Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Влияние газовых смесей с различным содержанием кислорода на культивируемые эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки человека

ДИССЕРТАЦИЯ
Влияние газовых смесей с различным содержанием кислорода на культивируемые эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки человека - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Влияние газовых смесей с различным содержанием кислорода на культивируемые эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки человека - тема автореферата по медицине
Гринаковская, Ольга Сергеевна Москва 2007 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.00.32
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Влияние газовых смесей с различным содержанием кислорода на культивируемые эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки человека

На травах рукописи

ГРИНАКОВСКАЯ ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

ВЛИЯНИЕ ГАЗОВЫХ СМЕСЕЙ С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ КИСЛОРОДА НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ И МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА

14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина 03.00.25 - цитология, гистология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ии^ие19 ю

Москва, 2007

003061910

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биолошческих проблем Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Северин Александр Евгеньевич доктор медицинских наук Солдатов Павел Эдуардович

Ведущее учреждение: Российская Военно-медицинская академия им. СМ. Кирова (г. Санкт-Петербург)

Зшцита диссертации состоится « Ь » 2007 г. в У®**

часов на заседании диссертационного совета (К 002.111.01) в Государственном научном центре РФ - Институте медико-биолошческих проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМЕЛ РАН) по адресу: 123007, г Москва, Хорошевское шоссе, 76-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Автореферат разослан «

Я

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^¡ТР^. .л И П. Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Использование новых искусственных газовых сред в обитаемых гермообъектах (космические корабли и орбитальные стащил, подводные лодки и подземные объекты, барокамеры различного назначения) требует тщательной всесторонней проверки их биологической активности с использованием различных тест-систем Показано что важным является не только изучение эффектов измененного содержания кислорода, но и реакция живых систем на такую важную составляющую как индифферентный газ [Вдовин и др, 1998, Ветош и др, 1999, Гальчук и др , 2001, Павлов и др, 1999, 2004, Шулагин и др, 2001, Соок, 1950, А1-КаЬиЬ1 <Л а1, 1997, Кшс^аП ег а1, 1995]

Гипоксические состояния могут возникать у здоровых людей в связи со специфическими условиями профессиональной деятельности и возможными чрезвычайными происшествиями в результате неисправности систем жизнеобеспечения В таких случаях снижение содержания кислорода в газовой среде протекает с различной скоростью и может вызывать тяжелые органные нарушения, если не удается сразу устранить причину появления экзогенной гипоксии Основная группа риска в данном случае - это водолазы, подводники, летчики, космонавты, шахтеры, пожарники и дайверы [Малкин и др, 1977, Гуляр и др, 1991, Полещук и др, 1991, Кт(1\уа11 е1 а1, 1995]

Для компенсации недостатка Ог, возникающего вследствие эндогенной и экзогенной гипоксии в настоящее время широко применяются гипероксические газовые смеси Они незаменимы при оказании неотложной медицинской помощи для купирования таких состояний как острая гипоксия, отравление угарным газом, декомпрессионные расстройства и другие [Жиронкин и др, 1968, 1972, Леонов и др , 1993, Сапов и др , 1982, Кш<1\уа11 й а1,1995]

Эффекты, возникающие при гипоксии и гипероксии, непосредственно связаны с изменением содержания кислорода в среде Высокая окислительная способность кислорода, имеет как положительные, так и отрицательные стороны Наряду с реакциями окислительного фосфорилирования, в которое вовлекается около 90% потребляемого кислорода, в живых организмах постоянно протекают процессы с образованием активных форм кислорода (АФК) [Скулачев, 1996] Одним из самых важных отрицательных действий кислорода на клетку является избыточная генерация АФК и их производных

В последние годы проводятся исследования, направленные на изучение воздействия газовых смесей с различным содержанием кислорода и широким спектром индифферентных газов на организм человека [Павлов и др, 1999, 2006, Шулагин и др, 2001] Большинство этих работ посвящено оценке эффектов газовых смесей на уровне

целого организма Однако для понимания клеточных и молекулярных механизмов возникающих изменений необходимо проведение исследований на уровне отдельных клеток Использование клеточных моделей позволяет не только оценить влияние газовых смесей с повышенным или пониженным содержанием кислорода на функционирование клеток, но и изучить молекулярные механизмы ответа клеток на изучаемый стимул [Буравкова и др, 1995, Ткачук и др, 1997; Nishida et al, 2000, Mold et al, 2001, Sengupta et al, 2001, Lee et al, 2005]

К сожалению, данные, получаемые при изучении влияния смесей с различным содержанием кислорода на клеточном уровне не только малочисленны, но и часто противоречивы Наблюдаемые изменения могут быть специфическими для изучаемого типа клеток, именно поэтому, очень важен выбор экспериментальной модели Для изучения эффектов измененных газовых сред m vitro наиболее интересными являются эндотелиальные клетки (ЭК), которые в силу своего положения в организме находятся в условиях различного содержания кислорода, и, как следствие, обладают механизмами коррекции своих функций и адаптации к изменяющимся условиям среды Изучение эффектов газовых сред на ЭК позволяет получить представление о влиянии измененной газовой среды на высокодифференцированные клеточные популяции

Для более полного понимания эффектов, оказываемых смесями с различным содержанием кислорода на организм человека, необходимо изучать их воздействие и на более пластичные и менее дифференцированные популяции клеток, такие как мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (МСЬС), интерес к которым значительно возрос в связи с их возможным применением в регенеративной медицине Одним из наиболее доступных источников МСК является жировая ткань, которая, также как и костный мозг, является производным мезенхимы и содержит поддерживающую его строму, которая может быть легко изолирована [Zuk et al, 2001, 2002, Katz et al, 2002, Ryang et a!, 2004, Leong et al, 2005, Dicker, 2005] Сравнительное изучение клеточных популяций (ЭК и МСК) с различным потенциалом дифференцировки в одних и тех же экспериментальных условиях (параметры культивирования, состав газовой среды, кратность и продолжительность воздействия) позволит оценить насколько степень дифференцировки клетки может определять клеточную реакцию на изменение содержания кислорода в окружающей среде

Разработка соответствующего экспериментального протокола является необходимым условием для получения результатов, наиболее адекватно отражающих эффекты воздействия измененных газовых сред на культивируемые клетки Условия использования измененных газовых сред, применяемых в различных исследованиях очень вариабельны

Чаще всего изучаются однократные кратковременные или длительные воздействия Однако для того, чтобы более достоверно оценить влияние изменения содержания кислорода на клетки, представляется важным сравнить влияние одно- и многократных экспозиций и эффекты последействия Создание такого протокола является чрезвычайно актуальным в связи с необходимостью тестирования вновь создаваемых газовых смесей для замкнутых гермообъектов и/или компенсации различных патологических состояний, возникающих у людей при изменении содержания кислорода

Цель работы, оценка эффектов измененных газовых сред на модели культивируемых клеток с разным потенциалом дифференцировки в качестве тест-системы Задачи исследования'

1 Разработать модель для исследования in vitro действия газовых сред с измененным содержанием кислорода на культивируемые клетки человека

2 Исследовать влияние кратковременных и длительных экспозиций в гипоксических и гипероксических газовых средах на пролиферативную активность, жизнеспособность и экспрессию молекул адгезии эндотелиальных клеток человека in vitro

3 Изучить влияние газовых сред с измененным содержанием кислорода на миграцию и синтез биологически активных веществ культивируемыми эндотелиальными клетками человека

4 Провести сравнительное исследование газовых сред с измененным содержанием кислорода на низкодифференцированные мезенхимальные клетки человека при кратковременных и длительных экспозициях

5 Сравнить с использованием культивируемых клеток эффекты гипероксических газовых сред, получаемых из медицинского кислорода и пшероксической кислородно-азотно-аргоновой среды, получаемой по методу короткоцикловой безнагревной адсорбции

Научная новизна работы Впервые на модели культивируемых ЭК человека показано, что при длительных многократных экспозициях в гипероксических газовых средах (от 75% до 95% Ог) происходит уменьшение экспрессии CD54 (ICAM-1), что свидетельствует о снижении степени активации эндотелиальных клеток

Установлено, что кислородный стресс (гипоксия или гипероксия) вызывает в ЭК человека увеличение экскреции IL-6 и VEGF во внеклеточную среду, при этом выявлена кумулятивная зависимость от времени и кратности экспозиций в измененной газовой среде

Впервые на культивируемых клетках проведено тестирование новых гипероксических смесей, получаемых по методу короцикловой безнагревной адсорбции, и

при этом выявлен их меньший повреждающий эффект по сравнению с гипероксическими смесями на основе кислорода и азота

Научно-практическая значимость работы

Разработана и апробирована тест-система, позволяющая изучать эффекты, оказываемые газовыми смесями на культивируемые клетки

Показано, что в периоде последействия (при возвращении клеток в стандартные условия культивирования) выявляются повреждающие эффекты измененного содержания кислорода в среде, не регистрируемые во время и сразу после воздействия Это указывает на необходимость учета латентных нарушений при использовании культур клеток в качестве тест-системы

Установлено, что при использовании мезенхимальных стромальных клеток-предшественников в качестве экспериментальной модели ш. vitro следует принимать во внимание их устойчивость к изменению напряжения Ог в среде

In vitro показано, что гипероксическая газовая смесь, получаемая по методу короткоцикловой безнагревой адсорбции, обладает меньшим повреждающим действием на культивируемые клетки, чем гипероксические смеси на основе медицинского кислорода Основные положения, выносимые на защиту:

1 Разработанная и апробированная тест-система позволила выявить гипероксические и гипоксические эффекты m vitro и провести оценку повреждающего действия газовых смесей с различным содержанием индифферентных газов, на модели культивируемых дифференцированных (ЭК человека) и малодифференцированных (МСК человека) клеток

2 Снижение содержания кислорода в среде до 5% при многократных кратковременных и длительных экспозициях не влияет на пролиферацию, миграцию и жизнеспособность, но модифицирует экспрессию клеточных маркеров и синтез IL-6 и VEGF эндотелиальными клетками человека

3 В условиях гипероксии (75% - 100% 02) ингибируется пролиферативная активность ЭК человека, но не МСК, при этом на поверхности МСК снижается экспрессия молекул клеточной адгезии (CD9, CD54)

Апробация работы и публикации Основные результаты и положения работы были доложены и обсуждены на Ш, V конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005 г, 2007 г ), VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2005 г), 2nd International Conference "Strategies m Tissue Engineering" (Wurzburg, Germany, 2006), International Society for adaptive medicine (ISAM) VIII World

Congress, (Moscow, 2006), Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006 г )

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» 21 06 2007 Работа выполнена при поддержке рангов МНТЦ-196, НТТ1-6364 2002 4 и контрактов в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники на 2002 -2006 г г » Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 154 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, главы собственных исследований с обсуждением полученных результатов и выводов Список литературы содержит 193 источника, из них 42 - на русском и 151 - на иностранных языках Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 38 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Химические реактивы и культуральные среды и пластик диспаза (нейтральная протеаза из В polymixa) (Gibco), гепарина натриевая соль (ICN), коллагеназа IA (Clostndiopepüdase А из Clostridium hystolyticum) (Sigma), 0,2% раствор желатина (Sigma), L-глугамин 200 мМ, пенициллин-стрептомицин (10000 ЕД/мл - пенициллин, 10000 мг/мл - стрептомицин), пируват натрия 100 мМ, сбалансированный солевой раствор Эрла, среда 199 с солями Эрла и 25 мМ HEPES, эмбриональная телячья сыворотка (FBS), 0,02 % трипсин - 0,05% ЭДТА (все Gibco), среда DMEM (low glucose, Gibco, ICN) Чашки Петри диаметром 60, 100 мм, центрифужные пробирки 50 и 15 мл (Coming, Costar, Nunc), 100 nm фильтры (Mihpore)

Культуры клеток В работе использовали культуры ЭК человека и лМСК человека Для получения первичных культур ЭК пупочной вены человека использовали метод Gimbrone et al, в модификации [Антонов и др, 1981] вместо коллагеназы использовали 0,15% раствор диспазы Клетки, полученные после отмывки раствором Эрла, ресуспендировали в среде роста и высевали на покрытые 0,2% раствором желатина чашки Петри Культуру помещали в С02-инкубатор в стандартные условия 37°С, 5% С02, 95% воздуха, 100% влажности По достижении культурой конфлуэнтного монослоя проводили пассирование клеток Рост и состояние культур контролировали с помощью фазово-контрастного микроскопа Axiovert 25 (Carl Zeiss)

Культуру лМСК получали по методу Zuk et al [Zuk et al, 2001, 2002] Подкожно-жировую клетчатку, полученную в ходе липоаспирации, помещали в пробирку и инкубировали на водяной бане в растворе коллагеназы I в течение 35 минут при перемешивании Фермент инакгивировали добавлением среды роста с сывороткой, после чего суспензию фильтровали через 100 нм фильтр и дважды отмывали центрифугированием Полученный осадок ресуспендировали в 10 мл DMEM с 20% FBS и помещали в чашку Петри Среду меняли каждые 3 дня и по достижении 90% монослоя

пассировали с плотностью 3*103 кя/емг. Субкультивирование клеток проводили до 4 пассажа, после чего анализировали экспрессию маркеров, характерных для популяции мезенхимальных клсток-предшественникое, выделенных из липоаспирата человека.

Изучение пролиферации кле.ок проводили при многокраггних кратковременных (3 часа) и длительных (18 часов) воздействиях на культивируемые ЭК и лМСК человека кислородно-аргоновых и шелородно-азотно-аргоновых смесей с различным содержанием кислорода.

Нммунофенотипирояание. Для идентификации клеток-предшественников, использовали ионоклоиальные антитела фирмы Beckman Coulter: CD9, CD31, CD34, CD49, CD54, CD62L, CD62P, CD71, CD90, HLA-ABC, CD117(c-kif), виментин, меченые ИТС. Клетки анализировали на проточном цитофлуоримегре BeckmanCouiier Epicx XL. Для этого клетки трнпсииизярояалк 0,25% раствором трипснн-ЭДТА, подсчитывали, отмывали и аликвоты, в концентрации 3*105 кл/100 мкл, инкубировали с антителами в течение 15 минут в темноте. нри+4°С.

Оценка жизнеспособности культуры. Жизнеспособность культуры оценивали с помощью метода проточной цитометрии с использованием набора ArmexinV-Propidium Iodide (PI) (Immunotech, Франция) по стандартному протоколу. Метод основан на одно времен нем использовании Н, проникающего в поврежденные клетки и взаимодействующего с ДНК, и Annexin V, аффинного к фосфатидилсерину, который в процессе апоптоза локализуется на клеточной поверхности и формирует один из специфичных сигналов для распознавания апоптогических меток. Использование пары Annexin-Pl позволяет выявить живые, некротические и апоптотические клетки.

Cxe.ua эксперимента. Экспозиции в среде с измененным газовым составом осуществляли однократно иди повторно в течение 3 ч и 18 ч в герметично замкнутой камере (StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canada) (рис. 1). Причем период нормоксии при длительных воздействиях составлял не более 6 часов. В каждой чашке Петри подсчитывали по 3 стационарных поля клеток с помощью программы SigmaSean Pro. За 100% принимали среднее значение при подсчете 3 полей через сутки после пассирования клеток. Оцифровку изображений осуществляли с использованием инвертируемого микроскопа Алю vert 2 5 (Zeiss) и цифровой видеокамеры.

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием непараметрическою критерия Манна-Уитни

Рис. К Модифицированная герметично замкнутая камера для экспозиций клеточных культур в условиях измененной газовой среды.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование влияния гипоксических и гипоксических газовых смесей на культивируемые эндотелиальные клетки человека.

Пролиферативная активность ЭК человека в условиях гипоксических газовых

сред.

Изучение пролиферации ЭК проводили при кратковременных (3 часа) и длительных (18 часов) одно- и/или многократных воздействиях гипоксических смесей с 5% содержанием кислорода с использованием различных газов-разбавителей (аргон или азот) За 100% принимали среднее значение клеток в поле зрения при подсчете трех полей зрения через сутки после пассирования клеток Относительные изменения (в %) динамики пролиферативной активности клеточных культур представлены в таблицах (табл 1)

Таблица 1

Влияние гипоксических газовых сред на пролиферацию ЭК человека при кратковременных и длительных воздействиях различной кратности

Экспозиция Количество экспозиций Пролиферативная активность, в % по отношению к фоновым значениям

90% N2+ 5%02 + 5% со2 95% воздух + 5%С02 90%Аг + 5%02 + 5%С02 95% воздух + 5%С02

Краткосрочные (3 часа) 1 100+5,7 100+6,7 100±6,9 100+8,7

2 120 + 6,3 138 ±9,6 117+11,7 139 ±10,9

3 204 ±9,8 200+12,0 200 ±9,9 220 ±11,8

Длительные (18 часов) 1 100 ±6,5 100 + 9,9 100 ±5,0 100 + 3,9

2 118 + 3,9 132 ±7,8 125 + 12,1 158 ±7,9

3 180 ±10,1 196 ±9,3 205 + 7,6 230 ±9,8

При замещении воздуха гипоксической газовой смесью с 90% содержанием N2 пролиферация клеток несколько замедлялась после двукратной кратковременной экспозиции по сравнению с клетками, находившимися в условиях нормоксии После трехкратной кратковременной экспозиции пролиферация ЭК в нормоксической и гипоксической (5% Ог) средах практически не отличалась Сходные эффекты наблюдались при использовании гипоксической кислородно-аргоновой смеси

При одно- и двукратных длительных экспозициях в условиях измененного содержания кислорода наблюдалась сходная тенденция - незначительное замедление пролиферации по сравнению с контрольной культурой клеток при однократной и двукратной экспозиции в гипоксических газовых средах, которое практически нивелировалось к третьей длительной экспозиции

Таким образом, было показано что при использовании гипоксических газовых смесей (5% Ог) вне зависимости от кратности, длительности экспозиций и от использованного индифферентного газа (Аг или N2) в изучаемых средах не наблюдалось достоверных изменений в скорости пролиферации ЭК человека

Жизнеспособность ЭК человека в условиях гипоксических газовых сред.

Ранее полученные результаты исследований влияния гипоксии на жизнеспособность ЭК человека при пониженном содержании 02 неоднозначны Так, в работе С^а\уа [1990] было показано, что кратковременное воздействие вызывает обратимое изменение барьерных и противокоагулянтных функций ЭК, и эти изменения не вызывают увеличения гибели клеток В то же время в работах [Римку, 1995, Ваиёгу, 1998, МюЫек, 1998] приведены данные о том, что длительное гипоксическое воздействие приводит к увеличению проницаемости сосудистого эндотелия и гибели клеток

Для оценки повреждающего эффекта пониженного содержания кислорода в среде на ЭК человека мы оценивали количество апоптотических и некротических клеток Показано, что кратковременные многократные экспозиции в аргоносодержащей гипоксической газовой среде не приводят к увеличению количества апоптотических и некротических клеток по сравнению с контролем В периоде последействия (через 24 и 48 часов после однократной трехчасовой экспозиции) было отмечено незначительное повышение доли некротических клеток и снижение числа апоптотических клеток, сходная тенденция наблюдалась и в период последействия после двукратных кратковременных экспозиций При использовании гипоксической среды с 90% содержанием N2 доля апоптотических клеток в культуре составляла 2% (при однократном трехчасовом воздействии) и затем незначительно увеличивалась при последующих воздействиях Доля некротических клеток, экспонировавшихся в Иг-содержащей газовой смеси была выше, чем в Аг-содержащей среде (до Зх раз) В периоде последействия (24 и 48 часов после однократного воздействия) доля некротических и апоптотических клеток значительно не изменялась

При длительных инкубациях клеточных культур в исследуемых газовых смесях было отмечено двукратное увеличение доли некротических клеток в Аг-содержащей газовой среде без увеличения доли апоптотически поврежденных клеток Доля некротически-поврежденных клеток после экспозиции в Ыг-содержащей газовой среде составила 11,8% при однократной экспозиции, и 5% при двух- и трехкратной экспозициях Доля апоптотически-измененных клеток при этом составляла 3% При стандартных условиях культивирования доля некротических и апоптотических клеток составляла 4% и

2%, соответственно Выявленные изменения не были статистически значимыми, в то же время, газовая смесь, содержащая Аг, оказывает меньший повреждающий эффект на ЭК человека, что, по-видимому, связано с некоторым протективным действием аргона в условиях гипоксии

Ранее в литературе уже появлялись данные о протективных эффектах аргона [Pavlov et al, 1997, Содцатов и др, 1998, 2000, 2002] Так в экспериментах с грамм-положительными и грамм-отрицательными бактериями было показано стимулирующее действие аргоносодержащих гипоксических сред на передачу Р-плазмид В экспериментах на крысах было показано, что добавление гипоксическую в газовую среду аргона приводит к достоверно большему выживанию экспериментальных животных Проведенные эксперименты на эмбрионах японского перепела показали, что присутствие аргона в качестве газа-разбавителя достоверно повышает выживаемость эмбрионов и оказывает антитератогенный эффект Полученные нами результаты и приведенные выше литературные данные позволяют предположить, что аргон обладает физиологической активностью и может влиять на метаболизм клеток, повышая резистентность организма к гипоксии

Содержание цитокинов в среде культивирования ЭК человека.

Важным свойством, характеризующим функциональное состояние клеточной популяции, является синтез цитокинов Было исследовано содержание цитокинов IL-1, IL-6, а также фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) Содержание цитокинов определяли в культуральной среде сразу после воздействия Было показано, что при кратковременных (3 часа) и длительных (18 часов) повторяющихся гипоксических воздействиях синтез интерлейкина-1 остается неизменным и концентрация его в культуральной среде составляет 5-7 pg/ml В то же время синтез IL-6 эндотелиальными клетками человека во время инкубации в гипоксических средах и в период реоксигенации достоверно увеличивался по сравнению с первоначальным уровнем (рис 2) Известно, что увеличение синтеза клетками IL-б свидетельствует об активирующем (повреждающем) влиянии гипоксических газовых сред на ЭК человека [Gleadle et al, 1998]

VEGF впервые был описан как продукт синтеза опухоли, модифицирующий сосудистую проницаемость, позднее была описана его способность увеличивать пролиферацию ЭК при культивировании [Ferrara et al, 1999] Увеличение продукции VEGF эндотелием связывают, главным образом, с индукцией экспрессии HIF-la в ядре и запуском гипоксия-чувствительных генов, к которым относится и VEGF [Forsythe et al, 2000] Наши данные показали, что кратковременные экспозиции в исследуемых газовых

средах не влияют на синтез УЕвР, в то же время длительные экспозиции приводят к увеличению синтеза исследуемого фактора В периоде последействия как после кратковременных, так и длительных экспозиций в гипоксических Аг или ^-содержащих средах наблюдалось увеличение синтеза УБОР

Полученные результаты свидетельствуют о стимулирующем гипоксии на синтез синтез биологически активных веществ, таких как К.-6 и \TiGF, которое выявляется при длительном воздействии или в периоде последействия

Экспрессия молекул адгезии культивируемыми ЭК человека в условиях гипоксической газовой среды.

Известно, что молекулы адгезии играют важную роль при адаптации клеток к изменяющимся условиям внеклеточной среды В наших экспериментах показано, что в гипоксических газовых средах различного состава, после однократного воздействия, доля клеток несущих 1САМ-1 (СБ54), резко увеличивается (до 3-х раз от первоначального значения) и снижается в периоде реоксигенации, не достигая первоначального уровня (рис 4) После двукратной кратковременной экспозиции этот показатель резко возрастает - до 2-х раз при инкубации ЭК человека в гипоксической среде, содержащей N2, и в 3 раза при инкубации ЭК в среде, содержащей Аг В периоде последействия через 24 и 48 часов после нахождения в гипоксической среде, в состав которой входит азот, доля клеток, несущий исследуемый маркер уменьшалась в 1,6 и 2,7 раза, соответственно При реоксигенации культуры, подвергнутой воздействию гипоксической газовой среды с 90% содержанием аргона, было отмечено увеличение доли клеток, экспрессирующих на своей поверхности СВ54 в 2 раза после 24 часов и 1,4 раза после 48 часов После трех1фатной кратковременной экспозиции в среде содержащей азот количество клеток, экспрессирующих СВ54, оставалось неизменным по сравнению с первоначальным уровнем, а в среде, содержащей аргон, оно увеличилось в 2,2 раза (рис 4)

При изучении влияния длительных одно- и многократных экспозиций в исследуемых гипоксических газовых смесях было показано, что после однократной 18-часовой экспозиции количество клеток, экспрессирующих на поверхности С054, уменьшается в 1,5-2 раза, а после третьей экспозиции доля клеток, экспрессирующих изучаемый маркер, достигает первоначального уровня (газовая среда, содержащая 90% N2 + 5% СОг + 5% Ог) или остается пониженным (газовая среда, содержащая 90% Аг + 5% С02 + 5% 02)

е.*

* - достоверно Дл н p-cD.il Ь по критарию М^чНа-УИТЬ и

Ряс. 2. 1 ипоксня увеличивает синтез 1Ь-6 при кратковременных (а) и длительных (б) воздействиях, а также в период реадаптации к кормоксическим условиям после краткосрочных (в) и длительных (г) воздействий (где Н - 21% Аг - смесь, содержащая 90%Аг + 5% СО; + 5%02: - смесь, содержащая 90%М3 + 5%СОг + 5%02).

в! Л

' - ДСхгТомрНЙ ЯЛ" Р'-С.СЙ ПП кри-шр^н, " Л

Рис. 3. Гипоксия увеличивает синтез УЕОР при кратковременных (а) и длительных (б) воздействиях, а также в период реадаптации к нормокснческнм условиям гтосле краткосрочных (в) и длительных (г) воздействий (где Н - 21% Сь, Аг - смесь, содержащая 90%Аг + 5% СЮ2 + 5%0г, N2 - смссь, содержащая 90%Ы3 + 5%СО; + 5%Оз).

Рис. 4. Влияние гипоксии (5% Ог) на изменение экспрессии СБ54 (1САМ-1) при кратковременных (а) и длительных (б) воздействиях, а также в период реоксигепации к нормоксии после краткосрочных (в) и длительных (г) воздействий,

-24 ч -деч

-24 ч - 4И 4 " 144

кратность и лв н £

Рис. 5. Влияние гипераксических газовых смесей различного состава на пролиферацию ЭК человека при краткосрочных (3 часа) экспозициях ь а - 100% От, б - 89% О; + 4,5% Лг + 6,5 % N2, в - 95% 02 + 5% Аг. г - 75% О; - 25% Аг

2 3

копии ест во воздействий

количество воздействий

количество воздействий

■ Смесп

Я Иэру-ХСЛЯ

1 2 _ 3 Г

количество поздеиствии i 2 3

* ■ достоверна для р<0,05 по критерию Ма*жа-У*т*« количество воздействий

Рис. в. Влияние гипероксических газовых смесей различного состава на пролиферацию ЭК человека при длительных {18 часов) экспозициях в а - 100% Q2l б - 89% Оз + 4,5% Аг + 6,5 % N2s в - 95% 02 + 5% Лг? г - 75% 02 + 25% Аг.

■ Смесь

М Hopucusw

б

Рис. 7. Влияние гипероксических газовых смесей на пролиферацию лМСК человека при кратковременных (а) и длительных (б) экспозициях в условиях гипероксических газовых сред.

11% О j, 1ППНО;

К". О] - 4V.A.

KjlUTiKJCTb мпэеЯсткиА

После помещения культур ЭК в нормоксические условия (95% воздуха + 5% СОг) было отмечено снижение уровня экспрессии СЭ54 в 1,5 - 2 раза во всех исследуемых газовых средах через 24 часа после воздействия и восстановление до первоначального уровня экспрессии на поверхности через 48 часов (рис 4)

Таким образом, при исследовании изменения степени экспрессии СБ54 на поверхности эндотелиальных клеток человека в гапоксических газовых средах было показано, что при кратковременных инкубациях в среде, содержащей аргон, наблюдается более выраженная активация экспрессии молекул адгезии, чем в среде, содержащей в своем составе азот Изменения, выявленные в периоде последействия также указывают на меньшее повреждающее действие аргоносодержащей среды При многократных длительных экспозициях в исследуемых средах с пониженным содержанием кислорода наблюдающееся уменьшение экспрессии молекул адгезии может косвенно свидетельствовать об возможности замедления миграции ЭК человека при моделировании повреждения сосудистой стенки, которая, как известно, контролируется регуляцией экспрессии молекул адгезии класса интегринов [Ьсига М е1 а1, 2004, всИагг М А е1 а1, 2005,хю0е1а1,2006]

Пролиферативная активность культивируемых ЭК человека в условиях гипероксических газовых сред.

Изменение пролиферативной активности в условиях гипероксических газовых сред было показано на различных типах клеток, таких как перициты, альвеолярные макрофаги, эпителиальные клетки легких, фибробласты (ТУАтоге, 1987, №гигкаг, 1988, С1етегй, 1992, Сопсот, 2004] Эти данные позволили предполагать, что если ЭК чувствительны к увеличению содержания кислорода в окружающей среде, то они тоже могут отвечать изменением скорости роста. Для того чтобы проверить данное предположение была изучена пролиферативная активность ЭК человека в условиях гипероксических газовых сред с различным содержанием кислорода

Экспериментальные исследования проводили при инкубации ЭК человека в 75% -100% кислородно-аргоновой смеси Показано, что многократные кратковременные экспозиции (по 3 часа ежедневно) культивируемых ЭК в условиях гипероксии (75%-100% кислорода) приводят к снижению пролиферативной активности клеток (рис 5) При этом тенденция к замедлению пролиферации наблюдалась после второй экспозиции в исследуемых газовых смесях, а достоверные различия в количестве клеток в культуре были выявлены только после третьей экспозиции в среде со 100% содержанием кислорода

Длительное (18 часов) гипероксическое воздействие тормозило пролиферативную активность культивируемых ЭК уже после первой экспозиции (рис 6) Отставание в нарастании количества клеток в культуре становилось достоверным после второй и

третьей экспозиции в условиях гипероксии При воздействии 100% кислорода количество клеток практически не изменялось, что свидетельствует о полном ингибировании пролиферации, поскольку известно, что даже использование модели «жесткой» гипероксии (95% кислорода и 5% углекислого газа в течение 3 суток) не приводит к изменению жизнеспособности клеток по сравнению с контролем [Semo et al, 2001]

Исследование эффектов гипероксической смеси (89% СЬ + 4,5% Аг + 6,5 % N2), получаемой в лабораторной установке при адсорбционном разделении воздуха, выявило более слабый эффект подавления пролиферации как при кратковременных, так, и особенно, при длительных многократных экспозициях Даже трехкратные воздействия по 18 часов ежедневно не приводили к достоверным различиям в увеличении числа клеток по сравнению с контрольными значениями в контрольных и опытных культурах При этом процент прироста числа клеток после трех суток эксперимента, был схожим с результатами, полученным в серии с использованием азот-содержащей газовой смеси с объемной долей кислорода равной 75% Таким образом, токсическое действие кислорода на культивируемые эндотелиальные клетки человека при использовании гипероксической смеси, получаемой по методу короткоцикловой безнагревной адсорбции [Gngonev et al, 2001], несколько ниже, чем смесей, содержащих медицинский кислород в близком диапазоне концентраций (75%-95% О2)

Необходимо отметить, что в литературе практически нет данных о влиянии на пролиферацию ЭК, экспозиций в условиях «жесткой» гипероксии Ранее проводимые эксперименты на обезьянах показали, что длительные экспозиции в условиях повышенного содержания кислорода (от 80% до 100%) приводят к гибели через 6-8 дней от дисфункции ЭК и альвеолоцитов легких, причем первые признаки кислородного отравления наблюдаются уже через 48 часов [Bowden, 1978, Adamson et al, 1980, Gaciutto et al, 1993] В работе Cui [Cui, 1988], было показано, что при нахождении крыс в течение недели в среде с 70% О2, наблюдалось достоверное ингибирование пролиферации ЭК, альвеолоцитов и других элементов стромы легких В то же время, при изучении ультраструктуры клеток не было отмечено значимых изменений В экспериментах Junod, проведенных с использованием культивируемых ЭК человека, показано, что длительная 48-часовая гипероксия (95% Ог) не влияла на пролиферацию клеток и морфологию клеток [Junod, 1987] При использовании той же модели гипероксии, но на культуре растущих клеток, было обнаружено значительное ингибирование активности тимидин-киназы, т е снижение пролиферативной активности и остановка клеточного деления Известно, что одним из механизмов реализации гипероксического воздействия на клетки является избыточная генерация активных форм кислорода, которые могут оказывать повреждающее действие При этом образование АФК влияет на клеточную подвижность и цитоскелет, а последующее увеличение концентрации АФК в клетке ведет к снижению

пролиферативной активности клеток [Boyd, 1995, Ingber, 1995 Alexandrova, 2006, Moldovan, 2006]

Исследование миграции ЭК человека в условиях измененной газовой среды

Миграционная активность является одной из функциональных характеристик ЭК, используемых при тестировании культивируемых клеток Известно, что репарация незначительных по ширине участков повреждения эндотелиального монослоя in vitro и in vivo осуществляется в течение нескольких часов только за счет распластывания клеток [Hirsh et al, 1977, Smirnov et al, 1988]

Исследование миграции культивируемых ЭК человека, показало, что значительное (до 50% от контрольных значений) ингибирование миграции ЭК наблюдалось при длительных экспозициях (18 часов) культур в гипероксических газовых средах, содержащих 75%- 95% Ог, дополненных соответствующим количеством аргона до 100% Кратковременные (3 часа) многократные экспозиции культур в тех же условиях приводили к недостоверному снижению миграции ЭК (80% от контрольных значений) Незначительная активация миграции наблюдалась только при однократной кратковременной экспозиции эндотелия в гипероксической среде, содержащей 5% Аг или N2 и 95% 02

Изучение миграции культивируемых ЭК человека в условиях среды с пониженным содержанием кислорода, с использованием той же модели показало, что гипоксия незначительно (до 15%) ингибирует миграцию как при кратковременных многократных экспозициях, так и при длительных экспозициях в измененных газовых средах по сравнению с культурой клеток, находившейся в стандартных условиях (95% воздуха, 5%СОг, 37°С, 100% влажность) Не было отмечено значимых изменений миграции клеток в зависимости от состава газовой среды Таким образом, изменение содержания кислорода в среде влияет как на скорость пролиферации, так и на миграцию ЭК, однако степень ингибирования пролиферации и миграции зависит не только от газового состава среды, но и от режима экспозиции

Изучение влияния газовых сред с различным содержанием кислорода на мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из липоаспирата человека (лМСК)

Характеристика лМСК человека в условиях нормоксии

В ходе экспериментов нами была адаптирована методика выделения и культивирования мезенхимальных стромальных клеток (лМСК), выделенных из липоаспирата человека [Zuk Р et al, 2001, 2002, Ryden М et al, 2003] В первичной культуре лМСК формировали типичные колонии адгезивных, быстроделящихся клеток с

фибробластоподобной морфологией и достигали конфлуэнтности к концу первой недели культивирования

Для идентификации и характеристики культивируемых клеток нами использовался набор моноклональных антител фирмы Beckman Coulter - гематопоэтические и эндотелиальные (CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR) и так же антитела к CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментину, которые являются маркерами, характерными для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников В качестве изотопического контроля к антителам использовались FITC- и РЕ-меченые IgG соответствующего класса Результаты иммунофенотипирования свидетельствуют о том, что на культивируемых лМСК экспрессируются CD9 (37-49,8%), CD54 (30,5-40,1 %), CD71 (87-97%), CD90 (98,7-100 %), CD105 (58-98,3%), CD106 (60-79,5 %), HLA-ABC (99,8100%), виментин (100%) и не экспрессируются маркеры, характерные для эндотелия (CD31) и гематопоэтических клеток-предшественников (CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR)

Пролиферативная активность лМСК человека в условиях гипероксических газовых сред.

Известно, что одним из наиболее изученных проявлений ответа клеточных систем на измененное содержание кислорода в окружающей среде является изменение пролиферации клеток [Rrick et al, 2005, Кшо-ока et al, 2005, Wang et al, 2006] Полученные нами данные показали, что при культивировании лМСК в условиях гипероксии (100% Ог или 96%Ог + 4% Аг) при одно- и многократных кратных кратковременных инкубациях не происходило снижения пролиферации клеток ни в одной из исследуемых смесей по сравнению с клетками, находившимися в стандартных условиях (95% воздуха, 5%С02) Это может быть связано с увеличением активности антиоксидантных систем клеток или незначительным повреждением структур клеток образующимися АФК в период воздействия гипероксических газовых смесей

При длительных (18 часов) однократных и многократных экспозициях в условиях гипероксии с использованием исследуемых газовых смесей не было показано достоверных отличий в скорости пролиферации клеток ни в одной из культур, подвергнутых воздействию гипероксической смеси Некоторое снижение пролиферативной активности лМСК, может указывать на изменения в системах внутриклеточной регуляции, при помещении клеток в условия с повышенным содержанием кислорода

Полученные данные указывают на высокую устойчивость культивируемых лМСК к токсическому действию высокого парциального давления кислорода

Исследование изменения жизнеспособности лМСК человека в условиях гипероксических газовых сред

Для оценки повреждающего эффекта повышенного содержания кислорода в среде на стромальные клетки-предшественники исследовали количество апоптотических и некротических клеток

При кратковременных экспозициях в исследуемых гипероксических средах, было выявлено незначительное увеличение доли апоптотических клеток по сравнению с нормоксическим контролем Максимальная доля апоптотических клеток при многократном кратковременном воздействии 100% кислорода не превышала 3,1%, а в газовой смеси, содержащей 96% 02 + 4% Аг - 2,7% Гораздо больше в этих условиях появилось некротических клеток - до 5% Однако, если последующий 24-часовой период восстановления после действия 100% Ог приводил к резкому нарастанию (до 20%) некротических клеток, то гипероксическая смесь, получаемая на установке, разработанной в ГНЦ РФ - ИМБП РАН [Солдатов и др, 2000, Gngonev et al, 2001], не приводила к таким выраженным последствиям Количество PI-положительных клеток не превышало 7% Необходимо отметить, что в периоде последействия не наблюдалось увеличения доли апоптотических и некротических клеток

Аналогичную картину наблюдали при длительных инкубациях клеток в гипероксических газовых смесях Увеличение доли клеток, подвергшихся некрозу, было схожим при однократных и двукратных 18-часовых экспозициях, причем доля некротических клеток в среде с медицинским кислородом была >13% и достоверно больше, чем в среде с гипероксической смесью, содержащей 96% Ог +4% Аг Следует отметить, что последующего увеличения доли поврежденных клеток в периоде последействия не наблюдалось Выявлено даже некоторое снижение доли PI-положительных клеток через 24 часа после завершения 18-часового воздействия медицинским кислородом Общеизвестно, что один из механизмов токсического действия кислорода на клетки - активация процессов апоптоза и некроза. Гибель клеток при гипероксии связана с усиленной генерацией АФК, влекущей за собой процессы перекисного окисления липидов, а также недостаточной эффективностью антиоксидантных систем, включающих в себя каталазу, супероксиддисмутазу, глютатион-редуктазу, витамины Е, С и регулирующих экспрессию генов, ответственных за регуляцию стресс-ответа и генов апоптоза [Iraní, 1988, Honda et al, 2001] Возможно, увеличение доли поврежденных клеток может быть связано с возросшей генерацией АФК

Таким образом, при исследовании эффектов гипероксических газовых смесей на культивируемые лМСК, было показано, что гибель клеток в условиях кислородного cipecca идет преимущественно по пути некроза, активация которого зависит от кратности и длительности экспозиции при использовании 100% (медицинского) кислорода

Гипероксическая среда (96% 02 + 4% Аг) приводит к достоверно меньшему (1,5-2 раза) уровню повреждения в популяции лМСК

Исследование изменения экспрессии молекул адгезии лМСК человека в условиях гипероксических газовых сред.

Исследование эффектов гипероксических газовых смесей показало, что многократные кратковременные и длительные экспозиции (по 3 и 18 часов ежедневно) лМСК в условиях пшероксии (100% Ог, 96% 02 + 4% Аг) приводят к уменьшению количества клеток, экспрессирующих маркеры клеточной адгезии (СВ9, СВ54) по сравнению с клетками, находящимися в нормоксических условиях Достоверное уменьшение количества клеток, экспрессирующих на своей поверхности СЭ9 и СБ54 наблюдалось уже после первой 3-часовой экспозиции в исследуемых газовых смесях Увеличение числа экспозиций в условиях гипероксии вызвало незначительное увеличение количества клеток, экспрессирующих СИ54 и СВ9, которое, впрочем, так и не достигло значений в нормоксии Важно отметить, что при экспозиции клеток в среде, содержащей 96%02 + 4%Аг, получаемой по методу безнагревной короткоцикловой адсорбции, приводили к достоверно меньшему снижению экспрессии СБ54 и СБ9 как после кратковременных, так и длительных воздействий по сравнению с медицинским кислородом Возвращение клеток в нормоксическую среду после 3-часовых и 18-часовых инкубаций не привело к восстановлению уровня экспрессии С09 и СБ54 на поверхности лМСК, что может указывать на необратимость выявленных изменений, по крайней мере, в рамках пассажа, подвергшегося воздействию пшероксии Показано, что уменьшение доли клеток, экспрессирующих молекулы, модулирующие клеточную адгезию (СЭ9, С054) в условиях гипероксии зависело не столько от выбранного режима экспозиции (длительность и кратность), но, в большей степени, от состава тестируемой газовой смеси

Полученные результаты свидетельствуют о более выраженном повреждающем эффекте на культивируемые мезенхимальные клетки-предшественники медицинского кислорода по сравнению с гипероксической смесью, полученной методом короткоцикловой адсорбции, что наряду с данными, полученными с использованием других моделей [Павлов Н Б и др 2003, Солдатов П Э и др, 2004, 2006], позволяет рекомендовать эту гипероксическую смесь для медицинского использования

Определение содержания цитокинов в среде культивирования лМСК человека

Одним из проявлением ответа клеток на стрессогенное воздействие может быть изменение синтеза биологически-активных веществ, таких как цитокины и хемокины, а также факторы роста В частности, показано, что оГэкспрессия 1Ь-б и УЕвР является чувствительной к изменению содержанию кислорода в среде [Койег е! а1, 2005] В работах

Еупеэ и АЬАБтакЬ [ЕупеБ е1 а1, 2004, А1-АзтакЬ е1 а!, 2007] было показано, что на изменение синтеза ТЬ-6 и УЕвР оказывают большое влияние активные формы кислорода, уровень которых, как известно, в гипероксических условиях резко увеличивается Нами было показано, что как при кратковременных и длительных воздействиях, так и в периоде последействия наблюдается достоверное увеличение экскреции 1Ь-6 при экспозиции лМСК в условиях 100% медицинского Ог Активация синтеза 1Ь-6 наблюдалась только в периоде последействия при длительных экспозициях в среде, содержащей 96% О2+ 4%Аг При кратковременных гипероксических воздействиях, и в период возвращения в стандартные условия культивирования происходила активация синтеза УЕвР только при экспозиции лМСК в среде, содержащей 96% Ог+ 4%Аг Также показано, что лМСК, находящиеся в газовой среде с 100% содержанием кислорода, синтезируют больше 1Ь-6, чем клетки, находящиеся в условиях газовой смеси, содержащей 4% Аг Таким образом, нам удалось продемонстрировать, что в лМСК гипероксия вызывает активацию синтеза таких показателей стресса, как цитокины и факторы роста, но при этом ингибирует экспрессию молекул адгезии, что, по-видимому, связано с различными сигнальными путями реализации гипероксического стимула.

Ответ на изменение содержания кислорода в окружающей среде и формирование комплекса ответных реакций клеткой - один из главных факторов, запускающих каскад различных процессов в клетке Несмотря на постоянно увеличивающееся число публикаций о влиянии изменения содержания кислорода на характеристики различных типов клеток, сами механизмы этих изменений остаются еще недостаточно изученными В то же время, наблюдаемые изменения при воздействии измененного уровня Ог на культивируемые клетки различной степени дифференцировки, такие как снижение степени экспрессии молекул адгезии и активация синтеза 1Ь-6 и УЕвР, свидетельствуют о том, что в реализацию этих эффектов вовлекаются общие механизмы С другой стороны, обнаруженные различия в пролиферации ЭК и лМСК при воздействии гипероксических газовых смесей, указывают на различную чувствительность клеток, отличных по степени дифференцировки к изменению парциального давления кислорода в среде Более того, можно предположить, что культура лМСК, являющаяся гетерогенной популяцией клеток-предшественников, может содержать субпопуляции клеток как более чувствительных к кислороду, так и менее чувствительных к его содержанию во внешней среде В таком случае, более чувствительные клетки будут погибать, как правило, по пути некроза, а более устойчивые клетки могут отвечать активацией пролиферации и за счет их вклада, сохранять относительно постоянное число лМСК в культуре, в отличие от культивируемых ЭК человека

Итак, в ходе работы была создана и апробирована эффективная тест-система, позволяющая изучать эффекты различных газовых сред на клеточном уровне Показано,

что при изучении действия измененных газовых сред необходимо учитывать не только дифференцировочный потенциал изучаемых клеточных популяций, но и использовать протокол, включающий в себя одно- и многократные краткосрочные и длительные воздействия Предложенная тест-система может иметь широкое применение для тестирования вновь создаваемых газовых смесей в связи с растущими потребностями современной медицины ВЫВОДЫ

1 Разработана эффективная модель с использованием многократного воздействия различной длительности для изучения влияния сред с измененным газовым составом на культивируемые клетки человека

2 Гипоксия (5% 02) при кратковременных и длительных одно- и многократных воздействиях не оказывает влияния на пролиферацию, жизнеспособность и миграцию ЭК, независимо от использованного индифферентного газа (Ar vs N2)

3 Длительная многократная гипоксия (5% О2) модулирует экспрессию маркеров, ответственных за межклеточное взаимодействие CD54 и CD9 и синтез IL-б и VEGF

4 Кратковременные однократные и многократные экспозиции, а также однократные длительные экспозиции в гипероксических газовых средах (75% - 100% 02) не влияют на пролиферативную активность ЭК и лМСК человека Многократные длительные экспозиции практически полностью ингибируют пролиферацию ЭК и не влияют на пролиферацию лМСК in vitro

5 Снижение жизнеспособности лМСК выявляется не только при воздействии гипероксической газовой смеси (при содержании кислорода >75%), но и в периоде последействия, в основном за счет увеличения количества некротических клеток в популяции

6 Гипероксия (90% 02) приводит к уменьшению доли лМСК, экспрессирующих молекулы, модулирующие клеточную адгезию (CD9, CD54) Выраженность эффекта зависит не столько от выбранного режима экспозиции (длительность и кратность), но в большей степени, от использованного индифферентного газа-разбавителя (Аг или N2)

7 Гипероксическая газовая смесь, содержащая 90% - 95% О2, получаемая по методу короткоцикловой безнагревной адсорбции, ингибирует пролиферацию и миграцию ЭК человека ш vitro значительно меньше, и оказывает меньший повреждающий эффект, чем смесь, получаемая на основе медицинского Ог Аналогичный протективный эффект этой смеси выявлен с использованием лМСК в качестве тест-системы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Влияние гипероксических газовых смесей на пролиферацию эндотелиальных клеток человека m vitro // Тезисы Ш Молодежной конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню Космонавтики, Москва, 2004 г С 14-15

2 Изучение влияния гипероксической газовой смеси на органоспецифичные клетки-предшественники человека // Тезисы VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» Звенигород, 2005 г, С 92 (соавт Л Б Буравкова, Е Р Андреева)

3 The effects of hyperoxic gas mixtures о human adipose tissue-derived progenitor cells // Abstracts of the 2nd International Conference "Strategies in Tissue Engineering" Wurzburg, 2006, Cytotherapy, Vol 8 Supp 2 P 37 (co-autors L Buravkova, E Andreeva, I Smirnov)

4 Влияние пшоксических газовых смесей на жизнеспособность, экспрессию молекул адгезии, миграцию и синтез интерлейкинов культивируемыми эндотелиальными клетками человека // Тезисы Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре» Санкт-Петербург, 2006 г, С (соавт Л Б Буравкова, Е Р Андреева)

5 Migration activity of endothelial cells in vitro ш hyperoxic gas mixture // Abstracts of the International Symposium "Biological Motivity New Trends ш Research" Pushchino, 2006 p 41-42

6 Влияние гипероксических газовых смесей на пролиферативную и миграционную активность культивируемых эндотелиальных клеток человека // Авиакосм и эколог мед, 2006 г, Т 40, N3,- С 38-42 (соавт Н В Мерзликина, Л Б Буравкова)

7 Влияние гипероксических газовых смесей на жизнеспособность и изменение экспрессии поверхностных маркеров мезенхимальных стромальных клеток-предшественников // Технологии живых систем, 2006 г, N2, С 47-52 (соавт Л Б Буравкова, Е Р Андреева)

8 VIII Международный конгресс International Society for adaptive medicme, Москва, Россия, 2006 г, С 89, «The effect of hyperoxic gas mixtures markers expression of stromal progenitor cells» (соавт Л Б Буравкова, Е Р Андреева)

9 Влияние гипероксических смесей на полипотентные мезенхимальные стромальные клетки человека // Тезисы V Молодежной конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню Космонавтики, Москва, 2007 г С 14-15

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода ИЛ, IL - интерлейкин

лМСК - мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из липоаспирата МСК - мезенхимальные стволовые клетки СК - стволовые клетки ЭК - эндотелиальные клетки

CD - cluster of differentiation - кластер дифференцировки

ICAM - intracellular adhesion molecule — межклеточная молекула адгезии

VEGF - vascular endothelial growth factor - фактор роста эндотелия сосудов

 
 

Оглавление диссертации Гринаковская, Ольга Сергеевна :: 2007 :: Москва

14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Л.Б. Буравкова

Москва

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

ВСК - стволовые клетки взрослого организма

ИЛ, IL - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

КМ - костный мозг лМСК - мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из липоаспирата

МКА - молекулы клеточной адгезии

МСК - мезенхимальные стволовые клетки

СК - стволовые клетки

СОД - супероксид дисмутаза

ЭК - эндотелиальные клетки

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

CD - cluster differentiation - кластер дифференцировки

FBS - Fetal bovine serum - фетальная коровья сыворотка

FITC - Fluorescein isothiocyanate - флуоресцеин изотиоционат

ICAM - intracellular adhesion molecule - межклеточная молекула адгезии

IgG - иммуноглобулин G

PBS - фосфатный солевой буфер

HIF - hypoxia inducible factor - фактор, индуцируемый гипоксией VEGF - vascular endothelial growth factor - фактор роста эндотелия сосудов

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Экспериментальные модели для изучения эффектов 12 измененных газовых сред.

1.2 Эндотелиальные клетки человека: морфология и 16 функциональная характеристика.

1.3 Мезенхимальные стромальные клетки-предшественники 19 человека: морфология и функциональная характеристика.

1.4 Цитокины и молекулы клеточной адгезии как показатели 32 функционального состояния клетки.

1.5 Гипоксия. Механизмы действия на клеточном уровне.

1.6 Гипероксия. Механизмы действия на клеточном уровне.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Культивирование клеток.

2.1.1. Химические реактивы, культуральные среды, пластик.

2.1.2. Выделение и культивирование эндотелиальных клеток 62 пупочной вены человека.

2.1.3. Выделение и культивирование мезенхимальных стромальных 63 клеток человека из липоаспирата.

2.1.4. Криоконсервация мезенхимальных стромальных клеток- 65 предшественников и эндотелиальных клеток человека.

2.2. Исследование свойств культивируемых клеток в условиях 66 моделируемой кратковременной и длительной гипоксии и гипероксии.

2.2.1. Моделирование гипоксии и гипероксии.

2.2.2. Анализ пролиферативной активности эндотелиальных и 67 мезенхимальных стромальных клеток-предшественников человека.

2.2.3. Изучение миграционной активности эндотелия на модели 68 механически поврежденного монослоя (wound healing).

2.2.4. Определение содержания цитокинов в культуральной среде 68 эндотелиальных клеток человека и стромальных клеток-предшественников.

2.2.5. Исследование изменений поверхностных маркеров клеток 71 методом проточной цитофлуориметрии.

2.2.5.1. Фенотипирование эндотелиальных клеток человека

2.2.5.2. Идентификация лМСК человека

2.2.5.3. Оценка жизнеспособности клеток после криоконсервации и 74 экспозиций в измененной газовой среде.

2.2.6 Статистический анализ.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследование влияния гипоксических и гипероксических 76 газовых смесей на эндотелиальные клетки пупочной вены человека.

3.1.1. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека - 76 характеристика и условия культивирования

3.1.2. Пролиферативная активность эндотелиальных клеток 79 человека в условиях гипоксических газовых сред

3.1.3. Изменение жизнеспособности эндотелиальных клеток 83 человека в условиях гипоксических газовых сред

3.1.4. Определение содержания цитокинов в среде культивирования 85 ЭК человека

3.1.5. Исследование изменений экспрессии молекул адгезии в 91 условиях гипоксической газовой среды.

3.1.6. Пролиферативная активность ЭК человека в условиях 93 гипероксических газовых сред.

3.1.7. Исследование миграции ЭК человека в условиях измененной 98 газовой среды

3.3.2. Изучение влияния газовых сред с различным содержанием кислорода на мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из липоаспирата человека (лМСК)

3.3.2.1. лМСК человека в условиях нормоксии.

3.3.2.2. Пролиферативная активность лМСК человека в условиях 111 гипероксических газовых сред

3.3.2.3. Исследование изменения жизнеспособности лМСК человека в 115 условиях гипероксических газовых сред

3.3.2.4. Исследование изменения экспрессии молекул адгезии лМСК 117 человека в условиях гипероксических газовых сред.

3.3.2.5. Определение содержания цитокинов в среде культивирования 122 лМСК человека

 
 

Введение диссертации по теме "Авиационная, космическая и морская медицина", Гринаковская, Ольга Сергеевна, автореферат

Использование новых искусственных газовых сред в обитаемых гермообъектах (космические корабли и орбитальные станции, подводные лодки и подземные объекты, барокамеры различного назначения) требует тщательной всесторонней проверки их биологической активности с использованием различных тест-систем. Показано что важным является не только изучение эффектов измененного содержания кислорода, но и реакция живых систем на такую важную составляющую как индифферентный газ [Вдовин и др., 1998; Ветош и др., 1999; Гальчук и др., 2001; Павлов и др., 1999, 2004; Шулагин и др., 2001; Cook, 1950; Al-Nabulsi et al., 1997; Kindwall etal., 1995].

Гипоксические состояния могут возникать у здоровых людей в связи со специфическими условиями профессиональной деятельности и возможными чрезвычайными происшествиями в результате неисправности систем жизнеобеспечения. В таких случаях снижение содержания кислорода в газовой среде протекает с различной скоростью и может вызывать тяжелые органные нарушения, если не удается сразу устранить причину появления экзогенной гипоксии. Основная группа риска в данном случае - это водолазы, подводники, летчики, космонавты, шахтеры, пожарники и дайверы [Малкин и др., 1977, Гуляр и др., 1991, Полещук и др., 1991 Kindwall et al., 1995].

Для компенсации недостатка 02, возникающего вследствие эндогенной и экзогенной гипоксии в настоящее время широко применяются гипероксические газовые смеси. Они незаменимы при оказании неотложной медицинской помощи для купирования таких состояний как острая гипоксия, отравление угарным газом, декомпрессионные расстройства и другие [Жиронкин и др., 1968, 1972; Леонов и др., 1993; Сапов и др., 1982 Kindwall etal., 1995].

Эффекты, возникающие при гипоксии и гипероксии, непосредственно связаны с изменением содержания кислорода в среде. Высокая окислительная способность кислорода, имеет как положительные, так и отрицательные стороны. Наряду с окислительным фосфорилированием, в которое вовлекается около 90% потребляемого кислорода, в живых организмах постоянно протекают реакции с образованием активных форм кислорода (АФК), Одним из самых важных отрицательных действий кислорода на клетку является избыточная генерация АФК и их производных [Скулачев, 1996].

В последние годы проводится значительное количество исследований, направленных на изучение воздействия газовых смесей с различным содержанием кислорода и широким спектром индифферентных газов на организм человека. Большинство этих работ посвящено оценке эффектов газовых смесей на уровне целого организма [Павлов и др., 1999, 2006; Шулагин и др., 2001]. Однако для понимания клеточных и молекулярных механизмов возникающих изменений необходимо проведение исследований на уровне отдельных клеток. В настоящее время в связи с появлением методов культивирования клеток, появилась уникальная возможность моделировать различные процессы на клетках человека in vitro. Использование таких моделей позволяет не только оценить влияние газовых смесей с повышенным или пониженным содержанием кислорода на функционирование клеток, но и изучить молекулярные механизмы ответа клеток на изучаемый стимул [Буравкова и др., 1991; Ткачук и др., 1997, Nishida et al., 2000; Mold et al., 2001; Sengupta et al.; 2001; Lee et al, 2005].

К сожалению, данные, получаемые при изучении влияния смесей с различным содержанием кислорода на клеточном уровне не только малочисленны, но и часто противоречивы. Наблюдаемые изменения могут быть специфическими для изучаемого типа клеток, именно поэтому, очень важен выбор клеточного объекта. Для изучения эффектов измененных газовых сред in vitro, одной из наиболее удачной моделей являются эндотелиальные клетки (ЭК), которые в силу своего положения в организме находятся в условиях различного содержании кислорода, и, как следствие, обладают механизмами коррекции своих функций и адаптации к изменяющимся условиям среды. Изучение эффектов газовых сред на ЭК позволит получить представление о влиянии измененной газовой среды на высокодифференцированные клеточные популяции.

Для более полного понимания эффектов, оказываемых смесями с различным содержанием кислорода на организм человека, необходимо изучать их воздействие не только на дифференцированные системы, но и на более пластичные и менее дифференцированные популяции клеток, такие как мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (МСК), интерес к которым значительно возрос в связи с их возможным применением в регенеративной медицине. Одним из наиболее доступных источников МСК является жировая ткань, которая, также как и костный мозг, является производным мезенхимы и содержит поддерживающую его строму, которая может быть легко изолирована [Zuk et al., 2001, 2002; Katz et al., 2002, Ryang et al., 2004; Leong et al., 2005; Dicker, 2005]. Сравнительное изучение клеточных популяций (ЭК и МСК) с различным потенциалом дифференцировки в одних и тех же экспериментальных условиях (параметры культивирования, состав газовой среды, кратность и продолжительность воздействия) позволит оценить насколько степень дифференцировки клетки может определять клеточную реакцию на изменение содержания кислорода в окружающей среде.

Создание соответствующего экспериментального протокола является необходимым условием для получения результатов, наиболее адекватно отражающих эффекты воздействия измененных газовых сред на культивируемые клетки. Условия использования измененных газовых сред, применяемых в различных исследованиях очень вариабельны. Чаще всего изучаются однократные кратковременные или длительные воздействия. Однако для того чтобы более достоверно оценить влияние изменения содержания кислорода на клетки представляется важным сравнить влияние одно- и многократных экспозиций и эффекты отмены воздействия. Создание такого протокола является чрезвычайно актуальным в связи с необходимостью тестирования вновь создаваемых газовых смесей для замкнутых гермообъектов и/или компенсации различных патологических состояний, возникающих у людей при изменении содержания кислорода.

Изучение возможности использования культивируемых клеток с различными дифференцировочными потенциями в качестве тест-системы для оценки измененных газовых сред и стала предметом настоящего исследования.

Цель работы.

Оценка эффектов измененных газовых сред на модели культивируемых клеток с разным потенциалом дифференцировки в качестве тест-системы. Задачи исследования:

1. Разработать модель для исследования in vitro действия газовых сред с измененным содержанием кислорода на культивируемые клетки человека.

2. Исследовать влияние кратковременных и длительных экспозиций в гипоксических и гипероксических газовых средах на пролиферативную активность, жизнеспособность и экспрессию молекул адгезии в эндотелиальных клетках человека in vitro.

3. Изучить влияние газовых сред с измененным содержанием кислорода на миграцию и синтез биологически активных веществ культивируемыми эндотелиальными клетками человека

4. Провести сравнительное исследование газовых сред с измененным содержанием кислорода на низкодифференцированные мезенхимальные клетки человека при кратковременных и длительных экспозициях.

5. Сравнить с использованием культивируемых клеток эффекты гипероксических газовых сред, получаемых из медицинского кислорода и гипероксической кислородно-азотно-аргоновой среды, получаемой по методу короткоцикловой безнагревной адсорбции.

Научная новизна работы.

Впервые на модели культивируемых ЭК человека показано, что при длительных многократных экспозициях в гипероксических газовых средах (от 75% до 95% Ог) происходит уменьшение экспрессии CD54 (ICAM-1), что свидетельствует о снижении степени активации эндотелиальных клеток.

Установлено, что кислородный стресс (гипоксия или гипероксия) вызывает в ЭК человека увеличение экскреции IL-6 и VEGF во внеклеточную среду, при этом выявлена кумулятивная зависимость от времени и кратности экспозиций в измененной газовой среде.

Впервые на культивируемых клетках проведено тестирование новых гипероксических смесей, получаемых по методу короцикловой безнагревной адсорбции, и при этом выявлен их меньший повреждающий эффект по сравнению с гипероксическими смесями на основе кислорода и азота.

Практическая значимость работы.

Разработана и апробирована тест-система, позволяющая изучать эффекты, оказываемые газовыми смесями на культивируемые клетки

Показано, что в периоде последействия (при возвращении клеток в стандартные условия культивирования) выявляются повреждающие эффекты измененного содержания кислорода в среде, не регистрируемые во время и сразу после воздействия. Это указывает на необходимость учета латентных нарушений при использовании культур клеток в качестве тест-системы.

Установлено, что при использовании мезенхимальных стромальных клеток-предшественников в качестве экспериментальной модели in vitro следует принимать во внимание их устойчивость к изменению напряжения 02 в среде.

In vitro показано, что гипероксическая газовая смесь, получаемая по методу короткоцикловой безнагревой адсорбции, обладает меньшим повреждающим действием на культивируемые клетки, чем гипероксические смеси на основе медицинского кислорода.

Положения, выносимые на защиту.

Разработанная и апробированная тест-система позволила выявить гипероксические и гипоксические эффекты in vitro и провести оценку повреждающего действия газовых смесей с различным содержанием индифферентных газов, на модели культивируемых дифференцированных (ЭК человека) и малодифференцированных (МСК человека) клеток.

Снижение содержания кислорода в среде до 5% при многократных кратковременных и длительных экспозициях не влияет на пролиферацию, миграцию и жизнеспособность, но модифицирует экспрессию клеточных маркеров и синтез IL-6 и VEGF эндотелиальными клетками человека.

В условиях гипероксии (75% - 100%0г) ингибируется пролиферативная активность ЭК человека, но не МСК, при этом на поверхности МСК снижается экспрессия молекул клеточной адгезии (CD9, CD54).

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Влияние газовых смесей с различным содержанием кислорода на культивируемые эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки человека"

выводы.

1. Разработана эффективная модель с использованием многократного воздействия различной длительности для изучения влияния сред с измененным газовым составом на культивируемые клетки человека.

2. Гипоксия (5% 02) при кратковременных и длительных одно- и многократных воздействиях не оказывает влияния на пролиферацию, жизнеспособность и миграцию ЭК, независимо от использованного индифферентного газа (Аг vs N2).

3. Длительная многократная гипоксия (5% 02) модулирует экспрессию маркеров, ответственных за межклеточное взаимодействие CD54 и CD9 и синтез IL-6 и VEGF.

4. Кратковременные однократные и многократные экспозиции, а также однократные длительные экспозиции в гипероксических газовых средах (75% - 100% 02) не влияют на пролиферативную активность ЭК и лМСК человека. Многократные длительные экспозиции практически полностью ингибируют пролиферацию ЭК и не влияют на пролиферацию лМСК in vitro.

5. Снижение жизнеспособности лМСК выявляется не только при воздействии гиперокснческой газовой смеси (при содержании кислорода >75%), но и в периоде последействия, в основном за счет увеличения количества некротических клеток в популяции.

6. Гипероксия (90% 02) приводит к уменьшению доли лМСК, экспрессирующих молекулы, модулирующие клеточную адгезию (CD9, CD54). Выраженность эффекта зависит не столько от выбранного режима экспозиции (длительность и кратность), но в большей степени, от использованного индифферентного газа-разбавителя (Аг или N2).

7. Гипероксическая газовая смесь, содержащая 90% - 95% 02, получаемая по методу короткоцикловой безнагревной адсорбции, ингибирует пролиферацию и миграцию ЭК человека in vitro значительно меньше, и оказывает меньший повреждающий эффект, чем смесь, получаемая на основе медицинского 02. Аналогичный протективный эффект этой смеси выявлен с использованием лМСК в качестве тест-системы.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2007 года, Гринаковская, Ольга Сергеевна

1. Антонов А. С., Крушинский А. В., Николаева М. А., Флегель Х.-Г.,

2. Репин В. С. Первичная культура эндотелиальных клеток из пупочной вены человека: идентификация и характеристика растущей и конфлуэнтной культуры. Цитология, 1981, т. 23, №10, с. 1154-1163.

3. Беляев А. Г. Влияние аргона на рост и размножение гидры.

4. Индифферентные газы в водолазной практике, биологии и медицине: Сборник докладов. М. 2000. С. 11-13

5. Беннетт, П. Б., Элиотт Д.Г. Медицинские проблемы подводныхпогружений. //М., Мир, 1988, 672 с.

6. Березовский В. А, Говоруха Т. Н., Назаренко А. И. Физиол. журнал им.

7. Сеченова, 1989, т. 35, №5, с. 75-78

8. Биохимия: Учеб. для вузов. // Комов В.П., Шведова В.Н.- М.: Дрофа, 2004,640 с.

9. Буравкова J1. Б., Ткачук В. А., Мирзопойзова Т. У., Григорян Т. У.

10. Влияние гипоксии на фосфоинозитидный обмен и аденилат-циклазную систему в эндотелиальных клетках человека. // Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1991, т.111, №5, с.464-466.

11. Вдовин А.В., Ноздрачева J1.B., Павлов Б.Н. Показатели энергетическогометаболизма мозга крыс при дыхании гипоксическими газовыми смесями, содержащие азот или аргон. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1998. - Т. 125. №6. С. 618-621

12. Вермель А. В. Стволовые клетки: общая характеристика и перспективыприменения в клинической практике. // Клиническая медицина 2004, №1 С. 1-5.

13. Ветош А.Н. Биологическое действие азота. // СПб. 2003, 230с Ю.Ветош А.Н., Алексеева О. С. Развитие гипотермии под действиемповышенного давления азота. // Доклады Академии наук, 1999, т. 335, №2, с. 276-278

14. Ветош А.Н., Попов А.А., Алексеева О.С., Пожидаев В.А. Действие на организм животных экстремальных значений плотности азотнокислородной дыхательной газовой среды. // Доклады Акад. наук. 1999. Т. 365, № 2, С. 276-278

15. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах. // Итоги науки и техники. Биофизика. 1992. Т. 29. С. 3-250.

16. Гальчук С.В., Туровецкий В.Б., Андреев А. И., Буравкова Л.Б. Влияние аргона и азота на перитонеальные макрофаги мышей и их устойчивость к повреждающему воздействию УФ-облучения in vitro. // Авиокосмич. и экологич. медицина. 2001. - Т. 35, № 3, С. 39-43

17. Гамалей И. А. Клюбин И. В. Пероксид водорада как сигнальная молекула. // 1996, Цитология, т. 36 № 12 стр. 1233-1247

18. Гансбургский А. Н., Павлов А. В. Сосудистый эндотелий. Руководство по гистологии. Под ред. Данилова Р. К. и Быкова В. JI. Санкт-Петербург, "Специальная литература". 1998. 102 с.

19. Гилберт С. Биология развития. М. «Мир», 1995, т.З, 352 с.

20. Гланц. С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ., М. «Практика», 1999, 459 с.

21. Гуляр С.А., Ильин В.Н., Моисеенко Е.В., Дмитрук Адаптивные реакции у человека при многократном действии глубоководных сатурационных погружений. // Физиол. журн. 1991. - Т. 37. №4. С. 9-19

22. Гуляр С.А., Шарапенко Б. А., Киклевич Ю.Н. Организм человека и подводная среда. // Киев, "Здоров'я", 1977, 182 с.

23. Демидов Н. С., Смирнов И. А., Смолянская Т. С., Солдатов П. Э. Конверсионные технологии космических систем жизнеобитания. // Полет: авиационная, ракетная техника и космонавтика, 2005, № 10, с. 54-60

24. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма. // Успехи современной биологии. 1989. Т. 108, вып. 1, N4. С.3-18.

25. Жиронкин А. Г., Исакян JI. А., Трошихин В. А. Влияние высокого давления на концентрацию свободного кислорода в мыжцах животных. // Физиол. Журнал им. Сеченова, 1972, т. № 58, № 7, с. 1109-1114

26. Казанцева Н.В. Клиническая эффективность различных режимов гипербарической оксигенациипри лечении мозгового инсульта. // Гипербарическая физиология и медицина. 1996, №2, С. 8-13.

27. Лукьянова Л. Д. Современные проблемы гипоксии. // Материалы 2-ой Всероссийской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». 2000, стр. 3-12

28. Малкин В. Б. Гиппентрейтер Е.Б. Острая и хроническая гипоксия. // Проблемы космической биологии, т. 35, М., "Наука", 1977, с. 31528.0вчинников Ю.А. Биоорганическая химия. // М.: Просвещение, 1987, 815 с.

29. Павлов Б. Н., Солдатов П.Э., Дьяченко А.И. Выживаемость лабораторных животных в аргон-содержащих гипоксических средах. // Авиакосм, и эколог, мед. 1998. Т. 32. № 4. С.33-37.

30. Петровский Б.В., Ефуни С.Н., Демуров Е.А., Родионов В.В. Гипербарическая оксигенация и сердечно-сосудистая система. // М.: Наука, 1987,326с.

31. Сапов И. А., Солодков А.С., Назаркин В. Я., Разводовский B.C. Физиология и патология подводных погружений и меры безопасности на воде. // М., ДОСААФ, 1986, 256 с.

32. Скулачев В. П. Кислород в живой клетке: добро и зло. // Соросовский образовательный журнал, 1996, № 3, стр. 4-20

33. Солдатов П.Э. Физиолого-гигиеническое обоснование новых методов обеспечения организма кислородом в экстремальных условиях. // Автореф. дис. д-ра мед. наук. М., 2006

34. Солдатов П. Э, Дадашева О. А, Гурьева Т. С., Лысенко Л. А., Ремизова С. Е. Воздействие аргонсодержащих гипоксических газовых смесей на развитие эмбрионов японского перепела. // Авиокосм. и экологич. медицина, 2002, т. 36, №2, с. 25-28.

35. Солдатов П. Э., Дьяченко А. И., Павлов Б.Н., Федотов А.П., Чугуев А.П. Выживаемость лабораторных животных в аргон-содержащих гипоксических газовых средах. // Авиокосм. и экологич. медицина, 1998, т. 32, №4, с. 33-37.

36. Трошихин Г.В. Организм в гелио-кислородной среде. // Л.,: Наука, Ленингр. отд-ние, 1989, 157 с.

37. Турпаев К.Т. АФК и регуляция экспрессии генов. // Биохимия, 2002. -Т.67. Вып. 3. С. 339-353.

38. Фрейдлин И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции. // Иммунология. -2001. № 5. - С. 4 7.

39. Шулагин А.Ю., Дьяченко А.И, Павлов Б.Н. Влияние аргона на потребление кислорода человеком при физической нагрузке в условиях гипоксии. // Физиология человека. 2001. - Т. 27, № 1, С. 95-101.

40. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и патологии. // Иммунология. 1997. - № 5. - С. 7 14.

41. An W.G., Kanekal М., Simon М.С., Maltepe Е., Blagosklonny M.V., Neckers L.M. Stabilization of wild-type p53 by hypoxia-inducible factor la. // Nature 1998., №392, P. 405-408.

42. Akira S. A nuclear factor for IL-6 expression (NF-IL-6) is a member of a c/EBP family. // EMBO Journal, 1990, №9, P. 1897-1906.

43. A1-Asmakh M., Race H., Tan S., Sullivan M.H. The effects of oxygen concentration on in vitro output of prostaglandin E2 and interleukin-6 from human fetal membranes. // Mol. Hum. Reprod. 2007, №13, Vol. 3, P. 197201.

44. A1-Nabulsi I., Wheeler K.T. Temperature dependence of radiation-induced DNA-protein crosslinks formed under hypoxic conditions. // Radiat. Res. 1997, №148, Vol.6, P.568-574.

45. Alvarez J.A., Baird A., Tatum A., Daucher J., Chorsky R., Gonzalez A.M., Stopa E.G. Localization of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor in human glial neoplasms. // Modern Pathology 1992, №5, P. 303-307.

46. Augustin H.G., Kozian D.H., Johnson R.C. Differentiation of endothelial cells: analysis of the constitutive and activated endothelial cell phenotypes. // Bioessays. 1994, №16, Vol. 12, P. 901-906.

47. Auron P.E., Webb A.C. The structure and regulation of the human prointerleukin 1 beta gene. // Annales de L'Institut Pasteur Immunologic 1987, №138, P. 462-469.

48. Ausserer W.A., Bourrat-Floeck В., Green C.J., Laderoute K.R., Sutherland R.M. Regulation of c-jun expression during hypoxic and low glucose stress. // Mol. Cell. Biol. 1994. №14 Vol. 8., P. 5032-5042.

49. Baksh D., Song L., Tuan R.S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. // J. Cell. Mol. Med., 2004 №8 Vol.3 P. 301-16.

50. Bartholomew A., Sher D., Sosler S., Stock W., Lazda V., Koshy M., Devine S., vanBesien K. Stem cell transplantation eliminates alloantibody in a highly sensitized patient. // Transplantation. 2001 № 27, Vol. 72, P. 1653-1655.

51. Bassenge E. Endothelial function in different organs. // Prog. Cardiovasc. Dis., 1986, №39, P. 209-228.

52. Bauer J., Herrmann F. Interleukin-6 in clinical medicine. // Annals of Hematology 1991, № 62, P. 203-210.

53. Beck G. Interleukin 1: a common endogenous mediator of inflammation and the local Shwartzman reaction. // Journal of Immunology 1986, №136, P. 3025-3031.

54. Bella J. The structure of the two ammo-terminal domains of human ICAM-1 suggests how it functions as a rhinovirus receptor and as an LFA-1 integrin ligand.// Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 1998, №95, P. 4140-4145.

55. Bennett J.H, Joyner C.J., Triffitt J.T., Owen M.E. Adipocytic cells cultured from marrow have osteogenic potential. // J. Cell. Sci. 1991, №99 (Pt 1), P. 131-139.

56. Beresford J.N., Bennett J.H., Devlin C., Leboy P.S., Owen M.E. Evidence for an inverse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultures. // J. Cell Sci. 1992, №102 (Pt 2), P. 341-351.

57. Bergui L. Interleukin-3 and interleuki-n 6 synergistically promote the proliferation and differentiation of malignant plasma cell precursors in multiple myeloma. // Journal of Experimental Medicine 1999, №170, P. 613619.

58. Berry L, Grant ME, McClure J, Rooney P. Bone-marrow-derived chondrogenesis in vitro. // J. Cell Sci. 1992, №101 (Pt 2), P. 333-342.

59. Berse B. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages, and tumors.// Molecular Biology of the Cell 1992, №12, P. 211-220.

60. Bhattacharya S., Michels C.L., Leung M.-K., Arany Z.P., Kung A.L. and Livingston D.M. Functional role of p35srj, a novel рЗОО/CBP binding protein, during transactivation by HIF-1. // Genes Dev. 1999, №13, P. 64-75.

61. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. // Stem Cells. 2001, №19, Vol. 3. P. 180192.

62. Bianco P., Robey P.G. Stem cells in tissue engineering. // Nature. 2001, №414 Vol. 6859. P. 118-21.

63. Bomford R., Henderson B. (editors) Interleukin-1, inflammation and disease. // Elsevier, New York (1989).

64. Brach M.A., Herrmann F. Interleukin-6: presence and future. // International Journal of Clinical and Laboratory Research 1992, №22. P. 143-151.

65. Brahimi H. C, Berra E, Pouyssegur J. Hypoxia: the tumor's gateway to progression along the angiogenic pathway. // Trends Cell Biol. 2001., Vol. 11. P. 32-36.

66. Cao Y., Sun Z., Liao L., Meng Y., Han Q., Zhao R.C. Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improvepostnatal neovascularization in vivo. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005 №332 Vol. 2, P.370-379.

67. Caplan A.I.,. Bruder S.P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. // Trends Mol. Med. 2001. № 7, Vol. 6, P. 259-264.

68. Carsten W., Schindler R., Frei U., Eckardt K.W. Increases in oxygen tension stimulate expression of ICAM-1 and VCAM-1 on human endothelial cells. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 1999. № 276 P. 2044-2052.

69. Chiarugi P. Reactive oxygen species as mediators of cell adhesion. // Ital. J. Biochem., 2003, №52 Vol.1 P. 28-32.

70. CIarke D., Frisen J. Differentiation potential of adult stem cells. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, №11 Vol. 5 P. 575-580.

71. Connolly D.T. Vascular permeability factor: a unique regulator of blood vessel function. Journal of Cellular Biochemistry 1991, №47, P. 219-223.

72. Cook S.F. The effect of helium and argon on methabolism and methamorphosis //J. Cell, and Сотр. Physiol. 1950. V. 36. P. 115-121.

73. Crews S.T., Fan C-M. Remembrance of things PAS: regulation of development by bHLH-PAS proteins. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999, №9 P. 580-587.

74. Cui D.J., Jafri A., Thet L.A. Effect of 70% oxygen on postresectional lung growth in rats. //J. Toxicol. Environ. Health. 1988, №25, Vol.1, P.71-86.

75. DiCarlo V. S., Chen S. J., Meng Q. C., Durand J., Yano M., Chen У. F., Oparil S. ETA receptor antagonist prevents and reverses chronic hypoxia induced pulmonary hypertension in rat. // Am. J. Physiol., 1995 №269, P. 690-697.

76. Dicker A., Le Blanc K., Astrom G., van Harmelen V., Gotherstrom C., Blomqvist L., Arner P., 1^ёп M. Functional studies of mesenchymal stem cells derived from adult human adipose tissue. // Exp. Cell Res. 2005 №15, Vol.308(2)P. 283-290.

77. Donko A., Peterfi Z., Sum A., Leto Т., Geiszt M. Dual oxidases. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2005, №360, P. 2301-2308.

78. Duranteau J., Chandel N.S., Kulisz A., Shao Z., Schumacker P.T. Intracellular signaling by reactive oxygen species during hypoxia in cardiomyocytes. // J. Biol. Chem. 1998, №273 Vol. 19., P. 11619-11624.

79. Eyries M., Collins Т., Khachigian L.M. Modulation of growth factor gene expression in vascular cells by oxidative stress. // Endothelium. 2004, №11, Vol.2, P. 133-139.

80. FedeIe A.O., Murray L. W., Peet D.J. Regulation of Gene Expression by the Hypoxia Inducible Factors. // Molecular Interventions 2002. №. 2. P. 229-243.

81. Ferrara N. Purification and cloning of vascular endothelial growth factor secreted by pituitary folliculo-stellate cells. // Methods in Enzymology 1991, №198 P. 391-404.

82. Forsythe J.A., Jiang B.H., Iyer N.V., Agani F., Leung S.W., Koos R.D., Semenza G.L. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. // Mol. Cell Biol. 1996, №16, Vol.9 P. 4604-4613.

83. Fradette C., Du Souich P. Effect of hypoxia on cytochrome P450 activity and expression. // Curr. Drug Metab. 2004, №.5 Vo.3 P. 257-271.

84. Gerstenfeld L.C, Shapiro F.D. Expression of bone-specific genes by hypertrophic chondrocytes: implication of the complex functions of the hypertrophic chondrocyte during endochondral bone development. // J. Cell Biochem. 1996, №62 Vol.1 P.l-9.

85. Gimbone M. A., Cotran R. S., Folleman J. Human vascular endothelial cells in the culture. Growth and DNA synthesis. // J. Cell Biol., 1974, №60, P. 673684.

86. Gimbrone MA. Vascular endothelium, hemodynamic forces, and atherogenesis. //Am. J. Pathol. 1999, №155 Vol.1 P.85-92.

87. Ginsberg M.H., Loftus FC, Plow E.F. Cytoadgesine, integrins and platelets. // Tromb. Haemostas. 1988. № 59. P. 1-6

88. Goldman C.K. Epidermal growth factor stimulates vascular endothelial growth factor production by human malignant glioma cells: a model of glioblastoma multiforme pathophysiology. // Molecular Biology of the Cell 1993. №4 P. 121-133.

89. Grigoriev A.I., Smirnov I.A., Soldatov P.E. Engineering of high-performance techniques of oxygen production and respiratory mixed gases for spacesystem and public health services. The 1st international cancer & aids conference, 2001, P.47-P.57

90. Gronthos S., Franklin D.M., Leddy H.A., Robey P.G., Storms R.W., Gimble J.M. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. //J. Cell Physiol. 2001, №189, Vol.1, P. 54-63.

91. Halterman M.W., Miller C.C., Federoff H.J. Hypoxia-inducible factor la mediates hypoxia-induced delayed neuronal death that involves p53. // J. Neurosci. 1999, №19 P. 6618-6624.

92. Hattori M. Acute phase reaction induces a specific complex between hepatic nuclear proteins and the interleukin 6 response element of the rat alpha-2-macroglobulin gene. // Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 1990, №87, P. 2364-2368.

93. Haynesworth S.E., Goshima J., Goldberg V.M., Caplan A.I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. // Bone. 1992, №13, Vol. 1,P. 81-88.

94. Herbertson A., Aubin J.E. Cell sorting enriches osteogenic populations in rat bone marrow stromal cell cultures. // Bone. 1997, №21, Vol. 6, P. 491-500.

95. Hu J., Discher D.J., Bishopric N.H., Webster K.A. Hypoxia regulates expression of the endothelin 1 gene through a proximal hypoxia inducible factor 1 binding site on the antisense strand. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, №245, P. 894-899.

96. Huang L.E., Arany Z., Livingston D.M, Bunn H.F. Activation of hypoxia-inducible transcription factor depends primarily upon redox-sensitive stabilization of its a subunit. // J. Biol. Chem. 1996, №271 P. 32253-32259.

97. Humar R., Kiefer F.N., Berns H., Resink T.J., Battegay E.J. Hypoxia enhances vascular cell proliferation and angiogenesis in vitro via rapamycin (mTOR)-dependent signaling. // FASEB J. 2002, №16, Vol.8, P.771-780.

98. Iruela-Arispe M.L. Sage E.H. Endothelial cells exhibiting angiogenesis in vitro proliferate in response to TGF-bl. // Journal of Cellular Biochemistry, 1993, №52 P. 414-430.

99. Ivan M., Kondo K., Yang H. F., Kim W., Valiando J., Ohh M., Salic A.,Asara J. M., Lane W. S. and Kaelin W. G. HIF-la targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for 02 sensing. // Science, 2001, №292, P. 464-468.

100. Jiang B-H., Semenza G.L., Bauer C., Marti H.H. Hypoxiainducible factor 1 levels vary exponentially over a physiologically relevant range of 02 tension. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1996, №271, P. 1172-C1180.

101. Joyner C.J., Bennett A., Triffitt J.T. Identification and enrichment of human osteoprogenitor cells by using differentiation stage-specific monoclonal antibodies.//Bone. 1997, №21, Vol.1, P. 1-6.

102. Junod A.F., Petersen H., Jornot L., Thymidine kinase, thymidylate synthase, and endothelial cell growth under hyperoxia. // J. Appl. Physiol. 1987, №62, Vol.1, P. 10-14.

103. Katz A.J., Tholpady A., Tholpady S.S., Shang H., Ogle R.C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. // Stem Cells. 2005, №23, Vol.3, P.412-423.

104. Kim К J. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. //Nature 1993, №362, P. 841844.

105. Kirkham B. Interleukin-1, immune activation pathways, and different mechanisms in osteoarthritis and rheumatoid arthritis. // Annals of the Rheumatic Diseases 1991, №50 P. 395-400.

106. Kofler S., Nickel Т., Weis M. Role of cytokines in cardiovascular diseases: a focus on endothelial responses to inflammation. // Clin. Sci. (Lond). 2005, №108, Vol.3 P.205-213.

107. Kotch L.E., Iyer N.V., Laughner E., Semenza G.L. Defective vascularization of HIF-la-null embryos is not associated with VEGF deficiency but with mesenchymal cell death. // Dev. Biol. 1999, №209 P. 254-267.

108. Krause D.S. Plasticity of marrow-derived stem cells. // Gene Ther. 2002, №9, Vol.11 P.754-758.

109. Krick S., Eul B.G., Hanzc J., Savai R., Grimminger F., Sceger W., Rose F. Role of HIF 1 {alpha} in hypoxia induced apoptosis of primary alveolar epithelial type II cells. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005. № 4. P. 215223.

110. Kume N, Gimbrone MA Jr. Lysophosphatidylcholine transcriptionally induces growth factor gene expression in cultured human endothelial cells. // J. Clin. Invest. 1994, №93, Vol.2, P. 907-911.

111. Lando D., Peet D.J., Whelan D.A., Gorman J.J., Whitelaw M.L. Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain: a hypoxic switch. // Science, 2002, №295, P. 858-861.

112. Le Blanc K., Tammik C., Rosendahl K., Zetterberg E., Ringden O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. // Exp. Hematol. 2003, №31, Vol.10 P.890-896.

113. Le Blanc K. Mesenchymal stromal cells: Tissue repair and immune modulation. // Cytotherapy. 2006, №8, Vo.6, P.559-561.

114. Lee R.H., Kim В., Choi I., Kim H., Choi H.S., Suh K., Bae Y.C., Jung J.S. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. // Cell Physiol. Biochem., 2004 №14 Vol.4-6, P.311-324.

115. Lee J.M., Grabb M.C., Zipfel G.J., Choi D.W. Brain tissue responses to ischemia//J. Clin. Invest. 2000, №106, P. 723-731.

116. Leong T.W., Chew F.T., Hutmacher D.W. Isolating bone marrow stem cells using sieve technology. // Stem Cells. 2004, №22, Vol.6, P. 1123-1125.

117. Li H., Chen S.J., Chen Y.F., Meng Q.C., Durand J., Oparil S., Elton T.S. Enhanced endothelin 1 and endothelin receptor gene expression in chronic hypoxia. //J. Appl. Physiol., 1994, №77, P. 1451-1459.

118. Lopez-Barneo J. Oxygen-sensing by ion channels and the regulation of cellular functions. // Trends Neurosci., 1996, №19, Vol.10, P. 5-40.

119. Lovett D. Macrophage cytotoxicity: interleukin-1 as a mediator of tumor cytostasis. //Journal of Immunology, 1986 №136, P. 340-347.

120. Malek A.M., Izumo S. Control of endothelial cell gene expression by flow. // J. Biomech., 1995, №28, Vol.12 P.1515-1528.

121. Maranchie, J.K., Vasselli J.R., Riss J., Bonifacino J.S., Linehan W.M., Klausner R.D. The contribution of VIIL substrate binding and HIFl-a to the phenotype of VHL loss in renal cell carcinoma. // Cancer Cell, 2002, №1, P. 247-255.

122. Marti H.H. Erythropoietin and the hypoxic brain. // J. Exp. Biol., 2004, №207, (Pt 18), P. 3233-3242.

123. Masson N., Ratcliffe P. J. HIF prolyl and asparaginyl hyroxylases in the biological response to intracellular 02 levels. // J. Cell Sci., 2003, №116, P. 3041-3049.

124. Maulik N., Sato M., Price B.D., Das D.K. An essential role of NFkB in tyrosine kinase signalling of p38 MAPkinase regulation of myocardial adaptation to ischemia. // FEBS Lett. 1998, №429, P. 365-369.

125. McCord J.M. Superoxide radical: controversies, contradictions, and paradoxes. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1995, №209, Vol.2, P.l 12-117.

126. Millauer B. High affinity VEGF binding and developmental expression suggest Flk-1 as a major regulator of vasculogcnesis and angiogenesis. // Cell 1993, №72, P. 835-846.

127. Minguell J.J., Erices A., Conget P. Mesenchymal stem cells. // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2001 №226, Vol.6, P.507-520.

128. Moore L.G., Shriver M., Bemis L., Hickler В., Wilson M., Brutsaert Т., Parra E., Vargas E. Maternal Adaptation to High altitude Pregnancy: An

129. Experiment of Nature A Review. // Placenta, 2004. Vol. 25, Supplement A, Trophoblast Research. — Vol. 18, P.60-71.

130. Morrell N.W, Morris K.G, Stenmark K.R. Role of angiotensin converting enzyme and angiotensin II in development of hypoxic pulmonary hypertension. // Am. J. Physiol., 1995. №269, P. 1186-1194.

131. Mortimer H., Patel S., Peacock A. J. The genetic basis of high altitude pulmonary oedema. // Pharmacol. Ther., 2004. №101, Vol. 2, P. 183-192.

132. Moses H.L. TGF-beta stimulation and inhibition of cell proliferation: new mechanistic insights. // Cell, 1990, №63, P. 245-247.

133. Murphy B.J. Regulation of malignant progression by the hypoxiasensitive transcription factors HIF-la and MTF-1. // Comparative Biochemistry & Physiology, 2004, №139, Vol.3,P.495-507.

134. Ohga E., Matsuse T. The relationship between adhesion molecules and hypoxia//Nippon Rinsho., 2000 №58, Vol.8, P.1587-1591.

135. Papandreou I., Powell A., Lim A.L., Denko N. Cellular reaction to hypoxia: sensing and responding to an adverse environment. // Mutat. Res., 2005, №6, Vol.569, P.87-100.

136. Peyssonnaux C. HIF-la expression regulates the bacterisl capacity of phagocytes. //J. Clin. Invest., 2005. №115. P. 1806-1815.

137. Pittenger M.F., Martin M.J. Mesenchimal stem cells and their potential as cardiac terapeutics. // Circ. Res. 2004. №5. P. 5-20.

138. Preston S.L., Alison M.R., Forbes S.J., Direkze N.C., Poulsom R., Wright N.A. The new stem cell biology: something for everyone. // Mol. Pathol., 2003 №56, Vol.2, P. 86-96.

139. Prockop D.J., Azizi S.A., Phinney D.G., Kopen G.C., Schwarz E.J. Potential use of marrow stromal cells as therapeutic vectors for diseases of the central nervous system. // Prog. Brain Res., 2000, №128, P.293-297.

140. Pugh C.W., Ratcliffe P. J. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. //Nat. Med., 2003. №9, P.677-684.

141. Rajotte D., Arap W., Hagedorn M., Koivunen E., Pasqualini R., Ruoslahti E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. // J. Clin. Invest., 1998, №15, Vol.l02(2), P.430-437.

142. Reyes M., Lund Т., Lenvik Т., Aguiar D., Koodie L., Verfaillie C.M. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. // Blood., 2001, №98, Vol.9, P. 2615-25.

143. Richard D.E, Berra E., Pouyssegur J. Non hypoxic pathway mediates the induction of hypoxia inducible factor la (HIF-la) in vascular smooth muscle cells. // J. Biol. Chem., 2000, №275, P. 26765-26771.

144. Risau W. Mechanisms of angiogenesis. //Nature., 1997, №386, P.671-674.

145. Sawa Y., Sugimoto Y., Ueki Т., Ishikawa H., Sato A., Nagato Т., Yoshida S. Effects of TNF-{alpha} on Leukocyte Adhesion Molecule Expressions in Cultured Human Lymphatic Endothelium. // J. Histochem. Cytochem., 2007, №19

146. Schinetti M.L., Sbarbati R., Scarlattini M. Superoxide production by human umbilical vein endothelial cells in an anoxia-reoxygenation model. // Cardiovasc. Res., 1989, №23, Vol.1, P.76-80.

147. Schooltink H. Structural and functional studies on the human hepatic interleukin-6 receptor. Molecular cloning and overexpression in HepG2 cells. // Biochemical Journal 1991, №277, P. 659-664.

148. Seebach J., Dieterich P., Luo F., Schillers H., Vestweber D., Oberleithner II., Galla H.J., Schnittler H.J. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. //Lab. Invest., 2000, №80, Vol.12, P.1819-1831.

149. Sekiya I., Larson B.L., Vuoristo J.T., Cui J.G., Prockop D.J. Adipogenic differentiation of human adult stem cells from bone marrow stroma (MSCs). // J. Bone Miner. Res., 2004 №19, Vol.2. P.256-264.

150. Semenza G.L. 02 regulated gene expression: transcriptional control of cardiorespiratory physiology by HIF-1. // J. Appl. Physiol., 2004, №96, Vol.3, P.l 173-1177.

151. Semenza, G.L., Wang G.L. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. // Mol. Cell. Biol., 1992, №12, P.5447-5454.

152. Sligh J.E. Inflammatory and immune responses are impaired in mice deficient in intercellular adhesion molecule 1. // Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 1993, №90, P. 8529-8533.

153. Stenmark K.R, Mecham R.P. Cellular and molecular mechanisms of pulmonary vascular remodeling. // Ann. Rev. Physiol., 1997, №59, P.89-144.

154. Suda T. Interleukin-1 stimulates corticotropin-releasing factor gene expression in rat hypothalamus. // Endocrinology, 1990, № 126, P. 1223-1228.

155. Swinson D.E, Jones J.L., Cox G., Richardson D., Harris A.L., O'Byrne K.J. Hypoxia inducible factor 1-alpha in non small cell lung cancer: relation to growth factor, protease and apoptosis pathways. // Int. J. Cancer, 2004, № 111, Vol.1, P. 43-50.

156. Toborek M., Barger S.W., M.P. Mattson, Barve S., McClain C.J., Hennig B. Linoleic acid and TNF-a cross-amplify oxidative injury and dysfunction of endothelial cells. // J. Lipid Res. 1996, №37, P. 123-135.

157. Trepel M., Grifman M., Weitzman M.D., Pasqualini R. Molecular adaptors for vascular-targeted adenoviral gene delivery. // Hum Gene Ther., 2000, №11, Vol.14 P. 1971-1981.

158. Tuckerman J.R., Zhao Y., Hewitson K.S., Tian Y.M., Pugh C.W., Rattcliffe P.J., Mole D. R. Determination and comparison of specific activity of the HIF-prolyl hydroxylases. // FEBS Lett, 2004, №576, Vol. 1-2, P. 145-150.

159. Turpaev K.T., Litvinov D.I. Redox dependent regulation of gene expression induced by nitric oxide. // Mol. Biol. (Mosk)., 2004, №38, Vol.1, P. 56-68.

160. Vaisman N., Millauer B. Characterization of the receptors for vascular endothelial growth factor. // Journal of Biological Chemistry, 1990, Vol.265, P.19461-19466.

161. Vanhoutte P.M. Platelets, endothelium and blood vessel wall. // Experientia., 1988, №15, Vol.44(2), P.105-109.

162. Wang J., Juhaszova M., Rubin L.J., Yuan X.J. Hypoxia inhibits gene expression of voltage gated K+ channel a subunits in pulmonary artery smooth muscle cells. // J. Clin. Invest., 1997, №100, P.2347-2353.

163. Wenger R.H. Cellular adaptation to hypoxia: 02-sensing proteinhydroxylases, hypoxiainducible transcription factors, and (Deregulated gene expression. // FASEBJ., 2002, №16, P.l 151-1162.

164. Yu A.Y., Frid M.G., Shimoda L.A., Wiener C.M., Stenmark K., Semenza G.L. Temporal, spatial, and oxygen regulated expression of hypoxia inducible factor 1 in the lung. // Am. J. Physiol., 1998, №275, Vol. 4, Pt. 1. P. 818-826.

165. Zarember K.A., Malech H.L. HIF-la: a master regulator of innate host defenses? // J. Clin. Invest., 2005, №115, P. 1702-1704.

166. Zhong H., Willard M., Simons J. NS398 reduces hypoxia inducible factor (HIF)-1 alpha and HIF-1 activity: multiple level effects involving cyclooxygenase 2 dependent and independent mechanisms. // Int. J. Cancer., 2004, №112, Vol. 4, P. 585-595.л

167. Ziegelstein R.C., He C., Hu Q. Hypoxia/reoxygenation stimulates Ca+-dependent ICAM-1 mRNA expression in human aortic endothelial cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, №10, Vol. 322, Pt.l, P.68-73.

168. Zuk P.A, Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. // Mol. Biol. Cell., 2002, №13, Vol.12, P.4279-4295.

169. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. // Tissue Eng., 2001, №7, Vol.2, P.211-228.