Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Толерантность головного мозга к ишемии и течение реперфузионного синдрома в условиях модулирования активности кининовой системы

, ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ОРОБЕЙ МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ТОЛЕРАНТНОСТЬ ГОЛОВНОГО МОЗГА К ИШЕМИИ И ТЕЧЕНИЕ РЕПЕРФУЗИОННОГО СИНДРОМА В УСЛОВИЯХ МОДУЛИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ КИНИНОВОЙ СИСТЕМЫ

14 00 16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

uudi64721

Новосибирск - 2008

003164721

Работа выполнена в ГОУ ВПО Алтайском государственном медицинском университете Росздрава, Алтайском филиале НИИ Физиологии СО РАМН (г Барнаул)

Научный руководитель.

доктор медицинских наук профессор

Официальные оппоненты*

член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук профессор

Ведущая организация

Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им академика Е Н Мешалкина Росздрава

Защита диссертации состоится «_» 2008 г в 10 00 часов на

заседании Диссертационного совета Д 208 062 04 при Новосибирском государственном медицинском университете Росздрава по адресу 630091, г Новосибирск Красный проспект, 52, тел 8 (3832)29-10-83

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета

Автореферат диссертации разослан «_» февраля 2008 г

Куликов Владимир Павлович

Киселев Валерий Иванович

Начаров Юрий Владимирович

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208 062 04 доктор медицинских наук, профессор

Белоусова Т В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Широкое распространение сосудистых заболеваний

сопровождающихся ишемией головного мозга и приводящих к инвалидизации и смертности населения трудоспособного возраста делает актуальным разработку методов повышения толерантности головного мозга к ишемии (Гусев Е И Скворцова В И . 2001, Biott Т, Bogousslavsky J 2000, Lo Е H , Dalkara T Moskowitz M A , 2003, Collins T С , Petersen N J , Menke T J и соавт , 2003, Agapova T Y , Agniullin Y V и соавт , 2007)

Расширение фармакологических и хирургических возможностей рециркуляции в ишемизированных органах помогли установить существование не только ишемических, но и реперфузионных повреждений Это создало представление об ишемии, как комплексном двухэтапном процессе, в котором повреждения, возникающие при острой ишемии усугубляются или приобретают необратимый характер при восстановлении кровообращения (Биленко M В , 1989, Гавриленко А В . Деменьтьева И И , Майтесян Д А и соавт , 2002 Antoniucci D, Valenti R, Mighorini A и соавт , 2001, Widimsky P 2002, Asiedu-Gyekye IS Vactorovich A, 2003) Общепризнано, что поиск методов уменьшения реперфузионных повреждений может быть достигнут путем углубленных патофизиологических исследований (Гусев Е И , Скворцова В И 2002)

Одним из важных подходов к повышению толерантности головного мозга к ишемии может быть модулирование активности калликреин -кининовой системы Многими авторами было показано, что при тяжелой черепно-мозговой травме (Prunea U D , Paquet J L , Luccarini J M и соавт , 1999, Prunea U D Chorn Y I. Benkovitz V и соавт , 1999, Verrecchia С , Mesenge С , Plotkme M и соавт , 2000, Rachinsky Y M , Prunea U D , Artru A и соавт , 2001, Kaplanski J , Pruneau D , Asa I и соавт 2002), ишемическом и геморрагическом инсульте (Wagner S , Kalb P , Lukosava M , Hilgenfeldt U и соавт, 2002) происходит активация кининовой системы в артериальной, венозной крови и ликворе

Постулируется как патогенетическое (Семенютин В Б , Зубков Ю H , Ломова И П и соавт , 2000), так и саногенетическое (Ping А , Chun Z X , Xue X Y и соавт , 2005, Xia С Г , Yin H , Boriongan С V и соавт 2006) значение активации калликреин - кининовой системы при ишемии/реперфузии головного мозга

Многими исследователями установлено, что гиперкининогенез при ишемии/реперфузии вызывает дилатацию церебральных сосудов (Brian J, Faraci F M , Moore S A , 2001), нарушает мозговую ауторегуляцию (Whalley ET , Wahl M 1983, Unterberg A и соавт, 1984), повышает проницаемость мозговых сосудов (Wahl С M и соавт , 1996, Sarker M H , Hu D E , Faser P A , 2000) Это способствует отеку головного мозга, нарушает 1ематоэнцефалический барьер, что в последствии приводит к нейрональным

повреждениям (Francel PC 1992, Walker К и соавт 1995, Plesnila N Schulz I Stoftel M и соавт 2001) Однако в других работах показан нейропротективный эффект активации кининообразования при ишемическом повреждении головного мозга (Xia С F , Yin H , Borlorigan С V и соавт , 2004 Ping А , Chun Z X , Xue X Y и соавт , 2005, Chao J , Chao L , 2006)

Возможно, противоречивость данных вызвана различными методологическими подходами и отсутствием комплексных исследований в этом направ тении

Цель исследования Установить патофизиологическое значение активности калликреин - кининовой системы при ишемии и реперфузии головного мозга

Задачи исследования

1 Исследовать влияние модулирования активности кининовой системы на продолжительность жизни головного мозга при ишемии у крыс

2 Исследовать состояние локального мозгового кровотока при ишемии и реперфузии головного мозга у крыс в условиях модулирования активности кининовой системы

3 Исследовать выраженность повреждения головного мозга при ишемии и реперфузии у крыс в условиях модулирования активности калликреин-кининовой системы

4 Исследовать связь кининообразования с локальным мозговым кровотоком и выраженностью повреждения при ишемии/реперфузии головного мозга у крыс

Научная новизна

Впервые установлено, что активация кининообразования трипсином укорачивает продолжительность жизни головного мозга у крыс при его тотальной ишемии способствует развитию гипоперфузии в реперфузионном периоде сопровождается интенсификацией свободно - радикального окисления метаболического ацидоза и усилением повреждения нейронов головного мозга

Впервые показано, что угнетение активности кининовой системы контрикалом при тотальной ишемии головного мозга у крыс способствует увеличению толерантности головного мозга к ишемии и препятствует развитию феномена «no-reflow» в реперфузионном периоде

Практическая значимость Результаты исследования, показавшие, что угнетение активности кининовой системы контрикалом вызывает выраженное увеличение толерантности головного мозга к ишемии и предупреждает развитие феномена невосстановленного кровотока в реперфузионном периоде, позволяют рекомендовать использование ингибиторов протеаз в том числе и контрикала, для профилактики

ишемических и реперфузионных повреждений при нарушениях мозгового кровообращения

Внедрение результатов исследования Результаты исследования применяются в чтении лекций на кафедре патофизиологии, функциональной и ультразвуковой диагностики Алтайского государственного медицинского университета Росздрава, на кафедре патофизиологии Красноярской медицинской академии Росздрава

Положения, выносимые на защиту

1 Калликреин - кининовая система принимает участие в патогенезе ишемического и реперфузионного повреждения головного мозга Активация кининообразования способствует сокращению продолжительности жизни головного мозга у крыс при ишемии и усугубляет течение реперфузионного периода Угнетение кининообразования способствует повышению толерантности головного мозга к ишемии и препятствует развитию реперфузионных осложнений

2 Активация кининовой системы в реперфузионном периоде приводит к снижению локального мозгового кровотока, сопровождается интенсификацией свободно - радикального окисления, метаболическим ацидозом и выраженным повреждением головного мозга у крыс

3 Угнетение кининообразования в реперфузионном периоде препятствует развитию феномена «по-геПо\у», сопровождается уменьшением активности свободно - радикального окисления и лактат - ацидоза и менее выраженной степенью повреждения головного мозга у крыс

Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференциях «Молодежь - Барнаулу» в Алтайском государственном медицинском университете в ноябре 2003, в апреле 2003г в ноябре 2004г , в ноябре 2007г

Публикации По теме диссертации опубликовано 4 научных работы из них одна в ведущем рецензируемом издании

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования глав с описанием собственных исследований и обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 14 рисунками Список литературы содержит 256 цитируемых источника, из них 88 отечественных и 168 зарубежных авторов

Личный вклад автора Весь материал представленный в диссертации получен, обработан и проанализирован лично автором

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использовалось 177 половозрелых крыс - самцов линии \Vistai Данные о животных, использованных в различных экспериментальных сериях, представлены в таблице 1

Модулирование активности капликреин-кининовой системы осуществлялось внутрибрюшинным введением следующих препаратов Для угнетения кининообразования использовался контрикал

(Арцнеймиттельверк, Германия) ингибитор калликреина в дозе 5000 ЕД/кг (Киселев В И Панченко А Л Шахматов И И и соавт 1985, Мухутдинова ФИ 1999) Угнетение кининоразрушения создавалось применением ингибитора АПФ - энапом (К.ЯКА Словения) в дозе 0 25 мг/кг (Аджиенко Л М 2000) Ингибиторы АПФ предотвращают расщепление брадикинина до неактивных продуктов (Ванхутте ПМ, 1996) Активация

кининообразования проводилась трипсином (СПОФА Чехословакия) в дозе 0 8 мг/кг (Мешалкин ЕН и соавт, 1982) Крысы контрольной группы получали физиологический раствор (ЫаС1 0,85%) АД к началу эксперимента у животных контрольной и экспериментальных групп значимо не различалось

Таблица 1

Характеристика животных, использованных в эксперименте

Серия Контрольная группа Экспериментальные группы

Количество животных Масса животных Количество животных Масса животных

1 Толерантность головного мозга к ишемии на фоне модулирования активности ККС 17 270±20,3 40 275±10,6

2 Измерение ЛМК при ишемии и реперфузии головного мозга на фоне модулирования активности ККС 20 296±18 3 60 280±20 4

3 Активность СРО, ККС и уровень маркеров повреждения в плазме при ишемии и реперфузии головного мозга при модулировании активности ККС 10 310±15,0 30 300± 16,7

Примечание Животные контрольных и экспериментальных групп в разных сериях не отличались по массе тела

На первом этапе исследовали толерантность головного мозга к тотальной ишемии на фоне модулирования активности кининовой системы Для этого производилась одномоментная перевязка магистральных артерий

головы: справа - брахиоцефального ствола, слева,- общей сонной и подключичной артерий, в первом сегменте, до отхождения позвоночной артерии (Тельпухов В.И.. Тренин С.О., Князев Г.Д. и соавт., 1985) (рис. 1).

Рис.1. Модель создания тотальной ишемии головного мозга. Примечание: I-общая сонная артерия: 2-

подключичная артерия;3-

позвоночная артерия;4-

внутригрудная артерия.

После перевязки сосудов питающих мозг производилась регистрация биоэлектрической активности головного мозга, дыхания и сердцебиения на программном аппаратном комплексе «МБП - НЕЙРОКАРТОГ РАФ - 4» (Россия). Регистрация продолжалась до появления изолинии на электроэнцефалограмме, что соответствовало смерти мозга (рис 2).

Рис.2. Характеристика биоэлектрической активности мозга (1), сердечной деятельности (2), дыхания (3) у животного контрольной группы.

Следующим этапом исследования являлось определение локального мозгового кровотока при неполной ишемии и последующей реперфузии головного мозга в условиях модулирования активности кининовой системы. Неполную ишемию головного мозга создавали путем наложения лигатур на обе общие сонные артерии. Ишемический период составлял 30 минут. Затем в течение 60 минут проводилась реперфузия головного мозга. Животные выводились из эксперимента декапитацией.

ЛМК измерялся в теменной области в коре головного мозга Регистрация ЛМК осуществлялась методом водородного клиренса (Демченко ИТ, 1976) на полярографе ПУ-1(Россия) Скорость вымывания водорода которая соответствовала ЛМК записывалась в виде полярографической кривой (рис 3)

водорода из ткани головного мозга

Расчеты ЛМК выполнялись по формуле t= H-K/SMOO мл/100г/мин где j- кровоток через орган (мл/100г/мин), Н - максимальное значение кривой клиренса (мм), К - скорость лентопротяжки (мм/мин), S - площадь под кривой клиренса (мм2) Измерение ЛМК проводилось до эксперимента на 1 и 30 минутах ишемии, на 1, 5, 10 минутах после восстановления кровотока и затем через каждые 10 минут до конца реперфузионного периода

Для определения маркеров повреждения головного мозга и активности кининообразующих ферментов кровь получали из сагиттального мозгового синуса Для получения плазмы кровь центрифугировали при 3000 об/мин (1200g) в течение 20 минут Все манипуляции с плазмой производили при комнатной температуре и без контакта со стеклом или другими отрицательно заряженными поверхностями Плазму разливали в полистироловые пробирки и замораживали Перед исследованием плазму размораживали при 37°С и в дальнейшем держали при комнатной температуре Повторное замораживание и оттаивание образцов не допускалось

Уровень молочной кислоты и активность креатинкиназы в плазме определяли с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «Витал Диагностике СПб» (Санкт-Петербург) Концентрацию малонового диальдегида в плазме крови определяли по методике Владимирова Ю М и Арчакова А И (1972) Измерения проводили на спектрофотометре СФ-4 (Россия)

Уровень прекалликреина и калликреина в плазме определяли при помощи хромогенного субстрата D-про-фен-арг-п-нитроанилин (S-2302) (фирма «Chromogemx», Швеция) по методике С Kluft в модификации Кузнецова В А (Кузнецов В А, 1984) Определение активности ферментов проводили кинетическим методом на спектрофотометре RA -50 «Technicon» (Германия)

Статистические расчеты производили с помощью пакета программ Statistica for Windows 6.0. Для каждой выборки вычисляли среднюю арифметическую (М). стандартное отклонение (SD). Достоверность различий исследуемых выборочных оценивали по критерию Стыодента (t) и значению вероятности (р). Статистически достоверными считались различия, уровень значимости которых был р < 0,05. Для вычисления взаимосвязи между показателями использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первым этапом исследования было изучение толерантности головного мозга к тотальной ишемии на фоне модулирования активности кининовой системы (рис.4).

Рис. 4. Время сохранения биоэлектрической активности головного мозга после перевязки магистральных артерий головы. Примечание: 1- животные контрольной группы; 2 - животные, получавшие трипсин: 3 - животные, получавшие энап; 4 - животные, получавшие контрикал; * - звездочкой обозначена величина, достоверно отличающаяся от контроля (р< 0,01 ).

Из рисунка видно, что у животных контрольной группы при тотальной ишемии головного мозга биоэлектрическая активность сохранялась 9,0±2,6 минуты, что соответствовало литературным данным (Тельпухов В.И., Тренин С.О.. Князев Г.Д. и соавт., 1985). Активация кининовой системы трипсином укорачивала продолжительность жизни головного мозга в среднем на 23%. Продолжительность биоэлектрическая активность головного мозга у животных, которые получали энап, не отличались от крыс контрольной группы. Угнетение кининообразования контрикалом удлиняло продолжительность жизни головного мозга в среднем на 50%, т.е. способствовало повышению толерантности головного мозга к ишемии.

Анализ литературных данных показал, что патогенетическое значение кининообразования при ишемии головного мозга объясняется увеличением проницаемости эндотелия мозговых сосудов (Sarker M.N., Hu D.E., Fraser P.A., 2000), сопровождается интенсификацией процессов свободно -

радикального окисления (Rosenblum W.I., 1987; Relton J.. Beckey V.E.. Hanson W.L. et ai., 1997; Sobey C.G.. Heistad D.D., Faraci F.M., 1997; Sarker M.H.. Hu D.E., Faser P.A., 2000; Brian J„ Faraci F.M., Moore S.A.. 2001). стимулированием образования цитокинов, адгезией и инфильтрацией лейкоцитов (Relton J., Beckey V.E., Hanson W.L. и соавт., 1997; Barone F.С., Feuerstein G.Z., 1999; Sobey C.G., 2003). В ряде работ показано, что стимуляция В2 рецепторов способствует активации глютамат - кальциевого каскада (Parpura V.. Basarky Т.A.. Liu F. и соавт., 1994; Jeftinija S.D., Jeftinija К.V.. Stetanovic G. и соавт.. 1996; Sobey G.G.. Heistad D.D.. Faraci F.M.. 1997; Kreslake - Hands S., Fraser P.A., 1998; Rydh-Rinder M., Kerekes N.. Svensson M. и соавт., 2001).

Таким образом, модулирование активности кининовой системы изменяет толерантность головного мозга к ишемии. Стимулирование кининообразования трипсином укорачивает биоэлектрическую активность головного мозга после перевязки магистральных артерий головы. Угнетение кининовой системы контрикалом способствует пролонгированию жизни головного мозга при тотальной ишемии. Полученные результаты, вероятно, объясняются тем. что апротинин. угнетая кининообразующие ферменты, способствует уменьшению проницаемости капиллярной стенки мозговых сосудов и снижает выраженность отека головного мозга, тем самым, повышая его толерантность к ишемии.

Следующим этапом исследования была оценка локального мозгового кровотока в условиях модулирования активности кининовой системы при неполной ишемии и реперфузии головного мозга.

Результаты измерения ЛМК при ишемии/реперфузии головного мозга у животных контрольной группы отражали закономерное течение реперфузионного синдрома, описанное в литературе (Биленко М.В., 1989: Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). и показали адекватность используемой модели ишемии головного мозга (рис.5).

Ишемия0 1 5 10 20 30 40 Исход Ролорфузия

Рис. 5. Динамика локального мозгового кровотока у крыс в процессе ишемии и реперфузии головного мозга у животных контрольной группы. Примечание; ** - двумя звездочками обозначен уровень ЛМК, достоверно отличающийся от исходного ЛМК (р < 0.01).

Из рисунка видно, что перевязка общих сонных артерий приводила к уменьшению кровотока в 1,6 раза. После восстановления мозговой перфузии максимальная постишемическая гиперемия соответствовала 20 минуте реперфузии. В конце реперфузионного периода развивался феномен «по-геПо\¥».

Активация кининообразования трипсином нарушала закономерное течение реперфузионного периода и способствовала выраженному снижению мозговой перфузии (рис.6).

Как видно из рисунка, восстановление кровотока приводило к нарастанию ЛМК, однако периода постишемической гиперперфузии не наблюдалось. При этом на 40-й минуте реперфузионного периода ЛМК составлял в среднем 82,3% . что соответствовало периоду гипоперфузии. Подобный результат можно объяснить вазодилятацией, повышением проницаемости мозговых капилляров и стимулированием миграции лейкоцитов (Мешалкин Е.Н. и соавт., 1982).

Исход Ишемия Реперфузия

Рис. 6. Динамика локального мозгового кровотока у крыс в процессе ишемии и реперфузии на фоне активации кининообразования трипсином. Примечание: * - одной звездочкой обозначен уровень ЛМК, достоверно отличающийся от исходного ЛМК (р < 0,05); ** - двумя звездочками обозначен уровень ЛМК. достоверно отличающийся от исходного ЛМК (р < 0.01); + - одним крестиком обозначен уровень ЛМК, достоверно отличающийся от ЛМК контрольной группы (р < 0,05); ++ - двумя крестиками обозначен уровень ЛМК. достоверно отличающийся от ЛМК контрольной группы (р < 0,01).

В группе животных, которые получали энап отмечалось усугубление гипоперфузии головного мозга в реперфузионном периоде (рис.7).

Из рисунка видно, что в ишемический период ЛМК соответствовал контролю. В период гиперперфузии ЛМК составлял 143% от исходного уровня, что на 10,5 % выше, чем в контрольной группе. У животных этой группы в отличие от контроля, феномен «по-геНош» приходился на 50-ю минуту реперфузионного периода, при этом ЛМК уменьшался в 1,3 раза.

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

1 зо Исход Ишемия

Ре перфузия

Рис. 7. Динамика локального мозгового кровотока у крыс в процессе ишемии и реперфузии на фоне угнетения кининоразрушения энапом. Примечание: ** - двумя звездочками обозначен уровень ЛМК. достоверно отличающиися от исходного ЛМК (р < 0,01); + - одним крестиком обозначен уровень ЛМК. достоверно отличающийся от ЛМК контрольной группы (р < 0,05); ++ -двумя крестиками обозначен уровень ЛМК. достоверно отличающийся от ЛМК контрольной группы (р < 0,01).

Логично предположить, что полученный нами результат связан с накоплением брадикинина, который усиливал выраженность сосудистых реакций. При этом повышение напряжения сдвига могло способствовать активированию локальной калликреин - кининовой системы в артериальной стенке, и вызвать вазодилатацшо, индуцированную повышенным кровотоком (Ванхутте П.М., 1996). Гипероксия в раннем реперфузионном периоде могла приводить к повреждению мембранных структур клеток, интенсифицировать процессы ПОЛ, ухудшать показатели локальной гемодинамики и усиливать проявление феномена «по-геАо\у» (Биленко М.В.. 1989).

Анализ литературы показал существование разнонаправленных точек зрения на значение ингибиторов АПФ при ишемии и реперфузии головного мозга. В ряде исследований (Гаевый М.Д. и соавт., 1999; Кожевникова Е.В. и соавт.. 1999) показано, что использование эналаприла в начале реперфузионного периода увеличивало процент выживаемости крыс и предупреждало развитие постишемического феномена невосстановленного кровотока.

Противоположные результаты исследования были получены в работе М.А. МаШЫ и соавт. (1995) и М. Наша1 и соавт. (2006). Введение животным эналаприла при перевязке средней мозговой артерии не способствовало уменьшению площади инфаркта и выраженности оксидативного стресса и приводило к ухудшению локальной мозговой перфузии в реперфузионном периоде.

Угнетение кининообразования контрикалом у животных препятствовало развитию реперфузионных осложнений после ишемии головного мозга (рис.8).

Из рисунка видно, что в ишемическом периоде мозговая перфузия, так же как и у крыс контрольной группы, снижалась в 1.8 раза. Восстановление кровотока сопровождалось периодом «роскошной перфузии», которая приходилась на 20 минуту реперфузионного периода. В дальнейшем происходило снижение мозгового кровотока, но периода «нищей перфузии» не наблюдалось до конца эксперимента, при этом ЛМК на 60 минуте реперфузионного периода составлял 103,4±21,2% от исходного.

Исход Ишемия Реперфузия

Рис. 8. Динамика локального мозгового кровотока у крыс в процессе ишемии и реперфузии головного мозга на фоне угнетения кининообразования контрикалом. Примечание: * - одной звездочкой обозначен уровень ЛМК, достоверно отличающийся от исходного ЛМК (р < 0.05); ** - двумя звездочками обозначен уровень ЛМК, достоверно отличающиися от исходного ЛМК (р < 0,01); + - одним крестиком обозначен уровень ЛМК, достоверно отличающийся от ЛМК контрольной группы (р < 0.05).

В современной литературе лишь единичные работы посвящены изучению влияния кининовой системы на мозговой кровоток в реперфузионном периоде после ишемии головного мозга.

На модели переднемозговой ишемии у крыс В.Б. Семенютиным и соавт. (2000) изучалось церебральное внутрисосудистое кининообразование и его влияние на локальный мозговой кровоток в реперфузионном периоде. Было установлено, что течение реперфузионного периода и активность кининообразования зависели от уровня остаточного мозгового кровотока. При минимальном остаточном кровотоке возобновление перфузии способствовало развитию длительной гиперемии по времени совпадающее с выраженным церебральным внутрисосудистым кининообразованием и развитием вазогенного отека мозга. Авторы считают, что длительное кининообразование становится фактором нарушения ГЭБ и способствует возникновению отека мозга и не восстановленному кровотоку в

реперфузионном периоде, приводящему к гипоксии и метаболическому ацидозу

Данных о влиянии контрикала на мозговой кровоток в реперфузионном периоде в доступной литературе найдено не было При этом НН Кипшидзе и соавт (1986) "было показано, что применение контрикала уменьшает реперфузионные нарушения кровотока после ишемии миокарда В исследованиях С Р Spanos и соавт (2007) использование апротинина при ишемии кишечника способствовало сохранению кровотока в реперфузионном периоде, уменьшало выраженность некроза и сглаженность ворсинок кишечника При этом вероятно, нельзя напрямую переносить наши данные на литературные хотя можно говорить об общей направленности результатов исследований

Таким образом, модулирование активности кининовой системы влияет на уровень мозгового кровотока в реперфузионном периоде Активация кининообразования трипсином препятствует возникновению периода гиперперфузии после восстановления кровотока и способствует более быстрому развитию «нищей перфузии» Угнетение кининообразования контрикалом способствует сохранению мозгового кровотока в реперфузионном периоде и препятствует развитию феномена «no-reflow» Использование энапа в качестве препарата угнетающего кининоразрушение усугубляет гипоперфузию в реперфузионном периоде

Для оценки степени повреждения головного мозга при ишемии и реперфузии в условиях модулирования активности кининовой системы исследовали уровень маркеров повреждения в плазме венозной крови, отражающие процессы свободно - радикального окисления, выраженность лактат - ацидоза и цитолиза (табл 2)

Таблица 2

Содержание маркеров повреждения в плазме крови при ишемии и реперфузии головного мозга у крыс (М±0)

Показатель Контроль (физ р-р) п=10 На фоне модулирования активности кининовой системы

Трипсином п=10 Энапом п=10 Контрикалом п=10

Лактат (ммоль/л) 4,3±0,49 5,2±0,54** 3,4±0,83** 1,9±0,83**

МДА (мкмоль/л) 4,7±0,65 5,5±0 28** 4,4±0,34 1.8±0,47**

КФК (U/л) 328,5±56,6 480±126,6** 328,5±43 9 225,7±22,1**

Примечание ** - двумя звездочками обозначена величина достоверно отличающаяся от контрольной группы (р < 0 01)

Из таблицы видно, что активирование кининогенеза трипсином способствовало интенсификации процессов свободно - радикального окисления, что отражалось в возрастании концентрации МДЛ в 1,2 раза по сравнению с контролем При этом усиливалась активация анаэробного гликолиза, о чем можно судить по увеличению уровня лактата в плазме на 21% в отличие от контроля Повышение активности КК в плазме на 46 1% в отличие от животных контрольной группы, соответствовало выраженному повреждению биомембран клеток ЦНС Таким образом активирование кининообразования увеличивало степень повреждения головного мозга

По уровню МДЛ и активности КК в плазме крови животные которым вводился энап не отличались от контроля При этом уровень молочной кислоты был на 20,9% ниже, чем у животных контрольной группы Для подобного результаты не было найдено простого объяснения

У животных, получавших контрикал, степень повреждения головною мозга была менее выражена На это указывало уменьшение концентрации МДА в 2 6 раза в сравнении с контролем В сравнении с контрольной гр>ппой, угнетение кининообразования уменьшало С1епень перехода нейронов на анаэробный гликолиз что выражалось в снижении уровня лактата в ппазме на 55,8% Активность КК была ниже на 31 3% в отличие от контроля

В исследованиях МИ Баканова и соавт (2001) была установлена четкая зависимость между активностью креатинкиназы в сыворотке и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) и тяжестью перенесенной внутриутробной гипоксии Авторы объясняют присутствие креатинкиназы в сыворотке выраженным повреждением ГЭБ и повышением его проницаемости

На основании анализа литературных данных Е И Гусевым и соавт (2001) было показано что снижение АТФ в ишемизированной зоне приводит к активации анаэробного гликолиза и усилению образования лактата и ионов водорода, что вызывает развитие метаболического ацидоза Снижение рН внутри- и внеклеточной среды вызывает «разрыхление» клеточных мембран, тем самым, повышая проницаемость нейронов и эндотелия сосудов Набухание эндотелиальных клеток усугубляет микроциркуляторные нарушения и вследствие этого постишемическую гипоперфузию

В работах Т Кагтуа и соавт (1993) и Л Не1кктеп и соавт (2006) было показано, что применение апротинина или ингибитора трипсина сои при ишемии и реперфузии головного мозга значительно уменьшало содержание лактата в плазме крови при сохранении уровня аденозинтрифосфата

Таким образом, существует зависимость между степенью повреждения головного мозга и уровнем маркеров повреждения в плазме крови Угнетение кининообразования контрикалом уменьшает

выраженность повреждения головного мозга при ишемии и реперфузии в то время как активация кининовой системы трипсином, интенсифицируя свободно - радикальное окисление и метаболический ацидоз, усиливает повреждение нейронов

и ^

При проведении корреляционного анализа между уровнем локального мозгового кровотока в период гипоперфузии и уровнем маркеров повреждения, нами была выявлена сильная отрицательная корреляционная связь Так, у животных получавших трипсин и энап была выявлена отрицательная корреляционная связь (г = -0,7, р< 0,05) между уровнем ЛМК в период гипоперфузии и содержанием МДА и КК в плазме т е , чем более выраженным было повреждение тем интенсивнее снижался мозговой кровоток к концу реперфузионного периода В группе крыс получавших контрикал уровень мозговой перфузии в конце реперфузионного периода коррелировал (I = -0,7, р < 0,05) с активность перекисного окисления липидов и выраженностью метаболического ацидоза При этом чем ниже была концентрация маркеров повреждения, тем лучше сохранялась мозговая перфузия в реперфузионном периоде

Для оценки активности кининовой системы в реперфузионном периоде, осуществлялось определение уровня прекалликреина и активности калликреина в плазме венозной крови животных (табл 3)

Из таблицы видно, что модулирование кининовой системы сопровождалось изменением активности кининообразования в плазме крови при ишемии и реперфузии головного мозга у крыс

У животных введение трипсина, приводило к стимуляции кининообразования, при этом на 73,6% нарастала активность калликреина, и на 63 7% уменьшалось содержание ПК в плазме в сравнении с контролем

Внутрибрюшинное введение животным энапа, тормозящего гидролиз брадикинина, и приводящего к его накоплению в крови, не оказывало влияния на содержание ПК и активность калликреина в плазме крови

Таблица 3

Показатели кининогенеза в плазме венозной крови при ишемии/реперфузии головного мозга у крыс на фоне модулирования активности кининовой

системы (М± а)

Показатель Контроль (п=10) На фоне введения

Трипсина (п=10) Энапа (п =10) Контрикала (п=10)

Прекалликреин ед/л 428,9±109,6 155,9±39,0" 419,9±74,6 773 3±197 7"

Калликреин ед/л 32,9±11,2 57 1±21,8" 27,5±5,8 18,6±3 8"

Примечание ** - двумя звездочками обозначена величина, достоверно отличающаяся от контрольной группы (р < 0.01)

Введение контрикала ингибитора калликреина,.напротив вызывало угнетение кининогенеза что выражалось в увеличении содержания ПК на 80 3% и уменьшении активности калликреина на 43,5% в плазме в отличие от контроля

Таким образом, введение животным трипсина при ишемии и реперфузии головного мозга повышала активность калликреина в плазме крови, в то время как использование контрикала увеличивало уровень прекапликреина и уменьшало активность калликреина в плазме крыс

Возможно, нейропротективный эффект контрикала может быть обьяснен уменьшением активно функционирующих брадикининовых рецепторов (Панченко Л Л исоавт,1982) ММ Минебаевой и соавт (1994) и ФИ Мухутдиновой (1999) предполагается, что механизм ингибирующего действия контрикала на кининовую систему обусловлен комплексированием с тканевыми белками и образованием плохо диссоциирующих неактивных комплексов с кининогеназами

При проведении корреляционного анализа между уровнем ЛМК и активностью кининогенеза была установлена сильная отрицательная корреляционная связь Гак. у животных контрольной и экспериментальных групп была выявлена сильная корреляционная связь (г = 0,7, р< 0,05) между уровнем ЛМК в период гипоперфузии и активностью калликреина в плазме крови То есть, чем выше была активность калликреина в плазме, тем ниже бьпа локальная мозговая перфузия, при этом уменьшение активности калликреина в плазме способствовало сохранению ЛМК

Таким образом, прямое определение уровня прекалликреина и активности калликреина в плазме крови показало наличие их тесной связи с локальным мозговым кровотоком Это указывает на способность препаратов изменять активность кининовой системы и влиять на локальную мозговую гемодинамику при ишемии и последующей реперфузии головного мозга

Резюмируя все выше изложенное можно заключить, что модулирование активности кининовой системы способно изменять толерантность головного мозга к ишемии и влиять на течение реперфузионного периода Активирование кининообразования трипсином укорачивает продолжительность жизни головного мозга при создании тотальной ишемии Угнетение кининоразрушения энапом не влияет на сохранение биоэлектрической активности головного мозга после перевязки магистральных сосудов Угнетение кининовой системы контрикалом в 1,5 раза повышает толерантность головного мозга к ишемии Полученные результаты указывают на патогенетическое значение кининообразование при ишемии головного мозга Можно предположить, что кининовая система, являясь пусковой протеолитической системой запускает каскад биохимических нарушений, способствующих выраженному повреждению нейронов головного мозга

Модулирование активности кининовой системы влияет на уровень локального мозгового кровотока в реперфузионном периоде Активирование кининообразования трипсином не вызывает развития постишемической

гиперимии и способствует более быстрому возникновению гипоперфузии Угнетение кининоразрушения энапом способствует развитию выраженной реактивной гиперемии и раннему появлению периода «невосстановленного кровотока» Угнетение кининообразования контрикалом способствует сохранению мозгового кровотока в реперфузионном периоде и препятствует развитию феномена «по-геАо\у» При этом выраженность повреждения головного мозга зависела от уровня мозговой перфузии в реперфузионном периоде и активности кининовой системы Вероятно, угнетение кининовой системы в раннем реперфузионном периоде сохраняет структуру гематоэнцефалического барьера, уменьшает проницаемость мозговых сосудов и выраженность отека головного мозга

ВЫВОДЫ

1 Модулирование активности кининовой системы фармакологическими препаратами оказывает существенное влияние на толерантность головного мозга к ишемии Угнетение кининообразования контрикалом способствует увеличению продолжительности биоэлектрической жизни головного мозга в условиях тотальной ишемии в среднем на 50% а активация кининогенеза трипсином укорачивает это время в среднем на 23 %

2 Модулирование активности кининовой системы влияет на локальный мозговой кровоток в реперфузионном периоде после 30 - минутной ишемии головного мозга Угнетение кининообразования контрикалом препятствует развитию феномена «по-геПо\у» Активация кининообразования трипсином угнетает возникновение реактивной гиперемии и способствует раннему развитию гипоперфузии Использование энапа усугубляет гипоперфузию в реперфузионном периоде

3 Модулирование активности кининовой системы влияет на выраженность повреждения головного мозга при ишемии Угнетение кининообразования контрикалом сопровождается ингибированием свободно - радикального окисления метаболического ацидоза и меньшим повреждением головного мозга, в то время как активация кининообразования трипсином усугубляет повреждение мозга

4 Активность калликреина в плазме крови при модулировании кининообразования контрикалом и трипсином коррелятивно связана с уровнем локальной мозговой перфузии и выраженностью повреждения головного мозга

5 Активация калликреин — кининовой системы трипсином при ишемии/реперфузии головного мозга играет преимущественно патогенетическую роль, так как снижает толерантность головного мозга к ишемии и способствует ухудшению течения реперфузионного периода Угнетение кининообразования контрикалом повышает продолжительность жизни головного мозта при ишемии и препятствует возникновению феномена «невосстановленного кровотока» в период реперфузии

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В условиях острой ишемии головного мозга, а также в реперфузионном периоде необходимо учитывать состояние кининообразования В случаях когда наблюдается активация кининогенсза, эффективным протектором ишемического повреждения и развития реперфузионного синдрома является применение контрикала

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Оробей М В , Неугодов А Н Толерантность головного мозга к ишемии у крыс в условиях торможения кининообразования и кининоразрушения // Молодежь Барнаулу материалы науч -практ конф -Барнаул 2003 -С 230-231

2 Оробей М В Влияние различных состояний кининовой системы на толерантность головного мозга к ишемии // Молодежь Барнаулу материалы науч-практ конф - Барнаул, 2004 -С 159-160

3 Куликов В П Оробей М В Шатилло Ю I" Состояние мозговой гемодинамики при ишемии и реперфузии у крыс в условиях модулирования активности калликреин-кининовой системы // Региональное кровообращение и микроциркуляция - 2006 -№4 -С 95-98

4 Оробей М В , Шатилло Ю Г Мозговая гемодинамика при ишемии и реперфузии у крыс в условиях модулирования активности калликреин-кининовой системы // Молодежь Барнаулу материалы науч -практ конф -Барнаул, 2007 -С 194-195

Соискатель Оробей М В

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

калликреин-кининовая система

ангиотензинпревращающий фермент

локальный мозговой кровоток

малоновый диальдегид

креатинкиназа

прекалликреин

артериальное давление

ККС

АПФ

ЛМК

МДА

КК

ПК

АД

Подписано в печать__2008 Печать ризографическая

Объем 1 п л Бумага офсетная Бесплатно__Тираж 100 экз_

Отпечатано РА «ПАРАГРАФ» г Барнаул, пр Ленина 40, каб 334, теп (385-2)366-143 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД 12-061 от 04 01 2002 г