Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Трансплантация культуры ткани неонатального аденогипофиза

АВТОРЕФЕРАТ
Трансплантация культуры ткани неонатального аденогипофиза - тема автореферата по медицине
Клитова, Зинфира Султан-Муратовна Москва 1996 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.00.41
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Трансплантация культуры ткани неонатального аденогипофиза

?го о a

1 3 ПИВ 1997

Jl » ni'iU'iX |.yt:.-;)íi.,;i

КЛИТОВА OHIltlíPA СУЛТАН- ЮТАТОШ1Л

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ «УЛЬТУРЫ ТКАНИ ИЕ011АТАЛЫ10Г0 АДКНОПШО'ШЛ

14.00.41 - трансплантологии и искусотпоимил opnuiu

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание уччной ппш'мш кандидата медицинских наук

M О С К К А - lfí'.iO

¡'.•Лота выполнена на ка^зд;-i операторной хирургии и хирургической анатомии с курсами Клинической анлрологии и трансплантологии медицинского ф.1культета Российского Университета дружбы народов и в Экспериментальной лаборатории нейр цитологии НИИ Honга РЛМН.

Ноучныо руководителя:

академик РАМГН,член-корреспондент РАМ», доктор медицинских на/к, профессор

КИРИАТОВСКИЙ И. Д. доктор медицинских наук

ВИКТОРОВ и.в.

ЗДичнальню onnoiioimt: доктор медицинских наук, профессор

ИГНАТЕНКО C.II. доктор медицинских наук, профессор ЮРКИА H.A.

Ведущая организация:

Институт трансплантологии и ИСКУССТЕОИНЫХ органов МЗ F\t>

Защита состоится 1997г. в ™ час.

на заседании диссертационного совета Д 05".22.06 в Российском Университете дружйы народов по адресу: 117198. Москса, ул.ииклухо-иаклоя, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского Университета друхОы народов по адресу: 1171S8, Москва, ул. Шюухо- Ыаклая, б.

Аьтореферат разослан J Ai iV^.'- -1 q9р.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Э.Д.Смирнова.

- 3 -

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМУ. Хирургическое лечение болышх с гипо-Физарной недостаточностью путем пересадки гипофиза решает ряд сложных проблем:пересаиениая «слеза не только восполняет дефицит гормонов и нормализует психический статус больного, но также улучшает его обмен-нне процессы и соматическое состояние.

Принципиально новик подходом било предлошше проф.И.Д.Кирлатовс-ким (1981) пересаживать гипооиз в комплексе с нейросекреторными ядрами переднего гипоталамуса. При этом в гипоталамо-гипофизарном комплексе восстанавливались как артериальный приток,так и венозный отток за счет включения в трансплантат внутренней сонной артерии и кавернозного синуса. По данной методике к настояцему времени им произведено на Клинической базе кафедры опбнативной хирургии 29 операции больным, страдающим Шгсахарним диабетом, пангипопитуитаризмом и вторичным гипогоиа-дизмом.

Однако, органная трансплантация остается на сегодняшний день вмешательством, сопряженным с определенными хирургическими и биологическими трудностями и требующим благоприятных условий для забора транс-, плантата и его консервирования, а такае проведения комплексной иммуно-супрессивной терапии и владения хирургом техникой сосудистого шва (Шумаков В.И.и др.,1994; Karl R.C. et al.,1977; и др.). Поэтому в последние годи, помимо органной трансплантации, ведется разработка методов пересадки культуры клеток соответствующей эндокринной яелезы.

Известны два способа культивирования эндокринных органов: цитоти-. пический, т.е. метод получения монослойних.культур клеток.и органотипи-ческий.т.е. метод получения культуры ткани эмбрионального эндокринного органа.

Большие успехи достигнуты в культивировании бета-клеток поджелудочной келезы и лечения больных с сахарным диабетом (В.Н.Блюмкин и ÄP.,1S30; С.Н.Игнатенко и др.,1991; В4И.Шумаков и др.,1994; A.Anders-son, 1976; и ин.др.), а также интерстициальных эндокриноцитов для лечения больных с андрогенной недостаточностью (И.Д.Кирпатовский, М.Е.Бас-мадиян и др.,198?; 3.У,Browning et а].,1981; и др.).

В то хе время культивирование клеток и ткани аденогипофиза с ле-' чебной целью недостаточно разработан, хотя этот метод представляет 'прекрасную экспериментальнув модель для изучения состояния гормон-

скретируюлих клеток и влияния гипоталамических регуляторов на клеточный состав и Функциональную ак-ивность аденоцитов ( О.П. Федотов и др. , 1 992: РеШип Ргаг.соЬ-е, 1373; и др.).

В частности, ми не нашли в литературе сведения по лечению больных, страдаюцих гипофизарной недостаточностью этим методом, что и определила характер настоящей раСоты. При зтом за основу била взята идея про. И.Д,Кирпачовского совместного культивирования гипофиза с нейросе-креторныки ядрами переднего гипоталамуса и . сочетанной культуральной '

трансплантации гипоталамо-гипофизарно-тестикулярного комплекса.

«

ЦЕЛЬ РЙБОТН: разработать методику изолированного и сочетанного культи-ьиривсшия адеиогипофиза в эксперименте и изучить состояние пересаженной культуры йлло-и ксенотрансплантатов аденогипофиза.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Дать сравнительную оценку статического (монослойного) и ротационного методов культивирования клеток аденогипофиза и семенника.

2. Изучить возможности использования ротационного метода при культивирования ткани аденогипофиза разной видовой и возрастной принадлежности .

3. Провести сроьннгельний анализ изолированного и сочетанного культ и- . нированкя гипофиза.

4. Изучить в динамике состояние пересажанной культуры алло- и ксенотрансплантатов аденогипофиза в эксперименте.

5. Провести клиническую апробацию ксенотрансплантации культуры ткани гипотал.-ичо-гилофизарно-тестикулярного комплекса.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. ' , '<

Впервые разработан ротационный метод получения культуры ткани аденогипофиза и геменииков, обеспечивавший максимально выход гормонпро-дуцирукциих клеток. •

Впервые приведен сравнительный анализ двух методов: статического (получения конослойных клеточных культур) и ротациинного.

Впервые разработана экс: гринентальная модель сочетанного культивирования гипофиза г ядрами переднего гипоталамуса и гонадами.

Впервые в мировой практике проведена клиническая апробация ксенотрансплантации сичетанной культуры ткани гипоталамо-гипофизарно-тес-тикулярного комплекса.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Экспериментально показана целесообразность получения культур» ткани аденогипофиза и семенников ротационным методом. Установлен» максимально допустимне сроки культивирования эндокринной ткани (гипофиз, семенники) яивотних неонатального возраста ротационнннм методом < до ? дней).

Проведены исследования по сочетанноыу культивированию гипофиза с ядрами переднего гипоталамуса и тестикулярной тканью. Обнарумено, что содержание гормонов в питательной среде при сочетанном культивировании гипоталамо-гмпофизарио-тестнкулярного комплекса вдвое выие, чем при изолированном культивировании аденогипофиза и семенников.

Выявлено, что для получения адеиоцитов и интерстициальних эндокри-ноцито'в лучше использовать аденогипофизы и семенники животных неоиатального возраста. "

Установлена целесообразность применения 3-х суточной культури ткани аденогипофиза, полученной ротационным методом. При данном методЬ культивирования и 3-м .суткам в питательной среде выявлено максимальное содержание гормонов (ЛГ.ФСГ.пролактин).

Показано, что сочетанная культура гипоталамо-гипофизарно-тестикуляр-иого комплекса, полученная ротационным методом, монет бить рекомендована в клииину как метод лечения болышх с нарушениями гормонального баланса с организне(гипогонадизм.андрогенная недостаточность,импотенция и т.д.). . •

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Разработанная методика выделения к культивирования ткани аденогипофиза получила практическое .применение при хирургическом лечении больных с секреторным бесплодием и вторичным гипогонадизмом, андрогенной недостаточностью и импотенцией в г. Москве в хирургическом отделении медсанчасти (I 11, являющейся клинической базой кафедри оперативной хирургии и хирургической анатомии с клиническим центром андрологии и пересадки эндЬиришшх органов РУД!! ( зав, кафедрой академик РАНТН, членкор. РАМН, проф..И.Д.Кирпатовский). . '

Материалы диссертации включены в лекционный курс по 1'рансплантоло-гии на кафедре оперативной хирургии и хирургической анатомии РУДН (г. Носква),

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены :

- на научно-клинических конференциях кафедры оперативной хирургии и хирургической анатомии РУДН (г.Москва,1993-1996);

- на- научной конференции молодых ученых медицинского факультета Университета дружбы народов (г.Москва, 1995);

- на 111 Всероссийской научно-практической конференции "Антропогенные воздействия и здоровье человека" (г.Калуга,1996);

- на межвузовской научно-практической конференции, посвященной 85-летию кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии СТМУ "Анатомо-хирургическое и экспериментальное обоснование оперативных вмешательств" (г.Саратов,1996);

- на I- м Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием (г.Москва, 1996)". '

ПУБЛИКАЦИИ.

Основные положения диссертации опубликованы в 5 научных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введейия,обзор« литературы, характеристики материала и методов исследования, результатов собственных исследований, общего заключения,выводов,практических рекомендаций и списка литературы. Обг.'м исследования.- 8 глав, 230 страницы машинописного текста. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 50 рисунками. В спяске литературы 310 источника, из них 150 отечественных и 160 иностранных авторов.

4

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Проведенные исследования носят комплексный экспериментам но-кли-ничесчй характер.

- ? -

Характеристика экспериментального материала

Эксперименталышелсследования включают две части: 1/- разработку и сравнительную оценку разных методов культивирования

зндокришшх органовСаденогипофиз, семенник) ; 2/- экспериментальную оценку результатов трансплантации культуральной . ткани неоиатального аденогипофиза.

Работа проведена с использованием разных видов животных.'В качестве донора били взяти взрослые быки,взрослые и неонатальные (7- дневные) крысы, неонаталыше (5- дневные) поросята.В качестве реципиентов - бес породные половозрелые белке крысы - самцы. Всего проведено 214 эксперимента с использованием 902 животных. Общее количество экспериментального материала представлено в таблице 1.

В первой части экспериментальные исследования проводились по следующим сериям:

- сравнительная оценка культивирования адегогипофиза и семенников статическим и ротационным методами;

-культивирование ткани аденогипофиза разной возрастной категории;

- культивирование ткани аденогипофиза разной видовой принадлежности;

- сочсганное I хиьтивирование гипофиза, ядер переднего гипоталамуса и семенников пеонатальнихС1-диевних) поросят;

- алло- и ксенотрансплантация культуры ткани неоиатального аденогипофиз

С целью проведения сравнительного анализа статического (клеточка культура) и ротационного (тканевая культура) методов культивирования ис пользованы аденогипофизи взрослых аивотных (быки и крысы) и семенники крыс неоиатального возраста.

Для культивирования ротационным методом ткани аденогипофиза разной видовой принадлежности бил выбран один вид животных (крысы), но разного возраста. Следующие эксперименты по культивирование проведены на биологически разных видах нивотных (крыс и поросят), но одного возраста, т.е. неонеталыюго периода (таб.1)

По предлоаенив академика И.Д.Иирпатовпного нами специально . была проведена серия экспериментов по сочетанному культивированию гипофиза с другими биологическими структурами функционально взаймосвязанными меяду собой ( ядра переднего гипоталамуса, гонады), В последующем именно эта серия стала основой для клинической апробации нового метода.

- 3 -

Таблица-1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МАТЕРИАЛА

1 1 Вид |эндокрин-I ной ткани 1 1 Вид |животных Культивирование 1 1 I Трансплантация |

Изолированное Сочетанное |в мышцу | живота 1 1 1 под 1 I оболочку1 | семей- | |ника |

Стати-|Рота-ческий|ционный метод |метод 1 Ротацион нмй метод

I быки 1 11/28 111/22 ______1_______

|ЛД'?ИОГИ-| ПОфИЗ |взрослые |криси ------1------- 1 13/1£0|23/145

|неонаталь I крысы |(7-днев.) 1 123/310 I 15/15 I 36/36 |

|неонаталь |поросята |(1-днев.) 1 110/40 1 15 / 60 | 15/15 I 36/36 1

| Семен-| ник (неонаталь |поросята I (1-днев.) 1 1 1 1 ______1_______

|неонаталь |крысы 1(7-днев.) ------1------- 3/45 |3/30 1 1 -

| Всего: 1 27/193|70/547 1 15 /60 I 30 /30 1 I 72/72 | 1 |

| ИТОГО: 214 / • 902 |

числитель - количество экспериментов знаменатель - количество животных

Вторая часть экспериментального раздела включала и.ппение ,ч.|Л1.-татов пересадки алло- и ксеногешшх трансплантатов культур» ткчни перинатального аденогипофиза, полученного ротациашши методом.

Для этого были проведены две серии экспериментов рлзли'ьтаихся по месту пересадки культуры (мывцо *ивота и семенники взрослых к;чи:>. Всего произведено 102 операции пересадки культур ткини неокагалыкгг') аденогипофиза на 102 животных, из них в мышцу мипота- 30 и в семенник - 72 ( табл.1). Иммносупресивная терапия после операции не применялось.

Все аивоткие содерхались в одинаковых условиях до и после ипера-ции. Виведенио аивотннх из экспериментов и оценка срстояния пересаженных культуральных трансплантатов осуществлялось в одни и те *е запланированные сроки: через 3 дня. 1-2 недели, ], 3 и б месяцев.

В экспериментальной че".ти работы били использоианн следующие методы исследования:

1- Экспериментальный метод -.забор донорского материала (гипофиз, ядра переднего гипоталамуса, семенник) с последувцей его подготовкой к культивированию.

2- Культуралышй метод - получение клеточных и тканевых культур аденогипофиза и семенников статическим и ротационным методами.

3- Трансплантация культуры ткани аденогипофиза ( в мыыцу хивота и под капсулу семенника).

4- Гистологический метод- окраска трипановым голубым, по Романовско-му-Гимза и гематоксилином и эози! :м.

5- Гормональный метод - определение .концентрации гормонов ЛГ.ФСГ, про-лактина и тестостерона в культуральной среде радиоиммунологическим, методом с использованием "kit"- ов , фирмы CIS (Франция).

6-.Метод статистической обработки- с определением достоверности Р< 0,05

Л

При выделении и культивировании аденоцитов и интерстициальных эн-докриноцитов нами был применен способ получения культуры эмбриональных клеток Лейдига, разработанный в 1987 году на нашей кафедре М.Е.Басма-д£ян, И.Д.Кирпатовским, В.Г.Геворкяном и С.С.Гамбаровым (авторское свидетельство N - 1317305). При культивировании ротационным методом был взят способ получения 4 культуры эмбриональных нервных клеток в роллер-ной установке (И.В.Викторов с соавт..1985г.). В процессе работы оба метода были видоизменены по некоторым параметрам.

Для культивирования аденоцитов и интерстицк.¡льних эндокриноцитов статическим методом ( получение монослойных клеточных культур) использовали пенициллиновые флаконы, а ротационным методом культивирование осуществляли в специальных флаконах в мини-роллерной установке в термостате.

Среда для культивирования состояла из 707. минимальной среды Игла, 10%. сиворотки крупного рогатого скота,207. сбалансированного солевого раствора Симмса, 600 нгУ. глюкозы, 0,2 ЕД/мл инсулина и 10-2 М органического буффера НЕРЕ5. Замену ростовой среды проводили каждые 24 часа, Максимальный срок культивирования 7 суток. Ежедневно с поиоцью световой микроскопии изучали гистологические изменения в культуре, а в ели вах среды определяли радиоиммунологическим методом концентрацию гормонов (ЛГ.ФСГ.пролактин.тестостерон).

Для снятия моиослоя из пенициллйновых Флаконов использовали смесь Еерсена и 0,25' 7. растюра трипсина в соотношении 1:1,

Характеристика клинических наблюдений

Культуральная ткань гипофиза, полученная ротационным методом.была применена в условиях клиники. Для этого в Центре андрологии и пересадки эндокринных органоь на кафедре Оперативной хирургии >1 хирургической анатомии Российского Нниверситета дружбы народов (рук. академик И.Л Кирпатовский) впервые в мировой практике выполнена ксенотрансплантация сочетанной культуры ткани неонатального гипофиза, ядер переднего гипота лануса и семенников 20 ' больным, страдающим вторичным гипогонадиз-мом.андрогенной недостаточностью и импотенцией,' бесплодием - с различи!, ми формами нарушения сперматогенеза (табл.2).. .

Ксенотрансплантацию сочетанной культуры ткани гипоталаио-гипо-физарно-тестикулярноги комплекса проводили больных с тяжелыми бесперспективными формами нарушения сперматогенеза и гормонального баланса в организме. Средний возраст больных составлял 30 лет, при продолжительности диагностированной патоспермии 5-7 ле«. До этого пациен-тн длительное время получали комплексную консерватирную терапии.

- и -

включающую антибиотики, фермента и гормональные препаратч. Из 20 больных у 7 в анамнезе отмечены различные хирургические вмешательства, выполненные с лечебно-диагностической целыа.

Таблиц 2.

Распределение больных по нозологическим формам

Нозологические формы Количество больных

Секреторное бесплодие нормоастеноспермия тератоспермия I

олигозооспермия Gravis 10

азооспермия 6

Вторичный гипогонадизм.андрогенная недостаточность и импотенция 3

Всего: 20

Показанием для ксенотрансплактации сочетанной культуры ткани гипофиза явились отсутствие положительного эффекта от длительно проведенной консервативной терапии, продолжительность заболевания и тяжелые степени нарушения сперматогенеза( азооспермия,олигозооспермия gravis и тератоспермия). В зависимости от нозологической формы всем боаьным перед операцией проводились специальные клинические обследов..ния (консультация уролога,сексопатолога,эндокринолога, бактериальный посев и анализ простатического сока, исследование на хламидий, определение гормонов /половых и гонадотропных/ в периферической крови и спермиологи-ческий анализ эякулята).

Тилько но результат«* комплексного клинического обследования консультативно рекался вопрос о необходимости применения данного метода

ДсЧгНИЯ.

Культурл гипофиза,предназначенная для клинической апробации сопро-ьокдались с i< и к м ttac нор том. Б паспортные данные входили: донор культуры, ¡lo.iji.ii-r дшюра, метод культивирования, срок культивирования, состав культуры. «пмлиз культуральной среди на стерильность с помощью свето-1ич и хикргико/м и дата передачи культуры в клинику. В клинике перед с;и-|м1)И1'Л обязательно проводилось бактериологическое исследование кулыур.ыыюй среди и емкого трансплантата, а также определялось содер-ланке гирмоиов а культуральной хидкости.

Культура ткани гипоталамо - гклофизарно - тестккулярного комплекса iifj.i-t,i*iM.ь по разработанной проф. И.Д.Кирпатовскнн ( 1987 ) методике ь пароки¿льнув цель иод белочную оболочку гонад с применением микрохирургический техники. lie нерувая целостность структуры семенных ка-hj.4i,Ui'1i создавллся специальный "карман" в паравазальной цели с помощью мииродилят^торов различного диаметра. После 'введения культуры прецизионный разрез белочной оболочки уциоался одним узловым wbom атравмати-ческой иглой с питье 7/0.

По показаниям у некоторых больных в послеоперационном периоде бил иссл<.до|!ан иммунологический статус. По методу Брауде,Гордман( 19G4) вмодисикации Л.П.Алексеева оценивалось состояние Т-системы иммунитета с пимоцьи реакция бласттрансОормацик лимСоцктов, как стимулированную. Tut; и не стимулированную специфически* мутагеном ФГА. Процентное содержание Т- лимфоцитов определялось по спонтанному розеткообразова-ннв лимфоцитов с эритроцитами барана и В- лимфоциты-с помочь» ЕйС -. розеток, с использованием сухого комплемента морской свинки. Гуморальный иммунитет оценивался По активности комплемента к кокплеменг-связивагких антител к ткани яичка,

"J больиих со вторичным гипогонадизмом.андрогенной недостаточность» и импотенции определялась концентрация гормонов ЛГ.ОСГ.пролактина и тестостерона в сыворотке крови с использованием тест-наборов "radio 1в-ttiinoiissey kit" $ирмы CIS (Франция) и оценивался сексуальный статус.

В связи с тем, что основным критерием.определявшим тяхесть бесплодия, является степень угнетения сперматогенеза, то спермиологический анализ эякулята у больных с бесплодием осуществлялся в достаточно ко-

роткие срони после операции с целью выяснения наличия или отсутствие положительной динамики. Исследования проводились через 1 месяц,3, 0 и 12 месяцев после ксенотрансплантации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ежедневно проводимые гистологические и гормональные наблюдения за состоянием культуры показали, что клетки аденогипофиза взрослых животных (крыс и быков) при статическом и ротационном методах культивирования хорошо переживают в культуре в течение 24 - 48 часов. Начиная с 3-х суток, аденоциты уменьшаются в размерах, ядра их становятся гипер-хромними и к 5- 7 су«кам культура практически погибает.

При статическом (клеточная культура) методе культивирования аденогипофиза взрослых животных максимальная концентрация гонадотропных гормонов(ЛГ.ФСГ) в питательной среде определяется на 5-е сутки, хотя к этому времени большинство аденоцитов подвергаются резким, структурным изменениям.Видимо, происходит выход гормонов в среду из погибших клеток аденогипофиза.

Нами была обнаружена совервенно иная картина пои обоих методах культивирования семенников крыс неонатального возраста'. Интерстициаль-ные эндокриноцип при статическом методе сохраняют свою жизнеспособность и функциональную активность в течение всего периода культивирова-ния(7 дней). Массовой гибели клеток, что имело место при культивировании аденогипофиза взрослых крыс и быков в данном случае не наблюдается, хотя к 7-м суткам культивирования разрушаются межклеточные связи и клетки располагаются достаточно изолировано друг от друга.

При ротационном методе культивирования семенников животных неонатального возраста (крыс и поросят), начиная со 2-х суток интерсти-циальные эндокриноциты образовывают большие скопления в межклеточных пространствах. Вокруг микрофрагмента происходит формирование ограничительного слоя из вновь появившихся клеток. К 5-м суткам в культуре ткани семенников встречаются клетки Яейдига как в стадии митоза, так и в стадии распада. Интерстициальнне эндокриноциты (клетки Лейдига) располагаются небольшими группами. Обширных очагов некроза клеток не

и.|Олюцается. Уровень тестостоона (пе/и1) и культуральной среде максим. 1Л1.них цифр достигает на 3- е сутки культивирования.

Исходя из вшееизлохенного, культуру эндокришшх органов, в частности, аденогипофиза и семенников животных неонатального возраста, кихно получить обоими методами. Одчако ротационный метод обладает значительным преимуиеством над статическим.

Анализируя этапы выделения и приготовления культур статическим методом иохно выделить следувцие его недостатки: -механическое повреждение клеток при обработке материала; -риск инфицирования культуры, который зависит от времени обработки и приготовления культур, т.е. от продолжительности контакта экспериментатора с культивируемым материалом; -продолжительность культивирования;

-экономические затраты, т.е. необходимость наличия дорогостояцей аппаратуры и реактивов (Перколл-градиенты,центрифуги и.т.д.);

Кроме того для получения монослойной культуры с максимальным содержанием гормонов в питательной среде необходимо 7-14 дней, что крайне нежелателен для пилучения культур клеток аденогипофиза, т.к. в процессе культивирования происходит исчезновение многих типов адекоцитов и к 5-7 суткам культивирования сохраняются в основной АКТ и пролак-тннсекретирувиие клетки.

В связи с этим била проведена серия экспериментов с целью выяснении возможности получения ротационным методом культуру ткани аденогипофиза неонатального возраста. В данной серии использован один вид животных (крысы), но разного возраста.

При культивировании аденогипофиза неонатальных крыс, начиная с 3-х суток аденоциты в культуре образуют трабекули и розетки. Вокруг микрофри.мента происходит формирование ограничительного слоя, из вновь образованных клеток. В 3-х суточной культуре неонатального аденогипофиза определяются клетки в стадии митоза. К 5-м суткам культивирования завервается формирование ограничительного слоя вокруг микрофрагмента. Очаги некроза, характерные к этим срокам для культуры взрослой ткани аденогипофиза. в данном случае отсутствуют.

К 7-м суткам культивирования клетки неонатального аденогипофиза уменьшаются в размерах, ядра их становятся гиперхромными. появляются участки в микрофрагменте с разрушенными межклеточными связями.

При гормональном исследовании выявлено, что гормоны (ЛГ.ФСГ и пролактин) определяются в питательной среде в течение 1 дней культиии-рования.

Таким образом, ткань аденогипофиза неонаталышх животных культивируется ротационным методом лучше, чем взрослых особей. В культу ч неонатальной ткани происходит гибель одних и деление других клеток аденогипофиза, значит, данная культура не только перепивает и усливиях fn vitro,, но и растет, активно продуцируя гормоны (ЛГ.ОСГ и пролактин). В то время как взрослая ткань аденогипофиза способна перекипать и куль туре в течение 2-3 суток, затем начинает погибать и первыми п этой куль туре погибают ФСГ- секрс-тируюцие клетки.

Следующая серия экспериментов была проведена с целью выяснения возможности использования ротационного метода при культивировании ткани аденогипофиза разной видовой принадлежности. В качестве истичнико культуры были взяты аденогипофизы разных видов животных, но неонатального возраста (7-дневных крысят и l-дневних поросят).

При культивировании была обнаружена аналогичная гистологическая . картина; начиная со 2-х суток.культивирования также происходит формирование отграничительного слоя вокруг микрофрагмента. К 7-м суткам отмечается увеличение количество аденоцитов с гиперхромными ядрами, хотя встречаются кле.ки аденогипофиза в стадии деления. Выяснилось, что концентрация гормонов (ЛГ, ФСГ и пролактин) в питательной среде максимальных цифр также достигает к 3-м суткам культивирования,затем отмечается ее медленное снижение.

Таким образом результаты культивирования аденогипофиза и семенников разных видов животных (крыс, быки и поросята) ротационным методом показали, что жизнеспособность и функциональная активность культур зависят от возраста животных и не зависят от их биологического вида.

''читывал наличие тесной функциональной взаимосвязи гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы, по предложению академика И.Д.Кирпатовс-кого, нами было проведено сочетанное культивирование этих органов в трех вариантах:

1/- гипофиз и ядра переднего гипоталамуса; , '

2/- гипофиз и семенники; '

3/- гипофиз, ядра переднего гипоталамуса и семенники одновременно.

При гормональной исследовании било выявлено, что содержание гормонов (ЛГ.СЗГ и пролактина) в питательной среде выше, чем при изолированном культивировании в одни и те *е сроки. Так, содержание ЛГ в питательной среде на 3-е сутки составлял - 1,4+0,2 (Ш/и при изолирован' ном культивировании ткани аденогипофиза неонатальных (1-дневных) поросят, а при сочетанием культивировании гипоталамо-гипофизарно-тестику-лярного комплекса уровень ЛГ на 3-е сутки достигал - 2,5 + 0,2 (ШЛ).

При гистологическом изучении совместно культивируемых микрофрагментов гипофиза и семенников выяснилось, что к 3 суткам вокруг микрофрагмента наблюдается формирование ограничительного слоя. В эти «е сроки в микрофрагментах определяются больльшое количество адсноцитов-и интерстициальных зндокриноцитов в стадии митоза.

Н 5 суткам появляются аденоциты мелких и средних размеров. Однако, количество их значительно меньше по сравнению с изолированной культурой аденогипофиза в те ке сроки наблюдения. ' Количество аденоцитов с нормо-хромными ядрами преобладали над количеством аденоцитов с гиперхромными ядрами. . • •

При.-анализе 7 суточной сочетанной культуры гипоталамо-гипофизар-но-тестикулярного комплекса было обнаружено, что гистологическая картина явна не отличается от вивеописанной гистологической картины 5 суточной культуры.

Таким образок при сочетанием культивировании гипоталамо-гипофизар-но-тестикулярного комплекса нам удалось воспроизвести Функциональную взаимосвязь " во флаконе", существующий в организме невду этими органами. '

Культура ткани аденогипофиза неонатальных животных ( 7-дневных крысят и 1-дневных поросят), полученная ротационным методом, подверглась экспериментальной трансплантации под оболочку гонад и в толщу мышцы живота взрослых крыс,

' Результаты трансплантации показали, что место пересадки оказывает зольное влияние на 'состояние пересавенного аденогипофиза,

Б блинайшие сроки (1-2 недели), как в аллогенном, так и в ксено-генном трансплантате появляются участки некробиоза при пересадке в мышцу. Вблизи трансплантатов местами отмечается лимфоидная инфильтрация

В эти же сроки происходит образование тонких волокон соеди"ительной ткани. К 1 месяцу наблюдения трансплантат, как алло-,так и ксеногенный, пересаженный в мышцу полностью погибает и место его локализации замешается соединительной тканью.

При гистологическом исследовании алло- и ксено.-енных трансплантатов культуры ткани аденогипофиза после пересадки (через 2 недели) в семенник выявлено, что клетки аденогипофиза располагаются компактно, ■образуя трабекулы и розетки, в созданно:. "кармане". Иногда встречаются митотически делящиеся аденоциты как в аллогенном, так ив ксеногенном трансплантате. Через 3 месяца после пересадки в области трансплантата наблюдается образование мелких кровеносных сосудов. Явления лимфоидной инфильтрации больше проявляются к этому сроку при ксенотранспланта-ции. Структура семенных канальцев при обоих видах трансплантации не нарушена, с картиной нормального сперматогенеза. Через 6 месяцев после ксенотрансплантации выявлено значительное утолщение капсулы семенника в области локализации трансплантата, а в некоторых случаях ( в 2 из 6 ) сохраняется ее отслойка. Тогда как при аллотрансплантации утолщение капсулы не так заметно. Количество участков с живыми клетками в аллогенном трансплантате больше, чем при ксеногенном.

Таким, образом, анализ пересадки в мышцу неонатального, культу-рального алло- и ксенотрансплантата аденогипофиза показал ее нецелесообразность, так как максимальный срок переживания культуры составляет до 1 месяца.В то же время, алло- и ксеногенные трансплантаты' культуры неонатальной ткани аденогипофиза в семеннике сохраняют свою жизнеспособность в течение 6 месяцев ( максимальный срок наблюдения), не вызывая каких- либо серьезных осложнений со стороны гонад.

Учитывая наилучшие результаты при сочетанием культивировании ги-поталамо-гипофизарно-тестикулярного комплекса и иммунологическую привилегированность семенников для клинической апробации бпа взята 3-х суточная сочетанная культура гипофиза и операции осуществлялись под белочную оболочку гонад больным со вторичным .гипогонадизмом, андрогенной недостаточностью и сеареторным бесплодием, с тяжелыми степенями нарушения сперматогенеза.

Часть больных в послеоперационном периоде получали "мягкую" им-муносупрессивнуи терапию, включающую преднизолон, хорионический гона-дотропин и гепарин.

Через 3 месяца после операции ксенотрансплантации о Клиническом центре андрологии било обследовано 13 человек, через 6 месяцев - 8 и че рез 12 месяцев - 4 (таблица 3),

Таблица 3,

Сроки и результаты культуральной трансплантации

Нозологические формы Сроки наблюдения 3 мес. 6 мес. 12 мес.

Секреторное бесплодие Нормоастено-тератоспермия 1/1 1/1 1/1

Олигозооспериия gravis 6/0 5/5 2/1

Азооспермия 3/2 2/2 1/1

Вторичный гиш андрогенная н импотенция згонадизм, ^достаточность, 3/3

Всего 13/12 8/8 4/3

числитель- количество оперированных больных знаменатель- количество больных с улучшением спермиологи-ческих и гормональных показателей

Из 20 ксенотрансплантации сочетанной культуры ткани гипофиза линь в I случае била отмечена картина острого реактивного орхита.у остальных больных (19) - операция и послеоперационный период протекали без осложнений. Иммунологические исследования, проведенные пйсле операции и спустя несколько месяцев,свидетельствовали об отсутствии реакции отторжения трансплантата в период наблюдения.

При анализе эякулята било выявлено положительное влияние операции ксенотрансплантации на все показатели сперматогенеза(обций объем,количество подвижных и морфологически нормальных форм и т.д.).

У больного с тератоспермией и астеноспермией ( до операции: 8? 7. - количество морфологически аномальных форм сперматозоидов и 25 У. - количество подвижных форм) наблюдалась нормализация сперматогенеза по всем критериям в течение всего года( максимальный срок наблюдения). Так,через 3 месяца после операции количество подвижных(активно-и малоподвижных) форм соответствовало - 68 7. , а количество морфологически аномальных -форм уменьшилось до 10 7. в исследуемом эякуляте.

Увеличение количества подвижных форм (активно- и малоподвижные) на 407. по сравнению от исходных величин отмечено у больных с нарушениями в виде олигозооспермии gravis.Однако, у пациентов с азооспермией -лиаь у некоторых (смлабл.З) появляются единичные подвижные и морфологически нормальные формы сперматозоидов. Хотя положительная динамика сохраняется в течение всего периода наблюдения.

У больных со вторичным гипогонадизмом, андрогенной недостаточ ностью и импотенцией также наблюдалось улучвение гормонального, андро-логического и сексуального статуса. При этом, у лиц более молодого возраста положительный эффект операции был выражен ярче, чем у лиц пожилого возраста. .

ВЫВОДИ.

1. Для получения культуры аденогипофиза и семенников можно использовать как статический метод "(клеточная культура), так и ротационный (органная культура). Культивирование статическим методом требует многоэтапной' об работки исходного материала, что приводит к увеличению риска механичес кого повреждения клеток. Ротационный метод технически .легко выполним и обеспечивает получение культуры с минимальным повреждением гормонсек ретируючих клеток.

2. Максимальной выход гонадотропных (ЛГ.ФСГ и пролактин) и полових(тес-' тостерон) гормонов в "питательную среду при статическом методе культивирования аденогипофиза и семенников отмечается на 5-е сутки, а при ротационном - на 3-е сутки. К 7 суткам секреция 9t«x гормонов резко снижается при обоих методах культивирования за исключением пролактина.

3. культивирование, аденогипофиза разной видовой принадлежности (быки, поросята л крысы) ротационным методом практическл приводит к однородным результатам, В то те время гипофиз и семенники, взятые от неона- • тальных животных культивируются лучше, чем от взрослых особей.

4. Продолжительность жизни культуры ткани аденогипофиза зависит от. места пересадки, Семенник животных благодаря наличию "гематотестику-

• лярного барьра" является привелигированнои зоной для аллотранспланта-. ции: пересаженные под оболочку семенника клетки аденогипофиза остаются жизнеспособными в течение 6 месяцев (максимальный срок наблюдения), в то время как в мышце живота - лишь до 'одного месяца.

5. При .пересадке в семенник явных, различий между аллогыными и ксено-генныыи трансплантатами культурального'аденогипофиза не выявлено, несмотря на то, что иммуносупрессивная терапия не применялась.

6. При сочетанном культивировании ротационным методом гипофиза с ядрами переднего гипоталамуса и тестикулярной тканью содержание гормонов ЛГ, ФСГ. пролактина и тестостерона _в питательной среде вдвое выше во все сроки наблюдения, чем при изолированном культивировании,

?.. При клинической апробации разработанного метода сочеташшго культивирования гипоталамо-гипофизарно-тестикулярного комплекса неонаталышх поросят больным с секреторным бесплодие«, а также со вторичным гипого-надизмом и а'ндрогенной недостаточностью отмечена положительная динамика в снермиологических и гормональных показателях ( максимальный сргк наблюдения - 1 год), ' •

ПРАКТИЧЕСКИЕ'РЕКОМЕНДАЦИИ '

1. Для культивирования ткани аденогипофиза и семенников разной видовой принадлежности 'следует рекомендовать 'Применение ротационного метода.

2. Для получение культур аденоцитов и интерстициальных эндокриноцитов |н- ационным методом целесообразно использовать неонатальные адено-гипофизы и семенники. ' •

■¿г

3. Для клинических целей лучше использовать сочетанную 3-х суточную культуру гипоталамо-гипофизарно-тестикулярного комплекса.

4. Операции ксенотрансплангацш сочетанной культуры гипоталамо-гипо-физарно-тестикудярного комплекса следует производить под белочную оболочку гонад с применением микрохирургической техники.

5. Ксенотрансплантацию сочетаний культуры ткани гипофиза в гонады можно рекомендовать как перспективный метод лечения мужского секреторного бесплодия с тяжелыми и средними степенями нарушения сперматогенеза и при эндокринных формах импотенции.

СПИСОК работ, опубликованных по материалам "чссертации.

1. Каитова З.С. .Кирпатовский И. Д. .Лысенко Д.И. Культивирование ткани аденогипофиза разных возрастных групп //Антропогенные воздействия

и здоровье человека:Сбор.докл. 3-я Всероссийская научно-практ. конф. Калуга,1996г.

2. КирпатовскийИ.Д., Каитова З.С. .Викторов И.В.,Рахманова Г..Л.

Первые клинические наблюдения ксенотрансплантации сочетанной культуры ткани неокатального аденогипофиза и яичка в клинике //Новые технологии в медицине:Тез.докл.Научно-практич.конф.Москва, 1996г.-С26-S.7

3.Лысенко А.И. .Смирнова Э.Д.,Каитова З.С. Мужская гонада как иммупо-логически привилегированная область при трансплантации.Морфологическая оценка пересаженной аллогенной ткани аденогипофиза.//"эвые технологии в медицине:Тез.докл. Науч.-практ.конф.Москва,1996г.-С 28-31.

4.Кирпатовский И.Д..Каитова З.С..Рахманова Г.А..Баскаков В.В. Соче-танная ксенотрансплантация культуры ткани аденогипофиза в кдики-ке//Анатомо-хирургическое и экспериментальное обоснование оперативных вмешательств:Тез.докл.Науч.конф.Саратов, 1996г.-С 18-19.

5.Кирпатовский И.Д..Каитова З.С..Викторов И.В. Культуральная трансплантация гонад,гипофиза' и ядер гипоталамуса при мужском бесплодии и эндокринной импотенции //Тез.докл.1-й Российский конгресс по патофизиологии. Москва, 1996г.- С. 318-319' . "

ZINFJRA SULTAN-MURATOVNA KAITOVA

/

TRANSPLANTATION OF CULTURED TISSUES OF NEONATAL ANTERIOR PITUITARY

Comparartive analysis of static (culturcd culls) and rotation (culture of organs) methods of cultivation was carried out which proved the advantage of rotation mathod.

For tiie first time in the world's practice there was fulfilled experimental researches on combination cultivation of hypophysis with nucleus of interior hypothalamus and testis by ir^ans of rotation method. !i was proved that while using combination cultivation of hypothalamus hypophysis tcsties complex the content of hypophysis and sexual hormones in cultivated medium is more at any time of observation than isolated cultivation method gives.

There was carried out xenotransplantation of combination culture of hypophysis in clinic for patients suffering from infirtility (azoospermia, teratospermia and oligozoospemia gravis) and for patients with hypogonadotrcpism, impotiency. There research showed improvement and balance of spermatogenesis and hormonal indices after xenotransplantation.