Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние стероидных гормонов на активность лизосомальных ферментов нормальной и патологически измененной кожи

наг4н0-исслед0вательский институт сармакологжг российская академия медицинских наук

нз правах рукописи

Щ?га|"; Марина Михаиловна

I

ВЛИЯНИИ ГПШ)ИД№К ГОРМОНОВ НА АКТИВНОСТЬ ЛН30С0МАЛЫ1ЫХ УЯРМПГГОВ НОРМАЛЬНОЙ И ПАТОЛОГИЧЕСКИ НЯМЕНЕНИОЙ КОЖИ

14.00.25- фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на сомскяте ученой степггнн кандидата медицинских наук

Моста 1994

Работа выполненз на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета.

Научные руководители:

Академик РАМН, доктор мэд]щинских наук,профессор П.В.Соргееп кандидат медицинских наук. Т.В.Ухина

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук М.Э.Камннна доктор медицинских наук, профессор Р.Д.Сейфулла

Ведушзя организация - ИМА им. Н.И.Сеченова

Зашитз состоится "..."............ 1995 г.

в " " часов на заседании диссертационного совета Д 001.25.01 в НИИ фармакологии (125315, г.Москзз, ул. Балтий-;Ская,8).

Автореферат разослан " "'....... 1995 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета доктор медицинских наук

Яворский А.Н.

Актуальность исследования:

В настоящее время в клинической практике широко применяются стероидные гормоны, что основано на широком спектре их биологической активности. Однако их применение в качестве лекарственных средств часто малоэффективно и сопровождается различными осложнениями, что связано с недостаточностью наших знаний о молекулярных механизмах действия стероидных гормонов на разные ткани организма.

Эффективность гормонотерапии во многом зависит от способности препаратов проникать через гисто-гематический барьер, их накопления и скорости метаболизма в тканях. В настоящее время достаточно хорошо изучена проницаемость многих гисто-гемати-ческих барьеров для различных групп стероидных гормонов. К сожалению, несмотря на успешное применение гормональных препаратов в практической дерматологии,особенно при терапии различных воспалительных заболеваний кожи, вопрос о проницаемости для них гемато-дермального барьера остается открытым.

Другим не выясненым вопросом в связи с гормонотерапией кожи остается возможность коррекции побочных эффектов гормонов, таких как кожная атрофия, стрии и т. д . [ 01каг1пеп А. Аасю Р. (1991)]. С данной проблемой связаны и так называемые эндокринопатические дерматозы: гиперпигментация кожи ( бронзовая окраска) при недостаточности надпочечников ( болезнь Адди-сона). " менструальные дерматозы", дерматозы беременных ( по-лосовидная атрофия, герпетиформное импетиго), климактерические дерматозы, гирсуитизм. акне при изменении Функций половых желез и т.д. [ВегагсЗеБса Е..СаМа Р..е1 а1'(1989). Во^п1а еЬ а! (1989).

Вместе с тем, наоборот, изменения метаболизма гормонов, обнаруживаются при целом ряде болезней кожи. Так. при склеродермии наблюдается дисфункция гипофиза и снижение функциональной активности щитовидной железы ; при псориазе - гипо- или гиперфункция надпочечников, половых желез, щитовидной железы [Милевская И. Р. (1984). Калашникова Л.А..Ким Е.К. (1989)]. Роль изменений метаболизма гормонов в этиологии и патогенезе перечисленных болезней различна и не всегда объяснима.

Известно, что в возникновении заболеваний, так и в развитии побочных реакций принимает участие лизосомальный аппарат клеток кожи, который выполняет специализированные функции органа: кератинизация, пигментация, рост волос, кожная секреция и т.д.. По данным последних лет, активность этих органелл изменяется и при некоторых заболеваниях (псориаз, атопический дерматит, экзема) и при старении кожи [Иванова И. П., Марева Т. Е. 1987, Мушет Г. В. 1987, Schopf Е., Kapp А. 1985 ] . Однако такие сведения отрывочны и противоречивы.

За последние годы была показана тропность стероидных гормонов к лизосомам.а также участие лизосомального аппарата в реализации гормонального действия на клетки. Наименее изученными являются вопросы гормональной регуляции лизосом клеток дермы и эпидермиса кожи.

Все вышесказанное определяет несомненную важность для клиники исследований в области гормональной регуляции клеток кожи и лх лизосомального аппарата , т.к. выяснение механизмов действия стероидных гормонов на лизосомы клеток кожи дает возможность разработки патогенетически обоснованных рекомендаций для повышения - эффективности лечения кожных заболева-

ний наряду со снижением побочных реакций . Другим аспектом наших исследований является поиск новых синтетических препаратов, обладающих специфической гормональной активностью в отношении заболеваний кожи и лишенных отрицательных побочных эффектов.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния стероидных гормонов на лпзосомн лермы и эпидермиса нормальной и патологически измененной кожи: цель исследования предопределила его экспериментально-клинический характер.

Задачи исследования:

1. Изучить проницаемость гемато-дермального барьера для меченых гидрокортизона, эстрадиола, тестостерона и прогестерона.

2. Изучить активность лизосомальных ферментов в дерме и эпидермисе кожи интактных крыс .

3. Изучить влияние стероидных гормонов ( гидрокортизона. эстрадиола. тестостерона и прогестерона ) на активность лизосомальных ферментов кожи крыс.

4. Изучить влияние новых стероидных синтетических препаратов, обладающих гормональной активностью на функциональное состояние лизосомального аппарата кожи крыс.

5. Изучить активность лизосомальных Ферментов в дерме и эпидермисе патологически измененной кожи (псориаз).

Научная новизна и практическая значимость.

В работе установлено, что 3Н-гидрокортизон. 3Н-прогесте-рон, 3Н-эстрадиол, 3Н-тестостерон при их внутривенном введении способны проникать через гемато-дермальный барьер. Наибольшей способностью к проникновению чер^з гемято-дермальннй бпрьер

обладает 3Н-кортизол. а наименьшей - 3Н-эстрадиол. Максимальный уровень удельной радиоактивности в тканях кожи определяется через 60 минут после введения гормонов.

При трансдермальном введении меченых препаратов наибольшая скорость включения в ткани кожи была характерна для 3Н-кортизола, а наименьшая для 3Н-эстрадиола. " Пик" накопления меченых гормонов в дерме и эпидермисе наблюдался на 30 минуте после данного вида введения.

Нами совместно с Т.В. Ухиной в дерме и эпидермисе был впервые установлен уровень активности четырех лизосомальных ферментов разного спектра действия, а именно: 3-глюкозидаза. р-галактозидаза, катепсин Д и кислая фосфатаза. Активность перечисленных гидролитических ферментов была выше в эпидермисе, чем в дерме . В интактных тканях кожи активность.лизосомальных ферментов у самок была выше по сравнению с самцами.

В работе также освещены такие неизученные ранее важные вопросы гормонального воздействия на кожу как изменение Функционального состояния лизосом дермы и эпидермиса в зависимости от вида и дозы гормона. При этом оказалось.что гидрокортизон . тестостерон, эстрадиол, прогестерон неоднозначно влияют на активность лизосомальных ферментов дермы и эпидермиса кожи крыс, что, видимо, связано с различиями в их липидном окружении и расположении в мембране. Гидрокортизон в большей степени влияет на активность катепсина Д. Половые гормоны, в отличие от него, в большей степени влияют на активность гликозидаз и катаболизм кислых мукополисахаридов.

Скрининг новых синтетических антиэстрогенных препаратов (КЛИ-418, КЛИ-423. тамоксифен цитрата, кломифен-цитрата) .

синтезированных в ЭНЦ РАМН В.М.Ржезниковым, позволил выявить, что их действие на активность лизосомальных ферментов дермы и эпидермиса схоже с эстрадиолом .

• Эксперименты по выявлению функциональной активности лизо-сом дермы и эпидермиса патологически измененной кожи проводили на биоптатах кожи детей.больных псориазом (любезно предоставлены отделением дет.дерматологии. ЦК8И. зав. отделением проф. Гребенюк В.Н.).

У детей (пре-. пост-, пубертантного возраста) с острой стадией псориаза отмечаются изменения активности лизосомальных ферментов (|}-глюкозидаза, катепсин Д). ведущие к снижению катаболизма белков и увеличению распада кислых мукополисахари-дов.

Полученные данные имеют несомненное клиническое значение как для расшифровки патогенеза псориаза, так и для разработки эффективных диагностических тестов и лечения данного заболевания. Кроме того, они позволяют во многом понять лизосомальные механизмы реализации действия гормонов на дерму и эпидермис и ставят новые задачи для их дальнейшего изучения.а также для разработки возможных путей их коррекции.

Апробация диссертационного материала.

Материалы диссертационной работы докладывались на совместных научных конференциях кафедры молекулярной Фармакологии и радиобиологии. ПНИЛ молекулярной фармакологии РГМУ и ПКИЛ метаболизма лекарственных веществ.

Материалы и методы исследования.

Для изучения проницаемости гемато-дермального барьера для стероидных гормонов крысам внутривенно вводили меченые тритием

гормоны из расчета 4 х 105 Бк (12x10"'0 моль) на 100 г массы животных.

Работа была выполнена на крысах массой 150-200 г., которых брали в эксперимент на 5-й день после гонадэктомии и адре-налэктомии.

Через 5, 15, 30, 60, 120 минут животных декапитироеали под легким эфирным наркозом. Извлекали кожный лоскут, разделяли его на дерму и эпидермис, взвешивали и высушивали. Ткани растирали до порошкообразного состояния в ступке с толченным стеклом, добавляли по 0,05 мл 2% раствора додеиилсульфата натрия. (SDS); подготовленные образцы помещали во флаконы с жидким сцинтиллятором. До начала радиометрии пробы выдерживали 30 минут для полной экстракции гормона сцинтиллятором, далее пробы радиометрировали .

Для изучения проникновения гормонов трансдермально мы проделали те же операции, что и описанные выше, за исключением того, что крыс забивали через 2, 5, 15, 30, 60, 120 минут.

Радиоактивность образцов регистрировали на жидкостном сцинтилляционном радиометре SL-40 Intertechnlque, Франция. Эффективность счета для трития составляла 20-25%.

Опыты по определению активности лизосомальных Ферментов в интактных дерме и эпидермисе, а также при действии на них гормонов проводили на белых беспородных крысах ( самцах и самках ) весом 180-200 г.,содержащихся на стандартном рационе вивария.

В опытах ln vivo при однократном введении гормоны инъеци-ировали в 20% растворе этилового спирта подкожно в дозах 1 и 10 мг/кг массы животного ( 5 и 15 мг/кг - прогестерон ). Крыс

забивали через t. 3. 6. 12. 18, 24 часа после введения гормона. В качестве контроля вводили соответствующий объем 20% этанола.

При проведении опытов In vitro препараты добавляли к го-могенату тканей в виде 20% спиртового раствора до конечной концентрации 10~3М, 10~7М, 10~8М. Гомогеняты инкубировали с гормонами в течении 30 минут при 37°С с последующим определением активности Ферментов.

Методы определения активности Ферментов лизосом основаны на спектрофотометрическом изменении количества продуктов реакции. катализируемой данным ферментом.

Для определения активности лизосомальных гликозилаз (р-глюкозидаза,р-галактозилаза) использовали метод Fat.el и Tappel (1969 г ). Их активность выражали в мкмолях освобожденного р-нитрофенола на 1 мг белка за 1 минуту инкубации при 37°С. Оптическую плотность как опытных, так и контрольных проб измеряли на "Specord М400" (Германия) при длине волны 420 нм. В качестве контроля использовали буферные системы.•

Для определения общей активности Ферментов в пробы добавляли Тритон XI00 в конечной концентрации 0.1%.

Активность кислой фосфатазы определяли по методу Barret (1969 г.). Оптическую плотность проб измеряли на " Specord М 400" (Германия) при длине волны 750 нм против дистиллированной волы. Активность Фермента выражали в мкмолях освободившегося неорганического фосфата за 1 минуту на мг белка. Содержание неорганического фосфата определяли по методу Lowry в модификации В.П.Скулачева (1962).

Активность катепсина Д определяли по методу Barret

(1977). Оптическую плотность проб определяли на "Specord М400"(Германия) при длине волны 280 нм против дистиллированной воды. Активность Ферментов выражали в мкмолях на мг белка. Белок определяли микробиуретовым методом. Активность фермента выражали в мкмолях на мг белка.

Определение фаз полового цикла у самок крыс (по влагалищным мазкам), а также кастрацию или адреналэктомию животных проводили по общепринятым методикам, описанным Киршенблат Я.Д. ( Практикум по экспериментальной эндокринологии ,1969 г.)

В работе были использованы следующие гормональные препараты: гидрокортизон ( "Serva", Австрия), эстрадиол ("Serva". Австрия), тестостерон ( "Serva", Австрия ), прогестерон ( "Ser- va", Австрия ), 3Н-эстрадиол ( "Amersham". Англия) ,3Н-тестостерон (" Amersham ".Англия ), 3Н-прогестерон (Россия), 3Н-кортизол ( " Amersham ", Англия ).

Статистическая обработка результатов. Для обработки экспериментальных данных был использован t-критерий Стьюдента (Н. Джонсон.Ф.Лион,1980).

Основные результаты исследования.

Изучение проницаемости, гемато-дермального барьера для стероидных гормонов.

Функцию биологического разграничителя, через который происходит проникновение различных веществ из крови в ткани кожи, выполняет гемато-дермальный барьер (ГДБ). Однако вопрос о проницаемости ГДБ для гормонов остается открытым, т.к. подобные сведения в доступной литературе отсутствуют. Поэтому первоначально необходимо было выяснить степень его проницаемости и изучить динамику накопления исследуемых стероидных гормонов в

Рис.3 Включение меченых стероидных гормонов в

дермр и эпидермисе.

Полученные нами данные позволяют утверждать, что меченые гидрокортизон, эстрадиол. прогестерон и тестостерон, вводимые внутривенно, способны проникать через ГДБ. При этом ткани кожи достигают максимальной удельной радиоактивности через 60 минут после введения гормонов (Рис.1,2)

При трансдермальном введении препаратов наибольшей скоростью включения в дерму наряду с наименьшей скоростью выведения обладал кортизол, а в эпидермисе - эстрадиол. "Пик" накопления гормонов в обеих тканях кожи наблюдался на 30 минут раньше, чем при внутривенном введении препаратов (Рис. 3. 4). При этом в количественном отношении уровень гормонов достигал значений в 100-250 раз больших, чем при внутривенном введении. Это еще раз подчеркивает, что ГДБ является биологическим регулятором проникновения гормонов в кожу.

Исследование активности лизосомальных ферментов в дерме и эпидермисе кожи крыс ч влияние на нее стероидтк гормонов.

Проникнув через гемато-дермальный барьер , гормоны могут влиять на ткани кожи, взаимодействуя с их клеточными структурами. В связи с этим возникает вопрос о механизмах действия этих гормонов на субклеточные органеллы тканей кожи . в частности на лизосомы, с нарушением Функционирования которых может быть связан ряд кожных заболеваний.

Как оказалось, в норме уровень активности исследуемых Фермрнтов выше у самок по сравнению с самцами: то же соотношение имеется в эпидермисе по сравнению с дермой. Из исследуемых Ферментов наиболее прочно связанной с мембраной лизосом оказалась р-глюкозидаза , а наименее катепсин Д (независимо от пола

животных), что. возможно, обусловлено особенностями их локализации и липидного окружения в мембране ( Табл. 1-2). Функциональное состояние лизосомального аппарата кожи крыс зависело не только от их пола и исследуемой ткани, но и от стадии астрального цикла (у самок) и возраста животных.

Таблица 1. Активность лизосомальных ферментов в интактных тканях кожи крыс-самок (мкмоль/мг белка) МмЛ.

Фермент акт-ть дерма эпидермис

р-глюкозидаза св 1.31 0. 13 1.81 к 0.23

об 2.89 ± 0.19 4.82 ± 0,41

% св 44,6 + 2,7 37,5 ± 1,2

(}-галактози- св 3,62 0.24 3.12 ± 0. 17

даза об 6,02 + 0.44 5,08 ± 0. 15

% св 60,4 2.3 62.5 ± 4, 1

катепсин Д св 0,25 + 0,02 0.31 ± 0,03

об 0. 38 4- 0.03 0.49 ± 0.04

% св 61,2 ± 3,7 60.8 ± 3.7

кислая св 0, 10 i 0.01 0.51 ± 0.01

фосфатаза об 0.21 ± 0,02 0.85 ± 0.0'.'

% св 50.4 1.9 58.8 + 2.7

Таблица 2. Активность лизосомалышх ферментов в ннтактных тканях кожи крыс-самцов (мкмоль/мг белка) М±т1.

Фермент акт-ть дерма эпидермис

(5-глюкозидаза св 0.35 + 0.03 0.42 ± 0.08

об 0.84 + 0,09 0.97 + 0.09

% св 40.6 + 2. 1 43, 2 ± 1.8

(5-галактозн- св 0,84 0,04 0,81 1 0.04

даза об 1.92 + 0. 14 1,98 т 0. 15

% св 43.7 + 2.9 40.5 ± 1.5

катепснн Д св 0. 15 + 0.02 0.26 + 0.03

об 0, 26 0.03 0.42 t 0.03

% св 55,2 + 2.9 60.2 ±2.3

кислая св 0.09 0.01 0,25 ± 0.01

фосфатаза об 0,23 + 0.02 0.72 + 0.06

л5 св 42.4 £ 1.5 35.2 + 1.5

оказались, что в коже молодых неполовозрелых крыс (по отношению к половозрелым животным) увеличен катаболизм белка в дерме, что. возможно, связано с потребностями "растущего" организма или с гормон-нечувствительностью дермы. Известно, что сроки становления гормонкомпетентности клеток зависят от тка-ии.вида животных и др. Все ткани млекопитающих приобретают присущую половозрелым интактным животным чувствительность к гормонам только к концу 3-Я недели жизни . У шестимесячных же животных, по сравнению с молодыми половозрелыми крысами, повышен катаболизм кислых мукополисахаридов (КИПС).

Влияние гормонов на лизосомы тканей кожи исследовали в опытах in vivo с трансдермальным введением в дозах 1 и 10 мг/кг массы животного для тестостерона, эстрадиола, гидрокортизона и 5 и 15 мг/кг для прогестерона. Данные дозы гормонов подбирались с учетом литературных данных .

Гидрокортизон действует на лизосомы дермы и эпидермиса уже в дозе 1 мг/кг и способствует выходу обеих исследуемых гликозидаз из их мембран. При этом у самок высвобождение ферментов не ведет к усилению катаболизма КМПС в связи с резким снижением абсолютных значений активности, что может быть связано с нарушением или снижением накопления гликозидаз в лизо-сомах кожи. На активность катепсина Д гормон в данной дозе не влияет, но снижает катаболизм макроэргов кислой фосфатазой как в дерме , так и в эпидермисе крыс обоего пола (Рис. 3.4).

При 10-кратном увеличении дозы гормона в коже животных происходят аналогичные изменения. Однако, регистрируется снижение активности катепсина Д (без изменений выхода фермента из мембран).

Адреналэктомия. не злияя на активность гликозидаз в дерме и эпидермисе самцов и самок крыс, увеличивает выход катепсина Д и кислой фосфатазы в коже самцов и снижает абсолютные значения этих ферментов в дерме и эпидермисе самок крыс. При заместительной терапии регистрируется возвращение активности ферментов к их значениям в интактных тканях.

Половые гормоны (тестостерон и эстрадиол) также уже в дозе 1мг/кг оказывают влияние на функциональное состояние лизо-сомального аппарата кожи крыс. Для прогестерона такой "минимальной действующей дозой" оказалась доза 5 мг/кг. При этом

Влияние гидрокортизона на активность лиэосомальны! Ферментов к охи крыс (в % свободной активности от обшей) м ± пи.(п=ю).

воздействие Р-глюко- Р-галакто- катепсин Л кислая зидаза зидаза фосфатаза

дериа

контроль 40,6 ± 2,1 I иг/кг 54.7 ± 2.2*

10 иг/кг 46.1 ±2.1

адреналэктоиия 36.5 ±1.6

43,7 ± 2,9 65.1 ± 2.7*

67,2 ± 3,4 49.7 ± 2.1 эпидериис

контоль 43,2 ±1,8 40,5 ± 1,5

I мг/кг 72.1 ± 3.2* 72.1 ± 2.1*

10 мг/кг 60,4 ±3,Г 65,2 ±2,5*

адреналэктоиия 38.6 ± 2.6 44.4 ± 2.4

55.2 ± 2.9 50.7 ± 3.2 50.9 ± 3.2 81.2 ± 2.!'

60,2 ± 2,3

58.4 ± 3.1

52.5 ± 3.1* 86.6 ± 3.2*

42.4 ± 1.5 27.6 ± 2.2* 40.8 ± 1.2 44,6 ± 3,1

35,2 ± 1.5 30,8 ± 1.2 45,2 ± 2,3* 55.9 ± 3.2*

примечаше: -р < 0,05.

все полозке гормоны через 1 час после введения вызывают однозначные изменения вне зависимости от своей специфичности (анл-роген, гестаген. эстроген), а именно: 1-увеличение высвобождения гликозидаз из мембран лизосом кожи у самцов и снижение его у самок: 2-сни;кение катаболизма фосфатов кислой фосфатазой у животных обоего пола: 3- не влияют на активность катепсина Л (Рис. 5-7).

При увеличении дозы тестостерона до 10 мг/кг выход глико-■зидаз из мембран лизосом в дерме у самок снижается и. наоборот, увеличивается в эпидермисе. Катаболизм белков катепспном Д при этом снижается в коже самцов и увеличивается у самок (Рис. 5).

Десятикратное увеличение дозы эстрадиола усиливает выход гликозидаз из мембран лизосом и возможность расщепления субстратов ферментами в коже самцов крыс ( Рис. 6).

Орхидэктомия приводит к резкому нарастанию активности гликозидаз и снижению выхода катепсина Д и кислой фосфатазн из мембран лизосом. Использование заместительной терапии возвращает активности ферментов к контрольным значениям.

Овариоэктомия снижает абсолютные значения активности гликозидаз в дерме крыс, в эпидермисе снижает катаболизм белков катепсинсм Д и макроэргов кислой фосфатазой и выход р-глюкози-дазы. усиливает выход р-галактозидазы из мембран лизосом.Заместительная терапия возвращает активность кислой фосфатазн и гликозидаз к контрольным значениям.

Интересно отметить, что после гонадэктомии половые различия исчезают. На основании этих данных можно предположить, что

- tq -

самцы

control l:ii::i:l 10 m(Aj Ш'А control I I in гпц/lig ДЯрМЭ. ГЭПИДорМНС

-,,ct 0ЯМКИ

КШ control ШШШ 10 ШйАв ЮТ control СП ю miA«

дерма згшдррнпс

Рчс.5. Влияние тестостерона на актигоюсть липоспмя.льичх ферментов кож крнс.

X.act

самцы

IQO I

b—glucoitdftM b—g«Uctostd»ee eatepstn D «eld photptulase

control liiiiiul 10 mg/kg

—непма_

I control 10 mg/kg

эпидермис

Я,act

самки

100

b—glucoildaM • b—fftUctostdfts« catepeln 0 «cid phovpbataa«

control ЕШШ 10 mg/kg

дерма

control О 10 mg/kg

эпидермис

Рис.

6. Влияние эстрадиола на активность лизосомальных ферментов в коже крыс'.

Z, act

самиы

b~gh2Coild»te b—f»UcteBid«ee catepvtn D «cid phosphatase

I control ШЛИ 15 mg/Jcg control о 15 mg/kg

дерма эпидермис

%,act

самки

100

b—(lucoetdaBe b—gaUctosldaee catepotn 0 »cid phoephaU*«

control ЕЛЕН 15 mg/kg WZ& control I I 15 mg/kg дерма эпидермис

Рис.7.- Влияние прогестерона на активность лизосомальных ферментов кожи крыс.

лизосомальныи аппарат кож» животных находится под непосредственным контролем полиьих гормонов. которые оказывают на него свое регулирующее влияние.

Прогестерон в диье 15 мг/кг снижает выход гликозидаз . а так:ке аосилятные значении их актииносга в дерме и эпидермисе самок крыс; у самцов гормин на (5-пшкозидазу не влияет, но увеличивает выход |5-галактизидази в дерме н снижает в эпидермисе. При этом прогестерон снижает вихид кислой фосфатази из меоран лизосом и увеличивает катаоолизм катеиспн Д-заьиеимих белков в эпидермисе и в дерме, независимо от пола животных (Рис. 7).

Заместительная терапия прогестероном овариоэктомироьашшх крис не приводит к возвращению активности ферментов к нормальным значениям. .Это свидетельствует о оолыием влиянии эстрадио-ла на поддержание структурно-функциональных свойств лизисом у интактних самок пи сравнении с прогестероном.

Таким ооразом . половые гормоны (андригены , эстрогены, гестагени) в отличие от гидрокортизона ы оольшей степени влияют на активность гликиоидаз и катаоолизм КМ11С. Гидрокортизон значительнее действует на активность катеисина Д и соответственно на белковый оомен. Кроме того, по нашим цанным. эстрогены в основном регулируют Функции лизосом эпидермиса.

Анализируя данные.полученные при исследовании влияния гормонов на активность лизосомальных ферментов 1м /кго. можно отметить', что гормоны в концентрации 10" ^М действуют однозначно с дозой гормона 10 мг/кг длн тестостерона, эстрадиола и

гидрокортизона и 15 мг/кг для прогестерона в опытах 1л vivo, а именно: гидрокортизон способствует выходу гликозидаз из мемб-ПН лизосом и снижает катаболизм макроэргов кислой ФоеФатазой как в дерме, так и в эпидермисе крыс обоего гюла: тестостерон снижает выход гликозидаз из мембран .лизосом r дерме у самок и .увеличивает r эпидермисе, катаболизм белков катепсином Л при этом снижается в коже самцов и увеличивается у самок: эстрадная усиливает выход гликозидаз из мрмбран лизосом и возможность расщепления субстратов Ферментами в коже самцов крыс: прогестерон снижает выход гликозидаз из мембран лизосом в коже самок.катаболизм катрпоин Л-зависимнх белков в эпидермисе крыс обоего пола. Такое однозначное действие на активность лизосо-мальных Ферментов, по-видимому, связано с тем. что гормоны непосредственно влияют на лизосомальнне мембраны, видимо действуя либо на аллостерические центры Ферментов, либо на какие-то компоненты мембраны, внедряясь в нее в качестве гидрофобных соединений.

Гормоны в концентрации 10"e М неодинаково влияют на Функ-■'пмальное состояние лизооомальннх Ферментов. Вероятно, это ■ в>! лно о тем. что гормоны в Физиологичных дозах могут действовать на лизосомы в тканях кожи не только путем непосредственного взаимодействия с их мембранами, но также опосредовано через рецепторно-Функциональные системы мембран клетки и образования вторичных мессенджеров f пЛМФ. пГМФ и т. д.).

Суммируя полученные результаты и учитывая данные литературы, можно заключить,что лизосомальный аппарат клеток кожи подвержен регулирующему влиянию стероидных гормонов. Это воздействие заключается в изменении активности и степени высво-

СТЕРОИД

Рис.8.Схема воэмояиого механизма действия стероидных гормонов на активность лизосомаяьных ферментов кожи крыс.

вождения ферментов из мембран лизосом. и. следовательно, возможности гидролиза различных клеточных субстратов данными фрр-ментами.На основании результатов нашего исследования также можно сделать предположение о различии механизмов действия стероидных гормонов на лизосомы, зависящее от их дозы.

Действие половых гормонов зависит от их дозы, пола животных и ткани.

Влияние половых гормонов на биохимические системы клеток, опосредованное действием лизосом. может осуществляться и за счет регуляции процессинга лизосомальных Ферментов. Это предположение основано на описанных результатах, что и требует дальнейшего детального изучения.

Принятые в настоящее время термины "стабилизатор" или ла-билизатор"лизосомальных мембран носят условный характер. Скорее всего.влияя на различные компоненты мембраны (липиды.белки. возможно,реиепторный аппарат и т.д.) или процессинг лизосомальных Ферментов, действие гормонов зависит от используемой дозы, что приводит к соответствующим изменениям высвобождения ферментов из лизосом или. наоборот, их включению в органеллы (Рис.8).

Поиск новых лекарственных препаратов, обладаюищх гормональной активноешью. и изучение их на лизосомотропность клеток кожи.

Для нужд современной клинической практики необходим поиск новых лекарственных веществ, обладающих выраженной гормональной ( или антигормональной) активностью, которые бы не имели присущих гормонам ( или антигормонам) побочных эффектов.

В настоящее время в клинике все большее распространение

приобретает дозированная накожная аппликация гормон-содержащих пластырей (например.эстроген-содержащих для женщин в период поздней менопаузы для восстановления нормального эпидермиса и стимулирования синтетической функции фибробластов дермы). В связи с этим весьма актуальным является изучение влияния на кожу новых препаратов с эстрогеннои активностью.

Анализ влияния на активность лизосомальных ферментов кожи крыс нистранола. являющегося синтетическим эстрогеном. синтезированного в ЭНЦ РАМН профессором В. М. Ржезниковым . позволил выявить аналогичное и более выраженное действие этого препарата по сравнению с эстрадиолом (Табл. 3). что заключается в усилении выхода гликозидаз и катепсина Д из мембран лизосом и, наооорот. в снижении возможности фермент-субстратного взаимодействия для кислой фосфатази.

При изучении влияния ряда антиэстрогенных препаратов (КЛИ-418 . КЛИ-423 .тамоксифен цитрат .кломифен-цитрат) на активность лизосомальных ферментов кожи крыс мы обнаружили лизо-сомотропное действие сходное с действием эстрадиола (Табл.3).

То есть исследованные антиэстрогешше препараты действуют на лизосомы кожи экспериментальных животных подобно эстрогенам. Следует подчеркнуть, что эстрогенная фаза свойственна для антиэстрогенов и при их влиянии на другие биообъекты.

Таким образом, синтетические эстрогены и антиэстрогены являются лизосомотрогашыи агентами и нарушают Функционирование лизосом кожи по эстрогенному типу, что следует учитывать при доклиническом испытании подобных препаратов.

Таблица 3. Влияние синтетических эстрогенннх и антиэстро-генных препаратов на лиэосомальнне ферменты дермы и эпидермиса сямок крыс в X свободной активности от общей активности. М ± гт>Ь (п«10).

препараты (5-г ли ко (5-галакто- катепсин л кислая

зидаза зидаза фосфатаза

дерма

контроль 50.4 2,7 61.3 ± 2,9 61.1 + 2.7 50.4 1.9

эстрадиол 60.5 + 2. 3* 53.8 ± 1.8' 65. 3 ± 4. 1 38.8 + 1.7'

кломифен 74. 1 + 6,6' 87,5 + 8. 1' 81.8 ± 6.5* 11.1 4- 1.2'

тамоксифеи- 84.5 + 6,7* 23.1 ± 3, 4' 80.5 9,4* 16.6 + 1.8'

цитрат

КЛИ-418 63.3 + 4.3 74.7 ± 6.6* 69.9 ± 7.4 13.3 4- 2. 1'

КЛИ-423 44 1 + 3.7 89.3 + 7.3' 75. 8 + 5.9* 18.9 4- 2. Г

нистранол 85.8 6.5' 41.6 ± 5. 4* 78. 6 + 6.6' 9.5 4- 1. Г

эпидермис

контроль 40.3 +■ 2.4 70.5 ± 2.8 60. 2 3.7 58.8 + 1.8

эстрадиол 59.6 + 4, Г 47.3 ± 1.4* 62.2 +- 2.4 41.2 + 2.5*

кломифен- 60.5 5, 1' 86.6 + 6.7' 86.4 + 5.3' 26.5 + 4.2'

тамоксифен- 76. 1 4- 4. 3* 87.2 1 6.9' 81.2 + 5. 4' 21,9 4- 2. Г

цитрат

КЛИ-418 39.4 t 3.5 66.3 + 7. 2 71. 1 4- 6.6 16.6 + 1.2'

КЛИ-423 90.3 8,4' 90.9 ± 8.4' 59.4 4- 4.7 24.3 + 2. 8*

Нистранол 77. 1 4- 6.5' 59,7 + 6.5' 61. 1 4- 5.2 22.4 -4- 1. 5*

Примечание:'- Р < 0.05.

Ацетиландрозол .предложенный А.В.Камерницким (институт органической химии РАН) в качестве противовоспалительного агента, статистически недостоверно снижал протеолитическую активность лизосом на фоне увеличения активности гликозидаз.

Исследование функционального состояния лизосомапьного аппарата в патологически измененной коже (псориаз).

Обследовано 20 детей,больных псориазом, в возрасте от 3 до 17 лет. Среди них было 13 девочек и 7 мальчиков.

Длительность заболевания до 6 месяцев была отмечена у 8 детей, от 6 месяцев до 1 года - у 2 детей, более 1 года у 10 детей.

Возраст, в котором началось заболевание, варьировал от 3 до 16 лет. Пик начала развития заболевания пришелся на возраст 5-8 лет ( 12 человек).

. Длительность последнего рецидива 1-2 месяца была у 7 детей. 3-6 месяцев- у 8 детей, и более 6 месяцев - у 5 детей.

У 19 детей процесс поражения носил распространенный характер. Псориатические бляшки располагались на коже волосистой части головы, туловища, конечностей; у 2 больных из них были также поражены ладони и подошвы. У 1 ребенка процесс поражения был ограничен разгибательной поверхностью локтей.

У 16 детей была отмечена экссудативная форма псориаза, которая характеризовалась наличием бляшек от 1 до 5 и более сантиметров в диаметре,с явлениями острого отечного воспаления с нерезко выраженной, а иногда и отсутствующей инфильтрацией, с обильным наслоением серозных или серозно-гнойных корок и корко-чешуек. У 10 детей отмечался зуд различной интенсивности.

Двое детей были с обычной формой псориаза, при которой имело место наличие ярких папул. У 2 детей отмечалась пуетули-заиия на Фоне псориатпческой эритролермии. Отмечались отечность и болезненность суставов.

Псориаз в стадии прогрессирования был у 17 детей . у 3 -стационарная стадия.

Наследственность была отягощена у 4 детей ( у близких родственников был псориаз).

Пациенты в острой стадии псориаза были разбиты на 3 группы по возрастному принципу - пре-,пост- и пубертатный возраст.

В клинической части работы было изучено функциональное состояние лизосом в бноптатах кожи детей, пораженных псориазом.

В коже здоровых детей ( контрольная группа) соотношение свободной и общей активностей лизосомяльннх (5-глюкозндазы и катепсина Л было выше в эпидермисе по сравнению с дермой: наиболее прочно связанной с мембраной лизосом оказалась (5-глпко-зидаза как в дерме, так и в эпидермисе.

В коже детей.больных псориазом в первой и второй возрастных группах снижались как абсолютные значения активностей катепсина Д, так и доля свободной активности . более выражение в эпидермисе (Табл. 4). Доля свободной активности р-глюкозидазы в эпидермисе,наоборот, увеличивалась на Фоне снижения абсолютных значений свободной и общей активностей. В дерме отмеченных изменений данного Фермента не наблюдали .

В третьей возрастной группе ( 16-18 лет) было отмечено повышение относительного содержания свободной активности катепсина Д у юношей .

Таблица 4. Активность лиаосомашных ферментов в дерме

эпидермисе детей оодъних псориазом ( а % сво бодной активности от общей активности). М + ш

группы кол 0-глюкозидаза катепсин Д

(пол) во дерма эпидермис дерма эпидермис

контроль 8 50.8 + 4.6 48,4 ±3.2 57.7 ± 5.4 62,5 +.5.7

группа 1

(5-9 лет)

девочки 7 58.3 + 1.9 89,3 ± 1.8' 32.2 1 4.7' 31.5 + 3.9'

мальчики 5 58.6 ± 8.8 88.1 +3.5 26,7 + 4.4' 26.6 + 4. 3'

группа 2

(14 лет)

девочки 3 61,8 + 5.5 89.1 +4.9 30,3 + 5.3 29.7 ±3.2

мальчики 1 48,9 83.5 25,8 49.5

группа 3

(16-18 лет)

девушки 1 56,2 75.5 42,3 40. 1

юноши 1 57. 1 77.6 55,2 83. 1

Примечание: • -р < 0.05

Так как данные возрастные группы отличались различным гормональным статусом пациентов, то мы предполагаем, что при псориазе происходит " поломка " механизмов гормональной регуляции лизосом дермы и эпидермиса: нарушаются либо синтез лизо-сомальных ферментов, лиоо " включение" их предшественников в лизосоми , что может привести со временем к дистрофии ткани .

выводы.

1. Гемато-дермэльннй барьер ( ГЛБ ) отличается низкой проницаемостью для гидрокортизона, эстралиола. прогестерона и тестостерона. При трансдермальном введении этих стероидов их скорость поступления и аккумуляции в дерме и эпидермисе превышает таковые при внутривенном введении в 100-250 раз соответственно. Наибольшей способностью к проникновению в ткани кожи через ГДБ и трансдермально обладает кортизол. а наименьшей -эстралиол.

2. Функциональная активность лизосом интактной кожи крыс выше у самок по сравнению с самцами. Активность лизосомальных гилролаз превалирует в эпидермисе по сравнению с дермой .

3. Активность лизосомального аппарата кожи крыс зависит от возраста животных. По сравнению с половозрелыми крысами молодые животные отличаются повышением ( на 153!) активности ка-тепсина Л в дерме, старые - повышением ( в 1.5 раза) активности кликозидаз в обеих тканях кожи.

4. Исследованные гормоны ( гидрокортизон, эстралиол. прогестерон и тестостррон ) в дозах 1-15 мг/кг ( гидрокортизон, тестостерон, эстралиол в дозах 1 и 10 мг/кг. прогестерон - 5 и 15 мг/кг) и з концентрациях 10"?М. 10"7М. 10"ЯМ изменяют активность Ферментов лизосом и прочность их свяли с мембранами в дерме и эпидермисе. Изменения в Функциональном состоянии лизо-сомального аппаоата кожи крыс зависят от типа гормона,его дозы, ткани кожи я пола животного.

5. Экспериментальные энлокринопатии влияют на активность лизосомальных ферментов дермы и эпидермиса кожи крыс. Адрена-лэктомия увеличивает выход катепсина Д ( на 65Я) и кислой Фос-

фатазы ( на 35%) в коже самцов крыс, снижая абсолютные значения этих ферментов, и не влияет на активность гликозидаз. Ор-хидэктомия приводит к резкому нарастанию активности гликозидаз ( в 2 раза) и снижению выхода катепсина Д и кислой фосфатазы (на 15% и 80%, соответственно ) из мембран лизосом. Овариоэк-томия снижает абсолютные значения активности гликозидаз в дер-ке крыс ( на 20%); в эпидермисе уменьшает катаболизм катепсин Д-зависимых белков ( на 15%) , выход кислой фосфатазы и гликозидаз (на 80% и 20%. соответственно) из мембран лизосом.

6. В работе исследованы следующие синтетические препараты стероидных гормонов: глюкокортикоид ацетиландрозол; эстроген нистранол; антиэстрогены КЛИ-418. КЛИ-423, тамоксифен-цитрат. кломифен-цитрат . Перечисленные препараты влияют на лизосомы тканей кожи в разной степени.Нистранол и антиэстрогены способствуют высвобождению гликозидаз и катепсина Д из мембран лизосом дермы и эпидермиса, снижая при этом возможность Фермент-субстратного ззаимодейстзия для кислой фосфатазы. Данные изменения активности ферментов схожи с таковыми при действии эстрадиола, но более выражены. Ацетиландрозол вызывает увеличивает долю свободной активности гликозидаз в обеих тканях кожи крыс и статистически недостоверно повышает выход катепсина Д из мембран лизосом.

7. Нарушение функции лизосом дермы и эпидермиса является одним из звеньев патогенеза псориаза: в острой стадии псориаза происходит увеличение ( з 2 раза) выхода (5-глюкозидазы на фоне снижения как абсолютных значений общей и свободной активностей. так и доли свободной активности катепсина Д ( в 2.5 раза) .

- ъъ -

Список опубликованных работ

1. Влияние гидрокортизона на активность лигосомальньк ферментов кожи.// Бюллетень -экспериментальной биологии н медицины, 1993, N 3, стр. 265-257'. ( Соавтр. Ухина Т.Е. ).

2. Лппидный спектр кожи при псориазе. /-• Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1953, N 9, стр. 271-271. ( Соавт. Сергеев П.З., Ухина Т.В., Калмагам-бетсва Г.Ж.).

3. Лнзоссмы нормальной и патологически вмененной кожи. // Беотник дерматологии и венерологии, 1994, N.4. стр. 28-30. ( Соавт. Ухина Т.В., Кубанова A.A., Сергеев П. В.)

4. Влияние яистранола на активность лпэосомалькыл ферментов кожи крыс. // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической фармакологии, Смоленск, 1994, стр. 134-135.) Соавт. Ухина Т.В.).