Автореферат и диссертация по медицине (14.00.45) на тему:Структурные и функциональные особенности гена тирозингидроксилазы и врожденная предрасположенность к алкогольной зависимости

На правах рукописи

КИБИТОВ Александр Олегович

СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНА ТИРОЗИНГИДРОКСИЛАЗЫ И ВРОЖДЕННАЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К АЛКОГОЛЬНОЙ ЗАВИСИМОСТИ

14.00.45.- Наркология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва- 2004

Работа выполнена в Национальном научном центре наркологии Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Иванец Н.Н.).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор Анохина Ирина Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор Судаков Сергей Константинович, доктор биологических наук

Поляков Александр Владимирович.

Ведущая организация:

Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского.

Защита диссертации состоится «27» апреля 2004 года в 10 часов на заседании диссертационного советаД 208.051.01 при ННЦ наркологии МЗ РФ по адресу:

119002, Москва, Малый Могильцевский переулок, 3. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННЦ наркологии МЗ РФ (Москва, Малый Могильцевский переулок, 3).

Автореферат разослан «_> марта 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Львова Ольга Федоровна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Зависимость от алкоголя формируется у разных больных по-разному, с неодинаковой скоростью: от быстрого злокачественного течения до столь медленного, что часто трудно провести четкую границу между периодом злоупотребления алкоголем и наступлением собственно заболевания (Иванец Н.Н., Игонин АЛ. 1983). Данные медицинской статистики (Авербах Я.К.,1992) показывают, что лишь небольшая часть потребляющих алкоголь заболевают алкоголизмом, иными словами, потребление алкоголя является необходимым, но не достаточным условием возникновения алкогольной зависимости.

В литературе широко обсуждается значительная роль наследственных факторов в патогенезе зависимости от алкоголя, в частности в виде биологической врожденной предрасположенности к развитию алкогольной зависимости (Анохина И.П., 1988,1994; Cloninger C.R.,1988; Walker R.D.,1996; Heath A.C.,2001). Данные классической генетики, в частности, результаты семейных исследовании и близнецового метода (Cotton N.S. ,1979; George F.R.,1989), убедительно показывают, что риск заболевания значительно повышается при наличии в роду больных алкоголизмом: у таких пациентов часто, хотя и не всегда, зависимость формируется стремительно и в раннем возрасте(СгаЬЬе J.C.,1985; Goodwin D.W., 1979). При этом установлено, что закономерности наследования предрасположенности к зависимости от алкоголя не носят характера "менделевского" расщепления признаков, что заставляет предполагать вероятную полигеннную природу заболевания.

Экспериментальный подход выявил факт разделения популяции животных на группы с противоположным отношением к алкоголю в условиях свободного выбора: только часть животных явно предпочитала алкоголь и усиленно потребляла его (Анохина И.П.,1994). Исследования на животных "чистых" линий, селекционный отбор которых велся на основе противоположных реакций на алкоголь, установили значительные врожденные особенности функционирования ряда нейрохимических систем у этих животных. (French TA., 1985,1993; Wand G.S.,1993;Lukas L.R.,1998;Sands SA., 2000).

С биологической точки зрения врожденная предрасположенность понимается как комплекс генетически обусловленных особенностей нейрохимических систем мозга, благодаря которым при злоупотреблении алкоголем состояние алкогольной зависимости развивается очень бистро и протекает злокачественно. Изучение биологических механизмов формирования зависимости от алкоголя на протяжении последних сорока лет убедительно доказало, что функциональные изменения обмена дофамина (ДА) в мезолимбической системе головного мозга являются патогенети-

ческой основой зависимости от алкоголя. Впервые «дофаминовая гипотеза» патогенеза алкоголизма была сформулирована И.П. Анохиной (1975-1979).

Таким образом, на наш взгляд, дальнейшие исследования патогенеза алкоголизма, в частности врожденной предрасположенности к алкогольной зависимости, должны быть сфокусированы на изучении структурных и функциональных особенностей генов, контролирующих дофаминовую ненротрансмиттерную систему. Ведущая роль в регуляции дофаминовой системы мозга принадлежит тирозингидроксилазе (ТГ) - ключевому ферменту биосинтеза катехоламинов, что обуславливает особый интерес к гену этого фермента. Роль гена ТГ в патогенезе зависимости от алкоголя и связь этого гена с врожденной предрасположенностью к зависимости от алкоголя остается неизученной. Выявление структурных и функциональных особенностей гена тирозингидроксилазы, специфических для состояния врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя, могло бы прояснить, хотя бы частично, генетическую основу алкогольной зависимости.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы стало изучение структурных и функциональных особенностей гена тирозингидроксилазы у животных с генетически детерминированной индивидуальной реакцией на алкоголь, а также у больных алкоголизмом с различной степенью наследственной отягощенности алкоголизмом и при различных клинических вариантах течения болезни. В связи с этим в ходе настоящей работы решались следующие задачи:

1. Оценить уровень экспрессии гена ТГ в дофаминэргических структурах мозга у инбредных линий животных с генетически детерминированной различной реакцией на этанол.

2. Изучить особенности влияния острого введения этанола на уровень экспрессии гена ТГ в дофаминэргических структурах мозга у животных инбредных линий с генетически детерминированной различной реакцией на этанол.

3. Изучить уровень экспрессии гена ТГ в дофаминэргических структурах мозга у животных со сформированной зависимостью от алкоголя, возникшей в результате хронического потребления этанола.

4. Провести сравнительное изучение структуры полиморфных локусов гена ТГ у больных алкоголизмом с наличием или отсутствием наследственной отягощенности этим заболеванием.

5. Провести сравнительное изучение структуры полиморфных локусов гена ТГ у больных алкоголизмом с различной тяжестью течения заболевания.

Основные результаты исследования и их новизна

Впервые показано, что у животных врожденная предрасположенность к зависимости от алкоголя ассоциируется с высоким уровнем экспрессии гена тирозингидроксилазы в дофаминовой мезолимбической системе мозга.

Впервые выявлен факт снижения уровня экспрессии гена ТГ в мезолимбической дофаминовой системе мозга под воздействием однократной дозы этанола только у «предрасположенных» к зависимости животных до уровня «не предрасположенных» к зависимости животных.

Впервые показано, что хроническое потребление алкоголя вызывает снижение уровня экспрессии гена тирозингидроксилазы в дофаминэргической нейротрансмиттерной системе мозга, гораздо более выраженное у животных, ставших зависимыми от алкоголя после хронической алкогольной интоксикации.

В ходе генотипирования больных алкоголизмом по полиморфному локусу HUMTH01 гена ТГ были впервые выявлены два генотипа, ассоциированные с алкоголизмом. Показано, что носители генотипа 9Ш-1 имеют выраженную семейную отягощенность по алкоголизму, а носители генотипа Д10-1 характеризуются более «легким» течением алкоголизма. Возможно, генотип 7Ш-1 обладает «протекторными» свойствами в отношении тяжести течения алкоголизма.

Таким образом, впервые показано значение структурных и функциональных особенностей гена ТГ в механизмах формирования зависимости от алкоголя и тяжести течения алкоголизма.

Научно-практическое значение работы

Высокая функциональная активность гена ТГ в мезолимбической дофаминовой системе мозга « предрасположенных» животных и факт ее быстрого снижения под действием однократной дозы этанола могут являться одним из механизмов нейрохимической «готовности» к развитию зависимости. Обнаруженное нами резкое снижение экспрессии гена ТГ в ДА системе мозга животных с развитой зависимостью от алкоголя можно оценивать как один из биологических маркеров зависимости, а высокий врожденный уровень экспрессии гена ТГ в этой же нейрохимической системе - как маркер врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя.

Выявленная ассоциация структурных особенностей гена ТГ с клиникой алкоголизма важна с точки зрения понимания молекулярных основ как собственно зависимости от алкоголя, так и важнейших типов алкоголизма. Выявление у пациента генотипа 9М0-1, характерного для больных из семей с высокой степенью наследственной отягощенности по алкоголизму может служить признаком врожденной предрасположенности к алкогольной зависимости и возможным маркером

повышенного риска возникновения алкоголизма. На основе полученных результатов также возможно прогнозирование степени тяжести течения алкоголизма: выявление у больного генотипа 7\10-1 может служить основанием для прогнозирования «легкого» течения болезни, отсутствие этого генотипа делает более вероятным тяжелое течение, что может быть успешно использовано для подбора соответствующей патогенетической терапии.

Апробация работы -

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании проблемной комиссии Национального Научного Центра Наркологии 25 декабря 2003 года.

Объем и структура диссертации '

Диссертация • состоит из введения,- обзора литературы, описания' материалов и методов, результатов исследования, обсуждения и выводов. Она, изложена на 170 страницах машинописного текста и содержит 9 рисунков и 5 таблиц. Библиографический указатель состоит из 324 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные модели и животные

• Экспериментальная часть работы выполнена на 80 нелинейных крысах-самцах (ср. вес 180-200гр.), 50 мышах- самцах инбредных линий HAFT (high acute functional tolerance) и LAFT( low acute functional tolerance), 20 мышах-самцах инбредных линий LS (long sleep) и SS (short sleep) (cp., вес 18-25гр). Животные выращивались и содержались в стандартных условиях. Все линейные животные были получены в питомнике Медицинской школы Университета штата Колорадо (г. Денвер. США).

Животные этих инбредных линий использовались в качестве экспериментальной модели врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя. Селекция линейных животных велась на основе различной, генетически детерминированной, реакции животных на алкоголь: для линий LS и SS - различное время сна животных после введения однократной дозы этанола из расчета 3,75 г\кг веса внутрибрюшинно, для линий HAFT и LAFT — различное время восстановления способности животного передвигаться по наклонной плоскости после повторной дозы этанола из расчета 3,75 г\кг веса внутрибрюшинно.

При моделировании сформированной зависимости от алкоголя использовалась традиционная процедура" хронической принудительной алкогольной интоксикации животных в течение 9 месяцев с последующим отбором в группы « предпочитающих» и «отвергающих» алкоголь животных в условиях свободного выбора. «Предпочитающие» алкоголь животные считались «условно зависимыми» от алкоголя. В процессе алкоголизации контрольная (20 животных) и опытная (60 животных) группы находились в одинаковых условиях содержания и питания в течение 9 месяцев. Опытная группа в качестве единственного источника жидкости получала 15% раствор этанола. После окончания периода алкоголизации проводился отбор по признаку предпочтения алкоголя воде: животные опытной группы были помещены в условия свободного выбора между 15% раствором этанола и водой. В течение 14 дней производились замеры потребления каждым животным объема воды или раствора этанола. Для отбора животных использовался коэффициент потребления этанола (КПЭ), представляющий собой отношение объема потребленного раствора этанола к общему объему потребленной жидкости. Животные, имеющие КПЭ >0,7 относили к группе «предпочитающих» этанол (ПЭ), группу «отвергающих

этанол» (ОЭ) составили животные с КПЭ< 0,1. Животные с промежуточными значениями КПЭ были исключены из дальнейшего исследования.

Оценка уровня экспрессии гена ТГ.

Функциональную активность гена ТГ в виде уровня экспрессии гена ТГ оценивали путем измерения уровня матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) для ТГ с использованием Northern Blot анализа индивидуально по каждому животному в следующих структурах головного мозга, замороженных на сухом льду: фронтальная кора головного мозга, средний мозг, гипоталямус, стриатум, locus ceruleus (LC). Выделение тотальной РНК проводилось гуанидин-тиоцианатным методом с фенол-хлороформной экстракцией(СпотсЫпзку S.,1987). АЛИКВОТЫ тотальной РНК, обычно в объеме 15 мкл, разделяли посредством горизонтального электрофореза. Полученные элекгрофореграммы использовали для блоттинга РНК путем капиллярной диффузии на мембраны " HYBOND-N (Amersham) в течение 12-14 часов с последующей гибридизацией -включением радиоактивных меченых зондов в структуру мРНК для ТГ. В качестве зонда использован синтетический олигонуклеотид отечественного производства, комплиментарный последовательности нуклеотидных пар участка мРНК для ТГ. В структуру олигонуклеотида вводили радиоактивную метку (альфа-32Р АТФ) посредством энзиматической реакции с ферментом терминальная трансфераза. После гибридизации мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой в течение 16-72 часов. Для количественного определения концентрации мРНК измеряли относительную оптическую плотность мест засветки рентгеновской пленки, соответствующую наличию радиоактивного зонда, связанного с мРНК для ТГ.

Для исследования динамики изменений уровня мРНК после однократной дозы этанола мыши получали инъекцию 15% раствора этанола в физиологическом растворе из расчета 3,75 г\кг веса внутрибрюшинно. Контрольная группа получала эквивалентный объем физиологического раствора. Животные забивались путем декапитации группами по 5 жи-вотных каждой линии через 2,4 и 6 часов после инъекции этанола.

Генотипирование больных алкоголизмом

Клинико-генетическая часть работы была посвящена поиску структурных особенностей гена ТГ, характерных для больных алкоголизмом. Особое внимание мы уделяли анализу связи структуры гена ТГ с семейной отягощенностью алкоголизмом и с клинической картиной заболевания. С этой целью был использован ассоциативный метод изучения полигенных заболеваний, каковым признан алкоголизм. Суть ассоциативного метода состоит в сравнении частот встречаемости тех или иных вариантов полиморфизма структуры гена между группами пациентов с диагностированным заболеванием и группой здоровых лиц. Полиморфизм структуры гена понимается как наличие в гене участков (полиморфных локусов), структура которых индивидуальна и встречается в популяции в нескольких вариантах с определенной частотой. Изменение частоты встречаемости варианта в изучаемой группе по сравнению с частотой встречаемости в популяции (контрольной группе) служит основанием для предположения о вовлечении данного гена в патогенез заболевания.

В работе изучался ТСАТ тетрануоклеотидный повтор в интроне 1 гена ТГ (HUMTHO1 -VNTR ) (Polymeropoulos X., 1991). Локус представляет собой многократные повторы короткой последовательности нуклеотидов вида (ТСАТ)п, где п- число повторов. Значения п составляют от 5 до 11, соответственно количеству повторов именуются и аллели (варианты) гена ТГ по этому локусу - А5, А6...И до АН. Ряд аллелей -А5,А10, АН являются редко встречающимися, «минорными». Выделяют также А10-1, или, «несовершенный аллель А10», когда в результате делеции одного основания в структуре пятого повтора локус приобретает следующий вид: (ТСАТ)4(САТ)(ТСАТ)5. Генотипы пациентов по локусу HUMTH01 являются сочетанием аллелей, например генотип 7\8 означает, что ДНК пациента содержит алели А7 и А8 одновременно, т.е. одна из цепей ДНК несет ген ТГ с семикратным повтором, другая - с восьмикратным.

Анализ ДНК.

Для генотипировання пациентов, т.е выявления, какие аллели и генотипы гена ТГ по локусу HUMTH01 несет ДНК пациента, использовали методику полимеразной цепной реакции (ПЦР), с помощью которой фрагменты ДНК, содержащие полиморфный локус, амплифицируются и их концентрация становится достаточной для разделения с помощью электрофореза. Материалом для исследования являлись образцы ДНК, выделенные из цельной венозной крови контрольных индивидуумов и больных алкоголизмом методом фенольной экстракции с некоторыми модификациями. ПЦР каждого образца ДНК проводили в конечном объеме 25 мкл, в стандартной реакционной смеси (реактивы фирмы "Силекс") в присутствии 12 pmol каждого праймера с использованием 2,5U термо-фильной Taq-полимеразы производства фирмы "Силекс". Реакцию проводили с помощью программируемого термоциклера "Терцик МС2" фирмы "ДНК-технология" при следующих условиях: 94С- 5 минут; 94С- 1 минута, 64С- 1 минута, 72С- 2 минуты: 30 циклов; 72С- 3 минуты. Для анализа ПЦР-фрагментов, амплифицированных ПЦР с парой праймеров RF 51 - ATT CAA AGG GTA TCT GGG CTC TGG-3' и RR 5' - GTG GGC TGA ААА GCT ССС GAT ТАТ-31 использовали константный денатурирующий акриламидный гель (6% акрил-амид (37,5:1), 7М мочевина) с последующей окраской серебром.

Группы пациентов

Были исследованы 143 пациента-мужчины, находившиеся на стационарном лечении в клинике ННЦ наркологии МЗ РФ. Средний возраст составил 42,5 года. Все пациенты-имели диагноз «хронический алкоголизм 2 или 3 стадию). Контрольную группу составили 113 мужчины-донора (Центр переливания крови, г. Москва), средний возраст 41,5 лет. Разделение больных алкоголизмом на группы проводилось на основании анализа индивидуальных клинических особенностей каждого пациента. Для сбора первичных клинических и медико-генетических данных была разработана анкета клинических данных пациента. Пациенты, имевшие диагностически подтвержденную психопатологию (шизофрения, депрессивные расстройства любого генеза, суицидальные попытки, в том числе и на фоне делирия), а также пациенты, имевшие прямых родственников, страдавших психическими расстройствами, были исключены на первом этапе отбора.

Распределение пациентов по группам представлено в Таблице 1. В качестве критериев отбора пациентов в группы были выбраны клинические параметры, отражающие признаки врожденной предрасположенности к развитию алкогольной зависимости:

A) степень семейной отягощенности, понимаемая как количество кровных родственников, страдающих (страдавших) алкоголизмом. Незнание больным ответа на вопрос анкеты оценивалось как отсутствие данных и этот больной не изучался на предмет семейной отягощенности. Критерию присваивались следующие значения: «НЕТ ОТЯГОЩЕННОСТИ» при отсутствии кровных родственников, больных алкоголизмом, «НАЛИЧИЕ СЕМЕЙНОЙ ОТЯГОЩЕННОСТИ» при выявлении более чем двух кровных родственников, больных алкоголизмом.

Б) возраст манифестации алкоголизма: при манифестации алкоголизма до 23 лет включительно, критерию присваивалось значение «РАННЕЕ НАЧАЛО», при манифестации алкоголизма после 35 лет включительно, критерию присваивалось значение «ПОЗДНЕЕ НАЧАЛО».

B) прогредиентность течения болезни: критерий имел три значения, согласно диагнозу лечащего врача: «ВЫСОКОПРОГРЕДИЕНТНОЕ», «СРЕДНЕПРОГРЕДИЕНТНОЕ» и «МАЛОПРОГРЕДИЕНТНОЕ» течение.

Совокупность критериев «возраст манифестации» и «прогредиентность течения » использовалась нами как объединенный критерии, описывающий тяжесть течения алкоголизма, далее называемый «тяжесть течения». Этот критерий имел два значения: «тяжелое течение» (манифестации алкоголизма до 23 лет включительно при оценке течения алкоголизма как «ВЫ-

СОКОПРОГРЕДИЕНТНОЕ» или «СРЕДНЕПРОГРЕДИЕНТНОЕ»), « легкое течение» (манифестация алкоголизма после 35 лет включительно при оценке течения алкоголизма как «МАЛОПРОГРЕДИЕНТНОЕ»).

Главной задачей при отборе пациентов было формирование максимально полярных групп, у представителей которых тот ИЛИ ИНОЙ клинический признак (критерий) выражен максимально или минимально. Пациенты с промежуточными или средними проявлениями признаков были исключены из дальнейшего анализа на данном этапе и сознательно не включались ни в одну из групп. Формирование групп больных по критериям «ТЯЖЕСТЬ ТЕЧЕНИЯ» и «СЕМЕЙНАЯ ОТЯГОЩЕННОСТЬ» проводилось независимо из одного и того же массива пациентов. Задача анализа связи семейной отягощенности и тяжести течения в данной работе не ставилась.

Таблица 1. Группы пациентов и их характеристика

Критерии отбора в группы

Группа Возраст манифестации Прогредиентно сть Степень семейной отягощенности N % общей группы

Признак: ТЯЖЕСТЬ ТЕЧЕНИЯ

«тяжелое течение» <"23 лет Высокая и средняя Любая 60 42%

«легкое течение» >=35 лет малая Любая 23 16%

Признак: СТЕПЕНЬ СЕМЕЙНОЙ ОТЯГОЩЕННОСТИ

«отягощенные» любой любая >=2 больных алкоголизмом кровных родственников 66 46%

«неотягощенные» любой любая НЕТ больных алкоголизмом кровных родственников 38 26%

С целью получения «клинического портрета» носителей определенных генотипов был проведен реверсивный (обратный) анализ связи индивидуальных генотипов с клиническими характеристиками больных, названный так в силу его направленности от генотипа к клиническим признакам. Группирующими критериями в этом случае выступают результаты генотипирования, анализируемыми же признаками здесь являются ряд клинических параметров, важных с точки зрения оценки течения болезни. Сочетание прямого и реверсивного анализа дает возможность вычленения тех клинических признаков, которые наибольшим образом связаны с генотипом, а также позволяет более полно оценивать клинические особенности пациентов - носителей каждого из генотипов. Кроме того, при при-менении реверсивного анализа исследуются все больные, несущие определенный генотип, без учета тех первичных клинических групп, в которых они выступали при прямом анализе.

Статистическая обработка результатов.

При анализе данных экспериментов на животных использовали ^критерий Стьюдента для несвязанных вариант. При применении ассоциативного метода в качестве анализируемых показателей при прямом анализе использовали абсолютные и относительные частоты встречаемости аллелей и генотипов гена ТГ в контрольной и клинических группах, при реверсивном анализе использовали частоты встречаемости клинических параметров в ге-

нотипических группах. Относительные частоты встречаемости каждого варианта клинического параметра выражали в процентах от общего количества больных в генотипической группе. Для анализа результатов использовалась статистика X2 с доверительным интервалом 0,05, позволяющая оценить различия в частоте признака в генеральных совокупностях по частотам признака в ограниченных выборках, а также двусторонний критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты экспериментов на животных.

Первой задачей экспериментальной части работы была попытка выяснить, является ли функциональная активность гена ТГ, определяемая в виде уровня его экспрессии, врожденным признаком и различна ли она у животных с генетически детерминированной реакцией на алкоголь. В результате экспериментов по изучению экспрессии гена ТГ в структурах мозга мышей линий LS и SS (РисД), обнаружено, что во фронтальной коре головного мозга уровень мРНК для ТГ у SS мышей более чем в 2 раза выше, чем у LS-мышей (р<0,05). Напротив, в стриатуме уровень мРНК для ТГ у SS-мышей снижен в 3 раза по сравнению с LS мышами (р<0,05). В гипоталамусе имеется значительная тенденция к повышению уровня мРНК для ТГ у SS мышей по "сравнению с LS мышами.

Таким образом, уровень экспрессии гена ТГ у SS мышей повышен в мезолимбической ДА системе (фронтальная кора и пшоталямус) и снижен в нигростриальной (стриатум). В норадренэргической нейротрансмиттерной системе (LC) различий между линиями не обнаружено. Известно, что LS и SS мыши обладают одинаково нормально функционирующим ферментом ТГ с неизмененной относительной активностью, однако уровни дофамина и ДО-ФА в мозге SS мышей существенно отличаются от LS мышей( French TA., 1985,1989), особенно при воздействии этанола (Baizer L.,1981). French TA (1995) показал, что инъекция этанола вызывает более выраженное снижение относительной активности ТГ в тканях мозга LS мышей по сравнению с SS мышами, что может отражать изначально высокий уровень экспрессии гена ТГ у SS мышей я косвенно подтверждать наши данные.

В экспериментах с мышами линий HAFT и LAFT было обнаружено (Рис.2), что во фронтальной коре головного мозга у LAFT-мышей уровень ТГ мРНК в 3 раза превышает таковой у HAFT-мышей (р<0,05), а в Locus cemleus(LC) уровень ТГ мРНК у LAFT- мышей был в 3,5 раза выше, чем у HAFT- мышей В гипоталямусе, напротив, уровень ТГ мРНК у LAFT-

мышей снижен в 3 раза в сравнении с HAFT-мышами (р<0,05).Таким образом, уровень экспрессии гена ТГ у LAFT мышей повышен в мезолимбической ДА системе (фронтальная кора) и в норадренэргической нейротрансмиттерной системе (LC), но не изменен в нигростриальной ДА системе (стриатум).

Рис.1. Уровень мРНК для ТГ в структурах мозга мышей линий LS и SS

Рис.2. Уровень мРНК для ТГ в структурах мозга мышей линий HAFT и LAFT

Вторая задача экспериментальной части работы была направлена на изучение эффекта однократной дозы этанола на уровень экспрессии гена ТГ в структурах мозга животных с генетически детерминированной различной реакцией на алкоголь ( линии мышей HAFT и LAFT, Рис.3). В результате однократной инъекции этанола во фронтальной коре головного мозга у LAFT мышей уровень мРНК для ТГ значительно снижается и составляет 37% от контроля через 2 часа, 14% от контроля через 4 часа и 24% от контроля через б часов после инъекции (р<0,05,

РисЗА). У HAFT-мышей этанол не влияет на уровень мРНК для ТГ, экспрессия остается стабильной через 2, 4 и 6 часов после инъекции. Аналогично, в Locus ceruleus (LC) через 2 часа после инъекции этанола уровень мРНК для ТГ у LAFT-мышей снижается до уровня 34% от контроля и различия с HAFT-мышами исчезают. Через 4 часа мРНК для ТГ остается сниженным -49% от контроля, через 6 часов составляет 25% от контроля. Все изменения достоверны (р<0,05, Рис ЗБ). Этанол снижал уровень мРНК для ТГ ив стриатуме, причем наблюдались однонаправленные изменения у обеих линий, значительно более выраженные у LAFT-животных: через 2 часа-15% от контроля, через 4 часа-19% от контроля, через 6 часов -11% от контроля (р<0,05 для всех временных точек, Рис. ЗВ). У HAFT-животных также обнаружено снижение данного показателя, но статистически недостоверное.

В гипоталямусе исходно низкий уровень ТГ мРНК у LAFT- животных через 2 часа после инъекции этанола незначительно возрастает и только через 4 часа после инъекции существенно снижается до уровня 13% от контроля(р<0,01,Рис.ЗГ), через 6 часов остается сниженным и достигает 40% от контроля. Интересно, что только в гипоталямусе обнаруживается реакция уровня экспрессии гена ТГ у HAFT-мышей на введение этанола. Исходно высокий, через 2 часа уровень экспрессии гена ТГ остается стабильным, и только через 4 ча-са после инъекции этанола также снижается и составляет 10% от контроля, через 6 часов составляет 21 % от контроля(р<0,05 для всех временных точек). Обращает на себя внимание тот факт, что несмотря на обратное соотношение как исходных уровней экспрессии гена ТГ, так и динамических изменений экспрессии в гипоталямусе, результатом разнонаправленных изменений уровня мРНК для ТГ является исчезновение различий между линиями по этому показателю.

Таким образом, врожденные различия в уровне экспрессии гена ТГ в структурах мозга животных с генетически детерминированным отношением к этанолу исчезают после введения однократной дозы этанола в основном за счет снижения врожденного высокого уровня экспрессии и не проявляются вновь в течение, по крайней мере, б часов. Marcel D.et al (1998) показали, что применение препарата RU 24722, вызывающего длительное повышение экспрессии гена ТГ, приводит к " выравниванию" уровней экспрессии гена ТГ в ДА структурах мозга между линиями мышей С57 (условно «зависимые» от алкоголя) и DBA (условно «независимые» от алкоголя) за счет изменений на уровне транскрипции. Ранее прямой генетический анализ наследования такого признака как активность ТГ мезенцефалической системы при скрещивании линий С57 и DBA в разных вариантах (Vadasz С, 1987) показал, что разница в активности ТГ исходных линий связана в первую очередь с количеством дофа-минэргических нейронов в изучаемой области: у DBA мышей значительно меньше клеток, экспрессирующих ТГмРНК, чем у С57, а собственно активность ТГ не изменена. Основным различием между линиями оказалось содержание белка ТГ,

как результат синтетической активности гена ТТ. Напротив, при анализе уровня мРНК для препроэнкефалина у линий животных линий NP и Р ( Р- Preferring , NP - Non-Preferring Ethanol. XDaubner S.C.,1993) обнаружилось, что при отсутствии базальных различий

Рис.3. Динамические изменения уровня мРНК для ТГ в структурах мозга мышей линий HAFT и LAFT после однократной инъекции этанола

между линиями, интрагастральное введение этанола приводит к повышению мРНК препроэнкефалина в пис1иев ассишЬет (ЫЛс) только Р крыс уже через час после начала инфузии. Все это может подтверждать возможность фармакологической регуляции, в том числе и этанолом, уровня экспрессии гена в структурах мозга животных с признаками врожденной предрасположенности к алкогольной зависимости.

Третья задача экспериментальной части работы состояла в изучении функциональной, активности гена ТГ в структурах мозга животных с выраженной зависимостью от алкоголя, развившейся в результате длительного потребления этанола. Исследование уровня мРНК для ТГ в мозге и надпочечниках крыс, отобранных по уровню потребления этанола в условиях свободного выбора после длительной алкоголизации, выявило статистически достоверные различия между

группами ПЭ (предпочитающие этанол) или «условно зависимые» и ОЭ (отвергающие этанол) или условно независимые (Рис4). В среднем мозге «зависимых» ПЭ животных уровень экспрессии гена ТГ оказался сниженным в 3 раза по сравнению с контролем (р<0,05), и в 2 раза по сравнению с ОЭ животными (р<0,05), уровень ОЭ животных оказался ниже значений контрольной группы на 45% ( р<0,05). В надпочечнике обнаружено снижение экспрессии гена ТГ у животных группы ПЭ в 2,5 раза против контроля (р<0,05) и в 3,5 раза против группы ОЭ (р<0,05). Уровень экспрессии гена ТГ в надпочечнике ОЭ животных не отличался от контрольных значений. Таким образом, обнаружено значительное снижение уровня экспрессии гена ТГ у «зависимых» от алкоголя «предпочитающих » животных по сравнению с контрольными и «отвергающими» этанол животными, как в среднем мозге, так и в надпочечнике.

Рис.4. Уровень мРНК для ТГ в мозге и надпочечниках "предпочитающих" этанол (ПЭ) и "отвергающих" этанол (ОЭ) после хронической алкогольной интоксикации.

Обобщая результаты экспериментов, можно заключить, что животные с генетически детерминированным различным отношением к алкоголю имеют различный врожденный уровень экспрессии гена ТГ в ДА структурах мозга. По мнению Weiner N,(1985), TabakofF B.(1989) поведенческие характеристики животных линий SS и LAFT при воздействии этанола могут отражать признаки врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя. Обнаруженный нами высокий уровень экспрессии гена ТГ во фронтальной коре как у SS-мышей , так и у LAFT-мышей позволяет предполагать активное вовлечение дофаминовой мезолимбической системы в механизм развития зависимости от алкоголя в отличие от нигростриальной ДА системы(стриатум), где экспрессия гена ТГ не изменена у LAFT-мышей и снижена у SS-мышей. Разнонаправленные изменения в НА системе (LC) и гипоталямусе могут быть следствием

различных моделей инбридинга линий. Кроме того, как известно, нейрохимия гипоталамических нейронов и системы регуляции экспрессии гена ТГ в нейронах пгаоталямуса близки к таковым в периферической нервной системе и в надпо-чечниках (Kedzieiski W., 1994), что не может не сказываться на регуляции уровня экспрессии гена ТГ. Интересно, что у условно «предрасположенных к зависимости» LAFT -мышей мы обнаружили сниженный уровень экспрессии гена ТГ в гипоталамусе , причем инъекция этанола не изменяет этот показатель. Уровень мРНК для ТГ у «не предрасположенных» HAFT- мышей под действием этанола изменяется только в гипоталамусе, причем происходит снижение экспрессии. Рассматривая эффект этанола на функциональную активность гена ТГ в гипоталямусе как отражение неспецифического эффекта этанола на катехоламиновую систему организма в целом, можно сформулировать еще один важный вывод: этанол снижает экспрессию гена ТГ в катехоламиновых клетках надпочечников и гипоталямуса только у «не предрасположенных» к зависимости животных. В случае условно «предрасположенных к зависимости» животных этот уровень снижен исходно и этанол не оказывает никакого эффекта.

Мы показали, что однократная доза этанола способна нормализовать уровень экспрессии гена ТГ в мезолимбических структурах мозга животных с врожденной предрасположенностью к зависимости от алкоголя до уровня экспрессии животных без признаков врожденной предрасположенности. Можно предположить, что алкоголь, регулируя уровень экспрессии гена ТГ, оказывает «условно терапевтическое» воздействие на ДА мезолимбическую систему «предрасположенных» к зависимости животных. В этом случае мотивация к потреб-лению алкоголя, вызванная врожденным дисбалансом ДА метаболизма, реализуется при кон-такте с алкоголем и может обеспечивать положительное подкрепление с формированием условнорефлекторных связей. Обращает на себя внимание тот факт, что однократное введение этанола не оказывает воздействия на экспрессию гена ТГ дофаминэргической нейроме-диаторной системы мозга у животных без признаков врожденной предрасположенности, что может объясняться значительной устойчивостью системы регуляции экспрессии гена ТГ у этих животных.

Модель хронической алкогольной интоксикации животных предполагает равные условия для всех особей, а помещение животных в условия свободного выбора между раствором этанола и водой после окончания алкоголизации дает возможность изучения индивидуального отношения каждого животного к этанолу. Длительная процедура алкоголизации сводит к минимуму эффекты, вызванные индивидуальными особенностями метаболизма этанола ферментами печени или физиологическую непереносимость этанола, что позволяет выявить действие индивидуальных, изначально существующих биологических наследственных факторов в ответ на

хроническое потребление алкоголя. Именно их действием можно объяснить как выраженную мотивацию к потреблению алкоголя в ответ на хроническую алкогольную интоксикацию и формирование зависимости от алкоголя у части животных (ПЭ-группа), так и высокую степень резистентности к формированию зависимости от алкоголя у другой части животных (ОЭ-группа). Интересно, что доля «предпочитающих» этанол животных составила 15% от общего числа животных, что близко к эпидемиологическим данным о количестве больных алкоголизмом среди населения. Можно предполагать, что биологическая предрасположенность к зависимости от алкоголя, связанная с геном ТГ, существует в популяции в латентном виде и ее «носителями» является 5-10% населения.

Результаты клинико-генетических исследований.

Основной задачей клинико-генетической части работы была попытка выявить проявления врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя на уровне структуры гена ТГ как у больных алкоголизмом в целом, так и в различных клинических вариантах болезни.

Результаты генотипирования общей группы больных алкоголизмом показали, что частоты аллелей (Таб.2) и генотипов (ТабЗ.,Рис.5), а также показатели гомозиготности по локусу HUMTH01 гена ТГ в общей группе пациентов и контрольной группе не различались между собой и соответствовали ранее опубликованным частотам для европейской популяции (Lim L.C., 1993). Подобные результаты сообщают и другие исследователи (Ishiguro H., 1998; Meloni R.,2002). Наиболее вероятным объяснением может быть известное представление о значительной клинической, а следовательно, и патофизиологической гетерогенности алкоголизма (Gilligan S.B.,1987; Cloninger C.R.,1988). Контрольная группа также имеет, вероятно, сложный состав, так как ее участники не обследовались на предмет алкоголизма. Это указывает на целесообразность сравнения генотшшческих показателей между группами пациентов, сформированными из общей группы больных на основе совокупности клинических признаков врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя.

Изучение частот встречаемости аллелей гена ТГ в выделенных нами группах больных не выявило значимых различий между группами (Таб.2). Можно видеть, что ни один из аллелей изученного локуса, взятый отдельно, не ассоциирован ни с тяжестью течения алкоголизма, ни с наследственной отягощенностью по алкоголизму. Этот факт хорошо согласуется с представление о сложной, возможно, полигенной, модели наследования предрасположенности к алкоголизму, опираясь на которую, трудно предполагать наличие единственного «патологического» аллеля гена. Более вероятно существование определенных генотипов (сочетаний аллелей), носители которых обнаруживают признаки врожденной предрасположенности в клинической картине алкоголизма.

Таблица 2. Относительные частоты аллелей гена ТГ по полиморфному локусу HUMTH01.

Группа характеристика N АЛЛЕЛИ ГЕНА ТГ

А6 А7 AS А9 А10-1

Контроль Здоровые 113 21% 19% 9% 17% 33%

ВСЕ ПАЦИЕНТЫ Больные алкоголизмом 143 22% 16% 6% 21% 33%

Группа 1 Тяжелое течение 60 24% 16% 8% 21% 33%

Группа 2 Легкое течение 23 17% 20% 7% 17% 39%

ГруппаА Отягощенность 66 19% 13% 6% 24% 38%

Группа В Нет отягощенности 38 28% 21% 7% 17% 26%

Таблица 3. Относительные частоты генотипов гена ТГ по полиморфному локусу HUMTH01.

Группа N ГЕНОТИПЫ ГЕНА ТГ

№ № -j 2> 00 СГ\ >2 о* о и 3 2 £ GO VC 00 ? о I0-1U0-1

Контроль из 2% 7% 3% 12% 17% 4% 5% 13% 5% 5% 10% 9%

Все пациенты из 3% 8% 2% 15% 13% 2% 10% 12% 3% 6% 10% 13%

Группа 1 60 3% 10 % 2% 13% 17% 3% 12% 7% 3% 7% 8% 13%

Группа2 23 4% 9% 0% 9% 9% 0% 9% 22% 4% 9% 13% 13%

Группа А 66 4% 13 % 2% 13% 15% 0% 9% 6% 4% 9% 15% 13%

Группа В 33 0% 6% 0% 18% 18% 12% 24% 6% 0% 0% 5% 12%

Важнейшим признаком врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя считается семейная отягощенность пациента по алкоголизму (Goodwin D.W.,1984; Dawson DA.,1992). Сравнение данных генотипирования пациентов из групп «ОТЯГОЩЕННЫЕ» (имеют не менее 2-х больных алкоголизмом кровных родственников) и «НЕОТЯГОЩЕННЫЕ» (не имеют больных алкоголизмом кровных родственников) по частотам встречаемости 12 возможных неминорных генотипов по локусу HUMTH01 гена ТГ обнаружило лишь один генотип, частота которого значительно различалась между группами. Генотип 9U0-1 встречался в группе «ОТЯГОЩЕННЫЕ»с частотой 15 % против 5% в группе «НЕОТЯГОЩЕННЫЕ» (*2 =2,31,Р=0,12

), что можно оценивать как устойчивый тренд, близкий к порогу достоверности по критерию х2-

Рис. 5. Частоты генотипов гена ТГ по локусу HUMTH-01 в общей группе больных алкоголизмом.

Рис.6. Сравнение частот генотипов гена ТГ по локусу HUMTH-01 в группах больных алкоголизмом с выраженной семейной отягощенностью (Группа А) и без семейной отягощенности (Группа В). Коэффициент Б - отношение частот каждого генотипа в группах сравнения. Б =1 при совпадении частот генотипа в группах сравнения и отсутствии различий между группами.

В контрольной же группе его частота составила 11%, что соответствует промежуточному значению между группами больных (Рис.6). Кроме того, как видно из Рис.6, обнаружены

однонаправленные тенденции к повышению частот встречаемости генотипов 8\10-1 и 9Ш-1 в группе "ОТЯГОЩЕННЫЕ", сходные с устойчивым трендом для генотипа 9Л10-1. Хотя различия частот этих генотипов (10-Ш0-1, 8\ 10-1) не столь выразительны, возможно, при использовании большей выборки больных они могли бы проявится более явно.

Важными клиническими признаками врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя считается раннее начало заболевания и тяжелое течение (8с1шскй МА,1992,>. Мы использовали объединенный критерий «тяжести течения» как совокупность критериев «прогредиентность» и «возраст манифестации» (см. «Материалы и методы»). Сравнение резуль-

Рис. 7. Сравнение частот генотипов гена ТГ по локусу НиМТН-01 в группах больных алкоголизмом с «тяжелым» (Группа 1) и «легким» (Группа 2) течением болезни.

татов генотипирования пациентов из групп «ЛЕГКОЕ ТЕЧЕНИЕ» и ТЯЖЕЛОЕ ТЕЧЕ-НИЕ» и контрольной группы выявило генотип 7и0-1, частота встречаемости которого достоверно выше в группе «ЛЕГКОЕ ТЕЧЕНИЕ» по сравнению с группой «ТЯЖЕЛОЕ ТЕЧЕНИЕ» (22% против 7%дг = 3,91, Р = 0,048). В контрольной группе частота генотипа Д10-1 составила 13%, что достоверно ниже частоты в группе «ЛЕГКОЕ ТЕЧЕНИЕ» и

занимает промежуточное положение между показателями групп пациентов

В ходе реверсивного анализа генотипические группы носителей выявленных нами генотипов сравнивались с прочими пациентами по клиническим характеристикам (Таб.4). При сравнении больных с генотипом 9Ш-1 (Группа «9Ш-1») с группой больных с прочими генотипами

Таблица 4. Результаты реверсивного анализа носителей генотипов 9М0-1 и 7X10-1.

Критерий Значение Частоты встречаемости критериев в

критерия генотипических группах

9\10-1 Прочие (не 9М0-1) 7410-1 Прочие (не 7410-1)

Начала болезни раннее 40% 51,6% 35,29% 51,59%

среднее 46% 37,5% 41,18% 38,1%

позднее 13,3% 10,93% 23,53% 10,32%

Прогредиентиость высокая 47% 35% 17,6% 38,89%

средняя 47% 15% 58,82% 46,83%

малая 6,7% 49,2% 17,65% 15,08%

Прямые родственники-ткоготт более 2х 60% 14,5% 35,29% 68,25%

Нет 20% 16,1% 29,41% 24,6%

(Группа «ПРОЧИЕ») мы обнаружили, что в группе 9Ш-1 число больных с высокой степенью семейной отягощенности ( более 2-х больных алкоголизмом кровных родственников) составило 60% против 14,5% в группе «ПРОЧИЕ» (х2=17,37, Р = 0,0001, Рис8А). Кроме того, достоверно и резко снижено количество больных с малопрогредиентным течением алкоголизма (6,7 % против 49%, (х'= 9,83, Р = 0,0017) и, напротив, достоверно повышено количество больных со среднепро-гредиентным течением ( 47% против 15%, х* =9,14,Р=0,0025,Рис.8Б). Таким образом, носители генотипа 9М0-1 характеризуются, как правило, наличием выраженной семейной отягощенности по алкоголизму, течение алкоголизма у этих больных чаще всего среднепрогредиентное и крайне редко встречаются случаи малопрогредиентного течения. Эти данные подтверждают связь генотипа 9М0-1 и выраженной семейной отягощенности по алкоголизму.

Сравнение больных с генотипом 7\10-1 (Группа 7Ш-1 ) с группой больных с прочими генотипами (Группа «ПРОЧИЕ» ) выявило устойчивую тенденцию к снижению частоты встречаемости параметра «ВЫСОКАЯ ОТОГТЕДИЕНТНОСТЬ» ( 17,6% против 38,9 %, х2 - 2,92, Р = 0,087, Рис. 9А) и, напротив, повышению частоты параметра «ПОЗДНЕЕ НАЧАЛО» (23,53% против 10,32%, двусторонний критерий Фишера Р=0,01, Рис9Б) в группе «7\10-1 » относительно группы «ПРОЧИЕ».

Рис. 8. Реверсивный анализ группы носителей генотипа 9М0-1 по клиническим параметрам: А)«семейная отягощенность алкоголизмом», Б) «прогредиент-ность течения алкоголизма».

Таким образом, носители генотипа 7\10-1 чаще характеризуются поздним началом алкоголизма и реже имеют высокопрогредиентное течение алкоголизма по сравнению с носителями других генотипов. В общем, течение алкоголизма в группе носителей генотипа 7\10-1 оказалось объективно более легким по сравнению с остальными больными. Данные реверсивного анализа подтверждают ассоциативную связь генотипа 7М0-1 с тяжестью течения алкоголизма и раскрывают возможные «протекторные» свойства этого генотипа в отношении тяжести алкоголизма.

Показательно, что структурные особенности гена ТГ оказались связаны как со степенью семейной отягощенности по алкоголизму , так и с клинической оценкой тяжести течения болезни. При этом выявлена роль разных генотипов по гену ТГ, что может служить

подтверждением важной роли гена ТГ как в наследовании предрасположенности к алкоголизму, так и в формировании клинических черт заболевания. Недостаточная достоверность в различиях

Рис. 9. Реверсивный анализ группы носителей генотипа 7X10-1 по клиническим параметрам: А) «возраст манифестации алкоголизма», Б) «прогредиентность течения алкоголизма».

частот генотипов отягощенных и неотягощснных алкоголизмом больных, рассчитанная по статистике х2 . может объясняться, во-первых, недостаточным обьемом выборки, во-вторых, возможным искажением данных о семейной отягощенности в процессе анкетирования пациентов. Согласно литературным данным, особое значение имеет учет количества кровных родственников, больных алкоголизмом, а не простое признание наличия в роду алкоголизма (Goodwin D.W.,1995; Rice J.P, 1995). Наиболее значимым предвестником развития алкоголизма, в том числе раннего

является количество родственников -алкоголиков в семье ("плотность алкоголизма") (Dawson D.A., 1992).

С патогенетической точки зрения, возможны структурные изменения в других генах «дофаминового ансамбля» у этих пациентов, либо вероятны комбинации специфических «настроек» нескольких генов, в том числе и ТГ, приводящие к проявлениям зависимости от алкоголя. Лишним подтверждением вероятной полигенности заболевания можно считать тот факт, что лишь 15% больных с выраженной семейной отягощенностью имели генотип 9X10-1. Однако более чем трехкратное снижение частоты этого генотипа в группе « НЕОТЯГОЩЕННЫЕ» является достаточным основанием для более углубленного изучения больных с этим генотипом.

Особого внимания заслуживает факт выявления промежуточные значения частот генотипов 9\10-1 и 7X10-1 в контрольной группе по сравнению с выделенными нами клиническими группами. Это можно объяснить неоднородностью контрольной группы, часть которой, вероятно имеет и семейную отягощенность алкоголизмом и не выявленные факты заболевания алкоголизмом. Наиболее важно, что, именно средние значения частот в контрольной группе могут служить дополнительным доказательством наличия ассоциативной связи обнаруженных нами генотипов с клиническими признаками, использованными нами в качестве группирующих при оборе пациентов в клинические группы. Можно предполагать, что в случае независимости генотипов от клинических признаков частоты их проявления в контрольной группе, не изученной с точки зрения алкоголизма, оказались бы неотличимы от значений, по крайней мере, одной из клинических групп.

Тот факт, что по результатам реверсивного анализа 60% носителей генотипа 9X10-1 имели выраженную семейную отягощенность, подтверждает вероятную вовлеченность именно этого варианта полиморфного локуса гена ТГ в патогенез зависимости от алкоголя у этих пациентов. Сочетание выраженной семейной отягощенности с достаточно прогредиентным течением болезни у этих больных позволяет говорить о возможном вовлечении гена ТГ в патогенез «семейного» алкоголизма по Jellinek (Jellinek E., I960). Совпадение данных первичного и реверсивного анализа указывает на оправданность предварительного разделения больных на группы в зависимости от тяжести течения болезни, при опоре на такие признаки как «ВОЗРАСТ НАЧАЛА» и «ПРОГРЕДИЕНТНОСТЬ ТЕЧЕНИЯ». Разделение больных на группы, сделанное лишь на основе клинических параметров, выявило достоверные генотипические различия между группами, что заставляет нас сделать вывод о продуктивности такого подхода в дальнейших исследованиях.

Современный уровень знаний не позволяет однозначно связать структурные особенности гена тирозингидроксилазы с функциональной активностью гена, однако последние работы говорят о высокой вероятности этой связи. В исследованиях на крысах было показано, что в

структуре промотера гена ТГ существуют домены, отвечающие за экспрессию гена в определенных структурах мозга. Так домен ЬС-экспрессии находится между 3,5 и 6,0 кб промотера, домен гипоталамуса - между 2,5-3,4 кб, домен ствола мозга - между 0,8-6,0 кб.(Ьш У, 1997) Было показано, что изучаемый нами ТСАТ полиморфизм обладает специфическим эффектом, как возможный регулятор экспрессии гена ТГ (Ме1от Я, 1998). Возможно, (ТСАТ)(п) полиморфный регион включает в себя специфический участок связывания с нуклеарным матриксом и физически закрепляет ген в ядре, второй находится в области промотера гена (Ьепайо^^Ы Я., 2002). Вполне вероятно, что полиморфные локусы гена ТГ могут служить активаторами или супрессорами активности гена в строго определенных нейрохимических системах. В этом случае тот или иной вариант полиморфного локуса выступает как модулятор транскрипции, обеспечивающий специфическую настройку синтеза тирозингидроксилазы по индивидуальной схеме и может быть включен в нейрохимическое звено патогенеза зависимости от алкоголя.

Уровень экспрессии гена достаточно хорошо отражает функциональную активность гена. С одной стороны, именно изменение экспрессии является реакцией гена на физиологические и патофизиологические процессы в организме. С другой стороны, норма реакции гена, понимаемая как диапазон возможных изменений экспрессии, является индивидуальной характеристикой организма и может определять особенности его функционирования.

Концепция единства структуры и функции, в применении к гену, проявляется в существовании сложных регуляторных систем, результатом работы которых является адекватный уровень экспрессии гена в любых условиях. Конечным субъектом регуляции остается ген, как участок молекулы ДНК, причем необходимым условием является , в конечном счете, механическое взаимодействие регуляторных факторов с молекулой ДНК. Любые структурные изменения гена приводят к функциональным сдвигам уровня экс-прессии, как результату перенастройки систем регуляции. Наше предположение состоит в том, что существуют врожденные, наследуемые особенности структуры гена, которые определяют как уровень исходной функциональной активности гена, так и характер изменений этой активности в ответ на специфические воздействия. Применительно к зависимости от алкоголя, мы предполагаем, что врожденные индивидуальные структурно-функциональные особенности гена ТГ могут иметь значение в формировании специфической реакции организма на алкоголь, участвовать в становлении «порочного» нейрохимического круга зависимости от алкоголя и, в конечном итоге, в формировании картины болезни, ее течения и прогноза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог, можно сказать, что нам удалось показать несомненную роль как структурных, так и функциональных особенностей гена тирозингидроксилазы в патогенезе алкоголизма.

Состояние врожденной предрасположенности к развитию зависимости от алкоголя сопровождается высоким уровнем экспрессии гена тирозингидроксилазы в мезолимбической дофаминовой системе мозга. Прием этанола нормализует экспрессию гена ТГ. Сформированная зависимость от алкоголя сопровождается выраженным снижением уровня экспрессии гена тирозингидроксилазы в мезолимбической дофаминовой системе мозга. Иными словами, функциональная активность гена тирозингидроксилазы непосредственно включена в патогенез зависимости от алкоголя и изменяется в процессе развития болезни.

Структура гена ТГ в виде особенностей полиморфного локуса HUMTH01 гена ТГ связана с такими клиническими характеристиками врожденной предрасположенности как высокая степень семейной отягощенности по алкоголизму и выраженная тяжесть течения алкоголизма. Особенно важно, что каждой их этих характеристик соответствует особый вариант структуры гена ТГ. Выявление «протективного» генотипа по локусу HUMTH01 гена ТГ, носители которого объективно легче переносят болезнь, делает возможным прогнозировать тяжесть течения алкоголизма по результатам генотшгарования.

Функциональная недостаточность дофаминовой мезолимбической системы, будучи основой возникновения и развития зависимости от алкоголя, вероятно, является следствием нарушения согласованной работы ансамбля генов, которые обеспечивают в норме синхронизированную и результативную дофаминэргическую нейромедиацию. Существуют данные о возможной связи полиморфных локусов генов катехол-орто-метилтрансферазы (КОМТ), дофаминовых рецепторов (типы Д4, Д2), переносчика ДА (ДАТ) с алкоголизмом (Pandey S.C.,1998; Blum K.,1995; Wei J.,1997). Можно предполагать, что близкие нейрофизиологические, нейрохимические и, в конечном счете, клинические проявления заболевания, имеют под собой различные функциональные и структурные особенности генов, вовлеченных в регуляцию дофаминэргической нейромедиации. Наиболее оправданным можно считать предположение И.П. Анохиной (2002) о функциональной полигенности зависимости от алкоголя и других ПАВ. Патофизиологический дефект в виде функциональной «слабости» дофаминэргической мезолимбической системы мозга может достигаться как результат сочетанных структурно-функциональных особенностей ряда генов, кодирующих нейрохимические звенья ДА системы. Более того, вероятно, что инди-видуальная клиническая картина зависимого от ПАВ пациента во многом определяется тем или иным сочетанием структурно-функциональных вариантов дофаминэргического ансамбля генов.

Дальнейшие исследования, вероятно, смогут более полно прояснить взаимосвязь между генотипами пациентов по гену ТГ и других генов, контролирующих систему дофаминовой нейромедиащш, с клиническими типами алкоголизма и наркоманий в целом, приблизив нас к пониманию биологической сущности наследственной предрасположенности к развитию зависимости от алкоголя.

ВЫВОДЫ

1. Животные инбредных линий с генетически детерминированной условной предрасположенностью к зависимости от алкоголя имеют врожденные различия уровня экспрессии гена ти-розингидроксилазы в дофаминэргических системах мозга. Признаки врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя у животных ассоциируются с высоким исходным уровнем экспрессии гена ТГ в мезолимбической ДА системе (фронтальная кора головного мозга, средний мозг и ЬС) и низким исходным уровнем экспрессии в стриопаллидар-ной ДА системе.

2. Острое введение этанола снижает экспрессию гена ТГ в мезолимбической ДА системе у предрасположенных к алкогольной зависимости животных и выводит ее на уровень, неотличимый от уровня экспрессии у животных без признаков предрасположенности.

3. Хроническое принудительное потребление этанола приводит к формированию алкогольной зависимости у части беспородных животных, при этом уровень экспрессии гена ТГ в мезолимбической ДА системе этих животных резко снижен: в 3 раза по сравнению с контрольной группой и в 2 раза по сравнению с животными, у которых зависимость не сформировалась.

4 Таким образом, врожденная предрасположенность к зависимости от алкоголя ассоцииро-вана с изначально высоким уровнем экспрессии гена ТГ в мезолимбической дофаминовой системе мозга. Острый прием алкоголя снижает уровень экспрессии, а хроническое потребление алкоголя приводит к резкому и стойкому снижению активности гена ТГ в состоянии развитой зависимости от алкоголя.

5. Сравнительное изучение структуры полиморфного локуса НиМТН01 гена ТГ у больных алкоголизмом с наличием или отсутствием наследственной отягощенности этим заболеванием выявило 3-х кратное повышение частоты встречаемости генотипа 9Ш-1 среди отягощенных алкоголизмом больных. Носители генотипа в 3 раза чаще, чем все остальные пациенты, имеют высокую степень семейной отягощенности по алкоголизму б Сравнительное изучение структуры полиморфного локуса НиМТН01 гена ТГ у больных алкоголизмом с различной тяжестью течения заболевания («легким» и «тяжелым» течением

алкоголизма) выявило статистически достоверное 3,5 кратное повышение частоты генотип 7\10-1 в группе пациентов с «легким» течением. Обнаружено, что генотип 7\10-1 по локус; НиМТН01 гена ТГ ассоциирован с ««легким» течением алкоголизма и его наличие у пациент делает более вероятным позднее начало заболевания и снижает вероятност высокопрогредиентного течения болезни, что позволяет предполагать «протективный» характе, этого генотипа.

7. На основании вышеизложенных фактов можно заключить, что структурные и функциональны особенности гена тирозингидроксилазы играют роль в механизмах наследственно! предрасположенности к развитию зависимости от алкоголя. Особенности структуры ген тирозингидроксилазы оказались связаны как с семейной отягощенностью по алкоголизму, так г с тяжестью течения болезни.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кибитов А.О., Анохина И.П. Уровень экспрессии гена тирозингидроксилазы в мозге крыс < различным потреблением этанола после длительной алкоголизации // Бюллетен экспериментальной биологии и медицины.-1997. -124. - № 7.-С.63-65.

2. Кибитов А.О., Анохина И.П. Уровень мРНК тирозингидроксилазы в мозге мышей с различно; врожденной чувствительностью к действию этанола // Нейрохимия. - 2000. -Т.17. -№4. «С.275 277.

3. Кибитов А.О., Анохина И.П. Влияние острого введения алкоголя на уровень мРШ тирозингидроксилазы в мозге мышей с различной врожденной чувствительностью к действи* этанола // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2001. -Т.131. -№1. -С.69-72

4. Кибитов А.О., Анохина И.П. Структурные особенности гена тирозингидроксилазы у больных различной тяжестью течения алкоголизма // Вопросы наркологии. - 2002. -№2. -С.55-65

5. Кибитов А.О., Анохина И.П. Тяжесть течения алкоголизма и структура ген тирозингидроксилазы.// Материалы международной научно-практической конференци: «Современные проблемы наркологии». Москва. 18-20 ноября 2002. -С.8-9.

6. Анохина И.П., Кибитов А.О. Патент на изобретение « Способ прогнозирования тяжести течени алкоголизма». ЯУ патент № 2225613, зарегистрирован 10.03.04.

Подписано в печать 12.03.2004.

Формат 60x90 1/16 Печать офсетная. Усл. псч. л. 2 Тираж_100 экз. Заказ № 16 01/03 04. - Полиграфические работы -Центр полиграфических услуг «Радуга» ПБОЮЛ «Гайнуллин» Лицензия: серия ИД № 06137 от 24.04.2000 г. Москва, Малый Могильцевский пер., 3 Тел.:241-36-06

Р-523 8

Непременным условием понимания сущности патологического процесса и выработки адекватного терапевтического воздействия является раскрытие патогенетических механизмов заболевания в совокупности с выявлением специфичных этиологических факторов. По современным представлениям, зависимость от алкоголя выступает ключевым признаком алкоголизма, стержневым патогенетическим феноменом, вокруг которого формируются прочие проявления заболевания (Портнов А.А., Пятницкая И.Н.,1973; Пятницкая И.Н.,1988; Иванец Н.Н., 2000). С клинической точки зрения, зависимость проявляется в виде патологического влечения к алкоголю, имеющего разнообразные проявления (Стрельчук И.В. 1976; Альтшулер В.Б., 1990).Проблема зависимости от алкоголя изучается достаточно давно, однако механизмы, посредством которых алкоголь вызывает зависимость, а также генетические факторы, делающие некоторых подверженными зависимости, остаются непонятыми. Доступные способы и виды лечения не дают достаточных результатов и остаются малоэффективными.Основной задачей для успешного лечения и предупреждения заболевания представляется поиск возможных нейрохимических механизмов патогенеза зависимости от алкоголя и генетической предрасположенности к ней.Актуальность исследования. Зависимость от алкоголя формируется у разных больных по-разному, с неодинаковой скоростью: от быстрого злокачественного течения до столь медленного, что часто трудно провести четкую границу между периодом злоупотребления алкоголем и наступлением собственно заболевания (Иванец Н.Н., Игонин А.Л. 1983). Данные медицинской статистики (Авербах Я.К.,1992) показывают, что лишь небольшая часть потребляющих алкоголь заболевают алкоголизмом, иными словами, потребление алкоголя является необходимым, но не достаточным условием возникновения алкогольной зависимости , огромное значение имеет индивидуальные биологические, а также личностные и социальные особенности больного.В литературе широко обсуждается значительная роль наследственных факторов в патогенезе зависимости от алкоголя, в частности в виде биологической врожденной предрасположенности к развитию алкогольной зависимости (Анохина И.П.,1988,1994; Cloninger C.R.,1988; Walker R.D.,1996; Heath A.C.,2001). Данные классической генетики, в частности, результаты семейных исследовании и близнецового метода (Cotton N.S. ,1979; George F.R.,1989) убедительно показывают, что риск заболевания значительно повышается при наличии в роду больных алкоголизмом: у таких пациентов часто, хотя и не всегда, зависимость формируется стремительно и в раннем возрасте (Crabbe J.C.,1985; Goodwin D.W., 1984).При этом установлено, что закономерности наследования предрасположенности к зависимости от алкоголя не носят характера "менделевского" расщепления признаков, что заставляет предполагать вероятную полигеннную природу заболевания.Экспериментальный подход выявил факт разделения популяции животных на группы с противоположным отношением к алкоголю в условиях свободного выбора: только часть животных явно предпочитала алкоголь и усиленно потребляла его (Анохина И.П.,1994). Исследования на животных "чистых" линий, селекционный отбор которых велся на основе противоположных реакций на алкоголь, установили значительные врожденные особенности функционирования ряда нейрохимических систем у этих животных. (French Т.А.,1985,1993; Wand G.S.,1993; Lukas L.R.,1998; Sands S.A., 2000).Все это позволяет говорить о существовании определенной биологической предрасположенности к развитию зависимости от алкоголя, которая носит врожденный характер и закреплена генетически. С биологической точки зрения врожденная предрасположенность понимается как комплекс генетически обусловленных особенностей нейрохимических систем мозга, благодаря которым при злоупотреблении алкоголем состояние алкогольной зависимости развивается очень быстро и протекает злокачественно. Изучение биологических механизмов формирования зависимости от алкоголя на протяжении последних сорока лет убедительно доказало, что функциональные изменения обмена дофамина (ДА) в мезолимбической системе головного мозга являются патогенетической основой зависимости от алкоголя. Впервые «дофаминовая гипотеза» патогенеза алкоголизма была сформулирована И.П. Анохиной (1975-1979).Согласно этой гипотезе, состояние зависимости от алкоголя определяется специфическими сдвигами метаболизма дофамина (ДА), формируется нейрохимический «порочный круг» в структурах дофаминовой мезолимбической системы мозга, поддерживающий стремление больного к все новым приемам алкоголя.Таким образом, с одной стороны, важным этиологическим фактором алкоголизма является генетически закрепленная, врожденная предрасположенность к развитию зависимости от алкоголя, с другой стороны, нейрохимической основой патогенеза алкогольной зависимости считают патологические изменения в структурах дофаминовой мезолимбической системы мозга. б Отправной точкой нашего исследования послужило предположение о том, что врожденная предрасположенность проявляется на уровне генома в виде неких структурных, а, следовательно, и функциональных, особенностей генов, контролирующих дофаминовую неромедиацию.Именно эти особенности обеспечивают такой уровень функционирования ДА системы, при котором встреча с алкоголем приводит к быстрому и необратимому развитию зависимости. Представляется вероятным, что до контакта с алкоголем или в состоянии длительной ремиссии после непродолжительного потребления, врожденные нейрохимические особенности существуют в состоянии субкомпенсации или неустойчивой компенсации, что позволяет организму нормально функционировать при достаточно стабильных условиях среды.Ведущая роль в регуляции дофаминовой системы мозга принадлежит тирозингидроксилазе - ключевому ферменту биосинтеза катехоламинов, что обуславливает особый интерес к гену этого фермента. Роль гена тирозигидроксилазы в патогенезе зависимости от алкоголя остается неизученной. Мы не обнаружили литературных данных по этому вопросу.Некоторые авторы (Ishiguro Н. et al., 1998; Kawada Y. et al.,1995) пытались выявить связь между структурой гена тирозингидроксилазы и алкоголизмом. Чаще всего изучалась недифференцированная, общая группа больных с диагнозом «алкоголизм» в сравнении с контрольной группой (Lobos Е.А., Todd R.D., 1997), несмотря на известную клиническую и, вероятно, патогенетическую неоднородность алкоголизма, что, на наш взгляд, и обусловило отрицательные результаты этих исследований.Клиническими проявлениями врожденной предрасположенности считаются, как известно, раннее начало и тяжелое течение заболевания в сочетании с высокой прогредиентностью (Бокий И.В и соавт. 1987; Гофман А.Г. и соавт., 1989; Cotton N.S., 1979; Crabbe J.C. et al.,1985; Alterman A.I. et al., 1988; Cloninger C.R.,1988; Keenan E. et al.,1997; Dawson D.A.et al., 2000; Hill S.Y.et al., 2000). Некоторые классификации называют такой тип алкоголизма «биологическим» или «истинным» в отличие от «социального» или «приобретенного» (Cloninger C.R.,1988 ; Penick Е.С. et al., 1990; Babor T.F. et al., 1995; Limosin F. et al. 2001). Многие из таких больных, но далеко не все, имеют семейную отягощенность алкоголизмом в виде наличия больных алкоголизмом среди кровных родственников больного. Однако известно, что семейная отягощенность алкоголизмом далеко не всегда предопределяет развитие алкоголизма (Goodwin D.W.et al., 1985; Mezzich A. et al., 1993).Таким образом, на наш взгляд, дальнейшие исследования патогенеза алкоголизма, в частности врожденной предрасположенности к алкогольной зависимости, должны быть сфокусированы на изучении структурных и функциональных особенностей генов, контролирующих дофаминовую нейротрансмиттерную систему. Ведущая роль в регуляции дофаминовой системы мозга принадлежит тирозингидроксилазе (ТТ) - ключевому ферменту биосинтеза катехоламинов, что обуславливает особый интерес к гену этого фермента. Роль гена ТГ в патогенезе зависимости от алкоголя и связь этого гена с врожденной предрасположенностью к зависимости от алкоголя остается неизученной. Выявление структурных и функциональных особенностей гена тирозингидроксилазы, специфических для состояния врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя, могло бы прояснить, хотя бы частично, генетическую основу алкогольной зависимости.Цели и задачи исследования Целью настоящей работы стало изучение структурных и функциональных особенностей гена тирозингидроксилазы у животных с генетически детерминированной индивидуальной реакцией на алкоголь, а также у больных алкоголизмом с различной степенью наследственной отягощенности алкоголизмом и при различных клинических вариантах течения болезни.В связи с этим в ходе настоящей работы решались следующие задачи: 1. Оценить уровень экспрессии гена ТГ в дофаминэргических структурах мозга у инбредных линий животных с генетически детерминированной различной реакцией на этанол.2. Изучить особенности влияния острого введения этанола на уровень экспрессии гена ТГ в дофаминэргических структурах мозга у животных инбредных линий с генетически детерминированной различной реакцией на этанол.3. Изучить уровень экспрессии гена ТГ в дофаминэргических структурах мозга у животных со сформированной зависимостью от алкоголя, возникшей в результате хронического потребления этанола.4. Провести сравнительное изучение структуры полиморфных локусов гена ТГ у больных алкоголизмом с наличием или отсутствием наследственной отягощенности этим заболеванием.5. Провести сравнительное изучение структуры полиморфных локусов гена ТГ у больных алкоголизмом с различной тяжестью течения заболевания.

6. выводы

1. Животные инбредных линий с генетически детерминированной условной предрасположенностью к зависимости от алкоголя имеют врожденные различия уровня экспрессии гена тирозингидроксилазы в дофаминэргических системах мозга. Признаки врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя у животных ассоциируются с высоким исходным уровнем экспрессии гена ТГ в мезо-лимбической ДА системе (фронтальная кора головного мозга, средний мозг и LC) и низким исходным уровнем экспрессии в стриопал-лидарной ДА системе.

2. Острое введение этанола снижает экспрессию гена ТГ в мезолимби-ческой ДА системе у предрасположенных к алкогольной зависимости животных и выводит ее на уровень, не отличимый от уровня экспрессии у животных без признаков предрасположенности.

3. Хроническое принудительное потребление этанола приводит к формированию алкогольной зависимости у части беспородных животных, при этом уровень экспрессии гена ТГ в мезолимбической ДА системе этих животных резко снижен: в 3 раза по сравнению с контрольной группой и в 2 раза по сравнению с животными, у которых зависимость не сформировалась.

4. Таким образом, врожденная предрасположенность к зависимости от алкоголя ассоциирована с изначально высоким уровнем экспрессии гена ТГ в мезолимбической дофаминовой системе мозга. Острый прием алкоголя снижает уровень экспрессии, а хроническое потребление алкоголя приводит к резкому и стойкому снижению активности гена ТГ в состоянии развитой зависимости от алкоголя.

5. Сравнительное изучение структуры полиморфного локуса HUMTH01 гена ТГ у больных алкоголизмом с наличием или отсутствием наследственной отягощенности этим заболеванием выявило 3-х кратное повышение частоты встречаемости генотипа 9410-1 среди отягощенных алкоголизмом больных. Носители генотипа в 3 раза чаще, чем все остальные пациенты, имеют высокую степень семейной отягощенности по алкоголизму.

6. Сравнительное изучение структуры полиморфного локуса HUMTH01 гена ТГ у больных алкоголизмом с различной тяжестью течения заболевания («легким» и «тяжелым» течением алкоголизма) выявило статистически достоверное 3,5 кратное повышение частоты генотипа 7\10-1 в группе пациентов с «легким» течением. Обнаружено, что генотип 7U0-1 по локусу HUMTH01 гена ТГ ассоциирован с ««легким» течением алкоголизма и его наличие у пациента делает более вероятным позднее начало заболевания и снижает вероятность высо-копрогредиентного течения болезни, что позволяет предполагать «протективный» характер этого генотипа.

7. На основании вышеизложенных фактов можно заключить, что структурные и функциональные особенности гена тирозингидроксилазы играют роль в механизмах наследственной предрасположенности к развитию зависимости от алкоголя. Особенности структуры гена тирозингидроксилазы оказались связаны как с семейной отягощенно-стью по алкоголизму, так и с тяжестью течения болезни.

7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог, можно сказать, что нам удалось показать несомненную роль как структурных, так и функциональных особенностей гена тирозингидроксилазы в патогенезе алкоголизма.

Состояние врожденной предрасположенности к развитию зависимости от алкоголя сопровождается высоким уровнем экспрессии гена тирозингидроксилазы в мезолимбической дофаминовой системе мозга. Прием этанола нормализует экспрессию гена ТГ. Сформированная зависимость от алкоголя сопровождается выраженным снижением уровня экспрессии гена тирозингидроксилазы в мезолимбической дофаминовой системе мозга. Иными словами, функциональная активность гена тирозингидроксилазы непосредственно включена в патогенез зависимости от алкоголя и изменяется в процессе развития болезни.

Структура гена ТГ в виде особенностей полиморфного локуса HUMTHOl гена ТГ связана с такими клиническими характеристиками врожденной предрасположенности как высокая степень семейной отягощенности по алкоголизму и выраженная тяжесть течения алкоголизма. Особенно важно, что каждой их этих характеристик соответствует особый вариант структуры гена ТГ. Выявление «протективного» генотипа по локусу HUMTH01 гена ТГ, носители которого объективно легче переносят болезнь, делает возможным прогнозировать тяжесть течения алкоголизма по результатам генотипирования.

Дальнейшие исследования, вероятно, смогут более полно прояснить взаимосвязь между генотипами пациентов по гену ТГ и других генов, контролирующих систему дофаминовой нейромедиации, с клиническими типами алкоголизма и наркоманий в целом, приблизив нас к пониманию биологической сущности наследственной предрасположенности к развитию зависимости от алкоголя.