Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние афобазола на генетическую и репродуктивную токсичность табачного дыма у крыс

На правах рукописи

Соломина Анна Сергеевна

4854619

ВЛИЯНИЕ АФОБАЗОЛА НА ГЕНЕТИЧЕСКУЮ И РЕПРОДУКТИВНУЮ ТОКСИЧНОСТЬ ТАБАЧНОГО ДЫМА У КРЫС

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 ОЕЗ 23:1

МОСКВА-20 И

4854619

Работа выполнена в НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

чл.-корр. РАМН Дурнев Андрей Дмитриевич

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, профессор, Гарибова Таисия Леоновна

доктор медицинских наук, профессор, Журков Вячеслав Серафимович

Ведущая организация: НИИ фармакологии СО РАМН

Защита состоится «_»_2011г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 001.024.01 при НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в учёной части НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан «_»_2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Е. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вред курения хорошо известен. У курящих повышается вероятность развития рака легких и других злокачественных новообразований, сердечно-сосудистых патологий, хронических респираторных заболеваний (IARC, 2004; ВОЗ, 2008). Особо отмечено комплексное неблагоприятное влияние курения на протекание беременности, развитие плодов и новорожденных. Курение - одна из причин, приводящих к перинатальной смертности, внутриутробной задержке развития плода, дефициту веса и недоношенности, снижению иммунитета, а также патологических изменений в плаценте (Herrmann М., King К., Weitzraan М., 2008; Shea К. А., Steiner М., 2007). Принципиально, что продукты сгорания табака негативно воздействуют не только на курящих, но также на лиц, подвергающихся пассивному курению (Wingle D. Т. et al., 2008; Rogers L. M., 2009; Jauniaux E., Burton G J., 2007).

Широкая пропаганда, отрицающая курение, не приводит к желаемому результату, доля курящих практически не уменьшается, а среди женщин детородного возраста увеличивается (ВОЗ, 2009, 2011). От 11 до 36 % женщин не отказываются от пагубной привычки даже во время беременности, что определяет необходимость поиска средств фармакологической коррекции репротоксических эффектов курения (Coleman Т., 2007). Поэтому целесообразны экспериментальные исследования закономерностей и механизмов негативного воздействия курения на пре- и постнатальное развитие потомства. Однако, работы, посвященные экспериментальной оценке репродуктивной токсичности табачного дыма и разработке корректоров патогенных эффектов курения, в рамках решения проблемы антенатальной охраны плода (Володин Н. Н., 2009, Аб-рамченко В. В., 2009), единичны и недостаточно информативны (De Flora S., 2003).

В качестве базовой мишени при поиске фармакологических корректоров эффектов курения возможно рассматривать генотоксические поражения, которые, по мнению многих авторов (de la Chika R. A. et al., 2005; Shulman L. P. et al., 1991; Tsui H.-C. et al., 2008; Lima P. H. et al., 2008; Florek E., Tadrowska M., Szyfter K., 1998), играют ведущую роль в формировании негативных последствий активного и пассивного курения, в том числе, у беременных. Эта гипотеза вытекает из данных о генотоксиче-ских эффектах продуктов сгорания табака в соматических клетках (Husgafvel-Pursiainen К., 2004; De Marini D. M., 2004). Сведения о генотоксическом влиянии ку-

рения непосредственно на эмбриональные ткани крайне ограничены (Jalili Т., Murthy К., Schiestl Н., 1998; Zenzes М. Т. et al., 1999; Zenzes М. Т., 2000). До настоящего времени отсутствуют работы, характеризующие поврежденность ДНК в эмбриональных тканях методом «ДНК-комет», признанным в качестве наиболее значимого для регистрации повреждений ДНК (Valverde М., Rojas Е. 2009).

Индукция генотоксических поражений может быть снижена под влиянием антимутагенов различной природы, их спектр довольно широк (Dumev A. D. et al., 2009). Среди них особое внимание привлекает афобазол, разработанный в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН. Афобазол, помимо основной анксиолитической активности, обладает нейропротекторным, антиоксидантным, цитопротекторным, антимутагенным и антитератогенным эффектами (Середенин С. Б., Воронин М. В., 2009; Дурнев А. Д. и соавт., 2009). Уникальный спектр фармакологической активности определил перспективу исследования влияния афобазола на репродуктивную и генетическую токсичность табачного дыма в эксперименте.

Цель исследования. Комплексное исследование влияния афобазола на поврежденность ДНК в клетках плаценты и эмбрионов, антенатальное и постнатальное развитие потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма.

Основные задачи исследования.

Дня достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать воздействие табачного дыма на поврежденность ДНК в плаценте и эмбриональных тканях, антенатальное и постнатальное развитие потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма.

2. Оценить влияние афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг при ежедневном пероральном введении с 1-го по 13-й дни беременности на индукцию табачным дымом повреждений ДНК методом «ДНК-комет» в плаценте и эмбрионах крыс.

3. Исследовать влияние афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг при ежедневном пероральном введении на протяжении всего периода беременности на проявления репродуктивной токсичности у потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма.

4. Оценить действие афобазола на формирование условных рефлексов у потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма в период беременности с помощью поведенческого теста «Т-образный лабиринт».

5. Провести сопоставление данных, полученных при исследовании влияния афоба-зола на потомство «курящих» крыс при пероральном пренатальном, постнатальном и сочетающим пре- и постнатальное введение препарата режимах обработки животных.

Научная новизна. Предложена и охарактеризована экспериментальная модель «пассивного курения», выявляющая негативное влияние табачного дыма на антенатальное и постнатальное развитие крысят. Методом «ДНК-комет» впервые охарактеризовано генотоксическое действие табачного дыма в эмбриональных тканях и плаценте, показано увеличение поврежденности ДНК в клетках плаценты и эмбрионов. Впервые установлена принципиальная возможность уменьшения генотоксических и репротоксических эффектов табачного дыма в клетках эмбрионов и плаценте с помощью афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг при пренатальном, постнатальном и сочетающим пре- и постнатальное введение режимах обработки животных.

Научно-практическая значимость. Результаты экспериментального исследования, демонстрирующие снижение генотоксических и репротоксических эффектов табачного дыма, а также нормализацию становления условно-рефлекторной деятельности у потомства под влиянием анксиолитика афобазола в дозах, соответствующих терапевтическим, определяют перспективу его клинического изучения в качестве возможного средства профилактики и коррекции нежелательных эффектов табачного дыма при активном и пассивном курении беременных в рамках решения проблемы антенатальной охраны плода.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на 4-ом Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010), 17-ом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), б-ом съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), 5-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Московская область, 2010), 40-м съезде Европейского общества по мутагенам окружающей среды (Oslo, 2010), Пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды и Научного совета по медико-экологическим проблемам здоровья работающих «Научно-методические и законодательные основы обеспечения генетической безопасности факторов и объек-

тов окружающей и производственной среды в целях сохранения здоровья человека» (Москва, 2010).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на ... страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Иллюстрирована ... таблицами и ... рисунками. Библиографический указатель включает ... отечественных и ... иностранных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные

Исследование проводили на самках беспородных белых крыс массой 200-250 г., полученных из сертифицированных питомников РАМН, содержавшихся в условиях вивария НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН при естественном освещении и свободном доступе к воде и брикетированному сбалансированному комбикорму.

Исследуемый препарат

Афобазол (2-[2-(морфолино)этилтио]-5-этоксибензимидазола гидрохлорид) -оригинальный селективный анксиолитик, разработан и внедрен в медицинскую практику НИИ Фармакологии им. В. В. Закусова РАМН в сотрудничестве с ЗАО «Мастер Фарм» (Per. № ЛС-000861 от 03.11.2005).

Режимы введения препарата

Афобазол вводили перорально в дозах 1 и 10 мг/кг. Выбор указанных дозировок основывался на результатах ранее проведенных работ, продемонстрировавших антимутагенные свойства препарата по отношению к действию ряда генотоксикантов (Жанатаев А. К., 2001), антитератогенные свойства в экспериментах с циклофосфами-дом (Дурнев А. Д., Жанатаев А. К., Шредер О. В., 2009). В отдельной серии исследований афобазол вводили кормящим самкам в дозе 200 мг/кг с тем, чтобы добиться приемлемого содержания препарата и его метаболитов в молоке для обеспечения их поступления в организм крысят на уровне дозы 1-10 мг/кг (Шредер О. В. и соавт., 2010). Афобазол вводили перорально непосредственно перед обработкой животных в модели «пассивного курения» (табл. 1). Все растворы готовили на дистиллированной воде ex tempore.

Экспериментальная модель пассивного курения

Животных с 1-го дня беременности (день обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках), подвергали принудительному содержанию в атмосфере табачного дыма при использовании 4-х сигарет с фильтром, содержащих по 13 мг смол и 1 мг никотина на объем 72 дм3 в течение 20-ти минут.

Схема установки для принудительного обкуривания животных табачным дымом

Рис. 1. Схема оригинального устройства для принудительного обкуривания животных табачным дымом. Условные обозначения: А. Б - камеры для содержания крыс в атмосфере табачного дыма; В - камера для содержания крыс в условиях атмосферного воздуха в отсутствии табачного дыма; 1 - герметичное устройство «револьверного типа» для последовательного использования сигарет; 2 - ручка для перемещения сигареты в исходную позицию для «прикуривания» (7); 3 - компрессор для подачи атмосферного воздуха в устройство и его прокачивания вместе с табачным дымом через зажженную сигарету в камеры А и Б; 4 - сигарета; 5 - электрический выключатель для процесса «прикуривания» сигареты; 6 - электрическая сеть; 7 - спираль, нагревающаяся под действием электрического тока; 8 - вентиляторы для равномерного распределения атмосферы с табачным дымом или без него; 9 - трубка для поступления дыма в камеры.

Методическое обеспечение исследований по оценке генотоксических и репротоксических эффектов

Эксперименты по оценке генетической токсичности выполняли в соответствии

с методическими рекомендациями (Дурнев А. Д., Жанатаев А. К., Анисина Е. А. и со-авт., 2006) методом гель-электрофореза изолированных клеток в щелочной версии (метод «ДНК-комет») на 13-й день беременности с использованием универсальной и легкоплавкой агарозы, напряженности поля lV/cm, силы тока~300тА, красителя SYBR Green I. Методика проведения исследования включала приготовление гель-слайдов, получение микропрепаратов плаценты и эмбриональных тканей (голова и туловище), лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию, фиксацию, окрашивание с последующим микроскопическим анализом. Регистрировали % ДНК в хвосте кометы и количество апоптотических ДНК-комет. Анализировали не менее 100 ДНК-комет от каждого образца плаценты, головы и туловища эмбриона.

Общие принципы и методы анализа репродуктивной токсичности, включающие исследование пре- и постнатального развития потомства, выполняли в соответствии с требованиями методических рекомендаций, посвященных оценке тератогенной активности фармакологических веществ (Смольникова Н. М. и соавт., 2005). Эмбрио-токсическое действие оценивали на 20-й день беременности. При вскрытии и осмотре репродуктивных органов самок регистрировали количество желтых тел, мест имплантации, число живых, мертвых и резорбированных плодов. В ходе осмотра и оценки плодов отмечали наличие аномалий развития, вес, пол и кранио-каудальный размер. Одну часть плодов фиксировали в жидкости Буэна с целью определения аномалий развития и состояния внутренних органов методом серийных срезов через плод (Ды-бан А. П., 1967), другую - в 96 0 этиловом спирте с последующим изучением формирования соединительной ткани и подсчетом точек окостенения и костей скелета (Peters Р., 1977).

В период постнатального развития у потомства регистрировали динамику массы (5-й, 15-й, 30-й, 45-й и 60-й дни жизни), становление безусловных рефлексов: «переворачивания на плоскости» и «избегания края», и двигательной активности в тесте «горизонтальная веревочка» (5-й день жизни), условно-рефлекторной деятельности на модели формирования пищедобывателыюго навыка в «Т-образном» лабиринте (60 -65-й дни жизни), избегание стресс-ситуации с помощью установки «экстраполяцион-ное избавление» (70-й день жизни). Все показатели фиксировали отдельно для самцов и самок.

Технические детали экспериментов изложены в диссертационной работе.

Статистическую обработку результатов исследования генетической и репродуктивной токсичности проводили с использованием параметрического t-критерия Стью-дента, непараметрического критерия Манна-Уитни, Вилкоксона, Пирсона (критерий X2), «вероятностный калькулятор», метода кластерного анализа (метод k-средних Мак-Куина); нормальность распределения проверяли при помощи критерия Шапиро-Уилкса.

Таблица 1

Алгоритмы исследования влияния афобазола на генотоксические и репротоксические эффекты табачного дыма

Группа Периоды развития потомства крыс, условия обработки Выполненные исследования

Пренагпальный (с 1-го по 20-й дни беременности} Постнатапьный (с 1-го по 20-й дни жизни) Генотоксич- ностъ Эмбриоток-сичность Постнатачъ-ное развитие

Контроль Атмосферный воздух Вода дистиллированная (per os) + + +

I ТД Вода дистиллированная (per os) + + +

2 ТД Афобазол, крысята; 1-10 мг/кг (через материнское молоко), самки: 200 мг/кг (самки-рег os) - - +

3 ТД, Афобазол, 1 мг/кг (per os) Афобазол, крысята: 1-10 мг/кг (через материнское молоко), самки: 200 мг/кг (самки-рег os) + + +

ТД, Афобазол, 10 мг/кг (per os) Афобазол, крысята: 1-10 мг/кг (через материнское молоко), самки: 200 мг/кг (самки-рег os) + + +

S ТД, Афобазол, I мг/кг (per os) - - - +

6 ТД, Афобазол, 10 мг/кг (per os) - - - +

Примечание: ТД - табачный дым; 1 - б - номера экспериментальных групп.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Генотоксические и репротоксические эффекты табачного дыма

Использование табачного дыма от 4-х сигарет с фильтром, содержащих по 13 мг смол и 1 мг никотина и 20-минутного срока экспозиции в пластиковых камерах объемом 72 дм3, явилось необходимым и достаточным условием выполнения экспериментальной модели «пассивного курения», при котором были получены следующие

результаты (табл. 2).

Таблица 2

Генотоксическое и репротоксическое действие табачного дыма

Этап исследования Регистрируемые параметры Значимые различия по сравнению с контролем (Р<0,05)

ДНК-повреждающее действие ДНК-повреждения (%): плацента, голова, туловище эмбриона Апоптотические ДНК-кометы (%): плацента, голова, туловище эмбриона Увеличение ДНК-повреждений в 6,8, 4,2 и 3,4 раза в плаценте, голове и туловище эмбрионов, соответственно. Увеличение уровня алоптотических ДНК-комет в 7,3,9,9 и 6,2 раза в плаценте, голове и туловище эмбрионов, соответственно.

Пренатапьное развитие Прирост массы тела беременных крыс Снижение прироста массы в интервалах с 1-7,14-20, 1-20 дни беременности.

Внешний макроскопический осмотр Снижение кранио-каудальных размеров и массы, появление мертвых плодов, увеличение числа сосудистых реакций кожных покровов плодов (гематомы и кровоизлияния).

Состояние внутренних органов Расширение боковых и среднего желудочка мозга, почечных лоханок у плодов.

Формирование костной и хрящевой ткани Уменьшение/отсутствие точек окостенения в области пястны, плюсны, грудины н позвонков, расширение родничков и мозговых швов в краниальной области, ретардация/отсутствие затылочных костей. Диспластические изменения хрящевой ткани в области левой и правой пястны у 18% и 14,1 %, в области левой и правой шносны - у 20,5 и 23.1 % плодов, соответственно.

Таблица 2. Продолжение

Самцы Сачки

3 I Сенсорно-двигательные рефлексы, становление двигательной активности Снижение формирования рефлекса «избегания края», «переворачивания на плоскости», времени удерживания на «горизонтальной веревочке», % крысят, удерживающихся на канате передними лапами. Снижение формирования рефлекса «избегание края».

Динамика массы тела Снижение массы тела на 5, 15,30,45 и 60-м днях жизни. Снижение массы тела на 5, 15,30,45 и 60-м днях жизни.

1 I Формирование пищедобывательного навыка в «Т-образном» лабиринте Снижение/угнетение формирования условно-рефлекторной деятельности: пассивно-стрессовые реакции на новизну обстановки, отказ от обучения, двигательная заторможенность.

Адаптивное поведение в тесте «Эхст-раполяционное избавление» Снижение числа животных, принявших адекватное решение в стресс-ситуации, увеличение латентного времени подныривания под край цилиндра и количества дефекаций Увеличение латентного времени подныривания под край цилиндра и количества дефекаций

Данные по изучению пренатального развития крыс, приведенные в таблице 2,

согласуются с немногочисленными результатами независимых наблюдений (Nelson Е., Goubet-Wiemers С., Guo Y., 1999; Nelson Е., Jodscheit К., Guo Y., 1999; J. Huang, M. Okuka, M. McLean, 2009). Однако в отличие от цитированных авторов в настоящей работе дополнительно наблюдалось увеличение числа сосудистых реакций кожи, появление отдельных аномалий развития внутренних органов и дисплазии хрящевой ткани, а также значимое расширение родничков, мозговых швов, ретардация или отсутствие затылочной кости в краниальной области.

Влияние афобазола на генотоксические и репротоксические эффекты табачного дыма

Введение самкам крыс афобазола в дозе 1 мг/кг значимо снижало индуцируемые табачным дымом ДНК-повреждения в плаценте и в клетках головы и туловища эмбрионов. При этом «% ДНК в хвосте» в эмбриональных тканях снизился до значений негативного контроля: в клетках головы эмбриона - 3,7±0,7 по сравнению с 2,8±0,6 в контроле; в клетках туловища - 4,1±1,0 по сравнению с 3,6±0,9 в контроле. В

клетках плаценты ДНК-повреждения, индуцируемые табачным дымом, значимо снизились под действием афобазола в 2,9 раза (табл. 3).

При использовании афобазола в дозе 10 мг/кг также выявлено значимое снижение ДНК-повреждений, вызываемых воздействием табачного дыма. В клетках плаценты показатель «% ДНК в хвосте» снизился с 14,9±2,9 до б,8±0,4, в клетках головы и туловища эмбрионов - с 11,6±0,9 до 5,2±0,7% и с 12,4±1,5 до б,б±0,6%, соответственно (табл. 3).

Таблица 3

Влияние афобазола на ДНК-повреждающие эффекты табачного дыма _ в клетках плаценты и эмбрионов крыс_

Группа П/П1 % ДНК в хвосте комггы % ипоптотических ДНК-комет

Плацента Голова Туловище Плацента Голова Туловище

Контроль 5/20 2,2±0,2" 2,8±0,6- 3,6±0,9" 3,0±0,2" 1,1 ±0,2« 1,9±0,8-

ЦФА, 20 мг/кг 4/16 23,7±3,1* 16,0±3,8' 40,3±3,4» 8,5±3,6*

ТД 5/20 14,9±2,9* 1!,б±0,9* 12,4±!,5* 21,8±6,4» 10,9±3,0* 11,7±3,3*

ТД + АФ, 1 мг/кг 5/20 5,2±0,7- 3,7±0,7" 4,|±1,0- 3,4±0,9- 0,6±0,3- 1,5±0,5-

ТД+ АФ, 10 мг/кг 5/20 6,8±0,4- 5,2±0,7- 6,6±0,6- 6,9±3,2- 1,3±0,б- 2,7±0,5-

Примечание. ЦФА - цикзофосфамид, АФ - афобазол; п/гц - количество животных /эмбрионов. р<0,001 по сравнению * с контролем , * с контролем (при сравнении с усредненным показателем для головы и туловтца эмбриона), " с эффектаи ТД.

При воздействии табачного дыма на самок крыс, получавших афобазол в дозе 1 мг/кг, доля апоптотических ДНК-комет в клетках плаценты, головы и туловища эмбриона составила 3,4±0,9%, 0,6±0,3% и 1,5±0,5%, соответственно. Сопоставление полученных показателей с контрольными данными не выявило между ними статистически значимых различий, что свидетельствует о снижении апоптотических ДНК-комет до уровня негативного контроля. В свою очередь, контрольные данные согласуются с результатами, установленными в предшествующих исследованиях (Шредер О.В. и соаэт., 2008).

При использовании афобазола в дозе 10 мг/кг также выявлено снижение индуцируемых табачным дымом апоптотических ДНК-комет. При этом в клетках плаценты процент апоптотических ДНК-комет снизился более чем в 3 раза. В клетках головы и туловища эмбриона вновь выявлено снижение значений оцениваемого показателя до негативного контроля (табл. 3).

Афобазол не оказал какого-либо влияния на изменения приросты массы тела обкуриваемых беременных животных. При этом на фоне его введения не наблюдалось характерного негативного влияния табачного дыма на размеры плодов, также не было зарегистрировано мертвых плодов (табл. 4).

Таблица 4

Влияние афобазола на эмбриональное развитие плодов крыс, подвергнутых

воздействию табачного дыма

Группа Число желты* тел на 1 самку Число мест имплантации на 1 самку Число живых ПЛОДОВ, абс, знач. Постим-плантационная гибель,% Средняя масса плодов, г Средний размер плодов, см Вес плаценты, г Мертвые плоды, %

Контроль 13,8±0,4 12,7±0,4 145 4,2 2,4*0,1 3,1±0,02- 0,6±0,02 0

ТД 14,7±0,4 11,6±0,8 137 11 2,2+0,04 2,9±0,02* 0,6±0,02 2,2

ТД+АФ, 1 мг/кг 12,9±0,4 11,5±0,6 138 7.6 2,3±0,03 3,1±0.01- 0,6±0,01 0

ТД+АФ, 10 мг/кг 15,0±0,4* 12,6±0,2 132 5,1 2,2±0,|* 3,1±0,02> 0,6±0,02 0

Примечание. Здесь и далее в таблицах 5,6,1,9: п- количество животных в группе, р<0,05 по сравнению * с контролем, ш с эффектам ТД.

В группах животных, обработанных афобазолом в дозах 1 и 10 мг/кг, количество плодов с гиперемией не отличалось ни от контрольных значений, ни от значений в группе животных, подвергнутых обкуриванию. В свою очередь, количество плодов с гематомами или с кровоизлияниями при действии табачного дыма, под влиянием афо-

базола в дозе 1 и 10 мг/кг было значимо редуцировано (табл. 5).

Таблица 5

_Данные внешнего макроскопического осмотра плодов_

Группа Количество исследованных плодов, абс. знач. Гиперемия плода, % Гематомы, % Кровоизлияния,%

Контроль 145 13,1 5,5- 26,2>

ТД 137 14,6 18,3* 44,5*

ТД+АФ, 1 мг/кг 138 13,8 5,1" 5,8*'

ТД+АФ, 10 мг/кг 132 14,4 3,0- 9,9*-

Сравнение результатов, полученных при использовании афобазола, с данными,

наблюдаемыми в группе животных, подвергнутых воздействию табачного дыма per se, выявило значимое уменьшение числа плодов с расширениями боковых желудочков мозга у животных, получавших препарат в дозе 1 мг/кг. Остальные показатели не имели значимых различий.

Введение афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг беременным самкам крыс привело к значимому снижению ретардадионного действия табачного дыма в отношении развития костной системы плодов (табл. 6).

Достоверное снижение количества плодов с диспластическими изменениями в области пястны и плюсны отмечено под действием афобазола в дозе 10 мг/кг; у плодов от самок крыс, обработанных афобазолом в дозе 1 мг/кг, не обнаружено данной патологии, что совпадает с данными, наблюдаемыми в контрольной группе (табл. 6),

Таблица 6

Влияние афобазола на формирование костной и хрящевой системы плодов крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма

Регистрируемые показатели, явс. знач./% Контроль тд ТД + АФ1 мг/кт ТД + АФ10 мг/кг

Количество исследованных плодов, абс.знач. 76 93 74 75

Правая пястна (число точек окостенения) 3,00*0,02- 2,46 ±0,09* 2,86 ±0,05*- 2,65 ±0,08*

Левая пястна (число точек окостенения) 3,00 ±0,01 ■ 2,47 ±0,09* 2,88*0,04*- 2,65 ± 0,07*

Правые тазовые кости (число точек окостенения) 3,00- 2,80 ±0,05* 2,91 ±0,03* 2,80 ±0,05*

Левые тазовые костя (число точек окостенения) 3,00- 2,77 ±0,05* 2,92 ±0,03*- 2,85 ± 0,05*

Правая плюсна (число точек окостенения) 3,21 ±0,05- 2,68*0,08* 3,12 ± 0,06- 2,87*0,08*

Левая плюсна (число точек окостенения) 3,21 ± 0,05- 2,71 ±0,08* 3,15*0,06- 2,88 ± 0,08*

Грудина (число точек окостенения) 3,58 ±0,07- 1,69±0,15* 2,93* 0,12*- 2,37± 0,15*-

Гипоплазия 13-го ребра 0,03 ± 0,02- 0,63 ± 0,05* 0,12*0,04*- 0,47 ±0,06*"

Количество позвонков 31,62 ±0,08- 29,11 ±0,13* 30,92 ±0,12*- 30,12±0,15*<

Расширение переднего родничка, % » 86,0* 16,2*- 40,0*-

Расширение мозговых швов, % 1> 88,2* 23,0*' 57,3*-

Ретардация затылочной кости, % 0« 68,8* 17,8*' 42,7*-

Отсутствие затылочной кости, % 0- 15,1* 1,4- 10,7*

Аномальное разрастание хрящевой ткани

Количество исследованных плодов, абс. знач. 61 78 59 60

Верхняя правая пястна, % 0" . 14,1* 0- 0-

Верхняя левая пястна, % 0- 18,0' 0. 0-

Верхняя правая плюсна, % 0- 23,1» 0* 1,7"

Верхняя левая плюсна, % 0- 20,5* о. 6.7*

Формирование рефлекса «избегания края» было достоверно снижено у крысят обоего пола всех подопытных групп, получавших афобазол. Однако и у самцов и у

самок отмечалось сходное с контрольной группой становление рефлекса «переворачивания на плоскости» под действием препарата.

Использование афобазола привело к увеличению числа крысят, удерживающихся на «горизонтальной веревочке», и времени удерживания во всех трех группах, однако лишь в группе 4 эти результаты были статистически значимы. При исследовании становления двигательной активности у самок всех подопытных групп не было выявлено существенных различий (табл. 7).

Таблица 7

Влияние афобазола на формирование сенсорно-двигательных рефлексов и становление двигательной активности у потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма в период антенатального развития

Группа п Регистрируемые показатели оценки становления рефлексов Тест «Горизонтальная веревочка»

«Избегание края»,% «Переворачивание на плоскости», % Время удерживания, сек (M±SD) % крысят, удерживающихся передними лапами

Контроль 27 100- 100- 8,б±],4" 100-

ТД+дист. вода(1 группа) 30 73* 80* 4,3±0,8* 83*

| ТД+постнаг. леч., АФ 200 мг/кг (2 группа) 37 81* 95 7,0±1,6 95

ТД+АФ, 1 мг/кг+постнат. леч., АФ 200 мг/кг (3 группа) 25 84* 100- 7,2± 1.8 96

ТД+АФ, 10 мг/кг+посгнат. леч., АФ 200 мг/кг (4 группа) 28 75* 100- 7,б±|,4- 89

Контроль 26 100- 100 8,5±|,6 100

ТД+дист. вода (1 группа) 32 81* 91 5,4±1,2 97

i ТД+постнат. леч., АФ 200 мг/кг (2 группа) 23 74* 100 5,5±2,8 87

ö ТД+АФ, 1 мг/кг+лостнат. леч., АФ 200 мг/кг (3 группа) 31 74* 100 7,5±!,7 94

ТД+АФ, 10 мг/кг+постнат. лет., АФ 200 мг/кг (4 группа) 32 81* 97 10,4±2,3 94

У всех животных, получавших афобазол, по сравнению с группой крыс, подвергнутых антенатальному воздействию табачного дым, было выявлено повышение исследовательской активности, ускорение адаптации в условиях незнакомой среды и формирования пищедобывательного навыка. Динамика обучаемости крыс этих групп практически не отличалась от таковой у контрольных животных (табл. 8).

Таблица 8

Влияние афобазола на способность к обучению у животных, подвергнутых пренатальному воздействию табачного дыма

Группа Фактор САМКИ (Медиана (25%-75 %)) САМЦЫ (Медиана (25%-75%))

Контроль п<?=10 п?=12 Дни 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

время 83 (2,0-17,0) 2,8'-(1,4-7,9) М'* (1,3-3,2) 1,7 (13-3,9) 1,6'■ 03-2,8) 13,7 (4,4-26,5) 3,1'■ (1,6-13,5) 1.7 (1,4-43) 1,7 '■ (12-3,7) 1,4 (1,1-2,1)

ошибки и (1,0-2,0) 1,0 (0,5-2,0) 1,0 (0,0-1,5) 1,0 (1,0-1,0) 1,0 (0,0-1,5) 1,5' (1,0-2,0) 1,5 (1,0-2,0) 1,0 (0,0-2,0) 1,0' (0,0-1,0) 1,0'. (0,0-1,0)

пиша 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0 ■ (5,0-5,0) 5,0" (5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0* (5,0-5,0) 5,0 » (5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0* (5,0-5,0)

ТД+вода дисг. п<3=10 время 300,0* (147,6-300,0) 300,0 • (300,0-300,0) 300,0* (300,0-300,0) 300,0* (44,9-300,0) 300,0 * (13,0-300,0) 300,0'* (123,2-300,0) 300,0 * (300,0-300,0) 300,0* (300,0-300,0) 300,0* (45,3-300,0) 48,7 '* (16,0-300,0)

ошибки 2,0 (0,0-3,0) 2,0 (0,0-3,0) 1,0 (0.0-4,0) 2,5 (0,0-4,0) 1,0 (0,0-2,0) 1,0 (1,0-2,0) 0,5 (0,0-1,0) 0,0 (0,0-1,0) 1,0 (0,0-2,0) 2,0« (1,0-3,0)

пиша 0,0* (0,0-4,0) 0,0* (0,0-0,«) 0,0* (0.0-1,0) 1,5* (0,0-4,0) 2,0* (0,0-5.0) 1,0* (0,0-2,0) 0,0* (0,0-0,0) 0,0'* (0,0-0,0) 0,0* (0,0-4,0) 3,5* (1,0-5,0)

ТД+АФ, 200 игЛсг п/н 4(3-11 п?=11 время 3,6 >■ (2,5-8,9) 2,1 '■ (1,7-3,3) 1,7'-(1,1-2,4) 1,9'■ (1,3-2,9) 1.4 (1,1-2,4) 2,6 '*■ (1,7-5,5) 2,1-(1,4-3,6) 3,5 '*• (2,1-15,2) 1,6'. 0,2-2,7) 1,4'-(1,2-2,4)

ошибки 2,0 (0,0-4,0) 1,0 (0,0-1,0) 0,0' (0,0-1,0) 1,0 (0,0-1,0) 1,0 (0,0-1,0) 1.0 ! (1,0-2,0) 1,0 (1,0-2,0) 1,0 (0,0-2,0) 1,0 (0,0-1,0) 0,0 1 -(0,0-1,0)

пиша 5,0-(5,0-5,0) 5,0« (5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0* (5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0)

ТД+АФ, 1 мг/кгь АФ200 мг/кг п/н п<?=10 п9=10 время 5,3 5-(1,8-12,4) 2,1 (1,4-2,9) 1,8'-(1,1-33) 1,3'-(1,0-23) 1,1'* (0,9-1,8) 2,7 (13-ЮД) 1,9" (1,2-6,2) 2,0'-(1,1-4,1) 1,5 (1,0-2,7) и'- (0,9-1,8)

ошибки 1.3 5 (1,0-2,0) 1.0 (0.0-1,0) 0,5 (0,0-1,0) 0,0 (0,0-1,0) 0,0 1 (0,0-1,0) 1,05 (1,0-2,0) 1.0 (1,0-2,0) 1,0 (1,0-2,0) 1,0 (1,0-1,0) 0,0 (0,0-1,0)

пиша 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5.0-5.0) 5,0-(5.0-5,0) 5.0-(5,0-5.0) 5,0-(5,0-5.0) 5,0-(5,0-5.0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5.0-5,0) 5,0" (5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0)

ТД+АФ, 10 мг/кг+ АФ200 мг/кг п/н 1к5=12 п2=11 время 4.6 (2,0-9.5) 2,5 (1.6-4,5) 2,5'-(1.4-5,5) 1,7 '■ (1,2-2.6) 1,5 (1,2-2,4) 6,2 (1,5-17.8) 3,0 (1,7-6,6) 2.7'. (1.8-5,4) 2,0'-(1-2-3.4) 1,6'-(1.1-3.6)

ошибки 1,05 (1,0-2,0) 1,0 (1,0-2,0) 1,0 (0,0-2,0) 0,0 й (0,0-1,0) 0,0' (0,0-1,0) 1,0 (0,5-2,0) 1,0 (1,0-2,0) 1,0 (0,5-1,5) 1,0 (0,5-1,0) 03 (0,0-1,5)

пиша 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0 > (5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0 > (5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0« (5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0) 5,0-(5,0-5,0)

Здесь и в табл. 10: статистически значимые различия (Р < 0,05) * по сравнению с контролем; ■ с эффектом табачного дыма; по сравнению с I днем тестирова-

ния; ' по сравнению с 5 днем тестирования, п - количество животных в группе.

На фоне введения афобазола во всех группах увеличилось число животных, принявших адекватное решение в тесте «экстраполяционное избавление», независимо от половой принадлежности. Достоверное снижение латентного времени поднырива-ния под край цилиндра, а также количества дефекаций было отмечено у самцов 4 группы (Афобазол, 10 мг/кг, 200 мг/кг) и самок 2 группы (Афобазол, 200 мг/кг) и 3 группы (Афобазол, 1 мг/кг, 200 мг/кг).

Можно заключить, что введение афобазола самкам крыс в дозах 1 и 10 мг/кг на протяжении всего периода пренатального развития потомства, а в дозе 200 мг/кг в течение вскармливания, также нормализует становление безусловных рефлексов и условно-рефлекторной деятельности крысят, нарушенных в результате антенатального воздействия табачного дыма.

В независимой серии экспериментов проведена оценка влияния афобазола, который беременные крысы получали с 1-го по 20-й дни беременности в дозах 1 и 10 мг/кг, на показатели постнатального развития потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма в период эмбрионального развития.

В ходе оценки параметров становления рефлексов, регистрируемых на 5-м дне жизни, влияние табачного дыма проявилось в снижении количества крысят-самцов и крысят-самок, воспроизводивших рефлексы «переворачивания на плоскости» и «избегания края», причем в последнем тесте результаты были статистически значимы. У потомства крыс от самок, получавших афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг, регистрируемые параметры формирования рефлексов не отличались от контрольных значений.

В результате оценки становления двигательной активности потомства, подвергнутого антенатальному воздействию табачного дыма, при помощи теста «Горизонтальная веревочка» наблюдалось снижение числа крысят (самцов и самок), удерживающихся передними лапами на канате (Р<0,05). При использовании афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг в период пренатального развития данный показатель не отличался от контрольного (табл. 9).

Таблица 9

Влияние афобазола на формирование сенсорно-двигательных рефлексов и становление двигательной активности у потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма в период антенатального развития

Группа п Регистрируемые показатели оценки становления рефлексов Тест «Горизонтальная веревочка»

«Избегание края», % «Переворачивание на плоскости», % Время удерживания, сек, Медиана (2594-75%» % крысят, удерживающихся передними лапами

Самцы Контроль 22 96- 100 3,0 (2,0-5,0)- 86«

ТД 9 И* 89 1,0 (0,0-2,0)* 44*

ТД + АФ, 1 мг/кг 17 100» 94 4,0 (3,0-6,0)" 100-

ТД + АФ, 10 мг/кг 19 68*» 95 2,0(1,0-3,0) 90-

Самки | Контроль 19 100- 100 2,0(1,0-4,0) 95«

ТД 9 56* 89 1,0 (0,0-3,0) 67*

ТД + АФ, 1 мг/кг 28 100- 96 3,0 (2,5-4,5) 96-

ТД + АФ, 10 мг/кг 26 85 92 2,0(1,0-3,0) 93-

Под воздействием табачного дыма у потомства крыс обоего пола наблюдалась двигательная заторможенность и отказ от обучения по нахождению пищевого подкрепления в условиях свободного выбора. Афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг ускорял адаптацию животных в условиях незнакомой среды и целенаправленное воспроизведение крысами когнитивной задачи, а также снижал время достижения пищевого подкрепления. Таким образом, данные группы животных практически не отличались от контрольных по всем регистрируемым параметрам (табл. 10).

Таблица 10

Влияние афобазола на способность к обучению у животных, подвергнутых пренатальному воздействию табачного дыма

Группа Фактор САМКИ (Медиана (25%-75%)) САМЦЫ (Медиана (25%-75%))

Дни 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Контроль время 21,0 >" 10,6'• 8,9'" 5Д'" 3,9 43,0'- 23,5 II,8'" 11,6'■

(10,1-56,4) (7,4-18,3) (5.1-14.0) (3.3-9,8) (3,1-6,4) (17,7-107,7) (8,9-63,5) (6,5-30,9) (53-22^) (3,6-11,4)

п<?=12 ошибки 2,0' 1,0 1,0' 1,0 1,0' 2,0' 1,0 1,0' 1,0 1.0'-

п?=10 (2,0-3,0) (1,0-2,0) (1,0-2.0) (1,0-2,0) (0,0-1,0) (1,0-2,0) (0,5-1,5) (1,0-2,0) (1,0-2,0) (1,0-1,0)

пища 5,0- 5,0- 5,0- 5,0" 5,0" 5,0 '■ 5,0- 5,0" 5,0'" 5.01"

(5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (4,0-5,0) (4,5-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0)

тд время 300,0 * 300,0 * 300.0 * 300,0* 300,0* 300,0* 300,0 * 300,0* 300,0* 169,6 •

(120,9-300,0) (300,0-300,0) (65,0-300,0) (300,0-300,0) (33,6-300,0) (131,8-300,0) (100,5-300,0) (42,5-300,0) (36,3-300,0) (27,9-300,0)

ошибки 0,5 0,0 0,0 0,0 1,0 0,5 2.0 2,0 0,5 2,0*

п?=6 (0,0-2,0) (0,0-1,0) (0,0-2,0) (0,0-2,0) (0,0-2,0) (0,0-4,0) (0,0-4,0) (0,0-3,0) (0,0-3,0) (2,0-3,0)

пиша 0,5* 0,0* 0,0* 0,0» 1,5* 1,5* 0,0 * 2,0* 0,0* 2,5*

(0,0-3,0) (0,0-1,0) (0,0-4,0) (0,0-2,0) (0,0-5,0) (0,0-3,0) (0,0-5,0) (0,0-5,0) (0,0-5,0) (0,0-5,0)

ТД+АФ, время 9,0 '*■ 7,4'> 6,5 5,2'- 5,0'- 30,3'" 16,2 '• 12,8'" 8,2'- 6,6

1 иг/кг (4,9-28,7) (3,5-18,3) (3,7-10,6) (2,9-8,6) (2.8-6,8) (14,6-65,4) (6,1-29,0) (6,3-25.8) (4,4-21.5) (4.1-12,9)

ошибки 1,0 1,5 1,0 0,5 1,0 2,0' 1.5 2,0 1,0 1,0'■

11,3=12 (1,0-2,0) (0,0-2,0) (0,0-2.0) (0,0-и) (0.0-2.0) (1,0-2,0) (0.0-2.5) (0.5-2,5) (0,0-2,0) (0.0-2,0)

п?=12 пиша 5,0- 5.0" 5.0" 5,0- 5,0" 5,0" 5.0- 5,0- 5,0- 5,0-

(5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5.0) (4,5-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0)

ТД+АФ, время 24,95 ■ 12,6'- 8.8 6,8'" 5,6'" 56,7'- 26,0- 24,8 21,9'• 12Д'"

10 мг/кг (13,2-61,8) (5,5-23,9) (5,4-17,1) (4,2-16,4) (3,9-11,6) (21,5-114,0) (14,0-73,7) (8,8-94,9) (5,8-43,4) (5,6-28,0)

ошибки ' 3,0 ! 2,0 1 2,0' 1,0' 1,0' 2,0' 2,0 2,0 1,5 1,0'

п<3»8 (2,0-4,0) (1,0-3,0) (1,0-3,0) (1,0-3,0) (1,0-2,0) (2,0-3,5) (1,5-3,0) (1,0-2,0) (1,0-2,0) (0,5-2,0)

п?«11 пиша 5,0 ■ 5,0" 5,0" 5,0- 5,0" 4,5 • 5,0- 5,0 5,0 5,0-

(4,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (5,0-5,0) (3,5-5,0) (3,5-5,0) (3,0-5,0) (5,0-5,0) (4,5-5,0)

Способность табачного дыма нарушать формирование безусловных рефлексов и условно-рефлекторной деятельности крысят была подтверждена в независимой серии экспериментов. Афобазол, также как в предшествующей серии, устранял и/или

снижал неблагоприятные эффекты табачного дыма.

* *

*

Результаты проведенного комплексного исследования указывают на способность табачного дыма повреждать ДНК в тканях эмбрионов и плаценты, вызывать нарушения пре- и постнатального развития крысят, проявляющиеся увеличением пост-имплантационной гибели эмбрионов, уменьшением кранио-каудальных размеров и массы плодов, увеличением числа сосудистых реакций кожи, появлением аномалий внутренних органов и диспластических изменений соединительной ткани, замедлением оссификации костей скелета, формирования сенсорно-двигательных рефлексов и условно-рефлекторной деятельности у потомства. Афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг при различных режимах введения эффективно снижает и/или предупреждает генотоксиче-ские и репротоксические эффекты пассивного курения у эмбрионов и новорожденных. Защитный эффект афобазола определяется уникальным спектром его фармакологической активности, обеспечивающим проявление в одном диапазоне дозировок ци-топротекгорной, нейропротекторной, антиоксидантной, антимутагенной и антитератогенной активностей, которые, по мнению М.В. Воронина и С.Б. Середенина (2009) определяются способностью препарата воздействовать на рецепторы мелатонина МТ3 (МЬ2) и О] рецепторы.

Способность анксиолитика афобазола в терапевтических дозах снижать повреждения генетических и эмбриональных структур, индуцированные антенатальным воздействием табачного дыма, открывает перспективы для дальнейшего экспериментального и клинического изучения препарата в качестве возможного средства профилактики и коррекции внутриутробной задержки развития плода и когнитивных нарушений у новорожденных в рамках решения проблемы антенатальной охраны плода при активном и пассивном курении и, возможно, влиянии других патогенных средо-вых факторов.

ВЫВОДЫ

1. Определены необходимые и достаточные условия содержания животных в атмосфере табачного дыма, отвечающие задаче моделирования генотоксических и репро-токсических эффектов «пассивного курения» без увеличения гибели беременных крыс.

2. Воздействие табачного дыма с 1-го по 13-й дни беременности значимо, от 4-х до 10-ти раз, увеличивает поврежденность ДНК в клетках плаценты, головы и туловища эмбрионов крыс.

3. Экспозиция табачным дымом на протяжении беременности снижает прирост массы беременных крыс, оказывает выраженное эмбриотоксическое действие, угнетает формирование сенсорно-двигательных рефлексов и условно-рефлекторной деятельности у потомства.

4. Афобазол в дозах 1 или 10 мг/кг при ежедневном перорадьном введении с 1 -го по 13-й дни беременности значимо снижает или полностью устраняет вызванную табачным дымом поврежденность ДНК в клетках плаценты и эмбрионов крыс.

5. При пренагальном, постнагальном и сочетающим пре- и постнатальное введение режимах обработки афобазол (1 и 10 мг/кг) снижает репродуктивную токсичность и угнетающее действие экспозиции табачным дымом на выработку условных рефлексов.

6. Во всех вариантах экспериментов наблюдаемые протекторные эффекты количественно более выражены при использовании афобазола в дозе 1 мг/кг, которая соответствует максимальной суточной дозе препарата (30-60 мг), рекомендованной на основе клинических исследований.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дурнев, А. Д. Влияние афобазола на генотоксические эффекты табачного дыма в плаценте и тканях эмбрионов крыс [Текст]/ А. Д. Дурнев, А. С. Соломина, А. К. Жа-натаев, В. Н. Жуков, С. Б. Середенин //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149, № 3. - С. 286-289.

2. Шредер, О. В. Модельное исследование распределения афобазола у беременных и кормящих самок крыс и новорожденных крысят [Текст]/ О. В. Шредер, Г. Б. Колы-ванов, А. А. Литвин, Д. В. Бастрыгин, Е. Д. Шредер, А. С. Соломина, А. О. Вигаин-ская, В. В. Забродина, В. П. Жердев, А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин //Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Т. 73, №8. - С. 17-20.

3. Шредер, О. В. Антитерзгогенный и антигенотоксический эффекты афобазола в эксперименте [Текст]/ О. В. Шредер, А. С. Соломина, А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин. //Материалы 4-го международного конгресса по репродуктивной медицине «Проблемы репродукции», 18-21 января, 2010, Москва. -М., 2010. - С.146.

4. Шредер, О. В. Распределение афобазола и его метаболита М-11 в тканях и биологических жидкостях крыс и новорожденных крысят [Текст]/ О. В. Шредер, Е. Д. Шредер, Г. Б. Колыванов, А. А. Литвин, Д. В. Бастрыгин, А. С. Соломина, А. О. Виглин-ская, В. В. Забродина, В. П. Жердев, А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин. //Материалы 4-го международного конгресса по репродуктивной медицине «Проблемы репродукции», 18-21 января, 2010, Москва.-М., 2010. - С.146-147.

5. Соломина, А. С. Исследование генотоксического действия табачного дыма в клетках плаценты и эмбрионов крыс и протекторный эффект афобазола [Текст]/ А. С. Соломина, А. К. Жанатаев, В. Н. Жуков, А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин. //Сборник материалов 17-го Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 12-16 апреля, 2010, Москва. -М., 2010. - С. 720-721.

6. Соломина, А. С. Исследование влияния афобазола на генотоксические и тератогенные эффекты табачного дыма in vivo [Текст]/ А. С. Соломина, С. С. Трофимов, А. К. Жанатаев, А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин. //Материалы 6-го съезда Российского общества медицинских генетиков, 14-18 мая, 2010, Ростов-на-Дону. - Ростов н/Д., 2010. -С. 168.

7. Соломина, А, С. Влияние афобазола на эмбриональное и постнагальное развитие потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма [Текст]/ А. С. Соломина, С. С. Трофимов, А. Д. Дурнев. //Материалы 5-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 1-4 июня, 2010, Московская область. - Экспериментальная и клиническая фармакология, - М,, 2010. -Т.73, №5 (приложение). - С. 82.

8. Solomina, А. S. Afobazole protects offspring of rats exposed to tobacco smoke [Text]/ A. S. Solomina, S. S. Troflmov, A. D. Durnev, S. B. Seredenin. //Abstracts from EEMS-2010, 40ft Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society, 14-18 September, 2010, Oslo. - Norway, Oslo., 2010. - P. 349.

9. Соломина, А. С. Модифицирующее влияние афобазола на генотоксические и репротокеические эффекты табачного дыма у потомства крыс [Текст]/ А. С. Соломина, А. К. Жанатаев, В. Н. Жуков, А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин. //Материалы Пленума Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды и Научного совета по медико-экологическим проблемам здоровья работающих «Научно-методические и законодательные основы обеспечения генетической безопасности факторов и объектов окружающей и производственной среды в целях сохранения здоровья человека», 15-16 декабря, 2010, Москва. - М., 2010. - С. 137-138.

10. Шредер, О. В. Влияние афобазола на когнитивное поведение потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма в период беременности [Текст]/ О. В. Шредер, А. С. Соломина, И. Б. Цорин, С. С. Трофимов, А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 151, № 1. - С. 48-54.

11. Соломина, А. С. Влияние афобазола на эмбриональное развитие потомства у крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма [Текст]/ А. С. Соломина, В. Н. Жуков, А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин //Токсикологический вестник (принята в печать).

Подписано в печать 27.01.2011 г.

Заказ № 177 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 130 шт.

Актуальность проблемы. Вред курения хорошо известен. У курящих повышается вероятность развития рака легких и других злокачественных новообразований, сердечно-сосудистых патологий, хронических респираторных заболеваний [15, 120]. Особо отмечено комплексное неблагоприятное влияние курения на протекание беременности, развитие плода и новорожденных. Курение -одна из причин, приводящих к перинатальной смертности, внутриутробной задержке развития плода, дефициту веса и недоношенности, снижению иммунитета, а также патологических изменений в плаценте [113, 194]. Принципиально, что продукты сгорания табака негативно воздействуют не только на курящих, но также на лиц, подвергающихся пассивному курению [109, 125, 219].

Широкая пропаганда, отрицающая курение, не приводит к желаемому результату, доля курящих практически не уменьшается, а среди женщин детородного возраста увеличивается [14, 15]. От 11 до 36 % женщин не отказывается от пагубной привычки даже во время беременности, что определяет необходимость поиска средств фармакологической коррекции репротоксических эффектов курения [71]. Поэтому целесообразны экспериментальные исследования закономерностей и механизмов негативного воздействия курения на пре- и постнатальное развитие потомства. Однако, работы, посвященные экспериментальной оценке репродуктивной токсичности табачного дыма и разработке корректоров патогенных эффектов курения, в рамках решения проблемы антенатальной охраны плода [1, 8], единичны и недостаточно информативны [76].

В качестве базовой мишени при поиске фармакологических корректоров эффектов курения возможно рассматривать генотоксические поражения, которые, по мнению многих авторов [78, 98, 142, 195, 206], играют ведущую роль в формировании негативных последствий активного и пассивного курения, в том числе, у беременных. Эта гипотеза вытекает из данных о генотоксических эффектах продуктов сгорания табака в соматических клетках [79, 119]. Сведения о генотоксическом влиянии курения непосредственно на эмбриональные ткани 6 крайне ограничены [124, 230, 231]. До настоящего времени отсутствуют работы, характеризующие поврежденность ДНК в эмбриональных тканях методом «ДНК-комет», признанным в качестве наиболее значимого для регистрации повреждений ДНК [209].

Индукция генотоксических поражений может быть снижена под влиянием антимутагенов различной природы, их спектр довольно широк [83]. Среди них особое внимание привлекает афобазол, разработанный в НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН. Афобазол, помимо основной анксиолитической активности, обладает нейропротекторным, антиоксидантным, цитопротекторным, антимутагенным и антитератогенным эффектами [17, 33]. Уникальный спектр фармакологической активности определил перспективу исследования влияния афобазола на репродуктивную и генетическую токсичность табачного дыма в эксперименте.

Цель исследования. Комплексное исследование влияния афобазола на поврежденность ДНК в клетках плаценты и эмбрионов, антенатальное и постнатальное развитие потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма.

Основные задачи исследования.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать воздействие табачного дыма на поврежденность ДНК в плаценте и эмбриональных тканях, антенатальное и постнатальное развитие потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма.

2) Оценить влияние афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг при ежедневном пероральном с 1-го по 13-й дни беременности на индукцию табачным дымом повреждений ДНК методом «ДНК-комет» в плаценте и эмбрионах крыс.

3) Исследовать влияние афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг при ежедневном пероральном введении на протяжении всего периода беременности на проявления репродуктивной токсичности у потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма.

4) Оценить действие афобазола на формирование условных рефлексов у потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма в период беременности, с помощью поведенческого теста «Т-образный лабиринт».

5) Провести сопоставление данных, полученных при исследовании влияния афобазола на потомство «курящих» крыс при пероральном пренатальном, постнатальном и сочетающим пре- и постнатальное введение режимах обработки препаратом.

Научная новизна. Предложена и охарактеризована экспериментальная модель «пассивного курения», выявляющая негативное влияние табачного дыма на антенатальное и постнатальное развитие крысят. Методом «ДНК-комет» впервые охарактеризовано генотоксическое действие табачного дыма в эмбриональных тканях и плаценте, показано увеличение поврежденности ДНК в клетках плаценты и эмбрионов. Впервые установлена принципиальная возможность уменьшения генотоксических и репротоксических эффектов табачного дыма в клетках эмбрионов и плаценте с помощью афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг при пренатальном, постнатальном и сочетающим пре- и постнатальное введение режимах обработки животных.

Научно-практическая значимость. Результаты экспериментального исследования, демонстрирующие снижение генотоксических и репротоксических эффектов табачного дыма, а также нормализацию становления условно-рефлекторной деятельности у потомства под влиянием анксиолитика афобазола в дозах, соответствующих терапевтическим, определяют перспективу его клинического изучения в качестве возможного средства профилактики и коррекции нежелательных эффектов табачного дыма при активном и пассивном курении беременных в рамках решения проблемы антенатальной охраны плода.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

5. ВЫВОДЫ

1. Определены необходимые и достаточные условия содержания животных в атмосфере табачного дыма, отвечающие задаче моделирования генотоксических и репротоксических эффектов «пассивного курения» без увеличения гибели беременных крыс.

2. Воздействие табачного дыма с 1-го по 13-й дни беременности значимо, от 4-х до 10-ти раз, увеличивает поврежденность ДНК в клетках плаценты, головы и туловища эмбрионов крыс.

3. Экспозиция табачным дымом на протяжении беременности снижает прирост массы беременных крыс, оказывает выраженное эмбриотоксическое действие, угнетает формирование сенсорно-двигательных рефлексов и условно-рефлекторной деятельности у потомства.

4. Афобазол в дозах 1 или 10 мг/кг при ежедневном пероральном введении с 1-го по 13-й дни беременности значимо снижает или полностью устраняет вызванную табачным дымом поврежденность ДНК в клетках плаценты и эмбрионов крыс.

5. При пренатальном, постнатальном и сочетающим пре- и постнатальное введение режимах обработки афобазол (1 и 10 мг/кг) снижает репродуктивную токсичность и угнетающее действие экспозиции табачным дымом на выработку условных рефлексов.

6. Во всех вариантах экспериментов наблюдаемые протекторные эффекты количественно более выражены при использовании афобазола в дозе 1 мг/кг, которая соответствует максимальной суточной дозе препарата (30-60 мг), рекомендованной на основе клинических исследований.