластов, характеризующихся веретеновидной формой к исходу первых суток составило 61,2 + 3,88 X.

На данном этапе клетки культуры формировали значительные по рамерам клеточные островки,состоящие из одного ряда клеток. Большинство клеток культуры к исходу первых суток наблюдения интенсивно включало 3Н-уридин, что свидетельствовало об интенсивном синтез в них РНК. Одновременно регистрировалось большое

число клеток, в ядро которых включался радиоактивный предшественник ДНК -3Н-тимидин (Табл 1).

В зонах островкового роста клеток отмечалось слабое положительное окрашивание алыдиановым синим, свидетельствующее о накоплении гликоэаминогликанов. К исходу первых ^уток было зарегистрировано накопление в фибробластах фибронектина. Фибро-нектин в виде мелкогранулярного материала красно-коричневого цвета верифицировался в цитоплазме клеток.

Таблица 1.

Динамика включения фибробластами 3Н-тимидина

Сроки регистрации X клеток, меченых

( сутки ) 3Н - тимидином

14,66 + 1,5 11,3 + 2,48 1, 92 + 0,83

Пластинчатый комплекс фибробластов, а также цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума нередко выглядели ги-перплазированными. В межклеточном пространстве на этом этапе наблюдения впервые появлялся хлопьевидный материал и отдельные микрофибриллы коллагена.

К 3 суткам культура фибробластов характеризовалась конф-люэнтным ростом. Практически все клетки таких культур были представлены веретеновидными или звездчатыми формами. Число их составило 72 ,48^ 4,78% и 27,2+ 4,6% соответственно. Число клеток, включивших 3Н-тимидин к исходу третьих суток по сравнению с предыдущим сроком исследования достоверно не изменялось и составляло 11,3+2,48%. Окраска клеточных культур альци-ановым синим позволила установить факт прогрессирующего накопления в культуре гликоэаминогликанов. Результаты применения иммуннопероксидазного метода на этом этапе наблюдения позволили констатировать высокий уровень накопления в цитоплазме кле-

ток фибронектина. Интенсивность окрашивания цитоплазмы фиброб-ластов к исходу третьих суток значительно превосходила таковую . на предыдущем этапе исследования.

При электронномикроскопическом исследовании клеточные культуры характеризовались плотным, на отдельных участках многорядным расположением клеток. Размеры и форма клеток варьировали, также как соотношение площади ядра и цитоплазмы.

К исходу, третьих суток клетки культуры формировали богатый экстрацеллюлярный матрикс: в межклеточном пространстве наряду с хлопьевидным материалом и микрофибриллами коллагена определялись фибриллы с поперечной исчерченностыо.

К шестым суткам развития культуры наблюдалось формирование плотного монослоя клеток. При этом процентное содержание фиб-робластов, характеризующихся веретеновидной формой среди всех клеток трансплантата составляло 98 +, 0,35% . Число клеток, включивших после часовой инкубации с изотопом 3Н-тимидин, достоверно уменьшилось по сравнению с предыдущим сроком наблюдения и составило 1,92+0,83%. Существенных отличий в характере окрашивания культур фибробластов альциановым синим и пикрофук-сином по сравнению с предыдущими сроками не отмечалось. Содержание фибронектина в цитоплазме фибробластов заметно снижалось, он определялся преимущественно вне клеток в виде переплетающихся волокнистых структур.

Электронномикроскопический анализ показал, что к б суткам большинство клеток характеризовалось меньшим по сравнению с предыдущими сроками наблюдения объемом цитоплазмы. Пластинчатый комплекс клеток выглядел значительно редуцированным. Экстрацеллюлярный матрикс становился еще более насыщенным хлопьевидным материалом и коллагеновыми микрофибриллами и фибриллами.

Таким образом,проведенный структурно-функциональный анализ культуры фибробластов человека показал, что первые два часа развития культуры характеризуются резким преобладанием округлых по своей форме клеток без отчетливых признаков синтетической и пролиферативной активности. Такие клетки по своим характеристикам условно могут быть отнесены к малодифференциро-ванной форме фибробластов (В.В.Серов,А.Б.Шехтер 1981).

К концу первых суток среди клеток культуры отмечается пре-

обладание веретеновидных и звездчатых форм, в которых верифицируется наивысшая за период наблюдения интенсивность процессов синтеза ДНК, накопление гликозаминогликанов. Одновременно электронномикроскопический анализ позволил зарегистрировать начало синтеза клетками культуры коллагена.

К третьим суткам в клетках культуры нарастает синтез гликозаминогликанов, фибронектина и коллагена, участвующих в формировании экстрацеллюлярного матрикса. Одновременно на значительном уровне сохраняется активность синтеза клетками ДНК. По своим структурно-функциональным признакам клетки культуры на этапе 1-3 суток культивирования весьма близки к юным фиброб-ластам соединительной ткани (В.В.Серов, А.Б.Шехтер 1981).

К шестым суткам в культуре фибробластов преобладают вере-теновидные клетки с низкой активностью синтеза ДНК, синтез гликозаминогликанов стабилизируется, выраженность синтетической активности в отношении внутриклеточного фибронектина резко уменьшается.

Такая динамика структурно-функциональной организации фибробластов монослойной культуры с учетом важной роли гликозаминогликанов, фибронектина и коллагена в процессах регенерации позволили нам определить 3 сутки в качестве наиболее благоприятных сроков использования культур фибробластов для изготовления трансплантатов.

Влияние Фибробластов на пролиферацию и дифференцировку

кератиноцитов в культуре

В ходе исследований установлено,что в реализации стимулирующего влияния фибробластов на адгезию, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов активное участие принимают синтезируемые фибробластами белки экстрацеллюлярного матрикса: коллаген I , III типа стимулирует процессы адгезии кератиноцитов, а фибронектин наряду с этим способен активизировать синтез ке-ратиноцитами ДНК и тормозить процессы клеточной дифференциров-ки.

Коллаген I, III типа и фибронектин обладают выраженным стимулирующим влиянием на процессы адгезии кератиноцитов. Применение количественных методов позволило нам документировать более выраженное влияние фибронектина на адгезию кератиноцитов

по сравнению с двумя другими названными субстратами. Если через два часа после начала культивирования на субстрате из коллагена I и III типа число прикрепившихся и распластавшихся ке-ратиноцитов составило соответственно 53,2+3,45% и 51,6+4,3%, то при культивировании этих клеток на фибронектиновом субстрате к этому сроку оно определялось на уровне 70,65+1,7%. К исходу первых суток число таких клеток возрастало во всех группах в среднем на 20% с сохранением достоверных отличий между изучаемыми субстратами. Эти данные согласуются с результатами, полученными Makisalo S.E. et al. (1989), показавшими , что фибронектин вызывает более быстрое прикрепление и распластывание кератиноцитов по сравнению с коллагенами 1,111,1Y типов. Однако необходимо подчеркнуть, что наряду со стимулирующем воздействием фибронектина на процессы адгезии клеток, нам удалось обнаружить влияние этого гликопротеида и на процессы синтеза ДНК кератиноцигами культуры. Это стало возможным, благодаря использованию методов радиоавтографического исследования. При использовании в качестве субстрата фибронектина к исходу третьих суток индекс клеток, меченых 3Н-тимидином, составил 16^3,15%. В то же время индекс кератиноцитов, меченых изотопом, при использовании субстратов из коллагена I и III типа составил 12,2 и 9,8 % соответственно. Сравнение уровня синтеза ДНК кератиноцитами, полученными на субстратах из фибронектина с культурами, выращенными на коллагеновых субстратах, свидетельствует о достоверности этих отличий на всех этапах наблюдения.

Наряду с вышесказанным в культурах кератиноцитов, полученных на фибронектиновом субстрате, были выявлены и другие отличия структурной организации клеток: отсутствие или слабая выраженность островков стратификации, своеобразное перинуклеар-ное расположение тонофибрилл при развитости аппарата Гольджи. С учетом того, что ртепень и компановка тонофибриллярного аппарата кератиноцитов является одним из наиболее достоверных критериев степени дифференцировки этих клеток как в культуре (А.А.Пальцын с соавт. 1989; O.Kanitakis et al. 1987; C.Compton et.al.1989,1990), так и in vivo (И.Н.Михаилов 1979; А.M.Чернух, Е.П.Фролов 1982) приведенные выше морфологичекие характеристики культур кератиноцитов, . полученных на фибронектине, на наш взгляд, свидетельствуют о торможении процессов дифференци-

ровки кератиноцитов в присутствии фибронектина. Это, с одной стороны, подтверждает известные данные об участии фибронектина в процессах клеточной дифференцировки( J.C.Adams, F.M.Watt 1989), а с другой - является новым фактом, указывающим на один из возможных путей взаимодействия фибробластов и кератиноцитов in vivo.

Важным звеном исследований, направленных на выявление общих закономерностей влияния фибробластов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов, стали эксперименты по совместному культивированию этих клеток. При этом использовались фибробласты, фиксированные и не фиксированные этиловым алкоголем. Нефиксированные клетки отличала способность клеток к пролиферации, синтезу, формированию экстрацеллюлярного мат-рикса.

Через два часа после начала совместного культивирования кератиноцитов и фибробластов, фиксированных этанолом, мы отметили, что большинство кератиноцитов не прикрепилось к поверхности культурального сосуда. Число неприкрепившихся клеток составляло 88,3+2% ( при культивировании кератиноцитов на пластике - 34,2^4,5% ). Лишь около 12% клеток к этому сроку прикреплялись , при этом клетки преимущественно фиксировались на свободном от фибробластов пластике. Признаки распластывания клеток в виде увеличения объемов клетки, ее цитоплазмы, появления псевдоподий регистрировались лишь в единичных случаях.

Напротив, при культивировании кератиноцитов с жизнеспособными фибробластами было отмечено, что через два часа после начала эксперимента абсолютное большинство кератиноцитов уже прикрепилось к поверхности культивирования. Число неприкрепившихся кератиноцитов составило лишь 5,5^+1,7%. Этот показатель в шесть раз меньше аналогичного показателя при культивировании кератиноцитов на пластике и в 10 раз меньше такого показателя при сокультивировании с фиксированными фибробластами. При этом, в отличие от первой группы, кератиноциты преимущественно фиксировались непосредственно на поверхности фибробластов.

К концу первых суток совместного культивирования с фиксированными фибробластами, оставались не прикрепившимися 37,6+3,16% кератиноцитов. Индекс кератиноцитов, меченых 3Н-ти-мидином, составил 5,46+2,55% , что достоверно меньше индекса

кератиноцитов, выращиваемых на пластике (8,2+1,3%) и резко уступает индексу кератиноцитов, меченых 3Н-тимидином,при культивировании с жизнеспособными фибробластами - 15,51+0,95%.

Значительно более высокую интенсивность пролиферативных процессов в культурах кератиноцитов, полученных в присутствии жизнеспособных фибробластов человека, отражала и морфологическая картина: кератиноциты таких культур формировали крупные, сливающиеся клеточные островки из полигональных или округлых клеток с крупными ядрами .

Дальнейшее наблюдение за развитием культур кератиноцитов показало, что в присутствии жизнеспособных фибробластов кератиноциты уже к исходу третьих суток формируют сливающиеся островки , а к 5-6 суткам - монослой клеток.В присутствии фиксированных фибробластов кератиноциты ни в одном случае не формировали сколько-нибудь крупных клеточных островков и монослоя клеток.

Начиная с третьих суток определялись четкие отличия в морфологии клеток первой и второй группы. Так, в присутствии живых фибробластов к исходу третьих суток среди кератиноцитов культуры преобладали клетки овальной формы с округлым или вытянутым ядром, 1-2 ядрышками, с равномерным распределением хроматина в ядре. Цитоплазма клеток по своему объему была равна или даже превосходила объем ядра. Характерной чертой таких клеток было формирование развитого тонофибриллярного аппарата. При этом в части клеток тонофибриллы располагались циркулярно "вокруг ядра, образуя своеобразный чехол , а в других - распространялись и на периферию цитоплазмы. Кератиноциты формировали плотные межклеточные контакты , в которых определялись десмосомы и полудесмосомы. Межклеточный матрикс в смешанных культурах кератиноцитов и фибробластов характеризовался наличием большого числа коллагеновых фибрилл с типичной поперечной исчерченностью.

В присутствии нежизнеспособных фибробластов кератиноциты, напротив, характеризовались слабым развитием тонофибриллярного аппарата. Тонофиламенты кератиноцитов даже в околоядерной зоне отличались тонкостью, малочисленностью, раэрозненостыо.В цитоплазме кератиноцитов тонофиламенты были фрагментированы и дезориентированы . Возможно, следствием таких изменений в

структуре кератиноцитов является то обстоятельство, что контакты между кератиноцитами формировались редко, характеризовались наличием редких полудесмосом и десмосом. Межклеточный матрикс таких культур был беден и характеризовался наличием хлопьевидного материала, редкими коллагеновыми микрофибриллами. Данные отличия в морфологической характеристике изучаемых культур кератиноцитов к б суткам не только сохранялись, но в некотором отношении становились еще более выраженными.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что : во-первых, в условиях in vitro фибробласты способны оказывать выраженное стимулирующее влияние на процессы адгезии кератиноцитов, увеличивая число прикрепившихся клеток и скорость их прикрепления более чем в 2 раза; во-вторых, стимуляция процессов адгезии сопровождается и более высоким уровнем синтеза ДНК и значительно более высоким уровнем пролиферации кератиноцитов; в-третьих, данные электронномикроскопического исследования прямо свидетельствуют о том, что присутствие живых фиб-робластов и ими сформированного экстрацеллюлярного матрикса является необходимым фактором формирования тонофибриллярного аппарата кератиноцитов, межклеточных связей, и в конечном счете - дифференцировки кератиноцитов. Отсутствие жизнеспособных фибробластов и сформированного ими экстрацеллюлярного матрикса ведет к торможению формирования тонофибриллярного аппарата кератиноцитов, задерживает процессы формирования межклеточных связей и дифференцировку кератиноцитов.

Получение й хранение трансплантатов из культивированных

фибробластов человека

Методика получения трансплантатов на основе монослойных культур фибробластов человека и переноса их на раны оригинальна, защищена двумя авторскими свидетельствами. Основные этапы методики получения трансплантата из культивированных аллофиб-робластов человека представлены на схеме (Рис 1).

Были выделены два наиболее эффективных подхода в получении первичных культур фибробластов - из фрагментов легочной ткани плодов человека и расщепленного кожного лоскута обожженных. При сравнительном качественном морфологическом анализе полученных культур фибробластов мы обнаружили, что в случаях

Рис.1

Этапы получения трансплантата из культивированных фибробластов человека

|ФРАГМЕНТ ДЕРМАЛЬНОГО Л0СКУТА1 I_,_I

I Фрагментация |

Г

"1

|ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА ФИБРОБЛАСТОВ|

1_

I Микробиологический|

I Морфологический |

I

контроль

I

I

контроль

I

|Пассирование| 1_,_I

I СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ ФИБРОБЛАСТОВ| I___I

Г

1

I ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КЛЕТОК НА РАНУ|

ч

получения фибробластов из легочной ткани культура характеризуется значительно меньшим содержанием зрелых верегеновидных клеточных форм в сравнении с культурой, полученной из фрагментов кожи пациентов. К исходу третьих суток относительное число таких клеточных форм в культурах, полученных из легочной ткани,составило 72+4,85%, в то время как в культурах клеток из фибробластов кожи - 88,2^2%. Для фибробластов, полученных из фрагментов легочной ткани, была характерна значительно более высокая пролиферативная активность по сравнению с фибробласта-ми кожи. К исходу первых суток число фибробластов, включавших 3Н-тимидин в культурах, полученных из легочной ткани, составил 48,5+3%, а в культурах, полученных из кожи пациентов, 11,9+1,19% .

Низкое содержание в культурах фибробластов, полученных из легочной ткани клеток, способных к активному синтезу коллагена, в сочетаний с показателями их высокой пролифератиной активности, свидетельствует о низком уровне их дифференцированнос-ти. Это наряду с техническими трудностями получения материала плодов человека, значительным риском предшествующего инфицирования тканей делают предпочтительным получение трансплантатов из фибробластов кожи обожженных.

Дальнейшие этапы изготовления трансплантата не отличались от известных принципов культивирования этих клеток (Р.Адаме. 1983; К.Н.Гринберг с соавт. 1987; Р.Фрешни 1989).

Культивирование клеток на последнем этапе велось на синтетическом мембранном основании, на котором клетки и переносились на раневую поверхность. Готовый трансплантат помещался в питательную среду, лишенную добавок, и доставлялся в операционную.

Применение трансплантата из культивированных фибробластов требуют более или менее длительной их транспортировки. В связи с этим были изучены некоторые вопросы, касающиеся условий и сроков хранения приготовленных трансплантатов (Табл.2).

Табл.2

Индекс клеток трансплантата, меченых 3Н-уридийом в динамике хранения его при различных условиях (%)

Температура Сроки хранения (ч. асы)

хранения 13 6 24

36° С 100 100 100 100

20° С 100 92+3,6 87,3+6,7 0

4° С 100 100 100 62,3+8,1

Полученные результаты позволяют сделать следующее заключение. При транспортировке клеток в течение коротких сроков, не превышающих шести часов, хранение их может осуществляться при температуре 20°С. В случаях длительной транспортировки предпочтительно хранение трансплантата при температуре 4°С.

Дальнейшие исследования были направлены на практическую реализацию установленной in vitro способности фибробластов стимулировать адгезию и пролиферацию кератиноцитов, участвовать в процессах их дифференцировки.

Результаты использования культивированных фибробластов при лечении пограничных ожогов XII степени Данную группу пациентов составили 27 человек. Для контроля использовались результаты лечения аналогичных ран у тринадцати из них. Местное лечение пограничных ожогов у больных контрольной группы осуществлялось с помощью мазей на водорастворимой основе. У 7 пациентов площадь поражения составила от 11 до 30% у 20 человека - от 31 до 70 % поверхности тела. Фиб-робласты были трансплантированы на рану однократно 21 обожженному (77,7%), четырем пациентам трансплантация была выполнена дважды (14,6 %), двум обожженный было выполнено соответственно 3 и 4 этапа трансплантации культуры фибробластов.

Площадь трансплантируемой культуры клеток была в каждом случае различной: у 62,6% пациентов площадь трансплантата составила ОТ 101 ДО 300 СМ2, В 18,5% оЪ 450 СМ2 ДО 930 см2. У всех пациентов до трансплантации было проведено бактериологи-

ческое изучение микрофлоры ран. Выявлялся Ps.aeroginosa, Staph. aureus, Proteus mirabilis, Enterobacter, Esch.coli, чаще - в ассоциации. Уровень микробной обсемененности как опытных, так и контрольных участков ран не превышал 104 микробных тел на см2 ее площади.

Динамика раневого процесса у пациентов, в местном лечении которых была использована культура аллофибробластов человека, значительно отличалась от таковой в контрольной группе. До трансплантации клеток в контрольной и в опытной группе раны были выполнены грануляционной тканью, местами покрытой фибрином, легко кровоточащей, без видимых островков эпителизации. После трансплантации клеток уже через 3-4 суток было отмечено, что раневая поверхность покрыта блестящей прозрачной пленочкой. Грануляции уплощаются. Манипуляции, сопутсвующие перевязке становятся менее болезнеными. К 5-7 дню у 44,4% пациентов (12 случаев) наблюдалась бурная эпителизация раны за счет разрастания островков эпителия в центре раны и прогрессирующей краевой эпителизации. Причем в 14,8% случаев (4 наблюдения) процесс эпителизации ожоговых ран после трансплантации культуры аллофибробластов занял только 4 суток. Лишь у одного больного (3,7%) эпителизация раны продолжалась 16 суток (Табл.3).

Табл.3

Сроки эпителизации пограничных ожогов III степени при использовании культивированных фибробластов

Сроки эпителизации ран Число %

(сутки после трансплантации) наблюдений

4-7 8-10 11 -14 16

самостоятельной эпителизации не наступило

12 5 7 1 2

44.4

18.5 26 3,7 7,4

ИТОГО :

27

100

В целом под влиянием трансплантации культур клеток самостоятельную эпителизацию пограничных ожогов III степени мы наблюдали у 25 из 27 больных (92,5%). Средний срок эпителизации составил 8,4 + 0,9 суток. ,У двух пациентов (7,5% ) , у которых были ожоги преимущественно III б степени эпителизации ран не отмечено. Дальнейшее лечение этих пациентов проводилось с использованием аутодермопластики. Нагноения ран при трансплантации культур клеток среди пациентов данной группы не зарегистрировано .

У пациентов контрольной группы эпителизация пограничных ожогов,при общепринятом лечении с использованием мазей на водорастворимой основе в сочетании с лечением на кровати "Кли-нитрон" наблюдалась в 78% случаев. Минимальный срок эпителизации составил 24 дня, а максимальный - 40 суток. Средний срок самостоятельной эпителизации пограничных ожогов в контрольной группе составил 31,5 ± 2,14 суток. Эти сроки достоверно превосходят показатели опытной группы. В 22,2% лечение контрольных участков ран потребовало проведение аутодермопластики.

Таким образом,трансплантация культивированных фиброблас-тов явилась эффективным средством восстановления целостности кожных покровов при пограничных ожогах III степени. Этот метод обеспечил полную эпителизацию ожоговых ран на площади от 56 до 930 см кв у 25 из 27 пациентов (92,5%) в сроки 8,4 + 0,9 суток в среднем.

Результаты использования культивированных фибробластов

при лечении ожогов III6-IY степени

Общее число пациентов с глубокими ожогами II16 - IY степени, при лечении которых были использованы культуры клеток составило 38 человек. У 16 пациентов трансплантация культуры фиробластов использовалась как самостоятельный метод лечения, а у 22 человек была выполнена комбинированная аутодермопласти-ка с использованием культивированных фибробластов и расщепленного кожного аутолоскута, перфорированного 1:4 (5 случаев) и 1:6 (17 наблюдений).

Общая площадь ожогов у пациентов данной группы составила от 12 до 80% поверхности тела. Глубокие ожоги от 3 до 70 %. У 28 пациетов (73,7%) трансплантация культуры фибробластов была

выполнена однократно. У 10 пациентов трансплантация культуры осуществлялась в несколько этапов: у б (15,8%) - дважды, у 4 человек (10,53!) - трехкратно. Площадь трансплантатов составила от 28 до 1600 см2. При бактериологических исследованиях, проведенных до трансплантации выделяли Esch.col i, Acetobacter, Ps.aeroginosa, Prot.vulgaris чаще всего в ассоциациях. Микробное число не превышало - 6Х104 микробных тел/см кв. Контролем служили ожоговые раны этих пациентов (38 наблюдений), в лечении которых культивированные фибробласты не использовались .

Самостоятельная эпителиэация ожоговых ран Ш6 - IY степени после трансплантации культур фибробластов наблюдалась лишь у 3 (7,8%) из 16 больных, когда площадь раны не превышала 60 см2 . Еще у 7 пациентов (18,4 %) к 7-10 суткам происходило значительное сокращение площади ран за счет краевой эпителиза-ции. Кроме того отметим, что трансплантация культур клеток, способствовала ликвидации гипергрануляций, а манипуляции, связанные с перевязкой становились безболезненными.

Указанные результаты использования трансплантатов из культивированных фибробластов при лечении глубоких ожогов представляются закономерными. Они подтверждают выдвинутый нами тезис о воздействии трансплантируемых клеток на эпителизацию ран путем стимуляции процессов пролиферации сохранившихся эпи-дермоцитов. С другой стороны подтвержденные факты влияния трансплантации фибробластов на созревание грану ляционной ткани позволили нам предложить его использование в комбинации с пластикой расщепленным кожным аутолоскутом, перфорированным как 1:4, так и 1:6.

При использовании культуры аллофибробластов человека в сочетании с аутодермопластикой кожным аутолоскутом, перфорированным 1:6, мы наблюдали быстрое разрастание кожного лоскута на подготовленной раневой поверхности . Средний срок полной эпителиэации ран при использовании данной методики составил 12 ¿ 1,32 суток. В то же время в контрольной группе исследований, в которых лоскут, перфорированный 1:6, был трансплантирован на раневые поверхности без предварительного применения фибробластов, средний срок эпителизации ран составил 20+2,29 суток. Таким образом разница в сроках эпителизации ран в опытной и

контрольной группе была достоверной ( 1 > 3 ).Следует отметить, что в ряде случаев сроки.эпителизации ран, лечение которых проводилось с помощью комбинированной аутодермопластики расщепленным кожным аутолоскуток , перфорированным 1:6 и культуры фибробластов, были равны срокам эпителизации ран, лечение которых велось с использованием только кожного аутолоскута, перфорированного 1:4. Это обстоятельство объективно подтверждается данными проведенного статистического исследования, свидетельствующего о том, что скорость эпителизации ожоговых ран при использовании кожного аутолоскута, перфорированного 1:4, без трансплантации культуры фибробластов составляет . НО,23 суток. ' Более подробно динамика эпителизации ран у пациентов с глубокими ожогами 1116-1У степени в случаях выполнения комбинированной аутодермопластики с культурой фибробластов и обычно используемой аутодермопластики отражена в таблице (Табл 4).

Табл.4

Динамика эпителизации ожоговых ран Шб-П степени при использовании трансплантации культуры фибробластов в комбинации с аутодермопластикой кожным лоскутом, перфорированным 1:6

Сроки эпителизации число пациентов

( сутки ) комбинированная ауто- : аутодермопластика

дермопластика с куль- : без трансплантации турой фибробластов : культуры фиб-тов % абс. % абс.

7-10 11 - 15 16 - 20 > 21

11,7 59

11,7 17,6

2 10 2 3

О 0

50 50

ИТОГО

100

17

100

16

Эпителизация глубоких ожогов при использовании комбинированной аутодермопластики с помощью культуры фибробластов человека и кожного аутолоскута с перфорацией 1:6 в абсолютном большинстве случаев происходила уже в первые две недели. В то время как при выполнении аутодермопластики без культуры фибробластов заживление регистрировалось только на 16 - 32 сутки. В 3 случаях (17,6%)'комбинированного применения культуры клеток и аутодермопластики наблюдались и более длительные сроки эпите-лизации ожоговых ран. Однако такая динамика характеризовала процессы эпителизации и контрольных участков, что отражает общие закономерности метаболических процессов у тяжелообожжен-ных.

Важно отметить тот факт, что в группе пациентов, проходивших лечение без применения трансплантации культуры аллофиб-робластов, в 11,8% случаев наблюдался частичный лизис ауто-рансплантата. В то же время после трансплантации культур клеток таких случаев не отмечено.

При использовании трансплантации культивированных аллофиб-робластов в сочетании с пластикой расщепленным кожным аутолос-кутом, перфорированным 1:4, различия в сроках эпителизации ран были недостоверны. Средний срок эпителизации в опытной группе составил 8,25 + 0,62 суток, а в контрольной, как уже говорилось выше - 11+3,28.

Результаты использования культивированных Фибробластов при лечении длительно незаживающих ран донорских участков

У 24 пациентов незаживающие раны сформировались после операций аутодермопластики по поводу послеожоговых рубцовых деформаций и контратур, а у 34 пациентов такие раны сформировались после операций аутодермопластики по поводу обширных термических поражений. В первой группе культивированные фиб-робласты были использованы при лечении 12 пациентов, во второй - 20 пациентов. Соответственно у других 12 и 14 пациентов этих групп с длительно незаживающими ранами донорских участков проводилось общепринятое лечение с использованием водорастворимых мазей , а полученные при этом результаты рассматривались нами в качестве контрольных. Показанием к трансплантации культиви-

рованных клеток являлось отсутствие заживления ран донорских ' участков в принятые сроки в сочетании с клиническими признаками осложненного их течения. Сроки существования незаживающих ран донорских участков до применения культивированных фибро-бластов составляли от 11 до 120 суток,средний срок - 50 +. 18,5 суток.

До начала лечения длительно незаживающие раны донорских участков характеризовались плохо развитыми бледными грануляци-.ями,поверхность которых была нередко покрыта налетом фибрина, редко отмечались явления островковой или краевой эпителизации. Бактериологически в отделяемой ран верифицировались Staph, epidermidis, Staph.aureus, Ps.aeruginosa. Strep.haemol., ассоциации этих микроорганизмов. У 22* пациентов роста микроорганизмов не было обнаружено. В 18,8* случаев количество микроорганизмов составляло менее 101, в 49* случаев - от 10z до 105 микробных тел, в остальных случаях более 10s микробных тел на см2 поверхности раны.

При использовании в лечении таких пациентов мазей на водорастворимой основе развитие регенераторных процессов протекало медленно. Уменьшение экссудации отмечалось только на 7-10 сутки после начала такого лечения. На исходе второй недели лечения грануляционная ткань становилась мелкозернистой, ' а признаки стимуляции краевой эпителизации отмечались только на исходе третьей недели с момента регистрации осложнений и начала лечения такой раны как осложненной. Средний срок эпителизации длительно незаживающих ран донорских участков под действием мазевого лечения у пациентов с последствиями ожогов составил 39,0+3,0 суток, а у пациентов с термическими поражениями 49,1 + 6,2 суток, при минимальных показателях.равных 16 суткам и максимальных - 103 суткам.

Местное лечение пациентов с длительно неэаживаживающим'и ранами донорских участков с применением трансплантации культивированных фибробластов вело к тону, что уже на первой перевязке - на 3-5 сутки после начала лечения, на поверхности раны формировалась прозрачная тонкая пленка. Кровоточивость грануляционной ткани прекращалась. К исходу 6-8 суток наблюдалась или полная, или частичная эпителмзация ран, на которые были трансплантированы клетки. Средний срок эпителизации ран до-

норских участков с осложненным течение у пациентов с последствиями ожогов составил - 7,16 +. 1,3 суток, а у пациентов с термическими поражениями - 6,2+0,45 суток.

Применение для лечения длительно незаживающих ран донорских участков культивированных фибробластов человека сопровождалось более быстрой сменой тканевых реакций, что документировалось изменением цитологического спектра мазков-отпечатков, полученных с поверхности ран у пациентов различных групп. Направленность этих изменнений характеризовала раннее и более выраженное развитие регенераторых реакций у пациентов, в лечении которых использовалась культура клеток.

Быстрое развитие регенераторных процессов в ранах под действием трансплантации культур фибробластов сопровождалось соответствующими изменениями гомеостаза и, в частности, достоверным сниженем уровня^/^-лизинов сыворотки крови, что документировало нивелирование воспалительных процессов.

Таким образом применение культивированных фибробластов в лечении пациентов с длительно незаживающими ранами донорских участков позволило добиться эпителизации таких ран в короткие сроки - на 4-11 (на 6,7+0,87 сутки - в среднем) день после трансплантации культур у всех 32 пациентов. В то же время традиционное лечение таких пациентов с использованием водорастворимых мазей обеспечило их заживление только через 44+4,6 суток в среднем.

Таким образом результаты клинических исследований свидетельствуют о выраженном стимулирующем влиянии трансплантации культивированных фибробластов на эпителизацию ожоговых ран.

Морфологическая оценка эффективности использования культивированных фибробластов при лечении обожженных Поставив задачу оценить эффективность применения культивированных фибробластов с морфологических позиций,мы сочли необходимым установить наиболее характерные черты тканевых реакций, сопровождающих местное проявление ожоговой болезни. Такая задача осложнялась тем, что многократный забор биоптатов из ожоговых ран затруднен объективными обстоятельствами, так как он связан с опасностью кровотечения. Выявленные нами закономерности развития тканевых повреждений должны были стать отп-

равной точкой в оценке эффективности использования культуры клеток. ...

Для изучения закономерностей повреждения кожных покровов при термической травме нами проанализирована морфология грануляционной ткани ожоговых ран у 23.пациентов с глубокими ожогами различной площади, в различные сроки после травмы. Была изучена морфология грануляционной ткани у пациентов с ожогами не превышающими 20% поверхности тела ( площадь глубоких ожогов III6-IY степени составляла от 5 до 10% ), при которых развитие ожоговой болезни наблюдается редко, а также с площадью поражения более 20% поверхности тела (площадь глубоких ожогов составляла более 15% поверхности тела), при которой развитие ожоговой болезни наблюдается в большинстве случаев. Исследование проводилось в течение первых 20 суток после травмы, на 20-40 сутки и по истечении 40 суток с момента травмы.

Результаты проведенного морфологическое исследование показали, что морфологическая картина грануляционной ткани у пациентов с глубокими ожогами площадью до 20 и более 20% поверхности тела в сроки до 60 суток после травмы соответствует представлениям, сформулированным H.A. Аничковым с соавт. (1951). Однако соотношение и выраженность тех или иных морфологических компонентов грануляционной ткани у пациентов этих групп на соответствующих этапах лечения различна. Эти отличия прежде всего касаются сформированности слоев грануляционной ткани, пролиферативной активности клеток периваскулярной локализации, распределения гликозаминогликанов Л характера формирования коллагеновых волокон.

Так,у пациентов с площадью ожогов менее 20% поверхности тела уже на 20-40 сутки после травмы под действием лечения лейкоцитано-некротический слой грануляционной ткани в значительной степени уменьшался или исчезал. Более зрелые её слои отчетливо дифференцировались. Цитологический спектр раны изменялся с увеличением содержания плазматических клеток и фиб-робластов. В .эндотелиальных клетках, перицитах и фибробластах периваскулярной локализации грануляционной ткани нарастал синтез ДНК, а капилляры грануляционной ткани становились цетрами формирования коллагеновых волокон и накопления гликозаминогликанов .

Напротив, у пациентов второй группы с глубокими ожогами более 20% поверхности тела даже к 60 суткам после травмы грануляционная ткань выглядит незрелой,а лейкоцитарно-некротичес-кий слой был выражен. Другие слои выглядели несформированными. Грануляционная ткань была инфильтрирована полинуклеарными лейкоцитами. У пациентов данной группы не обнаруживалось сколько-нибудь значимых признаков клеточной пролиферации в перивас-кулярных зонах. Содержание в грануляционной ткани гликозами-ногликанов было высоким и характеризовалось неравномерностью распределения. Коллагеновые волокна были представлены грубыми короткими дезориентированными фрагментами.

Такие результаты сравнительного анализа позволяют предположить, что одним из наиболее ранних морфологических признаков перехода воспалительного процесса в продуктивную фазу у обожженных является пролиферация клеток периваскулярной локализации, и в частности перицитов и фибробластов грануляционной ткани.

Одновременно нами было установлено, что эпидермис и дерма кожного аутотрансплантата, используемого для закрытия ожоговых ран у тяжело обожженных сохраняет структурную организацию. Однако уровень синтеза ДНК в клетках базального и шиповатого слоя эпидермиса, а следовательно и пролиферативный потенциал этих клеток характеризуются минимальными показателями-число клеток, включавших 3Н тимидин, в популяции баэальных клеток биоптатов в среднем составил 1,64 + 0,34%, а среди шиповатых -2,1 + 0,76%.

Морфологические изменения грануляционной ткани у пациентов с ожогами более 20% поверхности тела, обнаруженные нами в различные сроки после трансплантации культур фибробластов, выглядели следущим образом.

Через 4 суток после трансплантации культуры клеток, по сравнению с-исходной, морфологическая картина грануляционной ткани ран характеризовалась более слабой выраженностью лейко-цитарно-некротического слоя, в то время как другие слои грануляционной ткани были более четко дифференцированы. Особенно хорошо развитым выглядел слой сосудистых петель . Одновременно после трансплантации фибробластов наблюдалась смена клеточного пейзажа грануляционной ткани (Табл.5). Также нарастала проли-

феративная активность клеток периваскулярных зон. В более глубоких слоях грануляционной ткани изменения клеточного состава под действием трансплантаций культуры клеток не были столь значительными, однако и тут наблюдалось падение содержания по-линуклеарных лейкоцитов с 54 - 59% до 28-3055, в то время как число фибробластов увеличивалось с 9-14% до 28-52%. *

Табл.5

Изменение клеточного состава грануляционной ткани ожоговой раны после трансплантации культуры фибробластов человека (% соотношение клеток)

Тип клеток Исход Через 4 дня после трансплан

тации фибробластов

Полинуклеарные 70,7 + ' 4,3 9,8 + 2,4

лейкоциты

Лимфоциты 16,75+ 4,7 23 + 6,7

Макрофаги 5,1 + 0,39 8,3 + 3,2

Плазматические 5,32 + 0,25 -

клетки

Фибробласты 5,2 + 3,0 59 + 8,2

Через семь суток после трансплантации культур фибробластов мы наблюдали выраженную стимуляцию процессов эпителизации ожоговых ран под действием трансплантации клеточных культур и восстановление кожного покрова на значительной площади. При этом вновь сформированный эпителий характеризовался неравномерной толщиной, довольно четкой дифференцировкой всех слоев. Клетки базального слоя' располагались в 1-2 ряда. Были ориентированны на отдельных участках вертикально, а на других - горизонтально. В шиповатом слое регистрировалось от 3 до 5 рядов клеток. При авторадиографическом исследовании среди шиповатых и базальных клеток определялись многочисленные клетки, интенсивно включавшие 3Н-тимидин. Индекс клеток, меченых изотопом, у этих пациентов составил в среднем 10%. В ряде случаев нам удавалось обнаружить очаги пролиферации эпидермоцитов,рас-

полагающиеся глубоко в дерме. В них число слоев базальных клеток было увеличено, среди них отмечались многочисленные клетки, меченые 3Н-тимидином . Такие очаги пролиферации эпидермо-цитов, по-видимому, и являлись источниками их роста.

Через 7 суток после трансплантации фибробластов,при условии эпителизации ран, обращала на себя внимание несформирован-ность гребней сосочкового слоя дермы. В сетчатом слое к этому сроку отмечалось формирование нежных коллагеновых волокон. Обнаруживались многочисленные крупные светлые активные фибро-бласты,составлявшие до 88,2+3,7% от общего числа клеток. Определялись многочисленные многоядерные- макрофаги. Последние располагались группами или одиночно, характеризовались крупными размерами, эозинофильной цитоплазмой.

Важным фактом являлось то, что у пациентов этой группы регистрировался высокий уровень пролиферативной активности клеток периваскулярной локализации. Капилляры дермы и грануляционной ткани характеризовались не только высоким уровнем плотности клеток в периваскулярных зонах, но и высоким числом клеток, меченых 3Н-тимидином, достигавшим 65%.

Если говорить о морфологической картине контрольных участков, то следует подчеркнуть,что под воздействием общепринятого лечения восстановления целостности кожных покровов не происходило к этим срокам ни в одном случае.Грануляционная ткань ожоговых ран контрольной группы характеризовалась наличием более или менее выраженных зон некроза, интенсивной инфильтрацией полинуклеарными лейкоцитами, число которых в общем спектре клеток составляло от 66 до 71,4%. Число фибробластов в грануляциях контрольных участков было достоверно ниже уровня, определяемого в ранах, в местном лечении которых использовались культуры клеток. Их число не превышало 11,1+0,24%. в составе грануляционной ткани верифицировалось большое число плазматических клеток и лимфоцитов ( до 5,7 и 21% соответственно) Встречались и единичные двуядерные макрофаги, однако столь многочисленные и крупные многоядерные макрофаги, как в случаях трансплантации клеточных культур, мы не обнаружили ни в одном случае. Одновременно в контрольных исследованиях не определялись и сколько-нибудь выраженные признаки пролиферации клеток, окружающих сосуды грануляционной ткани . Индекс клеток, мече-

ных 3Н-тимидином, в контрольной группе.был достоверно ниже. Коллагеновые и эластические' волокна верифицировались в виде коротких и грубых дезориентированных фрагментов.

В одном случае морфологические исследования были выполнены через 21 сутки после проведенной трансплантации культуры фибробластов. В этом случае речь шла о пациентке с обширными ожогами, погибшей от септических осложнений. Несмотря на такой исход, у этой пациентки после трансплантации культуры фибробластов отмечалась эпителиэация практически всех ран, покрытых культурой клеток.

Было установлено, что сформироавшийся после трансплантации к исходу 21 суток эпителий характеризуется более высокой по сравнению с контролем пролиферативной активностью клеток базального слоя, которые образуют 3-4 ряда. Одновременно на этих участках отмечается увеличение, по сравнению с контролем, числа рядов шиповатых клеток. Гребни сосочкового слоя дермы были слабо выражены даже на этих сроках наблюдения. Отчетливо определялись очаги клеточной пролиферации в придатках кожи. Коллагеновые волокна дермы на участках трансплантации культур клеток, были сформированы тонкими фибриллами, в отличие от грубых коллагеновых волокон контрольных участков. Значительные отличия отмечены нами в составе клеток, верифицируемых в дерме: в случаях использования культуры клеток преобладали фиброб-ласты, составляющие до 95% от общего числа клеток, в то время как на контрольных участках их число не превышало 40%.

Результаты морфологического анализа свидетельствуют трансплантация культуры фибробластов на ожоговые раны сопровождается комплексом тканевых изменений: 1) быстрой сменой клеточного состава грануляционной ткани с уменьшением числа полинуклеарных лейкоцитов и достоверным резким увеличением процентного содержания фибробластов; 2) выраженной активацией процессов пролиферации клеток периваскулярной локализации грануляционной ткани ,и в первую очередь, фибробластов и перицитов; 3) появлением многоядерных макрофагов, активно элиминирующих продукты распада коллагена; 4) активацией процессов пролиферации аутоэпидермоцитов.

Таким образом, на основе современных морфологических и биотехнологических методов нам удалось реализовать новые подходы

к решению проблемы местного лечения термических поражений путем трансплантации in vivo клеток, полученных в условиях культуры. Был разработан оригинальный метод местного лечения ожогов с использованием культур аллофибробластов человека. Фиб-робласты такого трансплантата активно пролиферируют и синтезируют экстрацеллюлярный матрикс, что кардинально отличает их от существующих эквивалентов дермы. Регулирующее влияние фиброб-ластов in vivo реализуется через стимуляцию процессов пролиферации клеток грануляционной ткани, прежде всего периваскуляр-ной локализации - перицитов и фибробластов, быструю смену экс-судативной фазы воспаления на пролиферативную, стимуляцию пролиферации аутоэпидермоцитов. Это обеспечивает быструю самостоятельную эпителизацию обширных пограничных ожогов III степени, длительно незаживающих ран, а в комбинации с аутодермопласти-кой кожным лоскутом, перфорированным 1:6 - обширных глубоких ожогов III6 - IY степени. Методическая простота, исключение из технологического цикла дорогостоящих питательных сред и биостимуляторов роста, сокращение сроков получения трансплантата из аллофибробластов до 3 дней обеспечивают возможности внедрения метода в широкую клиническую практику.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и научно обоснован оригинальный метод восстановления целостности кожных покровов у обожженных с помощью трансплантации культивированных фибробластов человека.

2. Трансплантация культивированных фибробобластов человека является эффективным средством местного лечения обширных пограничных ожогов III степени, длительно незаживающих ран донорских участков после аутодермоплатики, а в комбинации с аутодермопластикой перфорированным 1:6 кожным лоскутом - обширных ожогов Шб - IY степени.

3. Комплексное морфофункциональное исследование показало, что фибробласты трансплантата характеризуются активным синтезом ДНК, а также коллагена, фибронектина, гликозаминоглика-нов, которые входят в состав формируемого клетками экстрацел-люлярного матрикса. Динамика синтеза последнего свидетельствует о том, что наиболее благоприятными сроками траснплантации

клеток на рану являются третьи сутки развития культуры.

4. В условиях in vitro присутствие фибробластов стимулирует процессы адгезии и пролиферации кератиноцитов, является необходимым фактором для дифференцировки последних и формирования кератиноцитами межклеточных связей.

В реализации стимулирующего влияния фибробластов на адгезию, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов активное участие принимают синтезируемые фибробластами белки экстрацел-люлярного матрикса: коллаген I , III типа стимулируют процессы адгезии кератиноцитов, а фибронектин наряду с этим, способен активизировать синтез кератиноцитами ДНК и тормозить процессы клеточной дифференцировки.

' 5. Применение трансплантатов из культивированных аллофиб-робластов человека в комплексном лечении обширных пограничных ожогов III степени обеспечило их самостоятельную эпителизацию в течение 8.4j+0,9 суток у 92,5% пациентов, а при лечении длительно незаживающих ран донорских участков - в течение 6,7+0,9 суток у 100 % пациентов. При традиционном лечении сроки эпите-лизации таких ран составили 31,5+ 2,14 и 44+ 4,6 суток соответственно.

6. Применение при лечении обширных глубоких ожогов II16 -IY ст культивированных фибробластов в комбинации с кожным ау-тотрансплантатом, перфорированным 1:6, значительно сокращает потребность в донорских ресурсах и повышает эффективность хирургического лечения, обеспечивая приживление аутотранспланта-та во всех случаях. При этом сроки эпителизации ран состаляют 12^1,32 суток. В то же время применение аутотрансплантатов кожи с той же перфорацией, но без трансплантации клеток, сопровождается частичным или полным лизисом их в 12% случаев и удлинением средних сроков эпителизации ран до 20+2,29 суток.

7. Пролиферация клеток грануляционной ткани периваскуляр-ной локализации у обожженных является одним из наиболее ранних гистологических признаков перехода воспаления в продуктивную стадию и служит объективным показателем эффективности проводимого лечения.

8. Трансплантация культивированых аллофибробластов человека на ожоговые раны и длительно незаживающие раны донорских участков обусловливает пролиферацию клеток грануляционной тка-

ни периваскулярной локализации (фибробластов,перицитов), активацию процессов элиминации продуктов распада коллагена и способствует быстрому переходу экссудативной фазы воспаления в продуктивную. Это в свою очередь создает условия для пролиферации аутоэпидермоцитов и адекватных процессов эпителизации 9. Изготовление трансплантатов из культивированных алло-фибробластов человека не требует специальных ростовых сред, дорогостоящих стимуляторов роста клеток, занимает не более 3-4 дней.Указанное,наряду с высокой клинической эффективностью данного метода, открывает широкие перспективы его использования .

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для изготовления трансплантатов на основе монослойных культур фибробластов человека целесообразно использовать технику органного культивирования клеток из эксплантатов кожи обожженных, полученных при операциях аутодермоплатики.

2. Трансплантация клеток на рану должна осуществлятся после формирования их монослоя. При плотности посева клеток 20 ООО на см кв. наиболее благоприятными сроками трансплантации являются третьи сутки развития культуры.

3. Хранение изготовленного трансплантата может осуществляться при температуре 36 С0 в течение суток и более, при температуре 4 С0 - в течение не более 24 часов, при температуре 20 С0 - не более 6 часов.

4. Трансплантация культивированных фибробластов при лече-. нии тяжелообожженных должна использоваться в комплексе с другими методами лечения таких больных.

5. Трансплантация культивированных клеток на ожоговую рану должна проводиться после соответствующей хирургической подготовки, направленной на снижение уровня микробной обсеменен-ности раны до 104 микробных тел / см2 площади.

6. При лечении пограничных ожогов и незаживающих ран донорских участков трансплантация культивированных фибробластов используется в качестве самостоятельного метода лечения. При лечении глубоких ожогов Ш6-1У степени - только в комбинации с аутодермопластикой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Использование культивированных фибробластов при лечении обожженных // БЭБиМ.- 1990,- N3.^С.400-402.(соавт. Сарки-сов Д.С., Туманов В.П., Морозов С.С. ).

2. Аллотрансплантация культивированных фибробластов на незаживающие раны после аутодермопластики // БЭБиМ. -1991 . -N5. -С.542-544 . ( соавт.Саркисов Д.С..Туманов

B. П. ,Морозов С.С.).

3. Использование клеточных культур при местном лечении ожоговых ран //Хирургия.-1993.-N11.-С.26-29. (соавт.Алексеев A.A., Морозов С.С., Туманов В.П., Саркисов Д.С. ).

4. Влияние экстрацеллюлярного матрикса на адгезию и пролиферацию эпидермоцитов в культуре//БЭБиМ.-1993.-N11.-С.541-544. (соавт. Туманов В.П., Серов Г.Г., Пальцын A.A.)

5. Лечение ожогов с использованием культивированных клеток кожи человека // Хирургия.-1993.-N3.-С.22-26.(соавт.Саркисов Д,Х.,Алексеев A.A..Туманов В.П.

6. Применение культивированных фибробластов при ожогах кожи // Врач.-1993.-N11.-С.26-28.(соавт. Федоров В.Д., Саркисов Д.С., Туманов В.П., ).

7. Опыт применения культур фибробластов при лечении обожженных // Воен.мед.жур.-1993.-N10.-с.62-63.(соавт. Саркисов Д.С., Туманов В.П., Морозов С.С., Гуруков Ш.Р.).

8. Влияние лазерного излучения на пролиферативную активность клеток в культуре // БЭБиМ.- 1994. -N3. - С.313-316. (соавт. Туманов В.П., Серов Г.Г.).

9. Теоретические и практические аспекты использования культивированных фибробластов при восстановлении целостности кожных покровов // Вестник Рос.Акад.Мед.Наук.- 1994.-N6.-

C.6-11.(соавт. Саркисов Д.С., Алексеев A.A., Морозов С.С.

. ИДР'Ь

10. Получение и использование культивированного эпидермально-го пласта при лечении обожженных // I Всесоюзная конференция " Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств". Тез.докл.- Москва.-1989.- С.121-122. (соавт. Туманов В.П..Морозов С.С., Серов Г.Г. и др.)

11. Utilisation des allofibroblastes de peau Huraaine pour le traite ment des brules // XII Cong.La Baule.Bordo.-1991 (Alexeev A.A., Tumanov V.P.).

12. Влияние фибронектина на пролиферацию эпидермоцитов // Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации,- Москва.- 1993,- С.18-19. (соавт. Серов Г.Г.).

13. Результаты использования коллагена Р в качестве субстрата при культивировании эпидермоцитов // Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации,- Москва.-1993.- С.66-67. (соавт. Серов Г.Г.).

14. Стимулирующий эффект питуитрального экстракта на пролифе-ративную активность клеток кожи человека // Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации,- Москва.- 1993.- С.67-68. (соавт. Серов Г.Г.).

15. Использование культивированных фибробластов в практике комбустиологии // Международная конференция "Интенсивное лечение тяжелообожженных",- Москва,- 1992 - С.66-67.(соавт. Д.С.Саркисов, В.П.Туманов, Морозов С.С., Г.Г.Серов)

16. Первый опыт использования биологической повязки, содержащей культивированные фибробласты при лечении длительно незаживающих донорских ран // Международная конференция "Интенсивное лечение тяжелообожженных",- Москва,-1992- С. 72-74.(соавт. Гуруков Р.Ш., Сарыгин П.А.).

17. Structural-functional analysis of the results of aplica-tion of transplants received from cultured human allofib-roblasts for treatment of burned patients // 9th Congress of the International Society for Burn Injuries, 27 Липе -1 July,1994 Paris, France,-P.30.(Tumanov V.P., Serov G.G., Sarkisov D.S.).

18. New methods of treatment of burned patients with cultured allofibroblasts // 9th Congress of the International Society for Burn Injuries, 27 Липе - 1 July,1994 Paris, France, -P.31. (Fedorov V.D.,Sarkisov D.S., Alexeev A.A.)

19. Способ лечения ожоговой раны //Бюл.иэоб.и рац.-1991.-HI.- (51).(соавт. Туманов В.П., Саркисов Д.е.,Морозов С.С.).

20. Способ лечения ран // Бюл.иэоб.и рац.- 1994.- N22.-(46). (соавт.Федоров В.Д., Саркисов Д.С., Алексеев А.А. и др.).

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения ожоговой раны // Авторское свидетельство . -1991 . -N1699047 . ( соавт. Туманов В.П.,Саркисов Д, С.,Морозов С.С.).

2. Способ лечения раны //Авторское свидетельство.-1993.-N2023424.(соавт. Федоров В.Д., Саркисов Д.С., Алексеев A.A. и др.).