Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние производных глицина и y-аминомасляной кислоты на течение экспериментальных аллергических реакций

На правах рукописи □030В3079

ШНЕУР Семен Яковлевич

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ГЛИЦИНА И у-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

14 00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

? 3 МАЙ 2007

Старая Купавна - 2007

003063079

Работа выполнена на кафедре фармации ГОУ ВПО Тверской медицинской академии.

Научный руководитель доктор медицинских наук,

профессор Демидова М.А. Официальные оппоненты доктор медицинских наук,

профессор В.Л Ковалева доктор медицинских наук, профессор В В.Яснецов Ведущая организация Российский государственный

медицинский университет

Защита диссертации состоится « 30 » мая 2007 г. в 1030 ч. на заседании диссертационного совета Д217.004.01 в ВНЦ БАВ (142450, Московская область, пос. Старая Купавна, ул Кирова, 23)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ВНЦ БАВ.

Автореферат разослан « 27 » апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Корольченко Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Совершенствование фармакотерапии аллергических заболеваний является одной из важнейших задач фармакологии (Мокроносова М.А., 1997;. Хаитов Р.М, 2002; Гущин И.С., 1999, 2001; Адо А.Д, 1994; Гущин И.С., Ильина Н.И., Польнер С.А., 2002; Бу-лина OB., Горланов И.А, Калинина НМ, 2004; Brisman et al., 1995; Heinrich et al, 1995; Stark et al, 1996). Урбанизация и химизация, появление новых аллергенов, широкое применение лекарственных средств, в том числе антибиотиков, изменение характера питания и другие причины приводят к тому, что во всем мире регистрируется рост заболеваемости аллергией (Пыцкий В.И. и соавт., 1999; Паттерсон Рой и соавт, 2000; Хаитов Р М, 2002, Jlycc J1.B., 2002). В настоящее время в медицинской практике используют большое количество противоаллергических средств, однако они не всегда являются достаточно эффективными, поэтому изучение влияния лекарственных препаратов на течение аллергических заболеваний сохраняет свою актуальность (Ионов И.Д, 1991, Гущин И С., 2002, Чучалин А.Г , 2000-2004, Медуницын Н В , 2001; Хаитов Р М , Пи-негин Б В., 2003, Ковалева B.JI, 2006).

Известно, что в формировании аллергизации организма принимает участие центральная нервная система (Ковалев И.Е., Сергеев П.В , 1972; Козлов BJC, 1973, Абрамов В В, 1988-2006; Йегер JI, 1988, Пыцкий В.И, 1991; Leslie et al, 1989). Имеются данные о том, что нарушения нормальных взаимоотношений между нейроэндокринной и иммунной системами способствуют возникновению аутоиммунных и аллергических заболеваний или определяют характер течения этих болезней (Абрамов В.В., 1996). Описано участие в аллергическом процессе ГАМК- и опиои-дергических механизмов (Утешев Б С., Коростелев С А , 1990, Gentilini et al., 1995, Djuric et al, 1995, Демидова M А , 1997) Обращает на себя внимание и тот факт, что в процессе аллергизации организма наряду со специфическими иммунологическими изменениями развивается выраженная тканевая гипоксия (Адо А.Д, 1978, Пыцкий В.И., 1991) и происходят существенные метаболические сдвиги. В частности, наблюдается активация реакций свободнорадикального окисления на фоне понижения активности антиоксидантных систем (Кошелевский В И., 1987, 1997; Митина Т.В., 1991; Ракита Д.Р., 1997; Демидова М А , 1997-2006; Di Gianni, 1996 и др ) Регистрируются выраженные изменения мембранных липидов клеток-мишеней аллергического процесса (Йегер J1, 1988, Гущин И.С., 2003), в том числе фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма (Демидова М А , Слюсарь Н.Н , 1997). Между тем известно, что фосфоинозити-

ды и их метаболиты принимают участие в реализации действия нейроме-диаторов на молекулярном уровне (Долго-Сабуров В.Б., 1989; Утешев Б.С., 1992; Baraban, 1989; Calvet et al., 1995, Li, 1990; Manzoni, 1990; Sharif et al., 1996 и др.), а также в процессах активации клеток-мишеней аллергического процесса (базофилов, тучных клеток) и иммунокомпе-тентных клеток (Лященко В.А.и соавт, 1988, Суслов А.П., 1990; Карга-полов А.В., Слюсарь Н Н , 1992-2005, Beaven et al., 1988, Gruchalla et al., 1990). При гидролизе полифосфоинозитидов происходит образование вторичных мессенджеров диацилглицеролов и инозитолтрифосфатов. Кроме того эти липиды являются одними из поставщиков арахидоновой кислоты и эйкозаноидов (Пыцкий В.И., 1991; Гущин И.С., 1993; Ковалева В.Л., Чучалин А Г., 1997; Bach, 1988; Abraham et al., 1989; Chilton, 1990, Seeger et al., 1990, Gibs et al., 1996 и др.). На метаболизм мембранных фосфоинозитидов оказывают влияние различные нейромедиаторы, в том числе нейроаминокислоты и их производные (Li X N , Song L., Jope R S , 2000) Однако эффекты новых производных аминокислот в этом отношении изучены недостаточно. С учетом роли центральной нервной системы и метаболических нарушений в патогенезе аллергии целесообразным представляется изучение влияния нейроаминокислот и их производных на течение аллергических реакций Известно, что многие производные нейроаминокислот наряду с центральным действием обладают рядом свойств, которые могут быть ценны для коррекции метаболических нарушений при аллергических реакциях. Так, например, ряд производных тормозных нейроаминокислот (глицина и у-аминомасляной кислоты) обладают выраженной антиоксидантной, мембраностабилизирующей и ан-тигипоксической активностью. Существуют сведения, что глицин оказывает выраженное противогипоксическое действие на моделях гистотокси-ческой, гиперкапнической и гипобарической гипоксии, причем введение фосфорилированного остатка в молекулу глицина приводит к повышению противогипоксической активности данной аминокислоты (Макарова JI.M , 2006). Результаты экспериментальных исследований показали, что новый оригинальный дипептидный препарат, содержащий глицин - но-опепт (этиловый эфир Ы-фенилацетил-1-пролилглицина) предотвращает вызванное стрессомнакопление продуктов перекисного окисления липи-дов, снижая содержание диеновых конъюгатов и шиффовых оснований, повышает активность эндогенных антиоксидантных систем - суперок-сиддисмутазы, каталазы и церулоплазмина, обладает антитромботиче-ским эффектом, проявляет противовоспалительный эффект на моделях острого неиммунного и хронического иммунного воспаления (Воронина

4

Т.А., Гудашева Т.А, Островская Р У, Воронина Т.А., Гарибова T.JL, 2004, 2006) Таким образом, известные фармакологические свойства глицина и его производных дают основания для изучения их эффектов при экспериментальных аллергических реакциях.

Работа выполнена по плану научно-исследовательской работы Тверской государственной медицинской академии (ТГМА) в рамках научного направления "Фармакология аллергии". Тема исследования утверждена на заседании ученого совета ТГМА и на заседании проблемной комиссии "Фармакология нервной системы" РАМН

Цель работы Исследование влияния производных нейроаминокис-лот на течение экспериментальных аллергических реакций (in vivo и in vitro).

Задачи исследования Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

• Исследовать влияние глицина, 1\Г-фенилацетил-1-пролилглицина, пикамилона и натрия оксибутирата на течение системной (анафилактический шок у кроликов и системная анафилаксия у крыс) и местной (реакция активной кожной анафилаксии у крыс) анафилактических реакций в эксперименте на животных

• Оценить влияние глицина, М-фенилацетил-1-пролилглицина и натрия оксибутирата на развитие анафилаксии in vitro (в тесте прямой реакции дегрануляции базофилов крови кроликов).

« Исследовать влияние глицина и К-фенилацетил-1-пролил глицина на течение кожной аллергической реакции замедленного типа у мышей.

• Исследовать изменения содержания фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма в крови, лимфоцитах и макрофагах крови ал-лергизированных животных под влиянием тормозных нейроами-нокислот и их производных;

• Оценить антигипоксическую активность глицина, N-фенилацетил-1-пролилглицина и натрия оксибутирата при экспериментальной анафилаксии;

• Провести сравнительный анализ эффектов действия глицина, N—- фенилацетил-1-пролилглицина и натрия оксибутирата при экспериментальной анафилаксии с действием глюкокортикостероидов (преднизолона) и кромолин-натрия.

Научная новизна работы Впервые на различных экспериментальных моделях анафилаксии (системной, местной и in vitro) обнаружено наличие умеренной противоаллергической активности у глицина и его про-

5

изводного нового оригинального препарата этилового эфира фенилацетил-1-пролилглицина (ноопепта). Впервые выявлена способность глицина и его производного (ноопепта) повышать устойчивость подопытных животных к анафилактической гипоксии. Впервые показано, что глицин и 1Ч-фенилацетил-1-пролилглицин оказывают корригирующее влияние на метаболизм фосфоинозитидов в крови, лимфоцитах и макрофагах крови при экспериментальной анафилаксии.

Научно-практическая значимость работы Результаты работы имеют как теоретическое, так и практическое значение. Фармакологически доказана возможность применения производных тормозных нейроа-минокислот в комплексной, патогенетически обоснованной терапии аллергических заболеваний. Выявлены изменения содержания фосфолипи-дов, в том числе фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма, в крови, лимфоцитах и макрофагах при анафилаксии Показана возможность фармакологической коррекции нарушений гомеостаза фосфоинозитидов при аллергических реакциях немедленного типа с помощью нейроаминокис-лот и их производных. Показана возможность использования препаратов с антигипоксической активностью при анафилактическом шоке для повышения устойчивости организма к анафилактической гипоксии Результаты исследования позволяют рекомендовать 1Ч-фенилацетил-1-пролилглицин для расширенных доклинических испытаний в качестве противоаллергического средства.

По материалам диссертации было сделано 3 рационализаторских предложения.

Положения, выносимые на защиту.

1 Наличие противоаллергической активности у глицина и Ы-фенилацетил-1-пролилглицина.

2. Способность глицина и ТЧ-фенилацетил-1-пролилглицина восстанавливать содержание фосфоинозитидов и их метаболитов в крови и им-мунокомпетентных клетках крови при экспериментальной анафилаксии

3. Повышение устойчивости подопытных животных к острой гипоксии при анафилаксии под влиянием натрия оксибутирата, глицина и Ы-фенилацетил-1-пролилглицина.

Внедрение. Результаты исследований используются в учебном процессе при проведении занятий и лекций по следующим темам: "Противоаллергические средства", "Иммунотропные средства", на кафедрах фармакологии Пензенского государственного университета и Смоленской государственной медицинской академии, кафедре фармации Тверской государственной медицинской академии, а также в научных исследованиях, 6

проводимых в НИЦ Тверской государственной медицинской академии

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на XIV Всероссийском конгрессе "Человек и лекарство", на областных научно-практических конференциях (Тверь, 2006,2007), на расширенном заседании кафедры фармации

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ. Сделано 3 рационализаторских предложения

Объем и структура диссертации Работа изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, научно-практических рекомендаций и списка литературы, включающего 250 источников, в том числе 160 отечественных и 90 иностранных. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и документирована 15 таблицами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проведены на 38 кроликах калифорнийской породы обоего пола массой 2,3±0,2 кг, 134 крысах-самцах линии Вистар массой 190-200 г, 357 белых беспородных мышах обоего пола массой 20-22 г и 96 мышах-самцах линии Balb/C массой 21,2±0,4 г. Эффекты нейроаминокислот и их производных: глицина, этилового эфира 1Ч-фенилацетил-1-пролилглицина (ноопепт, НИИ фармакологии РАМН), натриевой соли N-никотиноил- у-аминомасляной кислоты (пикамилон, Мосхимфарм, Россия) и натрия ок-сибата (натрия оксибутират, Мосхимфарм, Россия) оценивали с использованием различных моделей анафилаксии (системной, местной и in vitro), а также кожной аллергической реакции замедленного типа В качестве препаратов сравнения использовали один из наиболее эффективных препаратов для лечения анафилаксии глюкокортикостероид преднизолон (преднизолона фосфат натрий, Симпекс Фарма, Индия), препарат кромог-лициевой кислоты, угнетающий высвобождение медиаторов аллергии из тучных клеток и базофилов - кромолин-натрий (интал®, Гедеон Рихтер, Венгрия) Исследуемые соединения вводили кроликам внутривенно, мышам и крысам внутрибрюшинно за 15 минут до разрешающей инъекции антигена и в последующие 5 суток.

Кроликов сенсибилизировали однократным подкожным введением свиной сыворотки в дозе 1 мл/кг по методу Четверикова Г.Н (1971), разрешающие инъекции антигена вводили внутривенно в дозе 1 мл/кг на 147

й день латентного периода сенсибилизации. При этом у подопытных животных развивалась двухфазная анафилактическая реакция, при которой немедленная фаза регистрировалась через 1-2 минуты после введения антигена, повторное развитие симптомов отмечалось через 6-8 часов в результате позднего ответа. Тяжесть анафилактического шока у кроликов в немедленной фазе определяли в баллах (Weigl, 1960). Использование модели анафилактического шока у кроликов позволило оценить влияние исследуемых препаратов на течение как немедленной, так и поздней фазы анафилактической реакции, при этом учитывали, что двухфазные анафилактические реакции развиваются у 5-20% пациентов (Чучалин А Г, 2007)

Активную иммунизацию крыс и мышей проводили овальбумином по методу ЛП Ишимовой, Нгуен Нанг Ан (1962) (Ветренко Т.В. и соавт, 1983) С этой целью подопытным животным трехкратно ежедневно подкожно вводили 1 мкг овальбумина (Sigma, grade III), разведенного в 0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида с равным количеством вазелинового масла. Для индукции системной анафилаксии подопытным животным вводили внутрибрюшинно на 21-й день латентного периода сенсибилизации разрешающие инъекции овальбумина (1 мкг овальбумина в 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида) Системная анафилаксия у крыс и мышей проявлялась развитием анафилактического отека тонкого кишечника, выраженность которого оценивали по изменению содержания общей воды (методом высушивания до постоянной массы). Индукцию системной анафилаксии у крыс осуществляли для изучения влияния производных ней-роаминокислот на выраженность анафилактического отека внутренних органов. На модели системной анафилаксии у мышей оценивали антигипок-сическую активность исследуемых соединений в тесте острой гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме

Реакцию активной кожной анафилаксии у крыс индуцировали на 21-е сутки латентного периода сенсибилизации С этой целью подопытным животным внутрибрюшинно вводили синий Эванса (0,25 мл 1,6% раствора на 100 г веса), после чего внутрикожно - 0,05 мкг овальбумина, что приводило к развитию местной аллергической реакции Через 20 минут подопытным животным внутрибрюшинно вводили исследуемые препараты. После достижения эффекта препаратов повторно внутрикожно вводили антиген с другой стороны живота Через 20 минут животных (под эфирным наркозом) забивали, отсепаровывали кожу и оценивали результаты реакции. Визуально кожная анафилаксия проявлялась окрашиванием участка кожи в синий цвет, что было связано с выходом красителя из кровеносного русла в очаг аллергического поражения. Выраженность реакции активной кожной ана-8

филаксии оценивали по площади опытных и контрольных пятен

Исследование анафилаксии на клеточном уровне проводили на модели антиген-индуцированной дегрануляции базофилов по Shelley в модификации (Серова Т.И., 1986), используя базофильные лейкоциты крови сенсибилизированных кроликов (Базанов Г.А, 1994, Демидова М.А., 1997) С этой целью определяли число дегранулированных базофилов (отличающихся от неповрежденных клеток измененной формой, нарушенным контуром, наличием псевдоподий и гранулокинезом) до и после их инкубации с антигеном Препараты лейкоцитарной взвеси крови кроликов окрашивали нейтральным красным (при этом базофилы приобретали буровато-красновато-коричневый цвет, что позволяло легко отдифференцировать их от других форменных элементов крови) Влияние исследуемых соединений на выраженность антиген-индуцированной дегрануляции базофилов крови оценивали в экспериментах in vitro (при инкубации базофилов крови сенсибилизированного кролика с исследуемым препаратом в концентрации 10"5 М до воздействия антигена) и in vivo (при внутривенном введении исследуемых препаратов сенсибилизированным кроликам за 20 минут до забора крови для постановки прямой реакции дегрануляции базофилов)

Моделирование аллергической реакции замедленного типа осуществляли на мышах-самцах линии Balb/c Подопытных животных сенсибилизировали однократно путем внутрикожного введения в основание хвоста 60 мкл эмульсии аллергена (овальбумина) в полном адьюванте Фрейнда, препятствующего формированию Т-супрессоров. Реакцию замедленного типа вызывали через 5 дней путем введения 0,04 мл аллергена (овальбумина) в подушечку задней лапы Эффект реакции оценивали через 6 часов, через 24 часа и через 48 часов, измеряя толщину лапки подопытного животного с помощью инженерного микрометра МК-0-25. По разнице в толщине лапки до и после введения аллергена определяли величину отека. Для оценки влияния тестируемых соединений и препаратов контроля на выраженность затяжной аллергической реакции осуществляли внутри-брюшинное ведение исследуемых соединений за 20 минут до постановки реакции. В каждую опытную группу входило по 10-12 животных.

Выделение клеток крови (лимфоциты, макрофаги) проводили на градиенте плотности фиколл-верографина. Из отмытых клеточных суспензий и цельной крови экстрагировали липиды, выделение общих липи-дов, фосфолипидов, в том числе фосфоинозитидов, осуществляли с помощью усовершенствованного метода проточной горизонтальной хромо-тографии (AB Каргаполов, Н.Н.Слюсарь, 1991-1992). Диацилглицеролы

(ДГ) выделяли методом тонкослойной хроматографии (Финдлей Дж.Б. и соавт., 1990). Содержание арахидоновой кислоты (АК) определяли с помощью газожидкостной хроматографии (Богдарин Ю.Аи соавт., 1982). Количество простагландинов (ПГ) определяли радиоиммунологическим методом (Некрасова А А.и соавт, 1977) с применением набора реагентов ("Clinical Assays", USA) для ПГЕ, (Institute of Isotops, Hungary) для ШТ2а, с помощью сцинтиляционного счетчика "Mark-3" ("Nuclear Chicago", USA) Концентрацию белка в отмытых клеточных суспензиях определяли биуретовым способом

Статистическую обработку цифрового материала проводили с применением стандартного пакета программ "Ms ЕхеР". Для ряда выборок вычисляли среднюю арифметическую и среднюю квадратическую ошибку. Все данные в диссертации представлены в виде М±т Для оценки достоверности различий выборок применяли параметрический t-критерий Стьюдента. Все цифровые материалы оформлены в виде таблиц и графиков с помощью прикладного пакета "Microsoft Graph" в программном продукте "Microsoft Office 2000".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе экспериментального исследования была проведена оценка влияния препаратов тормозных нейроаминокислот на выраженность реакции активной кожной анафилаксии у крыс (табл 1). Оценивали действие глицина, этилового эфира М-фенилацетил-1-пролилглицина, натрия оксибутирата и пикамилона при внутрибрюшинном введении в диапазоне доз от 1/10 LD50 до 1/1000 LD50. Эффекты исследуемых соединений сравнивали с действием глюкокортикостероида преднизолона фосфата натрия (0,5 мг/кг), внутрибрюшинное введение которого угнетало выраженность активной кожной анафилаксии в среднем на 70,8% (р<0,01) по сравнению с контролем. Было выявлено, что среди производных нейроаминокислот имеются соединения угнетающие выраженность данной реакции. Так, например, в сериях опытов с внутрибрюшинным введением 1^-фенилацетил-1-пролилглицина (1 мг/кг), глицина (1 мг/кг) и натрия оксибутирата (100 мг/кг) выраженность реакции активной кожной анафилаксии снижалась соответственно на 50,8% (р<0,05), 35,8 (р<0,05); 22,1 (р<0,05) по сравнению с контролем. При этом все исследованные соединения уступали по своей активности препарату сравнения преднизолону (0,5 мг/кг) Достоверных изменений выраженности активной кожной анафилаксии при введении пикамилона обнаружено не было.

10

Таблица 1

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ НЕЙРОАМИНОКИСЛОТ НА ВЫРАЖЕННОСТЬ АКТИВНОЙ КОЖНОЙ АНАФИЛАКСИИ У КРЫС

№ Серия опытов Число Доза Активная кожная

крыс мг/кг, Анафилаксия

в/б Площадь ок- Изменения

рашенного реакции,%

пятна кожи,

мм2

1 Контроль (изотониче- 10 - 75,4+7,6 -

ский раствор натрия

хлорида)

2 Преднизолон 10 0,5 22,0 ±6,1 -70,8

3 ТЧ-фенилацетил-1- 8 0,1 61,3+8,4 -18,7

пролилглицин 10 1 37,1 ±4,6* -50,8

12 10 55,4±7,5* -26,5

4 Глицин 8 0,1 59,6±8,7 -21,0

10 1 48,4±9,1* -35,8

10 10 56,3±2,9* -27,9

5 Пикамилон (натриевая 8 2 78,4±8,1 +3,9

соль К-никотиноил-у- 8 20 69,9±5,6 -7,2

аминомасляной кисло- 10 200 69,2+6,9 -8,2

ты)

6 Натрия оксибутират 10 10 70,1+7,9 -7,0

10 100 58,7+4,6* -22,1

10 200 46,4±5,1* -38,5

Примечание Звездочка указывает на достоверность различий с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) - (р<0,05)

Одновременно было выявлено, что производные нейроаминокислот изменяли течение анафилактического шока у кроликов (табл. 2) Так, натрия оксибутират уменьшал тяжесть и гибель кроликов как в немедленной, так и в поздней фазе анафилактического шока. Глицин и КГ-фенилацетил-1-пролилглицин оказывали незначительно влияние на тяжесть шока в немедленной фазе, но предупреждали гибель кроликов в поздней фазе шока Пикамилон не влиял на течение анафилактического шока у кроликов

Таблица 2

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ НЕЙРОАМИНОКИСЛОТ И ПРЕДНИЗОЛОНА НА ТЕЧЕНИЕ АНАФИЛАКТИЧЕСКОГО ШОКА (АШ) У КРОЛИКОВ

№ СЕРИЯ ОПЫТА ТЯЖЕСТЬ АШ ЧИСЛО КРОЛИКОВ, ПОГИБШИХ В РАЗЛИЧНЫЕ ФАЗЫ АНАФИЛАКТИЧЕСКОГО ШОКА, %

НЕМЕДЛЕННАЯ ФАЗА ПОЗДНЯЯ ФАЗА ВСЕГО

1 0,9% РАСТВОР №С1 п= 48* 3,0 50 22 72

2 ПРЕДНИЗОЛОН (0,5 мг/кг) п=10* 1,6 10 0 10

3 ГЛИЦИН (1 мг/кг) п=10 2,5 40 0 40

4 >1-ФЕНИЛАЦЕТИЛ-Ь-ПРОЛИЛГЛИЦИН (1 мг/кг) п=10 2,4 38 0 38

5 НАТРИЯ ОКСИБУ-ТИРАТ (100 мг/кг) п=10 1,8 0 10 10

6 ПИКАМИЛОН (200 мг/кг) п=8 3,0 50 25 75

* - по данным Демидовой М А

Исследования, проведенные на модели системной анафилаксии у крыс, позволили выявить среди препаратов нейроаминокислот вещества, уменьшающие выраженность анафилактического отека внутренних органов Известно, что шоковым органом при анафилаксии у мелких грызунов (крыс, мышей) является тонкий кишечник. В связи с этим выраженность системной анафилаксии у крыс оценивали по степени гидратации тканей тонкого кишечника Было выявлено, что во время системной анафилактической реакции содержание общей воды в тонком кишечнике подопытных крыс увеличилось в среднем на 8,2% (р<0,05) по сравнению с ее уровнем в тонком кишечнике интактных крыс. В остальных органах (в легких, печени и толстом кишечнике) увеличение степени гидратации было недостоверным

8-1

в-

со 7-

5 6 /

и 5-

0 1 р

i % 3- к"

со cl -о сп 2 1- x /

0- л

3 4

Серии опытов

Рис. Í. Влияние препаратов нейроамннокислот и преднизалона на выраженность анафилактического отека тонкого кишечника у крыс.

Примечание: *-р<0,05; #-p<0,¡.

1 - контроль; 2 - преднизалон (0,5 мг/кг);3 - натрия оксибутират (100 мг/кг); 4 - глицин (1 мг/кг); 5 — N-фенилацетил-l-пролилглицин (1 мг/кг);6 - пикамилон (200 мг/кг).

Внутрибрюшинное введение лреднизолона в дозе 0,5 мг/кг эффективно предупреждало развитие анафилактического отека внутренних органов у крыс, поэтому в дальнейших экспериментах действие преднизо-лона (0,5 мг/кг) рассматривалось как эталон для сравнения (рис.1). Было показано, натрия оксибутират 0 00 мг/кг) и N-фенилацетил-!-пролилглнцин (J мг/кг) достоверно (р0,05) уменьшали выраженность анафилактического отека тонкого кишечника у подопытных животных, причем эффекты натрия оксибутирата в этом отношении были сопоставимы с действием преднизолона (0,5 мг/кг), ТМ-фенилацетил-]-пролилглицин (1 мг/кг) и глицин (1 мг/кг) действовали слабее. Пикамилон (200 мг/кг) в этом отношении был не эффективен.

Действие препаратов нейроаминокислот при экспериментальной аллергии оценивали не только в экспериментах in vivo, но и in v/íro. В этом отношении особый интерес представляло изучение влияния соединений на процессы антиген-индуцированной дегрануляцин клеток-мишеней аллергического процесса (тучных клеток и базофилов). Исследования проводили с использованием базофильных лейкоцитов крови кроликов, сенсибилизированных свиной сывороткой. Базофильные лей-

13

коциты крови являются клетками-мишенями аллергического процесса I порядка, так как несут на своей поверхности высокоаффинные Гс рецепторы для ^Е. Их активация реакцией аллерген-антитело приводит к высвобождению различных биологически активных веществ, которые изменяют функцию других клеток (клеток-мишеней аллергии II порядка). От функциональных взаимоотношений, складывающихся между клетками эффекторного звена аллергического ответа зависит исход аллергического процесса (И.С.Гущин, 1998).

Таблица 3

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ НЕЙРОАМИНОКИСЛОТ (10"5 М) И КРОМОГЛИКАТА НАТРИЯ НА УРОВЕНЬ СПОНТАННОЙ И АНТИГЕН-ИНДУЦИРОВАННОЙ ДЕГРАНУЛЯЦИИ БАЗОФИЛОВ КРОВИ КРОЛИКОВ

IN VITRO

№ Серия Опытов Число наблюдений Дегрануляция базофилов, % Уровень АГ-индуцированной дегрануляции, % к спонтанной

Спонтанная Антиген-индуцированная

1 ИР NaCl 15 29,6±8,5 64,7+4,10 + 119,6

2 Кромогликат натрия (интал) 12 26,6±3,2 38,3+4,1* +43,9*

3 Глицин 12 25,8±4,5 51,2±7,1 +98,4

4 N-фенилацетил-1-пролилглицин 12 27,1±3,7 43,1±3,2* +59,0*

5 Натрия оксибутират 10 29,7±б,2 47,4±5,1* +59,6*

6 Пикамилон 10 27,6±4,5 59,3+7,2 +114,9

Примечание *-различия с контролем (ИР NaCl) достоверны (р<0,05)

Обнаружено, что М-фенилацетил-1-пролилглицин и натрия оксибу-тират уменьшали степень антиген-индуцированной дегрануляции базо-филов крови сенсибилизированных кроликов (табл 3, рис. 2) Отмечено, что в опытах in vivo (внутривенное введение веществ животным) производные нейроаминокислот более эффективно подавляли эту реакцию, чем в экспериментах in vitro (инкубация базофилов с веществами и антигеном). Эти факты свидетельствуют о том, что эти соединения оказывают не только прямое, но и опосредованное действие на мембраны базофиль-ных лейкоцитов. Вместе с тем следует отметить, что по своей способно-

ти подавлять антиген-индуцированную дегрануляцию базофилов натрия жсибутират и ^фенилацеяйл-1-лролилглицин (ноопепт) были в среднем 1 1,35 раза (р<0,05) слабее, чем кромогликат натрия.

0.9% р-р NaCI глицин

«жсибутират

Рис, 2. Влияние производных нейроаминокйслот и кромогликата натрия (интала) на антиген-индуцированную дегрануляцию базофилов крови сенсибилизированных кроликов in vivo и in vitro.

Примечание. * - различия с контролем (0,9% раствор NaCl) достоверны (р<0,05),

Эффекты препаратов ней роа м и н о к и с л от оценивали не только в отношении аллергических реакций немедленного типа (общей, местной и ¡п уПго), но и замедленного типа. В качестве модели аллергической реакции замедленного типа была использована кожная аллергическая реакция у мышей линии Ьа1Ь/с. С этой целью в подушечку задней лапки сенсибилизированных животных виутрйкожно вводили 40 мкл аллергена (овальбу-мина). О степени выраженности кожной реакции замедленного типа у мышей судили по величине отека лапки. Анализ данных проведенного исследования показал способность глицина и М-фенилацетил-1-пролилглицина уменьшать выраженность кожной аллергической реакции замедленного типа у мышей. В серии опытов с введением этих соединений кожная аллергическая реакция замедленного типа развивалась в более поздние сроки и была выражена в среднем в 1,3 раза (р<0,05) слабее, чем в контроле (табл. 4). Пикамилон и натрия оксибутират подобной активности не проявили.

Таблица 4

ВЛИЯНИЕ ГЛИЦИНА И Ы-ФЕНИЛАЦЕТИЛ-Ь-ПРОЛИЛ ГЛИЦИНА

НА РАЗВИТИЕ КОЖНОЙ АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ _ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА У МЫШЕЙ_

Серия опытов Период наблюдения Достоверность различий

До введения АГ Через 6 часов Через 24 часа Р1 Р2 Рз

Контроль ИР №С1 2,35±0,02 3,6±0,1 3,67±0,05 0,001 0,001 —

Глицин 2,28±0,06 2,70±0,10 2,94±0,09 0,05 0,05 0,01

Ы-фенилацетил-1-пролилглицин 2,22±0,10 2,46±0,05 2,72±0,11 0,3 0,05 0,01

Примечание Р1 - различия между значениями показателя до введения антигена и через 6 часов после введения,

Р2 - различия между значениями показателя до введения антигена и через 24 часа после введения,

Р} — различия между значениями показателя в опыте и контроле через 24 часа после введения антигена

Таким образом, результаты эксперимента, проведенного с использованием различных моделей аллергических реакций немедленного и замедленного типов, показали, что среди исследованных производных ней-роаминокислот имеются вещества, обладающие противоаллергической активностью. Наиболее перспективным соединением этого ряда является новый оригинальный препарат Ы-фенилацетил-1-пролилглицин Наибольший эффект этого соединения был выявлен в отношении кожных проявлений аллергической реакции как замедленного типа (в реакции отека лапы у мышей), так и немедленного типа (в реакции активной кожной анафилаксии), кроме того 1Ч-фенилацетил-1-пролилглицин, также как и глицин эффективно предупреждали развитие поздней фазы анафилактической реакции у кроликов.

На следующем этапе экспериментального исследования изучали влияние производных нейроаминокислот на содержание фосфоинозити-дов и их метаболитов (диацилглицеролов, арахидоновой кислоты и про-стагландинов) в крови и иммунокомпетентных клетках крови. Анализ результатов биохимических исследований показал, что при анафилаксии содержание фосфоинозитидов в крови подопытных крыс уменьшалось по

16 ч

равнению с их уровнем у сенсибилизированных животных в дошоковом ериоде и у интактных крыс (соответственно в 1,2 раза и 1,7 раза, <0,05) Одновременно обнаружено уменьшение количества этих липи-ов в макрофагах и лимфоцитах крови крыс соответственно в 1,2 и 1,4 аза (р<0,05) по сравнению с их уровнем в дошоковом периоде и в 1,3 и ,5 раза (р<0,05) по сравнению с их количеством у интактных животных. 4ежду тем известно, что при распаде фосфорилированных форм фос-юинозитидов образуются вторичные мессенджеры (инозитолмонофос-)аты, инозитолдифосфаты, инозитолтрифосфаты, диацилглицеролы). "ак, например, при гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-дифосфатов про-[сходит образование основных вторичных мессенджеров - диацилглице-юлов и инозитол-1,4,5-трифосфатов (Утешев Б.С., Коростелев С.А., 990), которые соответственно активируют протеинкиназу С и мобилизуют ионы кальция, способствуя высвобождению медиаторов аллергии i усилению аллергизации организма Было отмечено, что содержание щацилглицеролов в крови крыс при анафилаксии было соответственно в i, 1 и 1,2 раза (р<0,05) выше, чем их уровень у интактных и сенсибилизированных крыс в дошоковом периоде. В макрофагах и лимфоцитах крови при анафилаксии также отмечалось увеличение количества диацилгли-церолов (соответственно в 1,15 и 1,2 раза (р<0,05) по сравнению с дошо-ковым периодом). Изменение содержания диацилглицеролов при анафилаксии сопровождалось увеличением количества арахидоновой кислоты в цельной крови и лимфоцитах соответственно в 1,1 и 1,3 раза (р<0,05) по сравнению с ее уровнем до введения разрешающей инъекции антигена Вместе с тем отмечено, что концентрация арахидоновой кислоты в макрофагах крови при анафилаксии, напротив, снизилась (в среднем в 1,5 раза (р<0,05) по сравнению с дошоковым периодом) Вероятно, это связано с усилением образования эйкозаноидов, в частности простагланди-нов, в макрофагах крови подопытных животных при анафилактическом шоке Так, одновременно с уменьшением количества арахидоновой кислоты в макрофагах крови отмечалось увеличение содержания в этих клетках ШТ2сс (в среднем в 1,2 раза (р<0,05) по сравнению с дошоковым периодом), тогда как количество ПГЕ не изменилось.

Следует отметить, что наибольшее корригирующее влияние на содержание фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма в крови и имму-нокомпетентных клетках крови при анафилаксии оказывал N-фенилацетил-1-пролилглицин Так, в сериях опытов с введением этого соединения было отмечено увеличение содержание фосфоинозитидов в крови и макрофагах подопытных крыс в среднем в 1,4 раза (р<0,05) по

сравнению с контролем, что, вероятно, связано с уменьшением расходования этих липидов при анафилаксии. В сериях опытов с введением натрия оксибутирата и глицина уровень этих липидов в макрофагах крови увеличивался в среднем в 1,2 раза (р<0,05), тогда как пикамилон такого действия не оказывал (рис. 3).

*

0,9% Мэа пмрн мклии ктгтркисжсибуичяпг п%«ам*пон

[□ 0,9% рэствор МзО [3 глицин И ноолегтг И натрия оксиб/тиргсг □птаьмлон |

Рис. 3. Влияние производных нейроаминокислОТ на содержание фосфати-дилинозитов в макрофагах и лимфоцитах крови крыс при анафилаксии.

Примечание. * - различия с контролем (0,9% раствор ИаС1) достоверны (р<0,05).

тицин нослпт нэтрил скиЦуглря

|00.9% раоаор МаС10 глицин □ ноопегп и натрия окенбугираг 13 пикамилон]

Рис.4. Влияние производных нейроаминокислот на содержание диацилг-

лицеролов в макрофагах крови крыс при анафилаксии.

Примечание. * - различия с контролем (0,9% раствор МаС!) достоверны

(р<0,05). 18

О рвттцор глицин носпепт н»1 р«я (жсЛутирят ПММПКИ

[□ 0.9% раствор Г4аС1 о гпицин □ иоопепт □ натрия оксибутират апикамилон]

■'ис.5. Влияние производных нейроами нокислот на содержание простаг-

лзндиное* ПГР2а в макрофагах крови крыс при анафилаксии, примечание. * - различия с контролем (0,9% раствор ЫаС1) достоверны (р<0,05).

09-х. ресгьср N3^1 гли^т

мослетт нэтрда осиеутирят гмкэмипан

Рис. 6. Влияние производных нейроаминокислот на содержание арахидо-

новой кислоты в лимфоцитах крови крыс при анафилаксии. Примечание. * - различия с контролем (0,9% раствор ИаС1) достоверны (р<0,05).

Изменения уровня фосфоинозитидов в крови и иммунокомпетент-ных клетках крови под влиянием производных нейроаминокислот сопровождались изменением количества их метаболитов - диацилглицеролов, арахидоновой кислоты и простагландинов (рис. 5, 6, 7). Так, в сериях опытов с введение глицина, М-фенилацетил-1-пролилглицина (ноопепта) и натрия оксибутирата отмечено уменьшение содержания арахидоновой кислоты в лимфоцитах крови в среднем в 1,3 раза (р<0,05) и снижение количества П1Т2сс в макрофагах крови соответственно в 1,57, 1,27 и 1,39 раза (р<0,05). Кроме того при введении подопытным животным глицина и 1Ч-фенилацетил-1-пролилглицина было отмечено уменьшение уровня диацилглицеролов в макрофагах крови соответственно в 1,15 и 1,54 раза (Р<0,05).

Известно (А.Д Адо, 1978; В И Пыцкий, 1991), что при анафилаксии наблюдается выраженная гипоксия тканей Кроме того отмечено снижение устойчивости подопытных животных к анафилактической гипоксии (Демидова М.А , 1997, Шатохина Н.А , 2006). Так, например, было выявлено, что продолжительность жизни сенсибилизированных мышей в условиях острой гипоксии уменьшалась в среднем в 1,3 раза по сравнению с контролем (интактные животные). Известно, что натрия оксибутират проявляет выраженную антигипоксическую активность при использовании различных моделей гипоксии, что позволяет рассматривать его как эталон при тестировании потенциальных антигипоксантов (Сернов Л.Н., Гацура В.В , 2000) Имеются указания (Макарова Л.М , 2006) на наличие антиги-поксической активности у глицина, однако оценка антигипоксической активности нейроаминокислот и их производных при анафилаксии не проводилась. В экспериментах на мышах, сенсибилизированных овальбуми-ном, было обнаружено, что натрия оксибутират (100 мг/кг) и глицин (1 мг/кг) достоверно увеличивают продолжительность жизни подопытных животных в условиях анафилактической гипоксии Ы-фенилацетил-1-пролилглицин (ноопепт) не проявлял антигипоксической активности у интактных животных, однако применение этого соединения у сенсибилизированных мышей (в условиях индукции системной анафилаксии) повышало устойчивость последних к острой гипоксии (рис 7)

Таблица 5

ЛР\Щ ОПЫТОВ ПО ИЗУЧЕНИЮ ЛНТИГИПОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

.ь Исследуемый Группа наблюдения (число мышей в опыте)

1 Препарат Интактные Сенсибилизи- Системная

мыши рованные мыши анафилаксия

ИР N30 10 10 10

г ! ] атрия океибутират 10 9 10

Глицин 12 10 10

1, ' N - фе н ид ацетил -1 -пролилглицин 9 8 10

5. Пнкамвдон 9 г? 9

I 5

X

к

X

У

г л

Е

V

I

п

0

а

С %

X «

У X

1

в

1

Рис. 7. В лияние производных нейроаминокислот на продолжительность жизни животных (интактные и сенсибилизированные мыши при анафилаксии) в условиях острой гипоксии. Примечание. * - различия с контролем (0,9% раствор №аС1) достоверны

¿=71

натрия оксибугарат

выводы

1. Среди исследованных производных нейроаминокислот наибольшей антианафилактической активностью обладали натрия оксибутират (100 мг/кг) и Ы-фенилацетил-1-пролилглицин (1 мг/кг), которые увеличивали выживаемость подопытных кроликов при анафилактическом шоке и уменьшали выраженность реакции активной кожной анафилаксии у крыс соответственно в 1,5 и 1,2 раза.

2. Натрия оксибутират оказывал противошоковое действие как в немедленной, так и в поздней фазе анафилактического шока у кроликов Глицин и М-фенилацетил-1-пролилглицин предотвращали развитие только поздней фазы немедленной аллергической реакции.

3. Натрия оксибутират и 1Ч-фенилацетил-1-пролилглицин угнетали выраженность антиген-индуцированной дегрануляции базофильных лейкоцитов крови, уступая в этом отношении кромогликату натрия в среднем в 1,35 раза. При этом эффекты этих соединений in vivo были выражены сильнее, чем m vitro

4 Глицин (1 мг/кг) и ]Ч-фенилацетил-1-пролилглицин (1 мг/кг) уменьшали выраженность кожной реакции замедленного типа у мышей в среднем в 1,3 раза.

5 Натрия оксибутират (100 мг/кг), глицин (1 мг/кг) и N-фенилацетил-!-пролилглицин (1 мг/кг) повышали устойчивость подопытных животных к гипоксии в условиях анафилаксии соответственно в 2,1; 1,34 и 1,28 раза.

6. 1Ч-фенилацетил-1-пролилглицин (1 мг/кг) в 1,4 раза, а натрия оксибутират (100 мг/кг) и глицин (1 мг/кг) в 1,2 раза увеличивали содержание фосфоинозитидов в крови и макрофагах крови крыс при анафилаксии

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты работы позволяют рекомендовать производное ней-роаминокислоты глицина (этиловый эфир N-фенилацетил-!-пролилглицина, ноопепт) для расширенного доклинического испытания в качестве противоаллергического средства.

2 При проведении поиска антианафилактических средств целесообразно проводить изучение веществ с антигипоксической активностью

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Демидова М А , Шатохина Н А , Шнеур С Я , Ковтун А А Антигипокси-ческая активность антиоксидантов при анафилаксии // Фармация - 2006 -№5 - с 35-36

Шатохина Н А , Шнеур С Я , Ковтун А А Влияние метаболических корректоров на течение системной анафилаксии у мышей // Сборник научных статей «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» - Пятигорск, 2007 - вып 62 - с 575-576 Шнеур С.Я , Галимская Е В , Ковтун А А Влияние производных нейроа-минокислот на уровень антиген-индуцированной дегрануляции базофилов // Сборник научно-практических работ «Лечебно-диагностические, мор-фофункциональные и гуманитарные аспекты медицины» - Тверь, 2007 -с 57-58

Шнеур С Я , Демидова М А , Галимская Е В , Ковтун А А Влияние производных нейроаминокислот на содержание фосфоинозитидов в крови при экспериментальной анафилаксии // Сборник научных работ Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии -Санкт-Петербург, 2007 - с 114-115

i Демидова М А , Шатохина Н А , Шнеур С Я , Ковтун А А Антигипокси-ческая активность реамберина, мексидола и дихолина сукцината при экспериментальной анафилаксии // Вестник Санкт- Петербургской Медицинской Академии им Мечникова-2006 -№2-с 183-184

6 Шнеур С Я , Ковтун А А , Галимская Е В Влияние производных глицина на течение экспериментальной анафилаксии // Тезисы докладов XIV Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 2007 -с 899

7 Шнеур С Я , Шатохина Н А , Ковтун А А Влияние производных нейроаминокислот на течение анафилактического шока у кроликов // Сборник научно-практических работ «Лечебно-диагностические, морфофункцио-нальные и гуманитарные аспекты медицины - Тверь, 2007 - с 95-96

8 Шнеур С Я , Демидова М А , Ковтун А А , Галимская Е В Влияние но-опепта и мексидола на течение экспериментальных аллергических реакций//Фармация 2007 - №3 -с 33-34

9 Шнеур С Я. Способ лечения анафилактической гипоксии // Удост на рац предложение № 2729, выданное БРИЗОМ ТГМА 02 04.2007

10 Шнеур С Я Способ уменьшения выраженности анафилактического отека внутренних органов// Удост на рац предложение № 2727, выданное БРИЗОМ ТГМА 02 04 2007

11 Шнеур С Я. Способ лечения экспериментального анафилактического шока// Удост на рац предложение № 2728, выданное БРИЗОМ ТГМА 02 04 2007

Заказ 15045 Тираж ЮОэкз

Подписано в печать 17 03 2007 Объем 1 п л

Отпечатано ООО «Документ-сервис», Тверь, ул Радищева, 41/30

Актуальность проблемы. Совершенствование фармакотерапии аллергических заболеваний является одной из важнейших задач фармакологии (Мокро-носова М.А., 1997;. Хаитов Р.М, 2002; Гущин И.С., 1999, 2001; Адо А.Д., 1994; Гущин И.С., Ильина Н.И., Польнер С.А., 2002; Булина О.В., Горланов И.А., Калинина Н.М., 2004; Brisman et al., 1995; Heinrich et al., 1995; Stark et al., 1996). Урбанизация и химизация, появление новых аллергенов, широкое применение лекарственных средств, в том числе антибиотиков, изменение характера питания и другие причины приводят к тому, что во всем мире регистрируется рост заболеваемости аллергией (Пыцкий В.И. и соавт., 1999; Паттерсон Рой и соавт., 2000; Хаитов Р.М, 2002; Jlycc J1.B., 2002). В настоящее время в медицинской практике используют большое количество противоаллергических средств, однако они не всегда являются достаточно эффективными, поэтому изучение влияния лекарственных препаратов на течение аллергических заболеваний сохраняет свою актуальность (Ионов И.Д., 1991; Гущин И.С., 2002; Чучалин А.Г., 2000-2004; Медуницын Н.В., 2001; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003; Ковалева В.Л., 2006).

Известно, что в формировании аллергизации организма принимает участие центральная нервная система (Ковалев И.Е., Сергеев П.В., 1972; Козлов В.К., 1973; Абрамов В.В., 1988-2006; Йегер Л., 1988; Пыцкий В.И., 1991; Leslie et al., 1989). Имеются данные о том, что нарушения нормальных взаимоотношений между нейроэндокринной и иммунной системами способствуют возникновению аутоиммунных и аллергических заболеваний или определяют характер течения этих болезней (Абрамов В.В., 1996). Описано участие в аллергическом процессе ГАМК- и опиоидергических механизмов (Утешев Б.С., Ко-ростелев С.А., 1990; Gentilini et al., 1995; Djuric et al., 1995; Демидова M.A., 1997). Обращает на себя внимание и тот факт, что в процессе аллергизации организма наряду со специфическими иммунологическими изменениями развивается выраженная тканевая гипоксия (Адо А.Д., 1978, Пыцкий В.И., 1991) и происходят существенные метаболические сдвиги. В частности, наблюдается активация реакций свободнорадикального окисления на фоне понижения активности антиоксидантных систем (Кошелевский В.И., 1987, 1997; Митина Т.В., 1991; Ракита Д.Р., 1997; Демидова М.А., 1997-2006; Di Gianni, 1996 и др.). Регистрируются выраженные изменения мембранных липидов клеток-мишеней аллергического процесса (Йегер Л., 1988; Гущин И.С., 2003), в том числе фос-фоинозитидов и продуктов их метаболизма (Демидова М.А., Слюсарь Н.Н., 1997). Между тем известно, что фосфоинозитиды и их метаболиты принимают участие в реализации действия нейромедиаторов на молекулярном уровне (Долго-Сабуров В.Б., 1989; Утешев Б.С., 1992; Baraban, 1989; Calvet et al., 1995; Li, 1990; Manzoni, 1990; Sharif et al., 1996 и др.), а также в процессах активации клеток-мишеней аллергического процесса (базофилов, тучных клеток) и имму-нокомпетентных клеток (Лященко В.А.и соавт., 1988; Суслов А.П., 1990; Кар-гаполов А.В., Слюсарь Н.Н., 1992-2005; Beaven et al., 1988; Gruchalla et al., 1990). При гидролизе полифосфоинозитидов происходит образование вторичных мессенджеров диацилглицеролов и инозитолтрифосфатов. Кроме того эти липиды являются одними из поставщиков арахидоновой кислоты и эйкозанои-дов (Пыцкий В.И., 1991; Гущин И.С., 1993; Ковалева В.Л., Чучалин А.Г., 1997; Bach, 1988; Abraham et al., 1989; Chilton, 1990; Seeger et al., 1990; Gibs et al., 1996 и др.). На метаболизм мембранных фосфоинозитидов оказывают влияние различные нейромедиаторы, в том числе нейроаминокислоты и их производные (Li X.N., Song L., Jope R.S., 2000). Однако эффекты новых производных аминокислот в этом отношении изучены недостаточно. С учетом роли центральной нервной системы и метаболических нарушений в патогенезе аллергии целесообразным представляется изучение влияния нейроаминокислот и их производных на течение аллергических реакций. Известно, что многие производные нейроаминокислот наряду с центральным действием обладают рядом свойств, которые могут быть ценны для коррекции метаболических нарушений при аллергических реакциях. Так, например, ряд производных тормозных нейроаминокислот (глицина и у-аминомасляной кислоты) обладают выраженной антиок-сидантной, мембраностабилизирующей и антигипоксической активностью. 6

Существуют сведения, что глицин оказывает выраженное противогипоксиче-ское действие на моделях гистотоксической, гиперкапнической и гипобариче-ской гипоксии, причем введение фосфорилированного остатка в молекулу глицина приводит к повышению противогипоксической активности данной аминокислоты (Макарова JI.M., 2006). Результаты экспериментальных исследований показали, что новый оригинальный дипептидный препарат, содержащий глицин - ноопепт (этиловый эфир Ы-фенилацетил-1-пролилглицина) предотвращает вызванное стрессом накопление продуктов перекисного окисления липидов, снижая содержание диеновых конъюгатов и шиффовых оснований, повышает активность эндогенных антиоксидантных систем - супероксиддисмутазы, ката-лазы и церулоплазмина, обладает антитромботическим эффектом, проявляет противовоспалительный эффект на моделях острого неиммунного и хронического иммунного воспаления (Воронина Т.А., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Воронина Т.А., Гарибова T.JL, 2004, 2006). Таким образом, известные фармакологические свойства глицина и его производных дают основания для изучения их эффектов при экспериментальных аллергических реакциях.

Работа выполнена по плану научно-исследовательской работы Тверской государственной медицинской академии (ТГМА) в рамках научного направления "Фармакология аллергии". Тема исследования утверждена на заседании ученого совета ТГМА и на заседании проблемной комиссии "Фармакология нервной системы" РАМН.

Цель работы. Исследование влияния производных нейроаминокислот на течение экспериментальных аллергических реакций (in vivo и in vitro).

Задачи исследования. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

• Исследовать влияние глицина, Ы-фенилацетил-1-пролилглицина, пика-милона и натрия оксибутирата на течение системной (анафилактический шок у кроликов и системная анафилаксия у крыс) и местной (реакция активной кожной анафилаксии у крыс) анафилактических реакций в эксперименте на животных.

• Оценить влияние глицина, Ы-фенилацетил-1-пролилглицина и натрия оксибутирата на развитие анафилаксии in vitro (в тесте прямой реакции дегрануляции базофилов крови кроликов).

• Исследовать влияние глицина и Ы-фенилацетил-1-пролилглицина на течение кожной аллергической реакции замедленного типа у мышей.

• Исследовать изменения содержания фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма в крови, лимфоцитах и макрофагах крови аллергизиро-ванных животных под влиянием тормозных нейроаминокислот и их производных;

• Оценить антигипоксическую активность глицина, Ы-фенилацетил-1-пролилглицина и натрия оксибутирата при экспериментальной анафилаксии;

• Провести сравнительный анализ эффектов действия глицина, N-фенилацетил-1-пролилглицина и натрия оксибутирата при экспериментальной анафилаксии с действием глюкокортикостероидов (преднизо-лона) и кромолин-натрия.

Научная новизна работы. Впервые на различных экспериментальных моделях анафилаксии (системной, местной и in vitro) обнаружено наличие умеренной противоаллергической активности у глицина и его производного нового оригинального препарата этилового эфира Ы-фенилацетил-1-пролилглицина (ноопепта). Впервые выявлена способность глицина и его производного (но-опепта) повышать устойчивость подопытных животных к анафилактической гипоксии. Впервые показано, что глицин и Ы-фенилацетил-1-пролилглицин оказывают корригирующее влияние на метаболизм фосфоинозитидов в крови, лимфоцитах и макрофагах крови при экспериментальной анафилаксии.

Научно-практическая значимость работы. Результаты работы имеют как теоретическое, так и практическое значение. Фармакологически доказана возможность применения производных тормозных нейроаминокислот в комплексной, патогенетически обоснованной терапии аллергических заболеваний.

Выявлены изменения содержания фосфолипидов, в том числе фосфоинозити8 дов и продуктов их метаболизма, в крови, лимфоцитах и макрофагах при анафилаксии. Показана возможность фармакологической коррекции нарушений гомеостаза фосфоинозитидов при аллергических реакциях немедленного типа с помощью нейроаминокислот и их производных. Показана возможность использования препаратов с антигипоксической активностью при анафилактическом шоке для повышения устойчивости организма к анафилактической гипоксии. Результаты исследования позволяют рекомендовать Ы-фенилацетил-1-пролилглицин для расширенных доклинических испытаний в качестве противоаллергического средства.

По материалам диссертации было сделано 3 рационализаторских предложения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наличие противоаллергической активности у глицина и N-фенилацетил-1-пролилглицина.

2. Способность глицина и Ы-фенилацетил-1-пролилглицина восстанавливать содержание фосфоинозитидов и их метаболитов в крови и иммунокомпе-тентных клетках крови при экспериментальной анафилаксии.

3. Повышение устойчивости подопытных животных к острой гипоксии при анафилаксии под влиянием натрия оксибутирата, глицина и N-фенилацетил-1-пролилглицина.

Внедрение. Результаты исследований используются на кафедре фармации Тверской медицинской академии в учебном процессе при проведении занятий и лекций по следующим темам: "Противоаллергические средства", "Имму-нотропные средства", а также в научных исследованиях, проводимых в НИЦ Тверской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на XIV Всероссийском конгрессе "Человек и лекарство", на областных научно-практических конференциях (Тверь, 2006, 2007), на расширенном заседании кафедры фармации.

1. Результаты работы позволяют рекомендовать производное нейроами-нокислоты глицина (этиловый эфир Н-фенилацетил-1-пролилглицина, ноопепт) для расширенного доклинического испытания в качестве противоаллергического средства.

2. При проведении поиска антианафилактических средств целесообразно проводить изучение веществ с антигипоксической активностью.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ