Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Влияние способа иммобилизации гепарина на взаимодействие биоматериалов с кровью и ее компонентами

шшсгерсгво здравоохранения ссср

иаучно-ксследовательснш институт ТРАНС11ШТ<могии й искусственных органов

На правах рукописи УДК 541.04:612.П

Нэкэц Евгегп® А-брг;лоЕ!я

шпэткте способа ккошизащй гажи нл

взш'одейстеле еисматеряадов с кровь» и ее компонентам!!

14.00.41 - трансплантология а хгскуссгавшгыэ органы

Авторефзрат дассоргацш на соискашзэ учвноа стегани кандидата биологических наук

Москва 1801

BIÄTO F,"полгода с Нзутоо-1;о<игдой»"«1ьдьсао:1 I'-ÜV^TÍTC rpsäcii ¿птаазпп i: искусстсзшас: орггя:ов СССР

Ез;лгилг pysoEour-TOja -

;~o:rrop с.содз ткэолк нэ«ч{ В.Ы. Сзюстысод

л;з:ггор H.Б. tk^E-я

траявлсайтолопп к глк^еслсшйк oprcKoz ^ашрьгс СССР,

сз;фзтгрь скзц::ги:.':;-.ровс.-:дого ccïctl

.ьОТГУОр ЯЗЗ-'ii» HpCjOCCCp

11* V tj^y-i.>... et...

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

_ Рэсетрэпкэ илиигеэского грз.»нонил искусствошшх органов, а танго скстеа и устройств, контактирущих с крозьо, гаклал) юсбю-дямость создается ботглаторлзлзп различная пргфода о пообходкгягл кошяэксом фазико-хгагшсшп и гетсовглзспешх свойств.

Разработка гвмособмзстеяж биомагэрпагоз вэдэтся, гдаЕПыл образом, Екпирятеэгаог! путей по двум направления:

- вгуксокяЕЗ ксагадоваяш? га синтезу новых каторгишзз:

- повэрхнастпая или обьзглпая аодв&асацяя су^етпугпга: бкоматоркл-лзв. С точки арония тегнолопяпости, стокгссттл и разнообразия подходов К5Я5ЯНО это напрашзшэ кажется сзгодгш па?£охз9 пэрспэ1гп:в-еш и аетуашш!! дня дашлкяшя гетгасовмосглизстл изделий кэдяцга-ского назначения.

Нахйаззо распространений! взпгзствач, р. зпользуеал! для модификации пшиторов о цэльо щцдания издалаг? эдздяского вазпато-ния геносош.гастк'ьк свойств, является гопзрш (ГП). Нэсокюшшя штерос прэдстааягат таю:хэ сок/в ставя гаиобшязацаи ГП с другггг,*п бкологкяэетш-аютпзЕк:,?!! вопретвами <БАВ), способствугжззйн кипс-яза-ЩТЛ Езажодзаспкш КОЛКфГЩгфОВЗННСа ПОБОрХЕОСТИ С Тр0.'Д501ЕГГВКИ.

В настояло время пса рззпосбразкэ способов гепобклззацчя ГП основано на фтакчэспса, кювахонтоя и яомйиняроваявои типах связывания азтккоагулядта. Однако, в багьялнетаэ аяучези автора обсуадаят ггтдепостеэ асгоэты хезгобидязацаа БАВ, зффшстакюсть дэйствзя которых оцзяЕваэтся по коночному рззультату без выяснения ьтзхаанзма повьпэнкя гшосоезстеглости. Практически по пршаздаэтел ЕО шпкояш всзшяяость ПХЮЯЭЯИЯ КвХаВИЭМа фуякцконнрования апти-коагулянта в повэржшетно связанное состояния.

В соотвэтстшш с отш цэль настегала работа состояла в сравнительном ашиигв кзхштгза гоеызэшш гзиосовкэсттаости биоиатори-алза при разлита способах «мяоейшшация ГП.

Для доеттзния указзяноа тли в работе быта постаагэны огэду-щш оспозпыэ задачи:

- протаста кошыэксноо кзучонш характера взахгзодэаопшя мода-фицироваинык образцов с кровыэ и оэ коипопозтаггл щи рашзгчпых способах кянобилизации ГП;

- ¡ашизственно оцэшпъ вклад проиэссоз адсорбция баков пдаззы кропи в изкэнэнмэ антикоагулянпш активности поверхностно связанного ГП;

- опредэ.вл ь роль знтшроьШна III (АТ-Ш) при взазаюдэасташ гейаршшззровав их бкоштркадов с тромбоцитами.

- разработать простой и дэЕзвыа способ повшоння хшосовгазсти-косте гопзркзсодеряазэго noiqsmm за счот сиккэшя адгозш тромбоцитов.

Иа/чная новазна. В fscScrro:

1. прэдлшша V, акс1 арзиетапло подгвэродзна пашеза об отрицательной шшншш образования слоя необратимо адсорбированных башюв ев аата1»агу,гянтадю активность газобпЕкзовашого гвпаркаа;

2. доказано, что основным йкямвотоа бахювого слая, отвзт- • ств&птсз за взатюдагзствкэ гошравззхфовавЕых бЕо^этернакш с троиЗоцигвия. яагяэтся антшрс;^ш III (AT-III);

3. odasppsH гхстрзкалъпьа характер зависимоеш количества троаЗощттов, адгеэкровагаиз: на гаяэрзйоста материалов с таазаваш-Бованша raospsscra от Ер&сэви юдаглгта с кровьо; .

4. рЕзргботан и эшьрьггэдтгазш) сбоссоваа способ соейзстной Е^шйдазает гешржа с шотпжагз&догаз шьготоа <ШО„ nmsSs-тором агрегация трсебоцшто;

Б. доказано. что ва повгрзиосте образцов, пасстщювешш сывороточша (CA) и $®ЗрЕЕогеноа (<&Г), Сорбируется

еоеослаа Е,ЗаКЗШЗ©ОШ5ЕИОГО ГЛ.

Праатетогааи езечыость. Рвзреботаншэ катода есйщюзвашя

шштаяи в "Обораа: e25to®riäcks5i рэйошвдацза ш оцзшй бВДСОШЭ-отпаи свойств вдусстбзвнш шгореаюв, контагшфувднг о кровъэ", {'¿-оста. IE8I г.) и рэко^задовавы ксшсстй по каструкантш, гшпэ-рзтггл, npsdopsa г шгервашз Шшпота ш> повоз кадацдаскоа тохзшш &яз.грзв8 СССР (протоков № 3 от 22 января ШЮ г.) дая одеши ,тласоЕгвстела cbcsctb бзгонаториадов.

Нрздюшзша способ шшсзекя гекосовавстаюета бшиатерашюа лзкгем сокхэстаоз каазбшизащш ГП и АСК позволял значительно поеы-сйт > с^этеевозть ЕЗЕэрошостиоЯ модафикацяи изделиа слошоа Форш из различна ю щгдюда гаишерных материалов. Ыэтод внэдрен в зхсш шкязт&шгув и клиническую практику ЮШ трансплаетшогш н искуссглзетш органов Минздрав;} СССР (г. Москва), ИССХ им. А.Н. Бакуяю"* йияэдрава СССР {г, Москва) и ВНИИ физиологии, биохюош и питания лсльскоюаяаств0ШШ1 животньи ВАСИШ СССР (г. Боровск).

Опубсжован I сборник методических рекомендация по оданкв бвосовмаетто; саозств искусственных материалов, контактирующих с кровью, кхгу -ано I гвгорсксе свидетельство, I рационализаторское v

продгошЕШэ, 3 заключения о npaimraecKo:.i кспользоваяш» результатов работы.

Апробация работы. Маториалн диссертации быдя прэдстаалэны на:

I к II научно-технических семинарах "Гемо- и биосо' .шсткшэ глато-риалы" (Кеов, 1038: Москва, 1990); vin Всесоюзном сншозиукэ "Сшпвтдчэсгазэ гишслорм медицинского назначения" (Кпэа, 1689); гйздународаои свкинарэ "Теория и щкязепешгз кэглбрзн в гекода&жзэ и плазмофзрзкэ" (Взргазэ, 1990); iv амврикано-совотском сетпоз1!укэ m систадам всгойогзталького кровообращения и биоматормлг:.! (Хыс--топ, 1830); I Всесоюзном скяхозяуга по зкскзр:т".энтажьноа серцзчно-сосудастоа хирургии (Суздаль, 1991).

Публихгцш. Оспоаяыз результаты дкссертапяи опублиовзны в

9 пзчатпых работах, I гзторско?а сшуртэдьстве и I сборнике кэтоди-чзскиж рекомендация.

Объем и структура ргботы. Диссертация лостоиг из введения,

обзора лггоратзгры, котодичэскол части, экскзрЕ.;зпташюз части, ззкдзчвния, выводов, списка .латоратуры и праиишиа.

Дкссэртация пегкеапа па русском языке, сояэрягг страшщ Kssîttomîciî. Указатель литература содэр'нт 100 источников, из шпг 19 отетастЕошпьйс и 81 гаюстршяьн. Работа идтастркрована 24 рисунками и 12 таблнц2г,ш.

СОДЕИЙАШЕ РАБОТЫ.

И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ.

fi. Объекты исошдования.

В качества объектов исслэдования были выбраны: пошвинилхяо-рзд иодищшетша (ПВХ) (Завод кэдищтсютх изделий из полеж^чых материалов, г. Б&шзрод-Дпэстровскиа), пол<урзтан "Btrryp" (ПУВ) (НПО ЧЬшкзрсинтоз", г. Владашр) и согшишр стирола и давнйал-бвязола <СТДВБ) (НПО "Бколар", г. Рига).

Способы модификации биоматериалов. 2.1 Пассивация поверхности биоматериалоа бэ.яками. Образцы полимеров предварительно обезжиренные скэсью епкрг-сфар 1:1, тщательно промыть© и высушенные; инкубировали в растоорэ СА (0,5 и 4,53), ©Г (0.2ÎS) на дасггиллированноЯ вода <37°С: I - 1,5 часа; РН=3,5) или дельной плазмой <ПЛ) крови человека (37°С; 0,5 :

- в -

час). Прзадсорсйфоваиныз бзлкововьй слой фиксировали в IS-ом раствор© глутаровсго адьдэгцда (ГА) (50°С, 40-50 кинут).

2.2 йккосй. шзацкя гшаршга копосродствэнЕО на поверхность шлаэров (прямая гепаршшзация).

Прлг.^я гошрстгзлцгхя образцов ПУВ и СТДВВ произведена на кафедра npotsELEDimos аколагии при Ш®1 ш. Д.К. Ьйндаюзва, Москва.

2.3 Е(г,;об1шгза1$ш пшзргзз на поворгкости бгокаторсаязв» хшсскзирозшги б&щхаа.

Образца С'ГДВЗр ПВХ в ГОВ, пассивкровашак СЛ, СГ iiem илагклоз аналогично п. 2.1 щад-Даровала в ргстаорэ ГП тробуемоз концэатр-avj.ni <37°С, 1-1,5 часа) осторо::ло npo;.;usaxi и фиксг-фовах! в IS-oa растЕоро ГА np:i БО°С в тстанкз 40-50 töisyr.

С цмы> удаюякя ЕзпрорззгЕропашзго ГА ocyt =»<гтл&о трэ5~ ьратиуз пролшк? в С? с изс^гцкэз в статшгэо !*знгз 20 спиуг. Затем отеихш сбрзацл иег;убкров&>«: в рзстворо П1 <37°С, 18 час), ■пцзтол то стаивал:! ©Р от посвдзагпшго алппгоагулстгэ и Bacyrasasi а тою обзспьцзшюго воздуха.

2.4 йакхйшззацзз гепзрза сошлсгао с Енпвбигороа агрогсцкн трокбоцгд-ов.

Процедура аналогична п. 2.3 с шгшъзоваякэа к&сто раствора ГП бинзряоа с&эся аэтикоагулязго и ACH с разлита соотиошгтзи ешкшезнтов по взсу от 20:1 до 5:1.

Катода ксслздеязашм гокосоЕкэстишг свойств негодных и кодафкцзрованныз бшзэторяалов.

3.1 Раддакзсггопньс кэтод регистрация юшетгаш адсорбции плазг.эннш; сз&якоз на повзрзиоетк бкоматераалов.

йсовдовала газшпажу рашия стадам (до 5 шауг> адсорбции CA ч С>Г чоловэгеа с использовании ког^зрчэскш щхэпзрвтов 13*1-СА и'эдрадаоцрэпарат, СССР) н 12&1-ФГ ("isotop", Вэнгрия).

Обрззвд Ессдэдуе^ах катаразлов пеггзцаш в плазму крона чзлОЕэка, содзркацую скэсь качены* балюза ва различно© время при посюяиноа пэрэкэашваиии. по&еэ инкубации при комнатной темтара- . туре образцы промывали в трех свэнах СР. доела чего определялась радио,чггшвость образцов на у-счетчике фирмы "peethold gammascint

bf-езэоо , фрг.

K0.3I4SCTB0 адсорбированного белка определялось по формуле:

к ' л / nc n, s

гдэ но. n - количество бзхш в 10 мгис инкубационноз с роды и

адсорбированного на поверхности образца, соотвэтствзнно» d ?ш\ no. n - радиоактивность 10 ш гиазмы и счот с погорзности образца, соответственно > в пиг/льсахЛят, s - пазцздь посэргноста обрззца, шнтактпрукзэгс с атазет" в

Получошшэ э!ссшрлг.:вптая>ЕЬ'э дешзиэ обргбатавалясь с ксполь-зовазкзм рззргйотагвоа рзпеэ натеяагпгезскоя годола. Количзстпэнпыз ш*рггэтрв - стеган ъ Езсбратиности адсорбции CA </?сд) и СГ а

такзэ относхгголшая стошнь аяьбугазгаацяа го&зрхности - Р, рзЕная

0ТВ0ПЗЗШ5 Pqp/Oqy- Сольет РСА и п. теп гггэ вероятность геко-

сок^зст:"*сста иссхэдуз::сго пзтзрпалз.

3.2 Оврэдэлззня вятЕзаостя гглой^зор«итого гепарина. AirnssocTb гсворагостпо связанного ант^гоагулязтз и'зучзгл по

isrsHoas» cäicMS02 копсэнтранкя АТ-Ш в результате контакта (37°С, СО пвз> о исслэдус^сет 0-гоггэтер:1аЕзкн. Использовали ыэтод zpcaorsszztz адстратов (scäop 0;tp'.ix ecshhingse, "FT).

3.3 för-ojnm коэттаства адгагЕровашл трс-Яодахов. ЕпзСгцгзэ псогэлубг-зя тал5г»роз с ярема, содзр&згда кзчэза»

трогйошгы, прогор-ыгл в ссэцкальшг кагорах кз полпйугзеот-еярягатэ, - тзвожххзя баз возгшгга с создаем одоврекэкно паедэ-даать в цсзггппЕьа: уаяогаях 10 сбрззцоз.

/активность образцов ощялзлялгеь на г-ctsrssis esstcojd ef-ззоо. Дгл контроля непользовз^л стсклгагуз дажл, трубки или rpanyjy.

В кзпзстеэ га„т.™остпзш:ого 1ф;гтер!ш кэтода еычксляли отвоси-тальаыа Еояаоагкмь адгегпроваяза трег/йецгггез (СПАХ) по фордулэ:

СПИ « м^р / мТО1Пр

то m^jjj, Mjgjjjjp - у-гяпЕяость (гхп/ггп) образца и контроля, соотсзтстгяняо, прспорцгоналыгыэ количэстзу трс?з5о1птоп, адпгза-

рОЕЛЕПЫЗ HS ис<ХЛЭДУЗ",03 ПОЕЗрХНОСТИ. ЧгМ ГСЗЪЕЗ ОПАТ, ТС", Е5СЭ

Езроатпость готгассЕгяэстклоста ггол-гзра.

3.4 Кзугзипэ стогзея аягаваш ад^зегрогипзгз тррябоцзтов. Актизадзэ тро::йоцгггсз :гзучял:1 путем ккорзпги кояцзэтргцга

трскбоцятарзого фактора 4 (ТФ-4), евдэлккэдгсся га кязтск в про-V0GCO адгезия. Ксполыюззлл раддаюя1увоятогёэскпа кэтод (зебор

аизотт laec>atc?m ест . Обрезиу полтеряах иатеркзлоз Езяуба-роэзда в евзяэпрэт-отоагэчяо* цягрзтпой (9:Т) кроэт. здоровы*

- о -

доноров (37°С, Л шш>. Споитанноз высвобокденш №-4 определяли в крою при тек т условиях» но без контакта с полимером.

3.5 Агрэгационная активность троглЗоцетов.

йзкзряЕюь кривые /^-индуцированной агрогащи трогаЗоцигов Kpoz¡sta» посла иж коишггя с исслэ дуемыми бишатерлалаш (37°С, И) кал). Кркваз спрямляла :ь в полулогар;фд ;чэскнх координатах. Таягзнс угла наклона пршой даот количествешакз крэторгз -капстенту агрзгацш (Кагр). Чзм мэныкэ изизнонкэ К™, тек вш» иорактЕОсть гекосовгйосгпшостп тшаюра.

З.в Оярэдэхзпкэ стешет "расшшстывания" адгззированкьк троглодитов.

Для опродзлэккя стешнн "распластывания" здге ¿ированньк трк^Зоцигов использовала кзтод схашфующэй элшярс шо2 ккхроекоши с вршзчоаща- по^авгогаткзсшзп cectcssj дгл шлтжотезнгоп» ена-¿szsa ггюЗргхзни& s.:0P-l(/iJ-G3). Паслз каатагега с кравгэ ек vivo и посла дуюцэг прокывхи в обржад ф*жегфог&га в 2.SS раствора ГА и депуц-етировали в азрин растворов sraEosoro спирта с возрастающее концэнтрацкза. Изучэпкз образцов сосхз си натшгикя на гас поверхность гогота праизводаи ш гхсзгароккоа скаящушш ИШфОСКОПЭ JEOL-330, при 15 кВт.

Количестве ннш кршвр®25 кзтода сдаст фактор фэрва тромбоцитов <£>, адгезмровзнкьн на поверхности полююра, вычшшюшя го

формула: - --

Г ■ < П S / Р

гдэ s, р - срздаш вашчкш пшцада и пэриаэтра краток на 5-7 слу-шо выбранных ИЕкрополяж ксслздуемого объекта. Чем блаш значащ© F к едгшнцэ, тел выагэ вероятность гтосовтсттостч полимера.

3.7 Опрэдзлэнш масса пристеночного тромба в динамике.

Бьиа изучена динамика пристеночного трокбообрсзовання при к. нтактэ ис&аэдуемых материалов с кровью собаки ex vivo. Коли-чечтваншя критерием служило количество тромботических масс, осе.эдет на стенках испытуемых образцов при протекании нагнано« кроЕД. гщстоночного тромба -МПТ). Для сравнительной оцэнки свойств образцов использовали относительный показатель пристеночно] о трсайообразования (ОППТ), равны» отношению МПТ на модифицированном образца и необработанном коятролз при одинаковом времени контакта с кровью.

Чем клав трзттр (ВДГ. тек шав дарокгность тюсоамеспдаа-m изданий га данного материала.

- о -

- III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСТЗДЕЖЕ.

21. Адсорбщюннвэ свойства гепаркшгзирсвашмз попоряюста.

алалп влияния способа гюдаЕикащш па пара:.',отрч адсорбцки СА я ОГ бил провэдэп дет СГДВБ и ПУВ с антекоагулягт м, коваяонтио связанным пзпосродстЕэшю с поверхность» (СТДВБ-ГП и ПУВ-ГП); для образцов' СТДВБ. пасстт-тропзттого СА, И" и плазмой (СТДВБ-СА, СТДВБ-ФГ и СТДВ5-ПЛ) и гопаринизироваиного чзрзз елей преадсорби-рованных балков (СТДПБ-СА-ГП, СТДВБ-ФГ-ГП я СТДББ-11Л-ГП); дяя ПУВ и 11ВХ с ГП, хзягобижзевашкп чорэз слой СА (ПУВ-СА-ГП, ПВХ-СЛ--ГГ).

125 ПрПП<ДОННЫ2 В ТЯбЛЯЦЭ I ОНаЧОШС! СТОГОПН пеобраткаости адсорбции боксов, г,:о::шо сдолзть ыгоод, что прямая иммобилизация ГП Емгываэт рззкеэ уиэлячошю р)Гг. пря постоянной рпа. В то вэ время, агопсоагулпат. фжеяфоваяпыа'яа различных образцах с преадсорбяро-поппым СА, изодаогпзчпо вл:шэт на параметру адсорбции.

. Тсбгздэ I. Влзшэ способа к'мобшкзатся ГГ. на пар-иэтры взасмдзестЕИя бпот-штернолоз с СЛ и <?Г.

Пояс-.тэр СПОССпЗ 1?"'0-билизации ГП "СА "ст Р + ^5Г

СТДШЗ Исходной 1,18 1,ео о.ез 2.СЗ

- " - ГП 1,13 4,89 0,24 6,05

- " - СЛ-ГП 1,10 о.ез Г,15 2,03

п?ж Ксзздзыз 2,24 1,20 . 1.07 3,44

- - СЛ-ГП 2.БЭ 2,08 1.И . 4,45

ПУВ КСЗГОДПЮ 1,22 0,94 1,30 2,13

- " - ГП 1,22 1*38 1,11 2,60

__ и __ СЛ-ГП 0,82 0.74 Г,II 1.Б8

Роль пргрсу?! пргздзорбгрозазшого бзлеа на шагодуйзяэ ^дсорй-гготшаз сеозстоз попоретост:! ейлда пзутояа па щгаеро СГД2Б <Тпбл. 2). Дет поггтрг:шостп, пзссго'фоязяиоя СА, небхддйэтея спсзонеэ рсв п. Р^, з прэгасорЗш-я ОТ, гапроткз, прпводат к повыгоняй РфГ на Оо:гэ лрзкгагсекя: пз'.?~»2поа /»оа. -В?»ста с тем обработка вэльноз пггггяа гжагзт сугрстгсетрэ усггтпагэ Рса и

Гопзржгапя шеепкраззнзоа вопврззгоста СХДББ кэ еякбсэт ерзотпогаа хгг-зпэгггл о пгреээтрзх адсорбщя Сл з отятчгэ от р^.

ГП сгассбэя к 1:с:лгг.з1;сообрззовйШЯ с СА к ггюот высокоо сро;

сто к СТ. С ддзугоа стороны, в вксдарикепте Еаблвдаюггся практиче-ет о®гаашшз заачэния Рсъ и в системах СА-ГП и ФГ-ГП, (Табл. 2). Эга шкиаккг: продахяокигь в обоих случаях саяичкэ рэвнокерно-го распрэдзлшга (созиожю ионослоя) шкобяшзоваиного антикоагу--Ежгга ш шээржЕзггга, что и приводит к шрзвшваниэ адсорбционных гвд&сго дащшж пгврпта. Равзэ <3ьшз обнарзаэш, что 1Т1 связывается с таиерхЕОстш б2штгорзг. гзв, иассдапроваовых СА, в соотношении 4:1 та Бзсу, ^то сазгедкуг с твдропгезйки рассчитанным дт образо-шшаз ьзщзотга ГН на щшздагрбгдхжагшза СА.

Тгйсэга 2. прс^хда щкг^дарйгрззаяного балка на параметры

. взз^^адазгтш СГ&5 с С& н £Г.

Спасай к^гхй&Егзггга гешрзза *%г А "СА +

Естцдаа '. 1.18 1,83 0.63 2.83

Пркжа! 1.16 0.24 6,1®

ШССЕШ га СД 0.80 1.Б1 0,63 2,47

Нассагкщрз €1" 1.22 2.£Э 0,51 3,в2

'П&ЕСквгщлга швжаза 2,® 2 .42 1.20 5,31

С&-Ш 1.10 о.сз 1ДЕ ' 2.«

©г-ш 1.П 1.14 2,да

ш-згн 2,80 1,Ш 1.45 - 4,73

СЕаввз Ш ЩРЩК&ВШШ» ХЕраКТврИСТИКИ '

С1ЩЩ5. г^гсзшрзшгжз птший, кш> сйшетигь ш- ■ ез^кшиг® юЗора йззэса в гжст!йЦ|ет2шя слт. чгеп» ш гшти- . рхг. кмкдаЕзшщг, га сгшздайза к шшждатей-расашакЕЭ с Ш.

12. йижЕгаадаетта® сзасепта гштаргшсшрашЕзше пкшёршости. ¿тЕШВДлкшшаз аотзапеть ГШ дравш в ршратата обра-ш завез сетшжа с шш&ПЕрет серташях Ершшда - АЗГ-Ш.

Ш§ккза ЕгзайЁакзосгш НЕ сотрошкдаотся с$шшя;шЕдап шйольшим даэ^ а^зжЕзя а&гшкяв дашршасти к АМН» ® опшге® от образцов -с Щ., фгжгрззшшаша га тех жо шдашжазг. ЮЕавцюша б«ви,' ^пр?^ ю$1ва|до|!й5^ртаашшага <{ашшго сям такая» гагазвгазвтся ва п'хщйшв гтагркшрошвшзшпп) каэтриалэ с А1-311. Беда в «яшы и ОТ^Б-ФГ-Ш вюшгшстта аяси^кйаршдаюЕШ ин-

гайюгшре врпшгз цржшша одазвшш. таз щггтюрждэет ввддащу-те шрдааиишшяэ 0 ¡швовюрвок рэсщредеаетшк ш кшркп шее-

бшгазовааиого гатжсоагулпята, то пря госсшацгя шиззои гффжпмсть кодйряцвровзтюго СТДВБ к АТ-Ш уЕвньпээтся.

Из подученных данных елэдуэт. что казгмжпуо '.т способа гепа-ряшзацкя б1;оматеряа*зв сугтзспцот отргхцэтольпая норраищот газду парамотрээ! адсорбцж! пказяэнных бажоэ С/з^р +■ /*£[■) я вффка-иостш говерхноста к АТ-1ГГ (Таблица 3).

Таблица 3. Значения гсозффшдазгггов коррэляцх! ш Сгмргеау (р) глсзду количеством ЛХ-Ш, связанного па ШЕзрхкостя гепзряпи-жфсвашак катэрпагов, и пзргкзтряня адсорбции СА и ФГ.

(>сл "ег Р

АТ-Ш (од/са2) - 0,404 - 0,857 - 0,571 - 0,893

Р отс. < 0,01 ото. < 0,0®

Анализ гапастаяг п ссбствэзпых зкспзрштентаяьшх результатов позволяет продотаггь слэдрзпуо схеду фушщкоикроваикя ГП в посорх-ностзо связанном состоешп!:

1. Гепарин тертт часть аптикоагуляптаоз азспвносга в результат© ковалоатного -свягкваккя с поверхностью биомзторяалов.

По-в:®«ому, в случае прямей гэпарияизащга рззкоэ рзягакэ

объясняется повызогаюя афивностью его к ГП на фоно стврячэскга затруднений, прэпятствукщих взашодеастюю антгасоагулянта с АТ-Ш (ПО ПрКЯЦШТу: ООЕ5 по АТ-Ш, то ФГ).

2. ПсЕзрхностно связанный гепарин но способов полностью рэажгаовать каталитичаскую активность по иаактивации тромбина, вслэдстекэ конкуренция кавду шгавмэнвьгот бэлкаш и АТ-Ш за ¡госта связывания на молокулэ аптакоагуляита и диффузионных затруднения.

Следовательно, с точки зрэния сохранения функционально л активности тчюбкшзоваяного ГП наиЗолэв зффветквны способы, тозво-ляэдзэ гдашшшфовать параметры адсорбции балков плазмы крови: яз птаршшрованноа поверхности.

§3. Взакйоде&ствиэ гэпаршизировапных бншатериалда с • ,трокбоцита;ш.

3.1 Адгезия тромбоцитов.

В таблица 4 продстаайзны результаты изучения влияния способа ижюбиишзащга ГП па характер взаикодействия биояатериалов с тром-

- 12 - . боцита:,ш. Обращют на себя внимание факт, что завксшость ОПАТ от врэкони дет гопа! инизированных образцов, в отлична от исходных, нос1гг экстремальный характер. Кроко того, как при прямой гогири-низации, так и при фиксации антикоагулянта на слое прэадсорбиро-вагшого СА, взакглодэйстввл бяшатеркалов с трогЛощггкш зависит от природа поджэаяси.

На прхкэро пассшащш СТДЗВ белками показано, что еоз£висе;,о от иг природа происз:о,{ят сш;»неэ количества адгозированных трои-

Таблица Влкяпеэ способа кийобилиэадай ГП навзакяодойствЕЭ б:-юаяторигдав с тро;з5ощзта?.;и.

ПЬлгелэр. способ О П А X

кодафшсадк 16 шш 30 иьш 60 кип % 3 виа 120 шв

С Т Д В Б

Исуодныз 1.05 1,ао 1,83 1,02 1,83

Прямая ] -паратазацвя 1.42 ' 2,04 1,62 г,ео 1,78

Пассивированный СА 0.37 0,63 0,68 0,81 0,60

Пассивированный ©Г 0.57 1,03 1,21 1,28 1,32

Пассивированный ГО1 0.32 0,59 0.7Б 0,78 0,76

СА-ГП 0,48 0.65 о.ез 0,69 0,64

©Г-ГП 0.47 0.63 0,91 0,70 о.ев

1И-ГП 0,30 0,44 0,60 . 0,51 0,43

0_Х

Исходный 0.44 0,72 0,81 0,83 0,80

СА-ГП 0,83 1,38 1,74 1,32 о.ез

П_0

1'СХОДВий 0,42 0,68 0,78 0,81 0,80

Щ я.-;8Л гепариикзацпя 0,79 1,58 1,28 1.&. 1,08

СА-ГП 0,39 0,56 0,81 0,52 0,49

бощпов. Бослздукоая фиксация ГП приводит к выравниванию параметров адгезии тромбоцитов в случае преадсорбции СА и ФГ, что-ев© раз годгверадаэт выдвинутое предположение о равномерном распределении го поверхности иммобилизованного антикоагулянта. Заметим, что изменения ОПАТ нельзя отнести за счет, пассивирующего эффекта белков: СТДВБ-ФГ > СТДВБ-ФГ-ГП = СТДВБ-СА-ГП > СТДВБ-ПЛ > СТДВБ-СА > СТДВБ-ПЛ-ГП. "

Отлпчитолыгоя особенностью гепарнцизкрованннх полшеров являет "0ТСЯ ггалояигольная коррэляцяя (Таблица 5) кежду и ОПАТ (для лошдифицкрованных гадрофобнык материалов эта корреляция отрицательна, р</?Сд - ОПАТ> = -0,08 (Р<0,001)). Бэстандартнкй характер носит таказ зависимость адгезии троьсбощггов от параметров адсорбции ФГ. Дяя поиодифацированных материалов она носит экстремальный зарактер, а для сыоматориалов с поверхностно связанным ГП кяеот кэсто шшяяатвлшап корреляция (Табл. 5) гезду этими параметрами. Слэдопательпо, закономерности, выявленные дая гидрофобных биомате-ршлов, т когут бить распространены на гепаринизированныв образин

В то псог'.я, для гвпзр:шизкрованЕЫХ образцов обнаружена коррзляцт жзду количеством эдгезировапных трорлбощггов и коли-чзстссм адсорбированного АТ-Ш (Табл. 5).

Тг&сгцз 3. Зловония козффнцгазнтов корреляции по Спирглену (р) между ОПЛТ и пзрп:.50трз:.га адсорбции СА, ФГ и ЛТ-Ш на гепари-■ шшроззшшх бпоматериадах.

га "фг р ^са + "фг АТ-Ш (ед/ом2)

ОПАТ 0,029 1.0 0,483 1.0 '- 0,943

Р <0,025 • <0,001 отсутств. <0,001 <0,005

Шдучэнныэ коррэлящюнпыо зависимости (Табл. 3 и 5) позволяют сдэлать с^эдугазво аахжгаоЕЕэ:

1. Дяя 1«парш®гкроваш2НХ сйтиатериалов АГ-III является основной кожонэвтоз адсорбцко-шсго слоя, ответственной за взаимодействие с тромбощггама.,

2. Адсорбция плазкешшх белков, независимо от их природа, оказывает лишь косвзнноэ влшшга на адгезию тромбоцитов за счет конкурен-нщи с АТ-Ш зз каста связывания на молекуле иммобилизованного аптикоагулянта.

3.2 Активация адгезированных тромбоцитов.

Для гепаркнизированных биоматериалов, независимо от способа их получения, корреляция между количеством высвобождаемого ТФ-4 и параметрами адсорбции CA, ФГ и АТ-Ш, а также ОПАТ отсутствует (Табл. 6). Вместе с тем, полученные результаты позволяют предположить, что степень активации тромбоцитов, адгезированных на гепари-низировзняых материалах значительно ниже, по сравнению с исходными

Таблица 6. -Значения коэффициентов коррелят»; по Спцрйвну <р)

между количеством высвобовдавмого Ш-4, трзйэтраая адсорбции CA, ФГ, AT-III и адгезией троибоцагов на гепаринизировашгых биоматериалах.

"CA п + "©Г AT-III о (вд/са Г ОПАГ

Т®-4 # (ег/см2) - 0,143 0,в43 - 0,250 0,286 ~ 0,383 о,ео7

Р отеут. отсут. отсут. отсут. отсут. отсут.

или пассивированными образцами. Так, при равенства количества ад-тезированных тромбоцитов в парах СТДВБ и СТДВБ-ГП;' ПУВ и ПУВ-СА-ГП степень кх активации на гепаршизированных образцах заштно юка (0.92 и 0.76; 0.22 и 0.16 ер-см2, соответственно).

Можно предположить, .что при адсорбции ка гепаринизированную поверхность болт ш протершвакгг конформационных изменений, необходимых для активации процэсса адгезии тромбоцитов.

§4. Совместная иммобилизация гепарша с аятиагрэгантш. Влияние концэвтравдм АСК в бинарной скоси на количество тромбоцитов/ адгезировашшх ка поверхности шдаф:ящх®звЕого ШХ, носит экстремальный характер (Табл. 7). При этой вводэниа антааг-рэганта эффективно только при высоких дозах антагсозгулянта-в кодифицирующем растворе (Табл. 7).

Таблица 7. Влияние соотношения ГП:АСК на количество '.рокбоцотов, адгезированшх на ПВХ.

Соотношение Концентрация ГП в нодафицирущза раствора (ед/кл)

ГП:АСК 100 500 . 1000

ГП без АСК 1,12 1,48 1,74

20:1 1,09 * 1,38 1.46

15:1 1,06 1,19 . 1,29

12:1 1,06 1,09 1.05

10:1 1,04 : 1,07 ; 1,03.

8:1 1,02 1,03 1,04

ö:I 0,98. 1,12 . 1.28

АСК боз ГП 0,83 ; 0,84 0,61

- is -

Таблица 8. Параметры адсорбции CA и ФГ из плазмы и количества

связанного AT-III для исходного и модифицированного ПВХ.

Способ дадафикацри пСК ' "ФГ ßCA + ПФГ AT-III (ед/см2)

Исходвдо 2.24 . 1,20 3,64 0,082

СА-Ш 2.39 2,06 4,45 0,189

СА-ТП-АСК (10:1) 2.37 1,42 3.79 0,242

СА-П1-АСК <5:1) 2.08 1,72 3,80 0,204

Параметры адсорбции CA и ФГ из плазмы и количества связанного AT-III дая исходного и модифицированного ПВХ представлены в таблица S, Кодафинадш геоверхности бинарной смесь0 сопровождается за-сзетши скгагенгезя суемарноа степени необратимости адсорбции белков и, как ояэдсгокэ, увеличением количества связанного AT-III. Сниже-еиэ aacoptffijsi AT-III при увеличении относительного содержания АСК с 10:1 да 5:1 на фоке равенства + n^j- объясняется, по-видимому, боиэо васокьм вкладом ФГ в конкуренции с AT-III за места связывания на гепзргшизированной поверхности.

Данные по данаиик» взаимодействия с тромбоцитами (Табл. 9) тозаоетсгг сделать вывод,' что экстремальный характер зависимости (ЛИТ от времени 'сохраняется и в случае кодификации ПВХ бинарной скееьа. Однако, по мере увеличения концентрации антиагрегзатз локальный «аксгязл сдвигается в сторону более ранних (30 шм) бреша котгаи.

Нэдувдшм результаты подтверждают сделашг* рэш© над о родя AT-III как основного медиатора взаимодеяотя тшшрадюйрэ-взяшх «йюматариалов с клетками.

Таблица 9. Влияние концентрации АСК в бшщтй сшей яз дагавду взаимодействия ПВХ с тршЗДотаи». v

Сшсоб О Я ■ А . f ТФ-4

модификации 15 мин 30 ют « ш №

Исходный 0.44 0,72 ом 0,8Э

СА-Ш 0,88 1,3« .1,74 Г,22

СА-ГП-АСК (10:1) 0.4,(5 1,№ ®м ÜJ2

СА-Ш-АСК (5:1) 0,Й2 - f ,т 'I.2S ХД2

. - le -

Гетриниззцю? приводит нв только к увеличению количества адгезированных трокбоцитов, но и к повыдаыизо стопэни кх активации. Использование m бинарной сшси (ГП:АСК=Ю:1) вызывает снегзяш высвобождения Т©-4 до уровня ниш исходного ШХ, хотя ОПАТ на модифицированном образцэ закзтно выю. Укэнывзнвз высвобокдения ТФ-4 при достают соотношения ГТ1:АСК=5:1 по сравнении с исходной кровью свидетельствует о десорбции аяткагрсгатга с поворхяости гепаршглзированного ПВХ в количествах, достаточные дда юдавлзния спонтанной агрегации трокбоцитов.

Действительно, при возрастании концзвтрацаи атыагрогшгта до 1И:АСК=5:1 значзниэ Кагр скачкообразно падает на фона роста ОПАГ, что ноано объяснить дэсорбцкэй АСК Б объем.

. Известно, что в растворе аитгагрегант образуот шашзкс с ГП при ГП:АСК=8:1-15:1. Для ПВХ oime,сально <с точки врония гемосоигэ-сткмостл) соотноеэякз ГП:АСК=8:1-12:1, что позволяет грдакшяигь образованна ношрлЕостаого связанного коглпязкса ПГ-АСК. ПЬшеэнеэ соотношения ГП:АСК до Б:1 приводах к появязниа избегла снтиагро-ганта. что отрицательно сказывается на параметрах: адсорбщш балков я активности «ммобияизованнох'о ГЛ.

?5. БзаишдзЕстввэ гетаргшжфованшх биоыатъриагов с цэлыюа' кровьо EX vivo и IM vivo.

Результаты изучения влияния способа ЕьзюбгхжзэдЕИ ГП ка íjssa-v:,<:zr приповэргностЕого трокбообраоовзпня бх vivo продотс-Елзна' в таблицах 10 к II.

Хсблща ТО. Влияние способа гашбилизацаа ГП на прж'лрамстЕсо

троибообразованиэ в усдэвшв: es vivo.

Иолиизр, способ кодзфикациЕ 0 п • п ' Т '

7 ьзш 14 ISIS <*>Х ¡W.III

СГДВБ - ГП о,ез 0.74 0,78

СТД8Б - СА - ГП 0,31 • 0,24 ода

отдав - ®г - га 0,33 0,25 0ДБ

СГДВБ - ПЛ - ГП 0.16 0,11 0,03

ПВХ - СА - ГП 0,61 0,52 0,35

ШЪ - ГП 0,56 ' 0,62

ГОВ - СА - ГП 0,23 0,14 одо

i

¡

Таблица II. Влияпш соотношения Ш: АСК и концентрации компонентов бинарной скеси па приповерхностное тромбоойрвзованке IÍBX в условиях ex vivo.

Способ ко- Соотноиэш» 0 П П Т

дификации ГП:АСК 7 мин 14 мин 21 мин

CA-ITI - 0,61 0,52 0,35

СА-ГП-АСК 20:1 0,55 0,47 0,30

— н — 15:1 0,46 0,39 0,27

___ м 12:1 0,34 0,26 0,19

—. — 10:1 0,31 0,22 0,16

— *• — 8:1 0,27 0,20 0,16

— a — б:1 0,25 0,22 0,24

СК-Ш ' - 0.44 0,63 0,83

йаз ездцо кз таблицу 10, наиболее эффективны способы инмоби-лзадв! ГП па поверхности биоматориалов. пассивированных белками.

Обработка ПВХ бинарной сетсыо ГП-АСК (Таблица II) приводит к сзкйегпш приповерхностного тромбоза по каре увеличения соотношения ГП:АСК аналогично результата*!, полученньм в условиях in vitro.

йз результатов матанатячесхоа обработки данных, полученных штодом авдпронноя скзяируидез микроскопии (Табл. 12), можно сделать вывод, что использование бинарной смэси ГП-АСК приводит практически к полному подавлению активации адгезированных в условиях ex vivo тромбощтгоз (параметр f доя ПВХ и силиконовой резины, гадафягтированных, бинарной смесью близок к 1,00) .

Таблица 12. Влиянкэ способа иммобилизации ГП на степень морфологических изменений адгезированных тромбоцитов.

Полимер Способ модафвсации к

Силик.резина СА-ГП 0.73±0.09

- " - СА-ГП-АСК (10:1) 0.9в±0,03

ПЛ-ГП 0,89-0,05

ПВХ СА-ГП 0,62-0,08

- " - СА-ГП-АСК (10:1) 0,95±0,05

- и - ГИ-ГП 0,77±0.07

)

- 18 -

. §6. Возможные оийбки при прогнозировании гекосовмэстшяаЕ свойств гопаринизированных бкоматеризлов на основании данных, полученных in vitro.

Как было показано в продадущем раздала, в рядэ случаов при оцэжэ гемоссвшстшмых свойств гепаринизирсвавЕШ: бжгаатериалов наблюдается несоответствие результатов in vite о к ex vivo.

Бов учета оссбонностей взаимодействия гопаршййязровзнЕЫх бко-катеризлов с кошюневтамн кровк в усдошяг in vitro такеэ оакбки нэз-пзбэкспы. Некоторые из нus иогут быть связаны с ягЕор:шовашэ;! влияния процесса формирования слоя нэобрапао адсорбированных балков на аятикоагулянтиуг активное п> к^обхуизоваввого ГП. Крэгэ того, боз учета зкстроизльного xapcirrepa заэисхкости относительного количества трог,3ох5тгов, гдгоз»фованапЕ на гешрйшзкроваЕныз; бионзтариаяах, што лаяуаггь зашзенниэ даншз, характера!» дяя локального какс>з;уиа в pasoso 30-60 минут инкубами. Tsic:si обнаружено, что швызэнкэ количества адгезкровашшж трагзбощп-оз es бсэ-гда корродирует с ухудазщзг, геиасовглэспЕйк свойств при Еаивэта-1531 изделия, ьслэдствиз сее;;энея стеганк аэткващ:! адгезирозакных клэтрк.

йкэсто с той, наличкз корреляций, odsapyaoheus езэд варвгэт-рами адсорЗщи cSjjkgs шшааы крсвл. аффхнностья гопарпюхрозянкос поверхности к AT-III к адгезгля тро:.:Зоц;ггов, нозголязт es« предю-кггь отказаться от части трудоемких мзтодов тестирован»!, связанна с использобзяшм радиоактивных препаратов (из.к5рагия параметров адсорбции белков я адгезии тромбощггов) с за.мапс. кг на опрз-' делониэ аффинности поверхности к AT-III и рзаш$~; Еысвобоэдэаия тромбоцитов.

ВНЖЩ

В результате исследования взаикодзйствдя m vitro к vivo трех полжэрньа материалов (шлавгиилхлорида, гюхэдзотааа "Вйтур", сопожшора стирола и длзйнилйэнзсла), гепаринизхфованньс разлучники способами, с балкаиа плазш крови (сывороточным вльбугогноа и ф1й{ШЕогекои), антитро8ййной III и трокЗоцигаии, а тамвэ с дашю* кровьв:

I. Показано, что по критерии гомосовгзстклоста (параметры адсорбция бзлхов» количество- адгезированкых трогЛо^тгоз я степень их активации» стегонь претовэрзностного тро?.;боза »x vivo), а так:;з

сохранении ккмобкяизозацяы?.! гепарином гнтякоагул<и.. raes активности,

\ - ' - ■ ' . ■

наилучшими являются образцы с гэпэринои, иммобилизованным на поверхности бгашатерналов, пассивированных белками.

2. Доказано, что на поверхности образцов с преадсирбированнш сывсрЬточным альбумином или фибриногеном, имеет место равномерное распредолэнкэ (возкокяо ионослоп) иммобилизованного гепарина.

3. На основании собственных и литературных экспериментальных данных доказано, что фибриноген адсорбируется на гепаринизирован-дуи поверхность в фортяе, кнергноа по отношению к меибранно связанны:.« рздапгоргн тромбоцитов, ответственных за их адгезию.

4. Обнарукэи экстремальный характер зависимости количества тромбоцитов, адгззкрованных на поверхности гепзринизированных бксматерналш, от Ерекени с локальным максимумом в районе 30-80 шшут контакта с кровьа in vitro.

5. Поясзсго, что для гепзртатафовзнньп: биоматериалов отсутствуют нзкоторуо корреляции, выявленные ранее при исследовании п-уюсфобпнх повзретостоа, а ямэнно, газду степенью необратимости адсорбцки снворототпого альбуикаа и количеством адгезированных трсглбсщггоз, а такк» козду количеством адгезированных троибоцкиов п, стзпэвьз их астивацця.

в. Дет ксслздоваанш: модифицированных поверхностей, независимо от способа кпобилЕзация гепарина, обпаруханы отрицательные коррзллци:!, с одаоа стороны, кздлу параметрами адсорбции белков пл2з:.а1 itpcEii и анхйсоагулштноз активностью иммобилизованного гспаряэ, с .другой,- тавду аффинностью гепзринизированной поверхности к AT-III я гагязстЕсм адгезированных тромбоцитов.

7. Евдвняуты й экстрикантально подтверждены гипотезы об отрзщэтольаом вдадаи процзссз образования моя необратимо адсорсйфовзншх балков на аятпкоагулянтную активность поверхностно связанного гоизркаа и об опрэдаляюиеа роли адсорбции ат-Ш в взакмодэастаии гепаржизировагшых материалов с тромбощггами.

8. Показано, что для адекватной оценки гемосовместимых свойств гепаринизкровзнш« биоматериалов достаточно ограничиться слэдуюгзез системой тостов:

- определение аффинности модифицированной поверхности к АТ-Ш

(in vitro),

- определение степени активации адгезированных тромбоцитов по высвобовдзнию тромбоцигарного фактора 4 (in vitro).

- регистрация динамики пристеночного тромбообразования (ex vivo).

)

9. Разработан и эксюришЕтально обоснован способ совкэстноа иммобилизации гепарина с ацетилсалициловой кислотой, позволяющий значительно повысить гемосовмэстимость изделиа медицинского назначения. доказано, что полученный эффект обуславливается образованней поверхностно связанного комшюкса гепарин - ацетилсалициловая кислота, кнгкбируицего адгезию и агрегацию тромбоцитов на модифицированных биоматериалах.

Список работ, опубликованных по тел» диссертации:

1. A.C. 138Г&52 (СССР) Н.Кл. A8IK 31/725. Способ швышння тромборезистенности полимерных материалов / С.П. Новикова, Е.А. Немец, З.М. Беломестная.- Опубл. 30.04.88.- Б.И.- №б.

2. Взаимодействие гапаринлзированноя поверхности биокатэриа-лов с тромбоцитами // В сб.: Вопросы трансплантологии и искусственных органов / Под ред.: В.И. Шумакова.- М„ 1889.- С. 173-175 (соавт. З.М. Беломестная, С.П. Новикова).

3. Влияние способа иммобилизации гепарина на взаЕдодэйствш -биоматариалов с компонентами крови // Тез. докл. vin Всесоюзного симпозиума "Синтетические шликера шдицинского назначения".-Киев, 1989.- С. 88-97 (соавт. Ю.Л. Кульчицкий, В.Й. Севастьянов).

4. Модификация полимерных поверхностей згокси-производашш гепарина // Тез. докл. 2 НТО "Геиосовмэстшш и бшсоЕ'Лэгтааш материалы".- M, 1990.- С. 9 (соавт. М.И. Изанчэшсо, С.П. Новикова, Ю.А. МШайн, Т.А. Черкасова, В.И. Севастьянов).

5. Повышение трокборезистентности полкмэрных кат* риалов производными гехирина // В сб.: Экстркиэнталкшя cepir шо-сосудастая хирургия.- M, 1991.- С.135-136 (соавт. С.П. Новикова, Ю.А, Леакин, Т.А. Чэркасова, В.Г. Севастьянов).

6. Адгезия тролйоцигов на гепаршшзированных материалах // В сб.: Экспериментальная сердечно-сосудистая хирурпш.- У, 1891.-С. 143-144 (соавт. С.П. Новикова, В.И. Севастьянов).

7. Сборник методических рекомендаций по оценка бносоваэстимыж свойств искусственных материалов, контактирующих с кровьэ / Под ред.: Н.Б. Добровоа, Т.И. Носковой, С.П. Новиковой, В.И. Севастьянова.- M, 1991.- 70 с. (соавт. З.М. Беломестная, Е>А. Цэатлина, А.Ю. Городков и