Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Участие малой ГТфазы ARF6 в канцерогенезе

ДИССЕРТАЦИЯ
Участие малой ГТфазы ARF6 в канцерогенезе - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Участие малой ГТфазы ARF6 в канцерогенезе - тема автореферата по медицине
Книжник, Анна Вадимовна Москва 2010 г.
Ученая степень
кандидата биологических наук
ВАК РФ
14.01.12
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Участие малой ГТфазы ARF6 в канцерогенезе

На правах рукописи

КНИЖНИК Анна Вадимовна УЧАСТИЕ МАЛОЙ ГТФАЗЫ А№6 В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ

Специальность 14.01.12-онкология

/

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

004601034

Работа выполнена в Лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза Учреждения Российской академии медицинских наук Российский Онкологический Научный Центр имени Н.Н.Блохкна РАМН (директор - М.И.Давыдов)

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Зборовская Ирина Борисовна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Красильников Михаил Александрович

Доктор биологических наук Крамеров Дмитрий Александрович

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-

на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН

химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «¿£> 2010

года

часов

Автореферат разослан М С^г^е— 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Процесс канцерогенеза представляет огромный интерес для фундаментальной молекулярной биологии и онкологии, поскольку причиной возникновения всех опухолевых заболеваний являются нарушения механизмов регуляции клеточной жизнедеятельности, до сих пор до конца не изученные даже в норме. Одной из наиболее актуальных проблем является идентификация белков, которые участвуют во внутриклеточных сигнальных путях, изменяющихся при прогрессии заболевания. Исследование таких нарушений может в будущем привести к разработке новых мишеней для направленной терапии.

В отношении большинства малых ГТФаз семейства Ras накоплен огромный экспериментальный материал, касающийся их участия в злокачественной трансформации клеток. Однако белок Arfó долго оставался «в тени» более известных G-белков. За последние годы появилось много данных, указывающих на важнейшую роль Arfó в ключевых аспектах жизнедеятельности клетки. Все больше внимания стало уделяться белкам Arf, в частности Arfó, и в аспекте канцерогенеза. Тем не менее, до сих пор опубликованы лишь единичные работы, исследующие участие Arfó в опухолевой прогрессии и метастазировании. Среди возможных механизмов, опосредующих участие Arfó в канцерогенезе, чаще всего рассматриваются Arfó-зависимое изменение цитоскелета и подвижности, а также регуляция эндоцитоза ряда белков и структуры мембраны. Менее понятной и остается роль Arfó в метаболизме липидов и участие этой ГТФазы во внутриклеточных сигнальных путях. Таким образом, исследование механизмов действия Arfó является крайне актуальным для понимания механизмов онкогенеза у человека.

Для изучения влияния Arfó на различные функциональные характеристики трансформированных клеток in vivo, а также на молекулярно-биологические характеристики клеток in vitro, была выбрана клеточная линия HET-SR ранее полученная в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Эта линия представляет собой эмбриональные фибробласты Сирийского хомяка (Mesocricetus auratus Waterh) трансформированные вирусом саркомы Рауса и характеризуется высокой туморогенностью, но низкой спонтанной метастатической активностью (СМА), что делает данную линию удобнг" ---

делью для исследования опухолевой прогрессии и изучения метастазирования in vivo на иммунокомпетентных животных.

Необходимо отметить, что при онкопаталогиях человека исследование экспрессии Arfó проводилось только на уровне мРНК в образцах глиом. Однако в контексте накопленных за последнее время данных на модельных системах о значительной роли Arfó в процессе канцерогенеза представляется чрезвычайно актуальным исследование экспрессии Arfó при других онкопаталогиях, в том числе при таком распространенном заболевании как немелкоклеточный рак легкого (HMPJI).

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является исследование влияния малой ГТФазы Arfó на ключевые биологические свойства трансформированных клеток в культуре in vitro и метастатическую активность in vivo, а также на активацию отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, ассоциированных с опухолевой профессией.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. На основе клеточной линии HET-SR (RSV трансформированные фиброб-ласты хомяка) получить производные линии, стабильно экспрессирующие различные формы белка Arfó: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную, не способную взаимодействовать с PLD.

2. Изучить основные биологические свойства клеток HET-SR, экспресси-рующих различные формы Arfó, в культуре in vitro: скорость пролиферации, подвижность, инвазивность, клоногенность и способность к неприкрепленному росту.

3. Исследовать влияние различных форм Arfó на протеолитическую активность внеклеточных протеиназ ММР 1,2,9 и иРА, активность PLD, а также на статус фосфорилирования основных MAP киназ (ERK1/2, р38 и JNK1) и киназ Akt и S6KI.

4. Получить клеточные линии, экспрессирующие одновременно активные формы белков Ral (RalA и RalB) и белок Arfó как в активной, так и в доминантно-негативной форме.

5. Сравнить уровень спонтанной метастатической активности всех полученных клеточных линий in vivo.

6. Провести анализ экспрессии белков Arfó и RalA в образцах HMPJI человека.

Научная новизна и практическая значимость исследования

Полученные в работе результаты расширяют представления о роли малой ГТФазы Arfó в канцерогенезе. В результате проведенных исследований получены приоритетные данные о влиянии белка Arfó и его основного эффектора — PLD на многие характеристики клеток. В частности, впервые показано наличие сигнального пути Arfó—»PLD—»mTOR—»S6K1, а также Arfó-зависимая стимуляция активности киназы р38. До сегодняшнего времени исследования изменения экспрессии Arfó в человеческих опухолях практически не проводились. Полученные в представленной работе данные об экспрессии Arfó и белка RalA, необходимого для активации основного партнера Arfó — PLD, при HMPJI являются уникальными и одними из первых исследований такого рода.

Работа носит в первую очередь теоретический характер, полученные данные о роли Arfó в опухолевой прогрессии могут быть использованы при дальнейшем изучении участия Arfó как на модельных системах, так и в клинических исследованиях. Перспективным представляется дальнейшее исследование роли Arfó в прогрессии HMPJI. Полученные данные свидетельствуют о возможной роли Arfó в качестве потенциального маркера при комплексной диагностике и поиске мишеней для таргетной терапии HMPJI.

Публикации и апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 18 февраля 2010 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза, молекулярной эндокринологии и механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях «European Small GTPase meeting» в 2007 г. (Умеа, Швеция), «Cancer Degradóme Symposium» в 2008 г. (Лондон, Англия), «Методы культивирования клеток» в 2009 г. (Санкт-Петербург), Beatson international cancer conference "Microenvironment, motility and metastasis" в 2009 г. (Глазго, Шотландия).

По результатам диссертационной работы опубликована 1 научная статья и 9 тезисов докладов.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков, 4 таблицы. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список использованной литературы». Список литературы содержит 127 источников, в том числе 2 в отечественных рецензируемых изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В работе использованы следующие методы исследования: трансформация бактериальных клеток, выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток, электрофорез нуклеиновых кислот, молекулярное клонирование, полимеразная цепная реакция (ПЦР), трансфекция эукариотических клеток, инфицирование клеток ретровирусными векторами, анализ количества мРНК методом ОТ-ПЦР, выделение и анализ белковых фракций с помощью вестерн-блот гибридизации, анализ ферментативной активности PLD и протеиназ внеклеточного матрикса (субстрат-специфическая зимография в ПААГ), анализ динамики роста клеток, анализ «зарастания раны» in vitro (wound healing assay), тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногенность), тест на образование колоний в полужидкой среде, тест на миграцию клеток по градиенту концентраций факторов роста, тест на инвазию in vitro, определение спонтанной метастатической активности (СМА) клеток на лабораторных животных, а также статистическая обработка данных.

Результаты исследования и обсуждение

1. Клеточные линии, использованные в работе

Для изучения влияния Arfó на характеристики трансформированных клеток получена панель стабильных клеточных линий производных HET-SR, экспресси-рующих последовательности Arfó в ретровирусном векторе pLXSN (см. рис. 1). Для проведения данного исследования использовались варианты гена Arfó человека, несущие следующие мутации (таблица I):

Аминокислотная замена Функциональное значение замены

Arfó Q67L (Gin—»Leu) конститутивная связь с ГТФ (конститутивно-активная форма)

Arfó WT дикий тип

Arfó N481 (Asn—>Ile) отсутствие взаимодействия с Р1ЛЭ

Arfó T27N (Thr—>Asn) конститутивная связь с ГДФ (доминантно-негативная форма)

Таким образом, были получены 5 стабильных поликлональных клеточных линий, производных HET-SR:

- HET-SR pLXSN (линия с «пустым» вектором, далее использовавшаяся в качестве контрольной для всех клеточных линий);

- HET-SR Arfó Q67L;

- HET-SR Arfó WT;

- HET-SR Arfó N481;

- HET-SR Arfó T27N.

Полученные клеточные линии далее были использованы в in vitro и in vivo экспериментах для сравнения влияния Arfó на изменение отдельных характеристик злокачественных клеток.

Z б —i Z

(D О 00 f Z г-pi Z со г— со О £ со -<J Z Is-СМ н-

(О СО со Ср х СО (О со со

t tí IE t _1 t t t: т=

< < < < Ol < < < <

ir а. а. о: о: tr а: а. а.

CO СО со со СО со СО СО

к н Ь- ь- н h— к— н к

LU ш ш ш ш Ш ш ш ш

X х X X X X X X X

Рисунок 1. Вестерн-блот анализ экспрессии экзогенного Arfó в клеточных линиях производных HET-SR. а) Антитела к Arfó, б) Антитела к НА. В качестве контроля использовались антитела к бета-актину.

2. Характеристики полученных клеточных линий in vitro и in vivo

Одной из основных характеристик трансформированных клеток является повышенная скорость деления. При исследовании влияния Arfó на пролиферацию клеток линии HET-SR оказалось, что активный мутант Arfó и Arfó дикого типа в

значительной степени ускоряют скорость деления клеток линии НЕТ-ЗИ. (см. рис.2).

HET-SR plXSN " HET-SR Arf6 Q67L HET-SR Ar(6 WT HET-SR Arf6 N481 • HET-SR Art6 T27N

//

Рисунок 2. Динамика роста исследованных клеточных линий Клетки, экспрессирующие доминантно-негативный мутант Arfó и мутант, не способный взаимодействовать с PLD, не отличаются от контрольной линии по этому показателю, что говорят о том, что влияние Arfó на пролиферативную активность реализуется через взаимодействие с PLD.

Одной из характеристик агрессивных культур трансформированных клеток in vitro является способность формировать колонии без стимуляции окружающими клетками (клоногенность), которая помимо разницы в пролиферации, отражает зависимость клеток от микроокружения. При проведении теста на клоногенность, оказалось, что среднее количество колоний увеличивалось во всех линиях, экс-прессирующих мутантные формы Arfó и Arfó дикого типа по сравнению с контрольной линией (см. рис. 3).

in О

/ с?*

/

«S- л-

//

Рисунок 3. Статистический анализ клоногенности полученных клеточных линий. Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05)

Таким образом. Arfó усиливает способность клеток к колониеобразованию независимо от того, находится ли он в ГТФ или ГДФ связанном состоянии, а также независимо от взаимодействия с PLD. По-видимому, для повышения клоногенно-сти достаточно присутствия большого пула молекул Arfó, в том числе дикого типа. Очевидно, что повышение клоногенности не может быть объяснено вкладом Arfó-зависимого усиления пролиферации, так как стимуляция пролиферативной активности наблюдалась только в линиях HET-SR Arfó Q67L и HET-SR Arfó WT.

Другой важнейшей характеристикой клеток, часто ассоциированной с более агрессивным фенотипом, является способность к миграции. Способность к миграции in vitro может проверяться в тесте «на зарастание раны», когда клетки прикреплены к подложке и зарастают рану на монослое, а также в камерах Бойдена, когда исследуется способность к направленной миграции сквозь поры мембраны по градиенту ростовых факторов. Исследование влияния Arfó на миграционную активность клеток проводилось с использованием обоих тестов (см. рис. 4,5).

Рисунок 4. Миграция клеток в среде с 10% сыворотки с добавлением 1,5 мкг/мл Митомицина С. Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05)

Мы не обнаружили стимуляции миграции клеток при введении активного мутанта Arfó, а также Arfó дикого типа ни в тесте «на зарастание раны», ни в камере Бойдена. В то же время, гиперэкспрессия мутантной формы Arfó, не взаимодействующей с PLD, приводила к снижению миграционной активности клеток в обоих тестах (см. рис. 4,5).

HET-SR pLXSN HET-SR Arf8 M7L HET-SR ArtB WT HET-SR Arf6 N481 HET-SR A/t6 T27N

f . - , • - ■. ■ .. - - - / V ■ ■ . . . . . . Щ V.J ; _ ..

;- ' ... .J"■ !f.; - ... . ' i'

V?'- iV?Av; ' ' '-v..v■■"'.. -V-'il ';•>'• v '

í'.Ví^-. ¡йл-í- ., Щ •• ■ ■■' ■ -i-i

Рисунок 5. Миграция клеток no градиенту сыворотки в камере Бойдена

Можно предполагать, что отсутствие возможности образования комплекса Arf6-PLD приводит к тому, что весь пул молекул активного Arfó, продуцирующийся при гиперэкспрессии в клетках, «перенаправляется» к другим эффекторам, взаимодействие с которыми и приводит в итоге к снижению подвижности клеток.

Способность трансформированных клеток in vivo проникать из опухоли в окружающую ткань является одной из основных характеристик, определяющих злокачественный фенотип опухолей. Инвазивность - это комплексная характеристика, оценивающая не только подвижность клеток, но и их способность ремоделировать внеклеточный матрикс. Для оценки инвазивных свойств клеток в культуре используется тест на инвазию in vitro с помощью камер Бойдена, дно которых покрыто матригелем, имитирующим внеклеточный матрикс. В данном тесте моделируется ситуация, при которой трансформированные клетки оказываются в состоянии голодания по факторам роста, и для того, чтобы их получить, клеткам необходимо преодолеть барьер, состоящий из матригеля. Такой тест отражает способность клеток к инвазии в целом, а также характеризует направленное движение и разрушение внеклеточного матрикса.

HET-SR pLXSN HET-SR Alffi Q67L HET-SR Alf6 WT HET-SR Arf6 N461 HET-SR Arf6 T27N

V" . ' л -a1

f 4 kT" &

Рисунок 6. Фотографии внешней стороны мембраны после проведения теста на

инвазию in vitro

При исследовании способности к инвазии оказалось, что контрольная клеточная линия HET-SR pLXSN обладает относительно слабым инвазивным потенциалом (см. рис. 6). Наглядная и воспроизводимая разница в данном эксперименте наблюдается только для линии HET-SR Arfó N481, которая была самой активной в данном тесте. Эти данные находятся в некотором противоречии с данными, полученными на моделях глиомы и карциномы молочной железы. Полученный результат представляется особенно интересным, поскольку в обоих тестах, оценивающих

движение клеток, данная линия обладала наименьшей активностью, что говорит о том, что высокая инвазивная способность линии HET-SR Arfó N481 не связана с миграционной активностью, а скорее может быть ассоциирована с повышенной способностью к ремоделированию матрикса. Для проверки этого предположения была проверена активность ряда протеиназ, деградирующих компоненты ВКМ, в тесте на субстрат-специфическую зимографию. При анализе матриксных металло-протеиназ, способных деградировать желатин (ММР1,2 и 9), мы не увидели значимых изменений (см. рис. 7а), что согласуется с литературными данными о влиянии Arfó на их активность. В тоже время, исследование активности другой важнейшей протеиназы, урокиназо-подобного активатора плазминогена (иРА), показало, что в линии HET-SR Arfó N481 активность этой протеиназы повышена по сравнению с другими исследованными линиями (см. рис. 76).

Рисунок 7. Зимография кондиционированных сред, полученных от клеточных линий, экспрессирующих различные формы Arfó, а) Анализ активности ММР. б) Анализ активности иРА.

Таким образом, по совокупности исследования подвижности и протеолитиче-ской активности можно предполагать, что присутствие в клетках большого количества белка Arfó, не взаимодействующего с PLD, перенаправляет основную активность Arfó на взаимодействие с другими эффекторами. Это взаимодействие с одной стороны, приводит к снижению подвижности клеток, как в условиях прикрепленного роста, так и направленного движения по градиенту факторов роста. С другой стороны, оно усиливает активность иРА, что, в свою очередь, приводит к стимуляции протеолитической деградации матрикса и повышению инвазивности данной линии в культуре ш vitro. Однако этого оказалось недостаточно для стимуляции метастатического потенциала опухолевых клеток in vivo. Определение спонтанной метастатической активности клеток проводилось спустя 8 недель после

подкожного введения 2104 клеток, экспрессировавших различные формы Аг56. В данном эксперименте имитировались практически все стадии прогрессии опухолевого заболевания, начиная с формирования первичной опухоли, заканчивая образованием очагов вторичного роста в отдаленных органах (легких). Так, при анализе уровня спонтанной метастатической активности всех исследованных линий оказалось, что статистически значимой разницы в количестве легочных метастазов при подкожном введении исследуемых линий экспериментальным животным нет (см. рис. 8).

Рисунок 8. Количество гистологически-верифицированных метастазов в легких спустя 8 недель после подкожного введения исследованных клеточных линий.

Ранее было показано, что введение активного RalA и RalB в клетки HET-SR приводит к стимуляции метастатической активности клеток. Одним из основных эффекторов белков Ral является PLD, кроме того, взаимодействие с PLD необходимо для Ral-зависимой стимуляции метастазирования. Поскольку известно, что активация PLD требует совместного участия белков Arfó и RalA, и, к тому же многие эффекты Arfó реализуются через активацию PLD, мы проверили, происходит ли изменение СМА при совместной экспрессии Arfó и Ral. Для этого мы экспрес-сировали Arfó (как активную, так и доминантно-негативную формы) в клетках, в которых ранее уже были экспрессированы экзогенные активные RalA и RalB (см. рис. 9).

ai 100-1

о

2 О

80-

С? со см го CN СП СМ

> > > >

< m СО со

Ш <0 я и

К Z tr СИ -I о: 2

* £ tr СИ со си ^ т Г41

Oí (t-iffz ее irj ffz (Ttf-iKzOÍCE-jarz

t ейе!; i iS ni [rttmoífcaícEka:!

(— (D H (P h- h ffl h (D X<X<XX<X< XX<X<XI<X<

OJ OJ со см со

> > > >

< < < СО

со СО СО ю

а СИ _J К Z а:

а. СИ m CÉ £ ь а.

со со о СО

н Н- ср 1- <р н-

ш ш t LU t ш

I X < X < I

<Л О и н

t- (р t'

ш t i

х < :

«и» «

Рисунок 9. Вестерн-блот анализ экспрессии экзогенного Arfó е производных линий HET-SR RalA V23 и HET-SR RalBV23. а) Антитела к Arfó, б) Антитела к НА. Антитела к бета-актину использовались в качестве контроля.

Проверка сохранения экспрессии экзогенных белков Ral после введения Arfó проводилась методом Вестерн-блот анализа тотальных клеточных лизатов с антителами к RalA и RalB (см. рис. 10).

X ¡Г -1 О. Z

х к « te й w w О и Í-

RalA ■ «РрЯШЩР RalB ** ч®* актин ^gft-^m ^т* актин

Рисунок 10. Вестерн-блот анализ экспрессии экзогенного RalA и RalB в производных линий HET-SR RalAV23 и HET-SR RalBV23.a) Антитела к RalA. б) Антитела к RalB. Антитела к бета-актину использовались в качестве контроля.

После анализа полученных линий в тесте на СМА (см. рис. 11), оказалось, что введение Arfó в линии HET-SR RalAV23 и HET-SR RalBV23 не привело к изменению уровня СМА по сравнению с линиями, экспрессирующими активные RalA и RalB.

o* / /

Рисунок П. Количество гистологически-верифицированных метастазов в легких спустя 8 недель после подкожного введения исследованных клеточных линий.

Следовательно, экспрессия Arfó сама по себе не приводит к изменению СМА и не влияет на повышение СМА, вызванное экспрессией экзогенных RalA и RalB.

3. Идентификация сигнального пути Arf6-PLD-mTOR-S6Kl и влияние Arfó на активацию основных МАРК

Следующим этапом нашей работы было определение молекулярных механизмов влияния Arfó на функциональные свойства клеток. Прежде всего мы исследовали активность PLD, которая согласно ряду литературных данных может быть стимулирована при активации Arfó. С помощью коммерческого набора для измерения активности PLD мы показали, что в исследуемой нами системе введение активного мутанта Arfó в клетки приводит к значительной стимуляции активности PLD, тогда как в линии HET-SR Arfó N481 активность PLD не отличается от контрольной линии (см. рис. 12), что строго согласуется с имеющимися литературными данными. При обработке в течение 24 часов всех исследованных линий ингибитором PLD, 1% бутанолом-1, наблюдалось статистически значимое уменьшение активности PLD по отношению к не обработанной бутанолом-1 контрольной линии HET-SR pLXSN.

25000-1

>- 20000-Q

а 15000-

I

ю

8 10000-

í 5000-

л

0-U-r1-

бутанол-1

Рисунок 12. Анализ активности PLD в полученных клеточных линиях до и после обработки бутанолом-1. Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05)

До сих пор мало что известно о том, как происходит дальнейшая передача сигнала после стимуляции PLD Arf6. На сегодняшний день есть данные о том, что PLD стимулирует активность ERK1/2 через основные метаболиты PLD, РА и хо-лин, регулирует экзоцитоз и эндоцитоз, а также участвует в активации киназы mTOR. Мы предположили, что киназа mTOR может быть одной из мишеней Arfó-зависимой активации PLD. Одним из маркеров активности mTOR часто служит уровень фосфорилирования одного из основных ее эффекторов — S6K1. Мы исследовали уровень фосфорилирования S6K1 по 389 треонину и показали, что Arfó влияет на активность S6K1 (см. рис. 13а). Так, введение активного мутанта Arfó приводит к стимуляции активности S6K1, тогда как введение остальных форм Arfó не вызывает изменений уровня фосфорилирования этой киназы. Таким образом, для активации S6K1 в нашей системе требуется активный, ГТФ-связанный Arfó. Поскольку при введении Arfó N481 не наблюдалось активации S6K1, мы предположили, что на фосфорилирование S6K1 влияет PLD. При анализе уровня фосфорилирования S6K1 в лизатах клеток, в которых активность PLD была подавлена бутанолом-1, оказалось, что фосфорилированная форма S6K1 в них практически исчезает, что говорит о том, что активация S6K1 зависит от активности PLD (см. рис. 13а).

а

бутанол-1 P-S6K1

S6K1

б

рапвмицин

P-S6K1

S®« ЩИ ЩМи--------- i"'4Mé чцт. «ев»' ам»

Рисунок 13. Вестерн-блот анализ влияния бутанола-1 (а) и рапамицина (б) на уровень фосфорилирования и экспрессии S6K1. Антитела к S6K1 использовались для определения общего уровня S6K1. Антитела к PT389-S6KI использовались для определения фосфорилированной S6K1

Далее для подтверждения того, что активация S6K1 вызывается активностью mTOR, все исследованные клеточные линии были обработаны ингибитором mTOR, рапамицином (см. рис. 136). Рапамицин оказал действие, схожее с бутанолом-1 -после обработки им клеток фосфорилированная форма S6K1 не детектировалась. Таким образом, впервые показана Arfó-зависимая активация mTOR, причем доказано, что это происходит через активацию PLD.

Поскольку считается, что основным путем активации mTOR является PI3K-Akt сигнальный каскад, мы проверили потенциальную возможность влияния Arfó на активацию Akt. Для этого мы сравнили уровень фосфорилированной по 473 аминокислотному остатку серина киназы Akt в исследованных клеточных линиях и оказалось, что он не изменяется при введении различных форм Arfó (см. рис. 14).

-1 — Z

со О Z Ol h-

£ со со £

< < < <

er (Г an СП

to

h- ь- н- н

ш I ш X ш X ш X

P-Akl

Ml

Рисунок 14. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии Akt. Антитела к Akt использовались для определения общего уровня Akt. Антитела к PS473-Akt использовались для определения фосфорилированной Akt

Следовательно, в нашей системе Arfó—>PLD—>mTOR—»S6K1 вероятно является основным сигнальным путем, связывающим Arfó и S6K1.

В нескольких недавних работах показана Arfó-зависимая активация ERKI/2, однако, влияние Arfó на активацию остальных основных МАРК - р38 и JNK1 до сих пор практически не изучено. Мы проверили уровень активности ERK1/2, р38 и JNK1 в полученных клеточных линиях.

Оказалось, что ни количество JNK1, ни уровень ее фосфорилирования по 183 треонину, не изменяются ни в одной из исследованных линий, что согласуется с имеющимися литературными данными (см. рис. 15).

о 5 z Р

£ ? Ч £

< < < <

о: а: о: or

Рисунок 15. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии JNK1. Антитела к JNK1 использовались для определения общего уровня JNK1. Антитела к PT183-JNK1 использовались для определения фосфорилированной JNK1

В отличие от JNK1, степень фосфорилирования р38 различается между производными линии HET-SR при неизменном общем количестве белка р38. Так, уровень фосфорилирования р38 по 182 тирозину и 180 треонину значимо повышается в линии HET-SR Arfó Q67L и в меньшей степени в линии HET-SR Arfó WT, что говорит о том, что активная форма Arfó необходима для активации р38. Arfó дикого

типа, по-видимому, за счет гиперэкспрессии в клетке, частично «оттягивает» клеточные GEF на себя и также несколько стимулирует р38. При этом в линии НЕТ-SR Arfó N481 наблюдается самая низкая степень фосфорилирования р38, что говорит о том, что активация р38 также зависит от взаимодействия Arfó с PLD (см. рис. 16а).

а g § 5 ! £ 6 g о 5 z £

I % % % % 2 i I i !

к а о: а: о: с с с о: а:

СЛ СО СО СД СЛ со со со со со

lil I

ц. к i- ь ь н h н н н

UJ Ш Ш Ш Ш ШШШШШ

м^м rilMh

^^^^ ^^^^

Рисунок 16. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии р38 (а) и ERK1/2 (б), а) Антитела к р38 использовались для определения общего уровня р38. Антитела к PT180+YI82-p38 использовались для определения фосфорипированной р38. б) Антитела к ERKI/2 использовались для определения общего уровня ERKI/2.

Антитела к P(T202+Y204/TI85+Y187)-ERKl/2 использовались для определения фосфорилированных ERK1/2.

При проверке возможности Arfó-зависимой активации ERK1/2 в нашей системе оказалось, что как и в случае р38, наибольшая степень фосфорилирования ERK1/2 наблюдается в линиях с активным Arfó и Arfó дикого типа (см. рис. 166). При этом уровень экспрессии ERK1/2 оставался неизменным во всех исследованных клеточных линиях. При этом уровень фосфорилированных ERK1/2 в линиях HET-SR Arfó N481 и HET-SR Arfó T27N оказался несколько ниже, чем в контрольной линии. Этот факт согласуется с литературными данными о том, что активность ERK1/2 зависит от PLD.

4. Анализ экспрессии Arfó и RalA в образцах НМРЛ

Отдельным фрагментом данной работы было исследование Arfó и RalA в образцах НМРЛ. Известно, что некоторые эффекторы и регуляторы Arfó гиперэкс-прессированы в инвазивных опухолях различных локализаций. Экспрессия же собственно Arfó при онкопаталогиях человека исследовалась только на образцах глиом. Несколько больше данных имеется относительно экспрессии RalA при различных онкопаталогиях. Так, показано, что уровень экспрессии RalA повышен в об-

разцах опухолей мочевого пузыря и предстательной железы по сравнению с условно-нормальной тканью, а также в образцах периферических опухолей оболочки нерва. Однако исследования RalA в контексте НМРЛ также до сих пор не проводилось.

В данной работе впервые проведен анализ экспрессии мРНК Arfó в первичных опухолях НМРЛ методом ОТ-ПЦР, а также исследование экспрессии белков Arfó и RalA методом Вестерн-блот анализа.

Образцы тканей двух основных типов НМРЛ: ПКРЛ (плоскоклеточный рак легкою) (29 образцов) и АК (аденокарцинома) (24 образца), а также прилегающих к опухолям морфологически нормальных тканей, т.н. «условных норм», были получены от пациентов, оперированных в 2005-2008 гг. по поводу рака легкого в НИИ КО РОНЦ им H.H. Блохина РАМН.

Первичный анализ экспрессии Arfó на выборке из 20 образцов методом ОТ-ПЦР показал, что экспрессия мРНК Arfó снижается в 90% опухолевых образцов по сравнению с «условной нормой» (см. рис. 17). Возможно, снижение экспрессии мРНК Arfó в опухолевых образцах по сравнению с «условной нормой» при НМРЛ может служить потенциальным маркером заболевания, однако, для подтверждения этого факта требуется дальнейшее расширение анализируемой выборки.

Рисунок 17. Анализ экспрессии мРНК Arfó в опухолевой и нормальной ткани легкого методом ОТ-ПЦР. Н - "условная норма", О - опухолевый образец.

При анализе уровня экспрессии белка Arfó в тех же образцах оказалось, что количество белка не коррелировало с экспрессией мРНК Arfó. Мы расширили выборку и проанализировали изменение экспрессии белка Arfó в 53 образцах НМРЛ с целью поиска возможных корреляций с основными гистологическими типами НМРЛ (АК и ПКРЛ), стадией заболевания, степенью дифференцировки опухоли и наличием регионарных метастазов в лимфатические узлы на момент оперативного вмешательства (см. рис. 18).

анонононо бнонононо^

Щ т> «31 * r¡ tm

мв щр,ттщт — Цу «у

|Щ I щи Щ-Щ-ШГ- * RalA ÜP jps®. —*

пкрл ак

Рисунок 18. Анализ экспрессии Arfó и RalA в опухолевой и нормальной ткани легкого методом Вестерн-блот анализа * - миристилированная форма Arfó, а) Образцы ПКРЛ б) образцы АК. Антитела к Arfó и RalA. Антитела к бета-актину использовались в качестве контроля. Н - "условная норма ", О - опухолевый образец.

Хотя статистически значимых корреляций между проанализированными характеристиками опухолей и экспрессией белка Arfó выявить не удалось, был зафиксирован ряд интересных закономерностей. В образцах с повышенной экспрессией Arfó чаще наблюдалась экспрессия миристилированной формы Arfó (59%), тогда как в образцах, где экспрессия Arfó не изменялась, доля образцов с наличием миристилированной формы составила лишь 22%. Наличиие миристилированной формы Arfó статистически значимо (р=0,0185) связано с повышенной экспрессией Arfó. Учитывая, что миристилирование белков Arf важно для мембранной локализации и взаимодействия с эффекторами, этот факт представляется интересным при дальнейшем изучении экспрессии Arfó при HMPJI.

Анализ уровня экспрессии белка RalA в образцах первичных опухолей HMPJI показал, что снижение продукции белка RalA наблюдается практически во всех образцах ПКРЛ, полученных от пациентов без метастазов, в то время как при наличии верифицированных метастазов в регионарные лимфоузлы снижение экспрессии белка RalA наблюдалось реже (в 50% исследованных образцов этой группы). Таким образом, в данной выборке снижение экспрессии белка RalA статистически значимо (р<0,01) связано с отсутствием метастазов у пациентов с ПКРЛ.

В заключение можно сказать, что Arfó несомненно оказывает существенное влияние на важнейшие биологические характеристики трансформированных клеток и вносит значительный вклад в изменение внутриклеточных сигнальных путей. Одним из важнейших наблюдений, с нашей точки зрения, является необходимость взаимодействия Arfó с PLD для стимуляции миграции клеток и активации киназ р38 и ERK1/2. Несомненно интересными являются полученные данные об участии

Arfó в передаче сигнала по пути Arfó—»PLD—>mTOR-+S6Kl, которые открывают перспективы для дальнейшего исследования ассоциированных с Arfó сигнальных каскадов на других моделях и на клиническом материале, в частности при HMPJI.

Выводы

1. На основе линии HET-SR получена панель новых клеточных линий, экс-прессирующих различные формы белка Arfó: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную и не способную взаимодействовать с PLD. Кроме того, получены линии с одновременной экспрессией белков Ral (RalA и RalB) с Arfó (конститутивно-активной и доминантно-негативной формой).

2. Обнаружено, что экспрессия всех исследованных форм Arfó приводит к усилению клоногенности клеток; активная форма Arfó, также как и Arfó дикого типа, увеличивает скорость пролиферации.

3. Отсутствие взаимодействия между Arfó и PLD снижает подвижность клеток, но стимулирует их инвазивность в экспериментах in vitro, что коррелирует с увеличением протеолитической активности иРА.

4. Впервые показана Arfó-зависимая активация киназы S6K1 и идентифицирован Arfó—>PLD—»mTOR—>S6K1 сигнальный путь.

5. Впервые обнаружено Arfó-зависимое фосфорилирование киназы р38; показано, что Arfó приводит к PLD-зависимой активации ERK1/2.

6. Показано, что экспрессия различных форм Arfó не изменяет уровень СМА полученных клеточных линий in vivo и не влияет на Ral-зависимое повышение СМА при одновременной экспрессии с белками RalA и RalB.

7. Впервые исследована экспрессия мРНК Arfó при HMPJI и показано, что в 90% образцов (как АК, так и ПКРЛ) наблюдается падение уровня мРНК в опухоли по сравнению с «условной нормой».

8. Обнаружена статистически значимая корреляция снижения экспрессии белка RalA с отсутствием регионарных метастатических узлов при ПКРЛ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рыбко В.А., Книжник А.В., Каинов Я.А., Комельков А.В., Чевкина Е.М. Активность протеиназ внеклеточного матрикса в экспериментальной модели опухолевой прогрессии.// Вестник РОНЦ. - 2008 - т. 19., №4— с. 16-21.

2. Kainov Y., Rybko V., Tchevkina Е., Knizhnik A., Komelkov A. Modulation of extracellular matrix remodelling system associated with different metastatic phenotype of v-src transformed cells.// Molecular Mechanism in Signal Transduction and Cancer, Spetses, Greece - 16-24 августа 2009.

3. Рыбко B.A., Книжник A.B., Комельков А.В., Чевкина Е.М., Зборовская И.Б. Исследование молекулярных механизмов Ral-опосредовакной стимуляции метастазирования.// Материалы 13-го Российского онкологического конгресса, Москва - 17-19 ноября 2009.

4. Kovaleva O.V., Knizhnik A.V., Mochalnikova V.V., Favorskaya I.A., Zborovskaya I.B. RalA, Arf6 and Birc5 comparative protein expression analysis in NSCL.// Международный симпозиум в рамках Сибирско-Тайваньского Форума «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии», Томск - 16-17 сентября

5. Knizhnik A., Rybko V., Kovaleva О., Kainov Y., Komelkov A., Tchevkina E. Arf6-dependent signaling contributes to cancer progression in in vivo animal model and lung cancer.// Beatson international cancer conference "Microenvironment, motility and metastasis", Glasgow, Scotland - 5-8 July, 2009.

6. Книжник A.B., Рыбко В.А., Каинов Я.А., Комельков А.В., Чевкина Е.М. Модуляторы активности фосфолипазы D белки RalA и Arf6: влияние на различные характеристики трансформированных клеток.// Цитология. - 2008 - т.50, №9 - с. 807.

7. Tchevkina Е.М., Knizhnik A.V., Rybko V.A., Kainov Y.A., Komelkov A.V. Extracellular Proteases Activity In Tumor Progression Experimental Model.// Anticancer Research. - 2008 - 28, 5C - 3513.

8. Knizhnik A.V., Rybko V.A., Kainov Y.A., Komelkov A.V. and Tchevkina E.M. ARF6 and ECM protease activity in hamster tumor progression experimental model.// Cancer Degradome Symposium, London, UK - 8-9 October 2008.

9. Зборовская И.Б., Аксельрод M.E., Фаворская И.А., Рыбко В.А., Книжник А.В. Молекулярные маркеры метастазирования рака легкого в лаборатории и клинике.// «СПИД, рак и общественное здоровье». - 2008 г. - Т. 1

10. Knizhnik A., Rybko V., Aushev V., Kainov Y., Komelkov A., Tchevkina E. Arf6 participates in modulation of cell metastatic activity in vivo.// European Small GTPase meeting, Umea, Sweden - 29-31 August, 2007.

2009.

Подписано в печать:

12.03.2010

Заказ № 3386 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

 
 

Оглавление диссертации Книжник, Анна Вадимовна :: 2010 :: Москва

Введение.

1. Обзор литературы. Малая ГТФаза Arf6.

1.1 Структура белков Arf.

1.2 Регуляция активности Arf6.

1.3 Функции Arf6 в клетках.

1.3.1 Arf6 и подвижность. Racl.

1.3.2 Arf6 и цитокинез.

1.3.3 Arf6 в метаболизме фосфолипидов. PLD.

1.3.4 Arf6 и эндоцитоз.

1.3.5 Arf6 и канцерогенез.

2. Материалы и Методы.

2.1 Клеточные линии.

2.2 Образцы тканей.

2.3 Выделение нуклеиновых кислот.

2.3.1 Выделение плазмидной ДНК.

2.3.2 Выделение РНК из образцов тканей легкого.

2.3.3 Выделение фрагментов ДНК для клонирования из агарозных гелей.

2.4 Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях.

2.5 Молекулярное клонирование.

2.5.1 Получение компетентных клеток Е. coli.

2.5.2 Трансформация компетентных клеток E.coli.

2.5.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами.

2.5.4 Реакция лигирования.

2.6 Обратная транскрипция РНК.

2.7 Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.8 Трансфекция и получение ретровирусных частиц.

2.9 Инфицирование клеток.

2.10 Анализ белков.

2.10.1 Приготовление клеточных лизатов.

2.10.2 Приготовление лизатов из образцов тканей легкого.

2.10.3 Вестерн-блот гибридизация.

2.10.4 Анализ активности PLD.

2.10.5 Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеаз.

2.10.6 Анализ желатиназной активности.

2.10.7 Анализ активности иРА.

2.11 Исследование клеточных характеристик в культурах in vitro.

2.11.1 Анализ динамики роста клеток.

2.11.2 Анализ клеточной подвижности методом «зарастания раны» in vitro (wound healing assay).

2.11.3 Тест на образование колоний в условиях разреженной популяции.

2.11.4 Тест на образование колоний в полужидкой среде.

2.11.5 Тест на движение по градиенту концентраций факторов роста.

2.11.6 Тест на инвазию in vitro.

2.12 Определение спонтанной метастатической активности.

2.13 Статистическая обработка результатов.

2.14 Растворы, реагенты и среды.

3. Результаты.

3.1 Получение ретровирусных векторов и клеточных линий, экспрессирующих различные варианты белка Arf6.

3.2 Исследование характеристик полученных клеточных линий в культуре in vitro.

3.2.1 Исследование динамики роста полученных культур.

3.2.2 Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (клоногенность).

3.2.3 Анализ способности к неприкрепленному росту.

3.2.4 Исследование миграционной способности полученных клеточных линий ("wound healing assay").

3.2.5 Анализ движения по градиенту концентрации ростовых факторов.

3.2.6 Анализ инвазивных свойств полученных клеточных линий.

3.3 Анализ активности секретируемых протеаз, ремоделирующих ВКМ.

3.3.1 Анализ уровня секреции матриксных металлопротеаз (ММР).

3.3.2 Анализ уровня секреции урокиназа-подобного активатора плазминогена (иРА)

3.4 Идентификация сигнального пути Arf6-PLD-mTOR-S6Kl.

3.4.1 Экспрессия активного Arf6 приводит к стимуляции активности PLD.

3.4.2 АгГб-зависимая стимуляция PLD активирует mTOR-S6K сигнальный путь.

3.5 Исследование влияния Arf6 на фосфорилирование основных митоген-активируемых киназ.

3.6 Исследование спонтанной метастатической активности (СМА) полученных клеточных линий.

3.7 Получение АгАб-производных клеточных линий HET-SR RalAV23 и HET-SR RalBV23.

3.8 Исследование спонтанной метастатической активности (СМА) полученных клеточных линий.

3.9 Анализ экспрессии Arf6 и RalA в образцах HMPJI.

Обсуждение.

Выводы.

 
 

Введение диссертации по теме "Онкология", Книжник, Анна Вадимовна, автореферат

Белок Arf6 относится к семейству малых G-белков Arf, входящему в состав суперсемейства малых ГТФаз Ras. В то время как в отношении большинства малых ГТФаз накоплен огромный экспериментальный материал, доказывающий их участие в злокачественной трансформации клеток, Arf6 долго оставался «в тени» более известных G-белков. Однако за последние годы появилось множество данных, указывающих на важнейшую роль Arf6 в ключевых аспектах жизнедеятельности клетки, таких как везикулярный транспорт, реорганизация цитоскелета, цитокинез, изменение липидного состава мембран и др. Все больше внимания стало уделяться белкам Arf, в частности Arf6, и в аспекте канцерогенеза. Тем не менее, до сих пор опубликованы лишь единичные работы, исследующие участие Arf6 в опухолевой прогрессии и метастазировании и механизмы, это участие опосредующие. Так, роль непосредственно Arf6 в процессе метастазирования исследовалась лишь в одной работе на линии меланомы человека LOX, где показано, что сигнальный каскад Arf6—>PLD—^ERKl/2—>Racl регулирует процесс инвазии клеток меланомы in vivo (Muralidharan-Chari et al, 2009b). Среди возможных механизмов, определяющих участие Arf6 в канцерогенезе, чаще всего рассматривается АгГб-зависимое изменение цитоскелета и подвижности, а также изменения в эндоцитозе ряда белков, например pi-интегринов, р-катенинов и ряда GPCR. Менее понятной остается роль Arf6 в метаболизме липидов и участие этой ГТФазы во внутриклеточных сигнальных путях. Одним из основных кандидатов на роль эффектора Arf6, влияющего на изменение внутриклеточной передачи сигнала, является PLD (фосфолипаза D). Участие Arf6 в активации PLD показано в нескольких работах последнего времени (Grodnitzky et al, 2007; Begle et al, 2009). PLD продуцирует важнейшие вторичные мессенджеры, РА (фосфатидную кислоту) и холин, которые участвуют в регуляции многих процессов, таких как эндоцитоз, реорганизация мембраны, миграция и др. Таким образом, активация PLD представляется одним из важнейших механизмов, опосредующих участие Arf6 в самых различных аспектах канцерогенеза и опухолевой прогрессии.

Данная работа посвящена исследованию роли Arf6 в изменении основных биологических характеристик трансформированных клеток, а также участия этой малой1 ГТФазы в модуляции внутриклеточных сигнальных путей, ассоциированных с опухолевой прогрессией. В последние годы появилось несколько работ, обнаруживающих Аг£6-зависимую активацию ERK1/2, ключевой MAP киназы Ras-Raf-MAPK сигнального пути, где показано, что Arf6 активирует ERK1/2 PLD-зависимо (Li et al., 2006; Muralidharan-Chari et al., 2009a, b). В то же время, до сих пор не исследовалось влияние Arf6 на активацию других MAP киназ, а также на другие сигнальные пути, связанные с активностью PLD.

В данной работе впервые исследовано влияние Arf6 на MAP киназу р38, а также на киназу S6K1. Для изучения влияния Arf6 на различные функциональные характеристики трансформированных клеток in vivo, а также на молекулярно-биологические характеристики клеток in vitro, была выбрана клеточная линия эмбриональных фибробластов сирийского хомяка (Mesocricetus auratus Waterh) HET-SR. Ранее на данной клеточной линии в лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов ГУ РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН показано, что основным, путем, опосредующим модулирующие метастазирование свойства H-Ras, является Ras-RalGDS-Ral зависимый путь (Tchevkina et al., 2005). PLD является одним из эффекторов Ral (Jiang et al., 1995), и, как ранее показано в нашей лаборатории, взаимодействие PLD с Ral является необходимым для Ral-опосредованной стимуляции метатазирования (диссертация н.с. В.А. Рыбко, 2009). Согласно некоторым литературным данным, активация PLD требует совместного участия белков Arf6 и RalA.

В отличие от RalA, экспрессия которого исследовалась при некоторых онкопаталогиях, данные об экспрессии Arf6 в опухолях человека практически отсутствуют. Для исследования возможной роли Arf6 в патогенезе опухолей человека нами проведен анализ его экспрессии в образцах HMPJI (немелкоклеточный рак легкого).

Таким образом, поскольку Arf6 влияет на многие важнейшие внутриклеточные процессы, претерпевающие перестройки в ходе злокачественной трансформации, изучение роли Arf6 в регуляции внутриклеточной передачи сигнала и патогенезе опухолей человека, в частности при таком распространенном заболевании как HMPJI, представляет большой интерес и научно-практическую значимость.

Целью данной работы являлось: Исследование влияния малой ГТФазы Arf6 на ключевые биологические свойства трансформированных клеток в культуре in vitro и метастатическую активность in vivo, а также на активацию отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, ассоциированных с опухолевой прогрессией.

В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. На основе клеточной линии HET-SR (RSV трансформированные фибробласты хомяка) получить производные линии, стабильно экспрессирующие различные формы белка Arf6: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную, не способную взаимодействовать с PLD.

2. Изучить основные биологические свойства клеток HET-SR, экспрессирующих различные формы Arf6, в культуре in vitro: скорость пролиферации, подвижность, инвазивность, клоногенность и способность к неприкрепленному росту.

3. Исследовать влияние различных форм Arf6 на протеолитическую активность внеклеточных протеаз ММР1,2,9 и иРА, активность PLD, а также на статус фосфорилирования основных MAP киназ (ERK1/2, р38 и JNK1) и киназ Akt и S6K1.

4. Получить клеточные линии, экспрессирующие одновременно активные формы белков Ral (RalA и RalB) и белок Arf6 как в активной, так и в доминантно-негативной форме.

5. Сравнить уровень спонтанной метастатической активности всех полученных клеточных линий in vivo.

6. Провести анализ экспрессии белков Arf6 и RalA в образцах HMPJI человека.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Участие малой ГТфазы ARF6 в канцерогенезе"

Выводы

1. На основе линии HET-SR получена панель новых клеточных линий, экспрессирующих различные формы белка Arf6: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную и не способную взаимодействовать с PLD. Кроме того, получены линии с одновременной экспрессией белков Ral (RalA и RalB) с Arf6 (конститутивно-активной и доминантно-негативной формой).

2. Обнаружено, что экспрессия всех исследованных форм Arf6 приводит к усилению клоногенности клеток; активная форма Arf6, также как и Arf6 дикого типа, увеличивает скорость пролиферации.

3. Отсутствие взаимодействия между Arf6 и PLD снижает подвижность клеток, но стимулирует их инвазивность в экспериментах in vitro, что коррелирует с увеличением протеолитической активности иРА.

4. Впервые показана АгАб-зависимая активация киназы S6K1 и идентифицирован Arf6—»PLD—»mTOR—>S6K1 сигнальный путь.

5. Впервые обнаружено АгАб-зависимое фосфорилирование киназы р38; показано, что Arf6 приводит к PLD-зависимой активации ERK1/2. I

6. Показано, что экспрессия различных форм Arf6 не изменяет уровень СМА полученных клеточных линий in vivo и не влияет на Ral-зависимое повышение СМА при одновременной экспрессии с белками RalA и RalB.

7. Впервые исследована экспрессия мРНК Arf6 при HMPJI и показано, что в 90% образцов (как АК, так и ПКРЛ) наблюдается падение уровня мРНК в опухоли по сравнению с «условной нормой».

8. Обнаружена статистически значимая корреляция снижения экспрессии белка RalA с отсутствием регионарных метастатических узлов при ПКРЛ.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Книжник, Анна Вадимовна

1. Зборовская, И.Б. и Татосян, А.Г. (2004) Молекулярные маркеры различных стадий развития немелкоклеточного рака легкого. Мол. Биология 38: 1-12.

2. Зуева, Е.С., Чевкина Е.М., Кимхи, А. и Татосян, А.Г. (2002) Подавление метастатического потенциала клеток трансформированных онкогеном v-src как результат активности экзогенной DAP киназы. Мол. Биология 36: 472-479.

3. Вalasubramanian,N., Meier,J.A., Scott,D.W., Norambuena,A., White,M.A., and Schwartz,M.A. (2009) RalA-Exocyst Complex Regulates Integrin-Dependent Membrane Raft Exocytosis and Growth Signaling. Curr Biol 20: 75-79.

4. Balasubramanian,N., Scott,D.W., Castle,J.D., Casanova,J.E., and Schwartz,M.A. (2007) Arf6 and microtubules in adhesion-dependent trafficking of lipid rafts. Nat Cell Biol 9: 1381-1391.

5. Begle,A., Tryoen-Toth,P., de,B.J., Bader,M.F., and Vitale,N. (2009) ARF6 regulates the synthesis of fusogenic lipids for calcium-regulated exocytosis in neuroendocrine cells. J Biol Chem 284: 4836-4845.

6. Berven,L.A., and Crouch,M.F. (2000) Cellular function of p70S6K: a role in regulating cell motility. Immunol Cell Biol 78: 447-451.

7. Bodempudi,V., Yamoutpoor,F., Pan,W., Dudek,A.Z., Esfandyari,T., Piedra,M. et al. (2009) Ral overactivation in malignant peripheral nerve sheath tumors. Mol Cell Biol 29: 3964-3974.

8. Boshans,R.L., Szanto,S., van,A.L., and Souza-Schorey,C. (2000) ADP-ribosylation factor 6 regulates actin cytoskeleton remodeling in coordination with Racl and RhoA. Mol Cell Biol 20: 3685-3694.

9. Brown,H.A., Gutowski,S., Moomaw,C.R., Slaughter,C., and Sternweis,P.C. (1993) ADP-ribosylation factor, a small GTP-dependent regulatory protein, stimulates phospholipase D activity. Cell 75: 1137-1144.

10. Burnett,Р.Е., Barrow,R.K., Cohen,N.A., Snyder,S.H., and Sabatini,D.M. (1998) RAFT1 phosphorylation of the translational regulators p70 S6 kinase and 4E-BP1. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 1432-1437.

11. Carracedo,A., Ma,L., Teruya-Feldstein,J., Rojo,F., Salmena,L., Alimonti,A. et al. (2008) Inhibition of mTORCl leads to МАРК pathway activation through a PI3K-dependent feedback loop in human cancer. J Clin Invest 118: 30653074.

12. Casanova,J.E. (2007) Regulation of Arf activation: the Sec7 family of guanine nucleotide exchange factors. Traffic 8: 1476-1485.

13. Chen,Y., Rodrik,V., and Foster,D.A. (2005) Alternative phospholipase D/mTOR survival signal in human breast cancer cells. Oncogene 24: 672-679.

14. Claing,A., Chen,W., Miller,W.E., Vitale,N., Moss,J., Premont,R.T., and Lefkowitz,R.J. (2001) beta-Arrestin-mediated ADP-ribosylation factor 6 activation and beta 2-adrenergic receptor endocytosis. J Biol Chem 276: 42509-42513.

15. Cotton,M., Boulay,P.L., Houndolo,T., Vitale,N., Pitcher,J.A., and Claing,A. (2007) Endogenous ARF6 interacts with Racl upon angiotensin II stimulation to regulate membrane ruffling and cell migration. Mol Biol Cell 18: 501-511.

16. Daher,Z., Noel,J., and Claing,A. (2008) Endothelin-1 promotes migration of endothelial cells through the activation of ARF6 and the regulation of FAK activity. Cell Signal 20: 2256-2265.

17. Dass,K., Ahmad,A., Azmi,A.S„ Sarkar,S.H., and Sarkar,F.H. (2008) Evolving role of uPA/uPAR system in human cancers. Cancer Treat Rev 34: 122-136.

18. Doherty,G.J., and McMahon,H.T. (2009) Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem 78: 857-902.

19. Donaldson,J.G. (2003) Multiple roles for Arf6: sorting, structuring, and signaling at the plasma membrane. J Biol Chem 278: 41573-41576.

20. Donaldson,J.G., Porat-Shliom,N., and Cohen,L.A. (2009) Clathrin-independent endocytosis: a unique platform for cell signaling and PM remodeling. Cell Signal 21: 1-6.

21. Exton, J.H. (2002) Regulation of phospholipase D. FEBS Lett 531: 58-61.

22. Eyster,C.A., Higginson,J.D., Huebner,R., Porat-Shliom,N., Weigert,R., Wu,W.W. et al. (2009) Discovery of New Cargo Proteins that Enter Cells through Clathrin-Independent Endocytosis. Traffic.

23. Farooqui,R., Zhu,S., and Fenteany,G. (2006) Glycogen synthase kinase-3 acts upstream of ADP-ribosylation factor 6 and Racl to regulate epithelial cell migration. Exp Cell Res 312: 1514-1525.

24. Fielding,A.B., Schonteich,E., Matheson,J., Wilson,G., Yu,X., Hickson,G.R. et al. (2005) Rabl 1-FIP3 and FIP4 interact with Arf6 and the exocyst to control membrane traffic in cytokinesis. EMBO J 24: 3389-3399.

25. Foster,D.A. (2007) Regulation of mTOR by phosphatidic acid? Cancer Res 67: 1-4.

26. Foster,D.A., and Xu,L. (2003) Phospholipase D in cell proliferation and cancer. Mol Cancer Res 1: 789-800.

27. Galandrini,R., Micucci,F., Tassi,I., Cifone,M.G., Cinque,В., Piccoli,M. et al. (2005) Arf6: a new player in FcgammaRIIIA lymphocyte-mediated cytotoxicity. Blood 106: 577-583.

28. Gillingham,A.K., and Munro,S. (2007) The small G proteins of the Arf family and their regulators. Annu Rev Cell Dev Biol 23: 579-611.

29. Goldfinger,L.E., Ptak,C., Jeffery,E.D., Shabanowitz,J., Hunt,D.F., and Ginsberg,M.H. (2006) RLIP76 (RalBPl) is an R-Ras effector that mediates adhesion-dependent Rac activation and cell migration. J Cell Biol 174: 877888.

30. Grodnitzky,J.A., Syed,N., Kimber,M.J., Day,T.A., Donaldson,J.G., and Hsu,W.H. (2007) Somatostatin receptors signal through EFA6A-ARF6 to activate phospholipase D in clonal beta-cells. J Biol Chem 282: 13410-13418.

31. Hashimoto,S., Hashimoto,A., Yamada,A., Onodera,Y., and Sabe,H. (2005) Assays and properties of the ArfGAPs, AMAP1 and AMAP2, in Arf6 function. Methods Enzymol 404: 216-231.

32. Hashimoto,S., Onodera,Y., Hashimoto,A., Tanaka,M., Hamaguchi,M., Yamada,A., and Sabe,H. (2004) Requirement for Arf6 in breast cancer invasive activities. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 6647-6652.

33. Honda,A., Nogami,M., Yokozeki,T., Yamazaki,M., Nakamura,H., Watanabe,H. et al. (1999) Phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase alpha is a downstream effector of the small G protein ARF6 in membrane ruffle formation. Cell 99: 521-532.

34. Hong,J.H., Oh,S.O., Lee,M., Kim,Y.R., Kim,D.U., Hur,G.M. et al. (2001) Enhancement of lysophosphatidic acid-induced ERK phosphorylation by phospholipase D1 via the formation of phosphatidic acid. Biochem Biophys Res Commun281: 1337-1342.

35. Hoover,H., Muralidharan-Chari,V., Tague,S., and Souza-Schorey,C. (2005) Investigating the role of ADP-ribosylation factor 6 in tumor cell invasion and extracellular signal-regulated kinase activation. Methods Enzymol 404: 134147.

36. Hornberger,T.A., Chu,W.K., Mak,Y.W., Hsiung,J.W., Huang,S.A., and Chien,S. (2006) The role of phospholipase D and phosphatidic acid in the mechanical activation of mTOR signaling in skeletal muscle. Proc Natl Acad SciUS A 103:4741-4746.

37. Houndolo,T., Boulay,P.L., and Claing,A. (2005) G protein-coupled receptor endocytosis in ADP-ribosylation factor 6-depleted cells. J Biol Chem 280: 5598-5604.

38. Hu,B., Shi,В., Jarzynka,M.J., Yiin,J.J., Souza-Schorey,C., and Cheng,S.Y. (2009) ADP-ribosylation factor 6 regulates glioma cell invasion through the IQ-domain GTPase-activating protein 1-Racl-mediated pathway. Cancer Res 69:794-801.

39. Ikeda,S., Ushio-Fukai,M., Zuo,L., Tojo,T., Dikalov,S., Patrushev,N.A., and Alexander,R.W. (2005) Novel role of ARF6 in vascular endothelial growth factor-induced signaling and angiogenesis. Circ Res 96: 467-475.

40. Inoue,H., and Randazzo,P.A. (2007) Arf GAPs and their interacting proteins. Traffic 8: 1465-1475.

41. Jackson,T.R., Brown,F.D., Nie,Z., Miura,K., Foroni,L., Sun,J. et al. (2000) ACAPs are arf6 GTPase-activating proteins that function in the cell periphery. J Cell Biol 151: 627-638.

42. Jenkins,G.M., and Frohman,M.A. (2005) Phospholipase D: a lipid centric review. Cell Mol Life Sci 62: 2305-2316.

43. Jiang,H., Luo,J.Q., Urano,T., Frankel,P., Lu,Z., Foster,D.A., and Feig,L.A. (1995) Involvement of Ral GTPase in v-Src-induced phospholipase D activation. Nature 378: 409-412.

44. Jing,J., Tarbutton,E., Wilson,G., and Prekeris,R. (2009) Rabll-FIP3 is a Rabl 1-binding protein that regulates breast cancer cell motility by modulating the actin cytoskeleton. Eur J Cell Biol 88: 325-341.

45. Kahn,R.A., Cherfils,J., Elias,M., Lovering,R.C., Munro,S., and Schurmann,A. (2006) Nomenclature for the human Arf family of GTP-binding proteins: ARF, ARL, and SAR proteins. J Cell Biol 172: 645-650.

46. Kahn,R.A., and Gilman,A.G. (1986) The protein cofactor necessary for ADP-ribosylation of Gs by cholera toxin is itself a GTP binding protein. J Biol Chem 261:7906-7911.

47. Kam,Y., and Exton,J.H. (2001) Phospholipase D activity is required for actin stress fiber formation in fibroblasts. Mol Cell Biol 21: 4055-4066.

48. Kang,Y.S., Zhao,X., Lovaas,J., Eisenberg,E., and Greene,L.E. (2009) Clathrin-independent internalization of normal cellular prion protein in neuroblastoma cells is associated with the Arf6 pathway. J Cell Sci 122: 4062-4069.

49. Killeen,S., Hennessey,A., E1,H.Y., and Waldron,B. (2008) The urokinase plasminogen activator system in cancer: a putative therapeutic target? Drug News Perspect 21: 107-116.

50. Kim,S.W., Hayashi,M., Lo,J.F., Yang,Y., Yoo,J.S., and Lee,J.D. (2003) ADP-ribosylation factor 4 small GTPase mediates epidermal growth factor receptor-dependent phospholipase D2 activation. J Biol Chem 278: 26612668.

51. Kon,S., Tanabe,K., Watanabe,T., Sabe,H., and Satake,M. (2008) Clathrin dependent endocytosis of E-cadherin is regulated by the Arf6GAP isoform SMAP1. Exp Cell Res 314: 1415-1428.

52. Krauss,M., Kinuta,M., Wenk,M.R., De,C.P., Takei,K., and Haucke,V. (2003) ARF6 stimulates clathrin/AP-2 recruitment to synaptic membranes by activating phosphatidylinositol phosphate kinase type Igamma. J Cell Biol 162: 113-124.

53. Krishna,M., and Narang,H. (2008) The complexity of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) made simple. Cell Mol Life Sci 65: 3525-3544.

54. Laakkonen,J.P., Makela,A.R., Kakkonen,E., Turkki,P., Kukkonen,S., Peranen,J. et al. (2009) Clathrin-independent entry of baculovirus triggers uptake of E. coli in non-phagocytic human cells. PLoS One 4: e5093.

55. Lau,A.W., and Chou,M.M. (2008) The adaptor complex AP-2 regulates post-endocytic trafficking through the non-clathrin Arf6-dependent endocytic pathway. J Cell Sci 121: 4008-4017.

56. Lebeda,R.A., Johnson,S.K., Stewart,M.I., and Haun,R.S. (2003) Sequence, genomic organization, and expression of the human ADP-ribosylation factor 6 (ARF6) gene: a class III ARF. DNA Cell Biol 22: 737-741.

57. Li,C.C., Chiang,T.C., Wu,T.S., Pacheco-Rodriguez,G., Moss,J., and Lee,FJ. (2007) ARL4D recruits cytohesin-2/ARNO to modulate actin remodeling. Mol Biol Cell 18: 4420-4437.

58. Li,H.S., Shome,K., Rojas,R., Rizzo,M.A., Vasudevan,C., Fluharty,E. et al.2003) The guanine nucleotide exchange factor ARNO mediates the activation of ARF and phospholipase D by insulin. BMC Cell Biol 4: 13.

59. Li,M., Ng,S.S., Wang,J., Lai,L., Leung,S.Y., Franco,M. et al. (2006) EFA6A enhances glioma cell invasion through ADP ribosylation factor 6/extracellular signal-regulated kinase signaling. Cancer Res 66: 1583-1590.

60. Li,M., Wang,J., Ng,S.S., Chan,C.Y., He,M.L., Yu,F. et al. (2009) Adenosine diphosphate-ribosylation factor 6 is required for epidermal growth factor-induced glioblastoma cell proliferation. Cancer 115: 4959-4972.

61. Lim,K.H., 0'Hayer,K., Adam,SJ., Kendall,S.D., Campbell,P.M., Der,CJ., and Counter,C.M. (2006) Divergent roles for RalA and RalB in malignant growth of human pancreatic carcinoma cells. Curr Biol 16: 2385-2394.t

62. Liu,L., Liao,H., Castle,A., Zhang,J., Casanova,J., Szabo,G., and Castle,D. (2005) SCAMP2 interacts with Arf6 and phospholipase D1 and links their function to exocytotic fusion pore formation in PC 12 cells. Mol Biol Cell 16: 4463-4472.

63. Liu,Y., and Fanburg,B.L. (2008) Phospholipase D signaling in serotonin-induced mitogenesis of pulmonary artery smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 295: L471-L478.

64. Lundmark,R., Doherty,G.J., Vallis,Y., Peter,B.J., and McMahon,H.T. (2008) Arf family GTP loading is activated by, and generates, positive membrane curvature. Biochem J 414: 189-194.

65. Luttrell,L.M., and Lefkowitz,RJ. (2002) The role of beta-arrestins in the termination and transduction of G-protein-coupled receptor signals. J Cell Sci 115:455-465.

66. Macia,E., Luton,F., Partisani,M., Cherfils,J., Chardin,P., and Franco,M.2004) The GDP-bound form of Arf6 is located at the plasma membrane. J Cell Sci 117: 2389-2398.

67. Marchant,D., Sail,A., Si,X., Abraham,Т., Wu,W., Luo,Z. et al. (2009) ERK MAP kinase-activated Arf6 trafficking directs coxsackievirus type B3 into an unproductive compartment during virus host-cell entry. J Gen Virol 90: 854862.

68. Menetrey,J., Macia,E., Pasqualato,S., Franco,M., and Cherfils,J. (2000) Structure of Arf6-GDP suggests a basis for guanine nucleotide exchange factors specificity. Nat Struct Biol 7: 466-469.

69. Mi,R., Ma,J., Zhang,D., Li,L., and Zhang,H. (2009) Efficacy of combined inhibition of mTOR and ERK/MAPK pathways in treating a tuberous sclerosis complex cell model. J Genet Genomics 36: 355-361.

70. Montagnac,G., Sibarita,J.B., Loubery,S., Daviet,L., Romao,M., Raposo,G., and Chavrier,P. (2009) ARF6 Interacts with JIP4 to control a motor switch mechanism regulating endosome traffic in cytokinesis. Curr Biol 19: 184-195.

71. Morishige,M., Hashimoto,S., Ogawa,E., Toda,Y., Kotani,H., Hirose,M. et al. (2008) GEP 100 links epidermal growth factor receptor signalling to Arf6 activation to induce breast cancer invasion. Nat Cell Biol 10: 85-92.

72. Moss,J., and Vaughan,M. (1998) Molecules in the ARF orbit. J Biol Chem 273: 21431-21434.

73. Muralidharan-Chari,V., Clancy,J., Plou,C., Romao,M., Chavrier,P., Raposo,G., and Souza-Schorey,C. (2009a) ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Curr Biol 19: 1875-1885.

74. Muralidharan-Chari,V., Hoover,H., Clancy,J., Schweitzer,J., Suckow,M.A., Schroeder,V. et al. (2009b) ADP-ribosylation factor 6 regulates tumorigenic and invasive properties in vivo. Cancer Res 69: 2201-2209.

75. Naslavsky,N., Weigert,R., and Donaldson,J.G. (2003) Convergence of non-clathrin- and clathrin-derived endosomes involves Arf6 inactivation and changes in phosphoinositides. Mol Biol Cell 14: 417-431.

76. Niedergang,F., Colucci-Guyon,E., Dubois,Т., Raposo,G., and Chavrier,P. (2003) ADP ribosylation factor 6 is activated and controls membrane delivery during phagocytosis in macrophages. J Cell Biol 161:1143-1150.

77. Noh,D.Y., Ahn,S.J., Lee,R.A., РагкД.А., Kim,J.H., Suh,P.G. et al. (2000) Overexpression of phospholipase D1 in human breast cancer tissues. Cancer Lett 161: 207-214.

78. O'Neal,C.J., Jobling,M.G., Holmes,R.K., and Hol,W.G. (2005) Structural basis for the activation of cholera toxin by human ARF6-GTP. Science 309: 1093-1096.

79. Onodera,Y., Hashimoto,S., Hashimoto,A., Morishige,M., Mazaki,Y., Yamada,A. et al. (2005) Expression of AMAP1, an ArfGAP, provides novel targets to inhibit breast cancer invasive activities. EMBO J 24: 963-973.

80. Oude Weernink,P.A., Lopez de,J.M., and Schmidt,M. (2007) Phospholipase D signaling: orchestration by PIP2 and small GTPases. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 374: 399-411.

81. Palacios,F., Price,L., Schweitzer,J., Collard,J.G., and Souza-Schorey,C. (2001) An essential role for ARF6-regulated membrane traffic in adherens junction turnover and epithelial cell migration. EMBO J 20: 4973-4986.

82. Palacios,F., Schweitzer,J.K., Boshans,R.L., and Souza-Schorey,C. (2002) ARF6-GTP recruits Nm23-Hl to facilitate dynamin-mediated endocytosis during adherens junctions disassembly. Nat Cell Biol 4: 929-936.

83. Palacios,F., and Souza-Schorey,C. (2003) Modulation of Racl and ARF6 activation during epithelial cell scattering. J Biol Chem 278: 17395-17400.

84. Paleotti,0., Macia,E., Luton,F., Klein,S., Partisani,M., Chardin,P. et al. (2005) The small G-protein Arf6GTP recruits the AP-2 adaptor complex to membranes. J Biol Chem 280: 21661-21666.

85. Paris,S., Beraud-Dufour,S., Robineau,S., Bigay,J., Antonny,B., Chabre,M., and Chardin,P. (1997) Role of protein-phospholipid interactions in the activation of ARF1 by the guanine nucleotide exchange factor Arno. J Biol Chem 272: 22221-22226.

86. Pasqualato,S., Menetrey,J., Franco,M., and Cherfils,J. (2001) The structural GDP/GTP cycle of human Arf6. EMBO Rep 2: 234-238.

87. Peters,P.J., Hsu,V.W., Ooi,C.E., Finazzi,D., Teal,S.В., Oorschot,V. et al. (1995) Overexpression of wild-type and mutant ARF1 and ARF6: distinct perturbations of nonoverlapping membrane compartments. J Cell Biol 128: 1003-1017.

88. Petroulakis,E., Mamane,Y., Le,B.O., Shahbazian,D., and Sonenberg,N. (2006) mTOR signaling: implications for cancer and anticancer therapy. Br J Cancer 94: 195-199.

89. Porat-Shliom,N., Kloog,Y., and Donaldson,J.G. (2008) A unique platform for H-Ras signaling involving clathrin-independent endocytosis. Mol Biol Cell 19: 765-775.

90. Poupart,М.Е., Fessart,D., Cotton,M., Laporte,S.A., and Claing,A. (2007) ARF6 regulates angiotensin II type 1 receptor endocytosis by controlling the recruitment of AP-2 and clathrin. Cell Signal 19: 2370-2378.

91. Radhakrishna,H., Klausner,R.D., and Donaldson,J.G. (1996) Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol 134: 935-947.

92. Raftopoulou,M., and Hall,A. (2004) Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol 265: 23-32.

93. Rankovic,M., Jacob,L., Rankovic,V., Brandenburg,L.O., Schroder,H., Hollt,V., and Koch,T. (2009) ADP-ribosylation factor 6 regulates mu-opioid receptor trafficking and signaling via activation of phospholipase D2. Cell Signal 21: 1784-1793.

94. Robin,P., Chouayekh,S., Bole-Feysot,C., Leiber,D., and Tanfin,Z. (2005) Contribution of phospholipase D in endothelin-1-mediated extracellular signal-regulated kinase activation and proliferation in rat uterine leiomyoma cells. Biol Reprod 72: 69-77.

95. Sabe,H., Hashimoto,S., Morishige,M., Hashimoto,A., and Ogawa,E. (2008) The EGFR-GEP100-Arf6 pathway in breast cancer: Full invasiveness is not from the inside. Cell Adh Migr 2: 71-73.

96. Sabe,H., Hashimoto,S., Morishige,M., Ogawa,E., Hashimoto,A., Nam,J.M. et al. (2009) The EGFR-GEP100-Arf6-AMAP 1 signaling pathway specific to breast cancer invasion and metastasis. Traffic 10: 982-993.

97. Santy,L.C., and Casanova,J.E. (2001) Activation of ARF6 by ARNO stimulates epithelial cell migration through downstream activation of both Racl and phospholipase D. J Cell Biol 154: 599-610.

98. Santy,L.C., Ravichandran,K.S., and Casanova,J.E. (2005) The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Racl. CurrBiol 15: 1749-1754.

99. Schonteich,E., Pilli,M., Simon,G.C., Matern,H.T., Junutula,J.R, Sentz,D. et al. (2007) Molecular characterization of Rabll-FIP3 binding to ARF GTPases. Eur J Cell Biol 86: 417-431.

100. Schweitzer,J.K., and Souza-Schorey,C. (2002) Localization and activation of the ARF6 GTPase during cleavage furrow ingression and cytokinesis. J Biol Chem 277: 27210-27216.

101. Skippen,A., Jones,D.H., Morgan,C.P., Li,M., and Cockcroft,S. (2002) Mechanism of ADP ribosylation factor-stimulated phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate synthesis in HL60 cells. J Biol Chem 277: 5823-5831.

102. Smith,S.C., Oxford,G., Baras,A.S., Owens,C., Havaleshko,D., Brautigan,D.L. et al. (2007) Expression of ral GTPases, their effectors, and activators in human bladder cancer. Clin Cancer Res 13: 3803-3813.

103. Souza-Schorey,C., and Chavrier,P. (2006) ARF proteins: roles in membrane traffic and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 347-358.

104. Souza-Schorey,C., and Stahl,P.D. (1995) Myristoylation is required for the intracellular localization and endocytic function of ARF6. Exp Cell Res 221: 153-159.

105. Sunaga,N., Miyajima,K., Suzuki,M., Sato,M., White,M.A., Ramirez,R.D. et al. (2004) Different roles for caveolin-1 in the development of non-small cell lung cancer versus small cell lung cancer. Cancer Res 64: 4277-4285.

106. Suzuki,Т., Kanai,Y., Hara,T., Sasaki,J., Sasaki,Т., Kohara,M. et al. (2006) Crucial role of the small GTPase ARF6 in hepatic cord formation during liver development. Mol Cell Biol 26: 6149-6156.

107. Svensson,H.G., West,M.A., Mollahan,P., Prescott,A.R., Zaru,R., and Watts,C. (2008) A role for ARF6 in dendritic cell podosome formation and migration. Eur J Immunol 38: 818-828.

108. Tague,S.E., Muralidharan,V., and Souza-Schorey,C. (2004) ADP-ribosylation factor 6 regulates tumor cell invasion through the activation of the MEK/ERK signaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 9671-9676.

109. Tanabe,K., Torii,T., Natsume,W., Braesch-Andersen,S., Watanabe,T., and Satake,M. (2005) A novel GTPase-activating protein for ARF6 directly interacts with clathrin and regulates clathrin-dependent endocytosis. Mol Biol Cell 16: 1617-1628.

110. Tchevkina,E., Agapova,L., Dyakova,N., Martinjuk,A., Komelkov,A., and Tatosyan,A. (2005) The small G-protein RalA stimulates metastasis of transformed cells. Oncogene 24: 329-335.

111. Tsuchiya,M., Price,S.R., Tsai,S.C., Moss,J., and Vaughan,M. (1991) Molecular identification of ADP-ribosylation factor mRNAs and their expression in mammalian cells. J Biol Chem 266: 2772-2777.

112. Wan,Т., Liu,Т., Zhang,H., Tang,S., and Min,W. (2009) AIP1 functions as Arf6-GAP to negatively regulate TLR4 signaling. J Biol Chem 285: 3750

113. Williger,B.T., Ho,W.T., and Exton,J.H. (1999) Phospholipase D mediates matrix metalloproteinase-9 secretion in phorbol ester-stimulated human fibrosarcoma cells. J Biol Chem 274: 735-738.

114. Xu,L., Frankel,P., Jackson,D., Rotunda,Т., Boshans,R.L., Souza-Schorey,C., and Foster,D.A. (2003) Elevated phospholipase D activity in H-Ras- but not K-Ras-transformed cells by the synergistic action of RalA and ARF6. Mol Cell Biol 23: 645-654.

115. Yano,H., Kobayashi,I., Onodera,Y., Luton,F., Franco,M., Mazaki,Y. et al. (2008) Fbx8 makes Arf6 refractory to function via ubiquitination. Mol Biol Cell 19: 822-832.

116. Yin,J., Pollock,C., Tracy,K., Chock,M., Martin,P., Oberst,M., and Kelly,K. (2007) Activation of the RalGEF/Ral pathway promotes prostate cancer metastasis to bone. Mol Cell Biol 27: 7538-7550.

117. Zhao,Y., Ehara,H., Akao,Y., Shamoto,M., Nakagawa,Y., Banno,Y. et al. (2000) Increased activity and intranuclear expression of phospholipase D2 in human renal cancer. Biochem Biophys Res Commun 278: 140-143.3757.