Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников

ДИССЕРТАЦИЯ
Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников - тема автореферата по медицине
Еремеева, Марина Викторовна Москва 2010 г.
Ученая степень
доктора биологических наук
ВАК РФ
14.01.24
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников

Еремеева Марина Викторовна

На правах рукописи

СТИМУЛЯЦИЯ АНГИО/МИОГЕНЕЗА ПРИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ И АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ

14.01.24. - Трансплантология и искусственные органы 14.01.05. - Кардиология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 2010

003490994

Работа выполнена в Научном Центре Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

Бокерия Лео Антонович

Голухова Елена Зеликовна

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Бочков Николай Павлович; Народицкий Борис Савельевич; Онищенко Нина Андреевна.

Ведушая организация:

ГУ Российский научный центр хирургии им. Б.В. Петровского РАМН.

Защита диссертации состоится «

на заседании

диссертационного совета Д.208.055.01 при ФГУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 123182, Москва, ул.Щукинская, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова»

Автореферат разослан ^ОЛЩ^Ь ОЮг. Ученый Секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Шевченко О.П.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

18Р-НХ} - меченная фтором фтордезоксиглюкоза

ЬРвР - фактор роста фибробластов

\TEGF - фактор роста сосудистого эндотелия

\VMSI -индекс региональной сократимости

БФ - болевой фактор

ДББХ - длительность безболевой ходьбы

ДКМП - дштятационная кардиомиопатия

ДП - дефект перфузии

ЖС - жизнеспособность

ИБС - ишемическая болезнь сердца

КГ-короноарография

КДО - конечный диастолический объем

КДР - конечный диастолический размер

ККМП - клеточная кардиомиопластика

КМЦ - кардиомиоцит

КСО - конечный систолический объем

КСР - конечный систолический размер

КШ - коронарное шунтирование

ЛВГ - левовентрикулография

ЛЖ - левый желудочек

ОЗ- общее здоровье

ПЗ - психическое здоровье

ПЭТ - позитронно-эмиссионная томография

РФП - радиофармпрепарат

Синхро-ОФЭКТ - синхронизированная с ЭКГ однофотонная эмиссионная

компьютерная томография миокарда

СН - сердечная недостаточность

ТМЛР -трансмиокардиальная лазерная реваскуляризация

ФА - физическая активность

ФВ - фракция выброса

ФК - функциональный класс

ХИНК - хроническая ишемия нижних конечностей

ХСН- хроническая сердечная недостаточность

ЭКГ - электрокардиография

ЭКП - эндотелиальные клетки - предшественники

ЭхоКГ - эхокардиография

ВВЕДЕНИЕ

Хроническая сердечная недостаточность - заболевание многофакторное. Применяемые на сегодня методы лечения способны замедлить развитие болезни, но постепенно заболевание прогрессирует и становится рефрактерным в отношении «традиционной» терапии. На поздних стадиях единственно эффективным методом лечения остается пересадка сердца Однако возможности применения трансплантации сердца жестко ограничены дефицитом донорских органов. Поэтому в настоящее время сложилась настоятельная потребность в разработке и внедрении альтернативных методов лечения.

Стимуляция регенерации поврежденного органа - следующий после замещения способ лечения. Успех такого лечения существенным образом зависит от понимания молекулярных и клеточных механизмов развития сердечной недостаточности, ее прогрессирования и регрессии в результате регенерации миокарда. В связи с этим представляется важным изучение факторов детерминирующих, а также ограничивающих регенеративные возможности организма взрослого. Открытым остается также вопрос о сохранении способности к регенерации в конечно-дифференцированных тканях человека.

В колоссальном потоке современных исследований на данную тему отчетливо прослеживаются три основных направления. Во-первых, это создание имплантируемых протезов левого желудочка . Конкретные механизмы восстановления сердечной функции у больных при данном методе лечения остаются неясными, однако, предполагается активация регенерации зрелых клеток, либо стимуляция миграции стволовых клеток сердца или костного мозга в пораженный участок миокарда. Эта последняя возможность подкрепляется фактом обнаружения повышенного содержания факторов привлечения стволовых клеток (инсулин-подобного фактора роста 1 и фактора 1 стромы) в миокарде пациентов после операции (AssmusB., et а]., 2002; Adams G. et al., 2007).

Вторым активно развивающимся в последние 20 лет направлением является применение генной терапии для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы и сердечной недостаточности, в частности ( Isner J., 2002; Henry Т. et al., 2003 ). Несмотря на связанные с этим направлением большие ожидания и огромный энтузиазм исследователей, реальный прогресс весьма ограничен, что объясняется как трудностью разработки эффективного метода доставки соответствующего гена в пораженный участок, так и сложностью выбора подходящего гена. Дополнительной возможностью служит применение клеточной терапии в качестве средства доставки «терапевтического» гена. В целом генная терапия остается перспективной возможностью стимуляции регенерации миокарда, как сама по себе, так и в сочетании с другими способами регенеративной

терапии. Однако успех этого направления полностью зависит от интенсивности исследовательской работы.

Третьей по порядку изложения, но не по важности, возможностью регенеративной терапии сердечной недостаточности является клеточная терапия. На экспериментальных моделях было продемонстрировано, что кардиомиоциты плода могут формировать межклеточные контакты с клетками миокарда, однако практической перспективы применения данный источник стволовых клеток не имеет ( Strauer В., 2003). Наиболее практичной в настоящее время возможностью представляется использование аутологичных либо гомологичных стволовых клеток взрослого, выделяемых из костного мозга, крови, жировой ткани, скелетных мышц, или непосредственно из сердца. На экспериментальных моделях сердечной недостаточности была продемонстрирована потенциальная способность клеток из вышеперечисленных источников улучшать функцию миокарда (Szmitko P., et al. 2003). Нуждается в дальнейшей отработке еще целый ряд вопросов, таких как оптимизация выбора клеток для введения и способа введения, недостаточное выживание введенных клеток и низкая скорость их пролиферации после инъекции, а также изучение способности введенных клеток к транедифференцировке и интеграции, либо к воздействию на оставшийся жизнеспособным миокард через паракриновый эффект. Прояснение этих основных моментов необходимо для оптимизации условий клеточной терапии, сочетающей максимальный клинический эффект с минимумом осложнений.

Целью настоящей работы стала разработка безопасных и эффективных методов генной и клеточной терапии, которые могли бы использоваться изолированно или в дополнение к существующим традиционным хирургическим методам для лечения ряда сердечно-сосудистых заболеваний.

Задачи исследования

1. Проанализировать и охарактеризовать состояние миокарда в предполагаемой зоне введения терапевтических агентов для стимуляции ангио/миогенеза.

2. На модели ишемии задней конечности крысы исследовать эффективность полученных нами генетических препаратов VEGFim и bFGF.

3. В культуре in vitro, а также путем непосредственного анализа выделяемых ех-vivo стволовых клеток-предшественников охарактеризовать их фенотип, а также пролиферативный и дифференцировочный потенциал.

4. На ограниченном контингенте больных с ИБС и ХИНК провести оценку эффективности клинического применения генетических препаратов -стимуляторов ангиогенеза.

5. На ограниченном контингенте больных с сердечной недостаточностью и ХИНК провести оценку эффективности клинического применения стволовых клеток-предшесгвенников для стимуляции ангио- и миогенеза.

6. Выработать и обосновать критерии отбора, а также рациональные и безопасные методы доставки и тактику применения генетических и клеточных препаратов для лечения больных с сердечно-сосудистой патологией.

Научная новизна работы. Создана уникальная плазмидная конструкция, позволяющая эффективно экспрессировать ген УЕОИ^ в тканях и обоснована перспективность его применения для стимуляции ангиогенеза в процессе реваскуляризации ишемизированных тканей.

Впервые продемонстрирована большая по сравнению с СБ 133+/СЮ4+Л/ЕСРК-2* клетками способность клеток СВ133+/С034-/УЕ0РК-2+ к дифференцировке в направлении эндсгтелиального ростка, и тем самым обоснована большая перспективность использования маркера С0133 по сравнению с СЭ34 для выделения стволовых клеток с целью лечения ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.

Впервые показано, что в зависимости от локализации ишемии, внутримышечное и/или интраартериалыюе введение СБ133+ аутологичных костномозговых клеток-предшественников ведет к достоверному улучшению перфузии вследствие формирования новой сосудистой сети.

Практическая значимость работы. Разработанная на основе гена УЕОРю генетическая конструкция внедрена в клиническую практику НЦССХ им. А.ИБакулева и успешно применяется для лечения больных ишемической болезнью сердца и хронической ишемией нижних конечностей с целью реваскуляризации пораженных тканей. В результате изучения потенциала к пролиферации, дифференциации и регенерации стволовых клеток костного мозга разработаны и внедрены в клиническую практику НЦССХ им. А.Н.Бакулева методы клеточной терапии ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.

Материалы работы могут рекомендованы к применению в научно-педагогической деятельности кардиохирургических центров нашей страны, в которых осуществляется квалификационная подготовка специалистов, работающих в кардиологии и кардиохирургии.

Результаты данной работы внедрены в клиническую практику Научного Центра Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН, а также материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов, в

сертификационном курсе для сердечно-сосудистых хирургов, проходящих обучение на базе НЦССХ им. А.Н.БакулеваРАМН.

Положения, выносимые на защиту:

1. Дополнительная стимуляция процессов ангио/миогенеза в ишемизированных тканях ведет к улучшению прогноза течения заболевания и улучшению качества жизни больных ишемической болезнью сердца и хронической ишемией нижних конечностей.

2. Применение плазмидной генетической конструкции (ангиостимулин) безопасно для больного, позволяет эффективно экспрессировать ген УБвРка, и может быть использована для индукции репаративного ангиогенеза в ишемизированных тканях.

3. Популяция стволовых СИ 133+/СО34"/УЕ0РК-2+клеток-предшественников обладает большим дифференцировочным потенциалом в направлении неоангиогенеза по сравнению с С0133+/С034+Л/ЕС1:Я-2+ клетками, что обусловливает их большую терапевтическую эффективность.

4. Терапевтическая эффективность аутотрансплантации стволовых СЭ133+ клеток определяется в том числе способом введения. В то время как интра-миокардиальный способ достоверно улучшает перфузию ишемизированного миокарда, шпракоронарное введение не оказывает влияния на данный параметр.

Апробация диссертации состоялась 8 мая 2009 года на заседании апробационного совета НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН.

Публикации. По теме работы опубликовано 43 научные работы, из них 16 - в центральной (в том числе зарубежной) печати.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 186 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, результаты, обсуждение), выводов, практических рекомендаций и указателя литературы из 10 отечественных и 323 зарубежных источников. Диссертация содержит 40 таблиц и 70 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Методы экспериментальных исследований.

Гистологическая оценка экспрессии факторов ангиогенеза и рецепторов к ним. Для окраски срезов тканей миокарда использовали моноклональные антитела: анти-CD34 Dako Corp., Дания; анти-СОЗ 1 Dako Corp., Дания; анти-VEGF Santa Cruz Bio-tech., U.S.A.; анти- Flt-1 Santa Cruz Bio-tech, U.S.A.; анти-Flk-l Santa Cruz Bio-tech, U.S.A.; акти-Thrombospondin Boerhinger Manhiem, Германия; aHra-CD95, anm-CD95L Novocastra. Биопсийный материал ишемизированного участка миокарда размером не менее 5*3 мм забирали во время операции КШ. Материал немедленно помешали в 10% раствор нейтрального формалина Проводка и заливка биопеийного материала в парафин проводилась по стандартной методике. Выдержка в 10% нейтральном формалине не превышала 24-36 часов. Для оценки экспрессии факторов ангиогенеза и других факторов роста использовались срезы толщиной 4мкм. Срезы депарафинировали и дегидратировали по стандартной методике. Для восстановления структуры антигенов срезы обрабатывались в Target Retrieval Solution (Dako) на водяной бане в течение 30 мин при 95-99°С. Для блокирования эндогенной пероксидазьг и неспецифического связывания срезы инкубировали с 3% Н2О2, 15 мин, а затем с 1% БСА - 15 мин при комнатной температуре. Инкубацию с первичными антителами проводили от 30 до 60 мин (в зависимости от вида антител) при комнатной температуре. После инкубации срезы промывали в PBS. Визуализация первичных антител производилась с помощью системы 4SAB plus kt (Dako Corp.) согласно инструкции. Препараты докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам. Подсчет количества сосудов проводился в поле зрения микроскопа при увеличении х200-х250.

Электронная микроскопия интраоперационной биопсии миокарда зоны, расположенной рядом с постинфаркгной аневризмой левого желудочка. У 16 больных с постинфарктной аневризмой ЛЖ были взяты интраоперационные биопсии миокарда ЛЖ из зоны, расположенной рядом с постинфаркгной аневризмой левого желудочка. Биопсийный материал фиксировали в растворе 2,5% глютарового альдегида и 1% параформальдегида на фосфатном буфере (pH 7,4), дофиксировали в 1,5% растворе четырехокиси осмия, обезвоживали, заливали в аралдит. На ультратоме Leica изготавливали полутонкие и ультратонкие срезы. Полутонкие срезы ткани окрашивали по методу ШИК с докраской метиленовым синим, изучали под световым микроскопом. Ультрагонкие срезы контрастировали уранилацетагом и цитратом свинца, просматривали в электронном микроскопе Philips СМ 100.

Получение шшмидной конструкции, содержащей ген васкулоэндотелиального фактора роста VEGFi65 (ангиосгимулип) в сотрудничестве с Институтом Биологии Гена РАН. Последовательность человеческого гена VEGF была получена из базы данных Genom Database с помощью программы Entrez (NM003376). Для получения гена к его последовательности были синтезированы праймеры: к 5' концу гена TGO GGC CGA ААС CAT GA и CGG СТС АСС GCC TCG GCT Т к 3' концу гена. Праймер к 5' концу гена был выбран с учетом последовательности Козак, обеспечивающей эффективное начало трансляции. Для обеспечения возможности проверки экзогешюго белкового продукта гена VEGF был также синтезирован праймер на 3' конец гена, который помимо последовательности гена содержал эгагтоп распознавания антителами полигистидиновой последовательности, необходимой для последующей очистки белка Для удобства клонирования и анализа праймеры также включали сайты узнавания уникальными ресгрнктазами, не содержащимися в последовательности гена. Сайт Eco RI для 5' концевого праймера и Smal сайт для 3' концевого праймера. Фрагменты ДНК, соответствующие по размерам VEGF165 и VEGF121, элюировались из геля после рестрикции и очищались с помощью набора фирмы Qiagen. Конструкция, содержащая ген VEGF165, была изготовлена на основе вектора pBK-CMV neo (Stratagene). Полученные плазмиды встраивали в соответствующий штамм Escherichia coli с целью наработки белка в процессе ферментации с последующей очисткой препарата из клеточного лизата на аффинных колонках с антителами, специфичными к гистидиновому хвосту молекулы.

Исследование эффективности ангиостимулина in vivo в тестс с матригелем. В экспериментах использовали мышей-самок С57В1/6 возрастом 6-8 недель. Матригель (BD Bioscience, Discovery Labware) при 4°С смешивали со 100 нг/мл VEGF (Becton Dickinson Labware), либо с клетками, трансфецированными геном VEGFim. Смесь Матригеля затем вводили подкожно мышам в подмышечную впадину, где он полимеризовался с формированием имплантанта, который удаляли на 7 день, фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24-36 часов и заключали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм докрашивались гематоксилин-эозином и по Мейсону (Masson's trichrome, Sigma Diagnostic). Общий индекс клеточной инвазии определялся при анализе изображений срезов, полученных с помощью цифровой камеры. Количество мигрировавших клеток определялось подсчетом процента области, занятой эндотелиальпыми клетками к общей области Матригеля.

Исследование эффективности ангиостимулина на модели ишемии иижних конечностей. В эксперименте использовались крысы Vistar, взрослые особи массой 200250 грамм обоего пола Для изучения ангиогенного эффекта испытываемых препаратов

была создана модель хронической ишемии скелетной мышцы конечности крысы. Под внугрибрюшинным наркозом раствором тиопентала производилась перевязка бедренной артерии крысы нитью Prolen на двух уровнях - проксимальном и дисгальном. На 10-е сутки после перевязки артерии из области ишемии брался кусочек ткани для гистологического исследования, вводился ген ангиогенного фактора в различных дозах. На 30-е сутки после введения препарата брался на гистологический анализ кусочек ткани из места инъекции. Блоки ткани скелетной мышцы замораживали при помощи охлажденного до -80°С петролейного эфира. Срезы толщиной 10 мкм приготавливали в криостате Leica. Свежезамороженные срезы скелетной мышцы окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизон, выявляли активность сукцинатдегидрогеназы и лакгатдегидрогеназы. Активность ферментов определяли по методике Burstone M.S., регистрируя восстановление соли нитросинего тетразолия до синего диформазана.

Методика оценки эффективности препаратов по плотности капиллярной сети в ишемизированной ткани. Блоки ткани скелетной мышцы фиксировали в 4% нейтральном формалине и заливали в парафин. Парафиновые срезы скелетной мышцы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизон. Оценка плотности капиллярного русла проводилась при увеличении хЮОО с использованием иммерсии. Подсчитывалось количество открытых капилляров при оценке не менее 10 полей зрения на срез. Сравнивались полученные данные от одного животного до введения препарата и через 30 дней после введения.

Метод выделения н получения аутологачных клеток-предшественников CD133+. Использовалась стандартная методика пункции костного мозга под местной анестезией из крыла подвздошной кости в количестве 40 мл. Пункция помещалась в 2x50 мл пробирки с 5 мл PBS и 2001)/мл гепарина. Полученная масса разводилась 1:2 средой RPMI 1640, содержащей 0,02% коллагеназы В и lOOU/мл ДНКзы. Осторожно перемешивалась при 20сС 45 мин. После фильтрации через фильтр 40 мкм выделялся весь пул мононуклеаров методом центрифугирования (35 мин - 400g - 20° С) на градиенте плотности Ficoll. Выделенные монокуклеары двукратно отмывали в растворе PBS, содержащем 2mM EDTA, центрифугировали (10 мин -300g - 20°С). Подсчитывали концентрацию мононуклеаров в камере Горяева. Оставляли финальный объем ЗООмкл PBS/не более 108 клеток для последующей магнитной сепарации CD133+. Для ингибирования неспецифического связывания добавляли FcR блокирующий реагент (100мкл). Инкубировали 10 мин при 20°С. После чего сразу вносили антитела CD133 на микросферах (ЮОмкл) и инкубировали 30 мин при 4°С. После отмывки в 10х объеме раствора PBS (10 мин - 300g - 20°С) ресуспендировали осадок в 500 мкл буфера Для

магнитной сепарации использовали MS колонки. После подсчета и оценки жизнеспособности клетки помещали в инкубатор (37°С, 0,5% СО2) в бессывороточной среде X-VIVO 15 согласно рекомендациям GMP, где сохраняли в течение 1-2 суток до процедуры введения пациенту. Для введения CD133+ клстки-предлиственники разводили в физиологическом растворе (2мл), содержащем 20% аутологичной сыворотки пациента.

Метод проточной цитофлюори.метрии (FACS). Цитометрический анализ проводился с использованием программ MultiGraph и FlowJo.

Иммуноцитохимический анализ. Мононуклеары были выделены на градиенте фикола и в конценрации 4x10s помещены в 24-луночный планшет, предварительно покрытый человеческим фибронсктином (10мкг/мл) (Sigma), в эндотелиальной основной среде ЕВМ (CcllSystems) с добавлением компонентов SingleQuots и 20% FCS. После культивирования (4 суток) были удалены неприкрепившиеся клетки и прикрепившиеся оставлены для цитохимического анализа.

Дм анализа эндотелиалыюго фенотипа выделенных клеток-предшественников использовали l,l-dioctadecyl-3,3,39,39-tetramethylindocarbocyanine-labeled acetylaied LDL (Dil-Ac-LDL)(CellSystcms). Клетки инкубировали в среде с 2,4 мкг/мл Dil-Ac-LDL бОмин при 37°С. После отмывки в PBS клетки фиксировали в 2% растворе формальдегида в PBS 10 мин при 20°С в темноте. Загем клетки отмывали и инкубировали с FITC-меченным Ulex europaeus agglutinin I (Sigma) в течение бОмин в темноте. Клетки, позитивные и по Dil-Ac-LDL, и по лекгину были идентифицированы как эндотелиальные клетки-предшественники (ЭКП) и подсчитаны в каждой лунке. Два независимых исследователя подсчитывали количество ЭКП в каждой лунке триады в 6 полях зрения.

2. Материалы и методы исследования в клинике.

Общая характеристика больных. В клиническое исследование по оценке эффективности стимуляции ангногенеза при применении генного препарата «ангиостимулин» и фракции клеток CDI33* было включено всего 101 пациент (29 пациентов с ишемической болезнью сердца, 29 пациентов с хронической сердечной недостаточностью различной этиологии и 43 пациента, страдающих ишемией нижних конечностей).

Группа 1: 11 пациентов (средний возраст 49±8,7 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,0±0,77 ФК CCS, ФВ ЛЖ 52,8±9,2%), которым было выполнено КШ в сочетании с введением генного препарата «Ангиостимулина».

Группа 2: 13 пациентов (средний возраст 51,4±6,7 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,23±0,73 ФК CCS, ФВ ЛЖ 50,8±8,8%), которым при проведении КШ был введен генный препарат «Ангиостимулин» и проведена ТМРЛ.

Группа 3: 5 пациентов (средний возраст 56,8±9,8 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,4±0,65 ФК CCS, ФВ ЛЖ= 48,1±8,3%), которым было выполнено ТМЛР в сочетании с введением «Ангиостимулина».

Группа 4: 10 пациентов (средний возраст 56,7±10,5лет) с ИБС (стенокардия напряжения II1-IV ФК CCS) и ХСН (III-IV ФК NYHA, ФВ ЛЖ =37,7±13,7%), которым были введены клетки CD133+.

Группа 5: 12 пациентов (средний возраст 43,1±14,8лет) с ДКМП и ХСН (III-IV ФК NYHA, ФВ ЛЖ = 28,4±7,2%), которым были введены клетки CD133+.

Группа 6: 7 пациентов (средний возраст 55,1 ± 14,1лет), с длительным ревматическим анамнезом, после операции протезирования митрального клапана со сроком послеоперационного периода не менее 1 года, при отсутствии поражения аортального клапана и с сохранной функцией протеза митрального клапана, при отсутствии атеросклеротического поражения коронарных артерий, подтвержденного данными коронарографии, со сниженной сократительной функцией миокарда ЛЖ по данным эхокардиографии (ФВ ЛЖ=36,4±10%, III-IV ФК NYHA). Всем пациентам этой группы при проведении коронароангиографии были введены транскатетерно интрамиокардиально CD133+ клетки.

Группа 7: 14 пациентов, страдающих ХИНК, которым были трансплантированы клетки-предшественники CD133+.

Группа 8:29 пациентов с ХИНК, которым был введен «Ангиостимулин».

Стандартная электрокардиография (ЭКГ) выполнялась на 6/12 канальном электрокардиографе MWZ BIOSET 8000 (Германия) со скоростью лентопротяжного механизма 25 мм/сек до и после операции в 12 стандартных отведениях.

Эхокардиография (ЭхоКГ) выполнялась на аппарате Hewlett Packard Sonos 5500 с использованием трансторакального S4 и чрезпищеводного Oraniplane II датчиков до и после операции. Определение конечных размеров и объемов полости ЛЖ в систолу и диастолу выполнялось из стандартных позиций по методике Teichkholtz. Оценка фракции выброса миокарда левого желудочка осуществлялась по модифицированному методу Simpson из апикальной 4-х камерной проекции. Из этой же проекции проводилось измерение конечно-диастолического объема левого желудочка (КДО ЛЖ, мл) и конечно-систолического объема ЛЖ (КСО ЛЖ, мл) по формуле площадь-длина в модификации Simpson.

Проба с физической нагрузкой (тредмил - тест) выполнялась на системе сопровождения нагрузочных проб «Burdic Quest» (США) по протоколу Bruce с применением системы 12 модифицированных отведений ЭКГ по методу Mason-Likar на

фоне отмены антиангинальных препаратов в утренние часы до операции и перед выпиской пациентов после операции. Производилась оценка толерантности к физическим нагрузкам, оценивалась длительность нагрузки и наличие ЭКГ критериев ишемии.

Рентгеноэндоваскулярные методы исследования артерий. Всем пациентам с заболеваниями сердца была сделана вентрикулоангиография. В группе пациентов с ХИНК было выполнено ангиографическое исследование магистральных сосудов нижних конечностей. Селективная коронароангиография на этапе дооперационного обследования выполнялась на апгиографических установках «Angioscop D» фирмы Siemens (Германия) и «Integris - 3000» фирмы Phillips (Голландия) под местной анестезией по методу М. Jadkins с введением катетера в бедренную артерию по S. Seidinger. Применялся контраст «Омиипак». Анализ ангиограмм выполняли на установке «Integris - V3000» со скоростью киносъемки 25-50 кадров в секунду на пленку фирмы «Kodak». Характер и степень поражения коронарного русла определяли по классификации Ю.С. Пстросяна и JI.C. Зингермана.

Синхронизированная с ЭКГ однофотонная эмиссионная компьютерная томография миокарда (сннхро-ОФЭКТ). Проба с дозированной физической нагрузкой выполнялась на велоэргометре «Meditronic» фирмы Hellige (Германия) с помощью 12 канального электрокардиографа «Bioset-800» фирмы в положении сидя по стандартному протоколу, принятому в НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. Реконструкцию полученных томограмм выполняли с применением стандартной программы AUTOSPECT-plus, реализующей механизм обратного проецирования фильтрованных проекций.

Позитроиная эмиссионная томография (ПЭТ). Дня оценки метаболизма глюкозы применяли радиофармпрепарат (РФП) - фгордезоксиглюкозу, меченую фтором ("F-FDG), которую синтезировали по двухстадийному методу R. Hamacher и соавторов на автоматизированном модуле синтеза производства фирмы «Nuclear Interface» (Германия). За 1 час до введения РФП пациенты получали перорально 50 г глюкозы с целью увеличения концентрации глюкозы в крови и подавления потребления жирных кислот в миокарде, что способствовало более высокому накоплению 18F-FDG в миокарде и лучшей его визуализации. Исследование осуществляли на позитронном эмиссионном томографе «Exact 47» фирмы «Siemens» в статическом режиме сбора данных через 40 мин после внутривенной инъекции 370 МБк РФП, Эмиссионное сканирование длилось 20 мин, а трансмиссионное - 10 мин.

Оценка транскутанного напряжения кислорода в тканях осуществлялась с помощью монитора ТСМ-2 фирмы «Radiometer» (Дания) исходно перед введением стимулятора ангиогенеза, через 1, 3 и 6 месяцев после введения (в некоторых случаях

дополнительно через 9 месяцев и 1 год). Во время исследования пациент находился в горизонтальном положении на спине с выпрямленными конечностями. Фиксация датчика осуществлялась по стандартной технологии, рекомендуемой фирмой - изготовителем прибора в первом межпальцевом промежутке на тыльной стороне стопы. Показатели регистрировались не ранее, чем через 20 минут после помещения откалиброванного датчика на место измерения.

Ультразвуковая допплерография сосудов нижних конечностей проводилась до операции на аппарате Hewlett-Packard Sonos 5500 с линейным сосудистым мультичастотным датчиком. Оценивалась проходимость сосудов, состояние комплекса интима-медиа-адвентиция, состояние просвета сосудов с оценкой степени их сгенозирования.

Изучение качества жизни проводилось при помощи опросника общего назначения - Короткая Версия Опросника Здоровья - 36 (MOS 36-item Short - Form Health Survey, или MOS SF - 36), разработанного в США в рамках исследования MOS (Médical Outcome Study, англ. - Изучение Медицинских Результатов).

Статистическая обработка данных. Результаты, представленные в работе, выражались как среднее значение ± стандартное отклонение. При сравнении зависимых переменных использовался W- критерий Уилкоксона, независимых - Т-критерий Манна-Уитни. Результаты считались статистически достоверными при значениях р<0,05. Все расчеты проводились при помощи программы «Statistica 6.0» Copyright © Stat Soft, Inc.

Методы введения ангиогенного фактора. «Ангиосггимулин» вводился на заключительном этапе операции коронарного шунтирования ишрамиокардиально в общей дозе 1000 мкг в зону, нуждающуюся в стимуляции неоангиогенеза. 11 пациентам препарат был введен на заключительном этапе операции, 13 пациентам дополнительно к КШ и введению препарата проводилась TMJIP. Суммарная доза препарата делилась на 4 интрамиокардиальных инъекции (по 250мкг). Область введения определялась на основании результатов коронароангиографии, сцинтиграфии миокарда, позитронно-эмиссионной томографии, как область ишемизированного, но жизнеспособного миокарда, не подлежащая хирургической реваскуляризации по техническим причинам (плохое дистальное русло, малый диаметр коронарной артерии).

Транскатетерно интракоронарно изолированно клетки CD133+ вводили 6 пациентам. Первоначально выполнялась селективная коронарография, затем ретроградная катетеризация ЛЖ и ЛВГ. Производилась смена катетера и под флюроскопическим контролем в полость ЛЖ проводили 7F Gaid катетер, кончик которого был установлен в область введения, которая определялась заранее на основании данных КГ и сцинтиграфии

миокарда. Через Оа1с1 катетер проводилась специальная гибкая игла 3,5К с ограничителем вкола 0,3мм для интрамиокардиальной пункции (с выбросом гибкой иглы) и выполнялись последовательные (по часовой стрелке) инъекции аутологичных клеток-предшественников С0133+ (в объеме 200-250 мкл) под флюороскопичсским контролем положения кончика иглы. Заключительным этапом выполнялась ЛВГ.

Интрамиокардиально клеточный препарат- СО 133+ вводили на заключительном этапе операции. 12 пациентам аутшраненлантация клеток производилась путем интрамиокардиалыгой инъекции, 4 пациентам - путем интрамиокардиальной транскатетерной инъекции (через полость ЛЖ).

В дополнение к хирургической реваскуляризации или при изолированном введении ангиогенных факторов все пациенты с поражением миокарда получали стандартную кардиальную терапию.

Введение стимулятора ангиогенеза (ангиостимулина, либо клеток-предшественников) при ХИНК производилось однократно внутриартриалыю в магистральную артерию пораженной нижней конечности с помощью катетера, после выполнения исходной ангиографии, или внутримышечно обкалыванием икроножной мышцы в области пораженной артерии через 4-5 вколов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Результаты экспериментальных исследований.

В результате иммуноморфологического исследования полученных в ходе оперативного вмешательства тканей ишемизированного миокарда больных ИБС нами зарегистрирован параллелизм в экспрессии стимулирующих ангиогенез факторов в тканях и рецепторов к этим факторам на отвечающих клетках. При этом в значительной степени подавляется экспрессия маркеров апоптоза на клетках сосудов сердца. Таким образом, в ишемизированном миокарде активизируются механизмы формирования новых кровеносных сосудов, способных компенсировать недостаток кровотока и ишемию в пораженном участке. Нам удалось показать, что в результате хирургической реваскуляризации миокарда с помощью КШ происходит стимуляция эндогенного компенсаторного ангиогенеза. По-видимому, дополнительное введение факторов, стимулирующих ангиогенез (в частности ДНК, кодирующей УЕОБ) при ишемии миокарда, может способствовать более эффективным результатам хирургического лечения, а также в сочетании с лазерным воздействием, поддерживая уровень экспрессии ангиогенных факторов, необходимый для терапевтического ангиогенеза.

По данным гистологического анализа у всех больных в анализируемой зоне миокарда содержание соединительной ткани было повышено: у 4 больных наблюдали выраженный склероз, у 2 больных - умеренный. В интерстиции у половины больных отмечены отдельные жировые клетки, у одного больного - единичные тучные клетки. КМЦ у всех больных были гипертрофированы (средний поперечный диаметр составил от 28,96±6,17 до 32,21±7,03мкм). Большинство КМЦ демонстрировало разную степень утраты миофибрилл: слабую, умеренную или значительную, - с накоплением в саркоплазме повышенного количества гликогена. Наибольшая степень утраты миофибрилл была типична для КМЦ, расположенных в зонах миокарда с более выраженным склерозом.

Электронно-микроскопическое исследование выявило характерные изменения ультраструктуры КМЦ. Ядра этих клеток, как правило, имели сильно извитые контуры, содержали эухроматин с небольшими глыбками гетерохроматина и крупные ядрышки. В околоядерной зоне располагались митохондрии, гранулы гликогена, отложения липофусцина, цистерны и везикулы аппарата Гольджи. У 5 из обследованных 6 больных в некоторых КМЦ рядом с везикулами аппарата Гольджи были обнаружены специфические предсердные гранулы, у 3 больных в околоядерной области КМЦ встречались хорошо развитые цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума. Большинство КМЦ демонстрировало четко организованный сократительный аппарат. Миофибриллы этих клеток имели параллельное расположение, между ними находились цепочки митохондрий межмиофибриллярной популяции. В некоторых КМЦ были выявлены области саркоплазмы, утратившие миофибриллы и заполненные несократительными структурами, в том числе, митохондриями, расширенными везикулами саркоплазматического ретикулума. В межмиофибриллярной и околоядерной зонах КМЦ всех больных определялись отдельные митохондрии с зонами расхождения крист, заполненные хлопьевидным содержимым матрикса. Вставочные диски КМЦ были интенсивно развиты, имели зигзагообразные контуры, включали соединения типа fascia adherence, в меньшей степени - десмосомы и щелевые контакты. У 2 больных некоторые вставочные диски КМЦ демонстрировали локальные расхождения контактирующих мембран. У большинства больных в отдельных КМЦ были обнаружены множественные вставочные диски, расположенные на расстоянии 1-3 саркомеров. Характерным признаком многих КМЦ была дилятация каналов Т-системы. Содержание гликогена в КМЦ сильно варьировало, обычно оно было повышено в клетках с расширенными зонами утраты миофибрилл. Иногда в клетках выявляли скопления гликогена, окруженные мембранами, которые в ряде случаев могли входить в состав миелиноподобных образований.

Миелииоподобныс фигуры были обнаружены у большинства больных в некоторых КМЦ. Как правило, они располагались под сарколеммой. В отдельных КМЦ присутствовали мелкие жировые капли. Во всех изученных образцах миокарда выявлен умеренный или выраженный склероз, описанный в литературе как характерный признак миокарда больных ИБС (Zimmer G., et al., 1992), втом числе больных с постинфарктной аневризмой JDK (Su X-, et al., 2000). Размеры КМЦ были значительно выше нормы, при которой, как установлено (Maron B.J., et al., 1975), диаметр КМЦ составляет 10-15 мкм. Средний диаметр КМЦ у разных КМЦ демонстрировали ультраструктурные признаки, типичные для гипертрофированных больных находился в пределах от28,96±6,17 до 32,21±7,03 мкм, что соответствовало тяжелой степени гипертрофии миокарда по классификации B.Kunkcl, М. Schneider (1987). Таким образом, результаты морфологического исследования миокарда демонстрируют наличие в нем склеротических изменений, тяжелой степени гипертрофии КМЦ с началом их перестройки по типу дедифференцировки, что сопряжено со снижением их сократительной способности, а также выявлены дистрофические изменения КМЦ. Полученные результаты свидетельствуют, что у больных ИБС с постинфарктной аневризмой присутствуют значительные патологические изменения миокарда JDK, что является основанием для целенаправленного применения клеточной и генной терапии для стимуляции регенеративных и ангиогенных процессов в пораженном миокарде.

В работе получена и оценена плазмидная конструкция, содержащая ген васкулоэндотелиалыюго фактора роста VEGFi« (ангиостимулин). На модели ишемии задней конечности крысы и в тесте с матригелем продемонстрирована эффективность препарата и обоснована перспективность его применения для стимуляции ангиогенеза в процессе реваскуляризации ишемизированных тканей. Было выявлено, что эта конструкция позволяет эффективно экспресспровать ген VEGFies в тканях экспериментальных животных. Также в эксперименте продемонстрированы высокая переносимость и отсутствие токсичности препарата. Для изучения эффективности ангиогенных препаратов VEGF^s и bFGF была создана модель хронической ишемии скелетной мышцы задней конечности крысы. Достоверный прирост количества капилляров был обнаружен через 30 дней после введения гена VEGFisj, даже при введении минимальной в нашем исследовании (250 мкг) дозы препарата. Плотность капиллярной инфильтрации мышечной ткани после введения гена bFGF не отличалась от таковой в контроле (физиологический раствор). При изучении проангиогенной активности генных препаратов в тесте с матригелем клетки человека линии НЕК 293 были

трансфецированы плазмидой, содержащей ген УЕСР^з- В качестве контроля использовался аналогичный препарат, не экспрессирующий белок УЕОР^.

С целью более полной характеристики стволовых клеток-предшественников мы выделяли СО 133 клетки методом магнитной сепарации на покрытых антителами бусах из костного мозга больных ИБС. Анализ на проточном цитофлуориметре позволил выявить наличие двух субпопуляций в составе данной клеточной фракции: большая С034+/С0133+ (69±3% от всех СОШ-положительных клеток) и меньшая С034"/С0133+ (29±3%) субпопуляции. Обе эти субпопуляции в равной мере экспрессируют на поверхности рецептор к УЕйР (99%) и не экспрессируют моноцитарно-макрофагальный маркер СП14. В процессе культивирования в условиях, благоприятствующих дифференцировке в эндотелиальные клетки, на протяжении 4 дней в популяции С034"/С0133+/\'Е0РК-2+ клеток параллельно с усилением экспрессии С034 и маркера эндотелиальных клеток С031, было зарегистрировано прогрессивное снижение экспрессии СБШ на клеточной поверхности. Тем самым, наши данные показывают, что субпопуляция клеток-предшественников С0347С01334/УЕ0РК-2+ находится на более продвинутой стадии дифферениировки в направлении эндотелиальных клеток по сравнению с СЭ34" /С0133+Л/Е0РЕ-2+ клетками. Дополнительно было проанализировано поглощение ОПАс-ЬОЬ и связывание лектина Ц еигораеиз клетками. При этом удалось продемонстрировать, что в большей степени двойное положительное окрашивание этими специфическими для клеток эндотелия маркерами свойственно субпопуляции С0347СВ133+/УЕСРК-2+ клеток по сравнению с СШ4+/СП133"Т\'ЕОРК-2+ клетками (Рисунок 1). В отличие от этой последней субпопуляции клеток-предшественников, двойное положительное окрашивание по маркерам эндотелия проявляется уже через 24 часа культивирования, что позволяет предположить, что их более высокий дифференцировочный потенциал в направлении зрелых клеток эндотелия может быть связан с более высокой адгезивностью этих клеток. В связи с этим предположением, в тестах на адгезивность нам удалось показать, что стимулированная 50Р-1 и зависимая от [^-интегрина адгезия выше в субпопуляции СЭ34УСО133+/УЕОРК-2+ клеток по сравнению с С034"7СШ337УЕ0РЯ-2+ клетками (Рисунок 2).

Рисшшк_1

10

С034+/С0133+ СЭ34-/С0133+

Выделенные методом магнитной сепарации клетки разделяли на СТ134+ и СЭ34- субпопуляции, культивировали в основной звдотелиальной среде. В обозначенные на рисунке сроки ло методике приведенной в главе «Материалы и методы» определяли поглощение [Ы-АЫ.О!. и присоединение лектина О выгораем. (+Р<0,05 по сравнению с СШ4+/СО133+ клетками, культивированными в течение 24 часов; #Р<0,05 по сравнению с С034-/СШЗЗ+ клетками, культивированными в течение 4 .дней).

Рисунок 2.

Snpe-SDF1 Ипост-SDFI I

S 2500

Ц 2000

1 1500

I 1000

= 500

CD34+/CD133+ CD34-/CD133+

Прилипание обозначенных на рисунке субпопуляций ЭПК к покрытому фибронекгкном предметному стеклу в присутствии или отсутствии SDF-1 (100 nmol/L, 5 min) оценивали под световым микроскопом (хЮО) путем прямого подсчета прилипших клеток после 3 интенсивных отмывок lx PBS. Для каждой группы оценивали по 5 препаратов; (*Р<0,05 по сравнению с нестимулированными клетками; #Р<0,05 по сравнению с SDF-3-стимулированными CD34+/CD133+ клетками).

В [тгоге экспериментальных исследований была отработана методика получения выеокоочищенной популяции CD133+ стволовых клеток костного мозга. Показано, что данная популяция состоит из двух субпопуляций: менее зрелых CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток и более дифференцированных CD1337CD34+/VEGFR-2r клеток. В экспериментах in vitro установлено, что субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток обладает большим по сравнению с CD133+/CD347VEGFR-2+ клетками потенциалом к дифференцировке в направлении эндотелиального ростка. Тем самым обоснована большая перспективность использования маркера CD133 по сравнению с CD34 для выделения стволовых клеток с целью лечения ИБС и ХИНК.

2. Результаты клинического применения ангиогенных факторов.

На ограниченном контингенте больных (п=101) с ишемическим поражением миокарда и при ишемии нижних конечностей проанализирована эффективность трансплантации генного препарата и клеток-предшественников для стимуляции регенеративных процессов.

Препарат «Ангиостимулин» был введен 29 пациентам, страдающим ИБС. Из 29 пациентов исходно 24 (83%) находились в III - IV ФК стенокардии (CCS), после операции большинство пациентов (21 человек, 84%) относились к I и II ФК. 11 пациентам было выполнено КШ в сочетании с введением генного препарата «Ангиостимулина».13

пациентам при проведении КШ был введен генный препарат «Ангиостимулин» и проведена ГМРЛ. 5 пациентам было выполнено ТМЛР в сочетании с введением «Ангиостимулина», в дальнейшем эта группа выбыла из наблюдения. Сравнение результатов лечения проводилось между 1 группой (КШ+УЕвР) и 2 группой (КШ+УЕОР+ТМЛР). Значительно снизилась потребность в приеме нитратов и возросла толерантность к нагрузке у пациентов обеих групп. При оценке изменения сократимости миокарда ЛЖ по данным ЭхоКГ было выявлено в леченных, а также в смежных к пролеченным сегментах обеих групп наблюдался прирост количества нормокинетичных и уменьшение гипо- и акинетичных сегментов. При оценке индекса региональной сократимости было определено достоверное уменьшение значения в первой группе при оценке всех пациентов вместе в сроки от 2 месяцев. Во второй группе также отмечается небольшая, однако, недостоверная положительная динамика. Большая выраженность данной тенденции у пациентов 1 группы, возможно, связана с более тяжелым исходным состоянием сократимости миокарда у этих больных.

При оценке изменения перфузии миокарда оперированных больных с помощью ОФЭКТ с 99шТс-тетрофосмином все сегменты в обеих группах пациентов были подразделены на 3 подгруппы: леченные, смежные к леченным и нелеченные.

Леченные сегменты: у пациентов 1 -й группы (АКШ+УЕвР) отмечается достоверное увеличение накопления РФП при нагрузке в ранние сроки после операции (до 1 месяца), затем наблюдается некоторая тенденция к снижению (статистически недостоверная), но с сохранением положительного эффекта в сравнении с дооперационным исследованием (таблица 1). В покое наблюдаются схожие изменения, но не такие существенные, как при нагрузке. У пациентов 2-й группы (АКГЛ+ТМЛР+УЕвР) в нагрузке в раннем постоперационном периоде наблюдаются схожие с 1-й группой достоверные изменения (прирост накопления РФП в сроки до 1 месяца), а также, в отличие от 1-й группы, наблюдается достоверный прирост перфузии в отдаленном постоперационном периоде (1 год). Изменения в покое менее выражены (недостоверный прирост в 1-й месяц, положительная динамика в отдаленном периоде).

Смежные сегменты: у пациентов 1-й группы при исследовании в нагрузке отмечен незначительный, но достоверный прирост накопления РФП и далее - достоверное снижение (даже в сравнении с исходным накоплением) при наблюдении до 1 года (таблица 2). Наблюдения в покое повторяют результаты исследования в нагрузке. У пациентов 2-й группы мы не нашли достоверных изменений при исследовании в нагрузке. В покое отмечено незначительное достоверное снижение накопления РФП к 2-4 месяцам и затем небольшой прирост в сроки до 1 года.

Таблица I- Показатели накопления РФП (в %) в леченных сегментах исходно и в различные сроки

после операции у пациентов 1 и 2 групп

N Срок наблюдения (п/о) Накопление РФП (%) в леченных сегментах: Ме (10-90%)

На нагрузке В покое

1 группа п=100 2 группа п=132 1 группа п=132 2 группа п-132

1 Исходно 58 (29-80) 63 (41-84) 68 (34-83) 68 (49-86)

2 До 1 месяца 70(41-85) 71 (50-86) 69(44-88) 73 (51-90)

3 2-4 месяца 66 (42-82) 69 (49-85) 70 (49-86) 70 (52-87)

4 6-8 месяцев 65 (39-80) 69 (50-83) 67 (45-83) 70(51-83)

5 1 год 64(32-78) 80 (64-90) 64 (37-86) 79 (58-88)

р < 0,05 1-2,1-3, 1-4,1-S 1-2,1-3,1-4,1-5, 2-3,2-4,2-5,4-5 1-2,1-3,2-4,3-5 1-5,2-3,2-5,4-5

Таблица 2. Показатели накопления РФП (в %) в смежных сегментах исходно и в различные сроки после операции у пациентов 1 и 2 групп.

N Срок наблюдения (п/о) Накопление РФП (%) в смежных сегментах: Ме (10-90%)

На нагрузке В покое

1 группа п=41 2 группа п=56 1 группа п=44 2 группа п=56

1 Исходно 52 (29-65) 58 (38-76) 56 (39-73) 60 (42-74)

2 До 1 месяца 55 (34-73) 57(43-73) 57 (36-77) 58 (46-71)

3 2-4 месяца 46(33-59) 59 (43-70) 51 (40-76) 57(41-76)

4 6-8 месяцев 46 (30-59) 56(41-80) 52 (37-72) 60 (45-77)

5 1 гол 44 (30-54) 61 (47-73) 46(34-54) 64 (59-81)

р < 0,05 1-2,2-3, 2-4,2-5 - 1-2,2-3,2-4,3-4,35 1-3,1-5,2-3,2-5,34,4-5

Каких-либо существенных изменений в нелеченных сегментах не выявлено.

При оценке площади дефектов перфузии в динамике было выявлено, что у пациентов обеих групп отмечалось существенное уменьшение площади ДП (%) как при нагрузке, так и в покое в 1-й месяц после операции в сравнении с дооперациоиными значениями. Помимо этого, практически исчезает разница площадей дефектов при нагрузке и в покое, что свидетельствует о редукции ишемии миокарда. В 1-й группе в дальнейшем наблюдалось постепенное увеличение площади дефекта в течение года наблюдений, не достигшее, однако дооперационных значений. Во 2-й группе небольшое увеличение площади дефектов в 2-4 месяца сменялось второй волной снижения к 6-12 месяцам наблюдения. Суммарно результаты изучения динамики площадей дефектов перфузии повторяют тенденции, обнаруженные при сегментарной оценке накопления РФП.

Аутологичные клетки-предшественники CD133+ были введены 22 пациентам с хронической сердечной недостаточностью различной этиологии. Все пациенты находились под динамическим наблюдением, в течение которого им было проведено комплексное обследование в различные сроки после операции. Из 22 пациентов исходно 9 (41%) находились в III ФК и 13 (59%) в IV ФК СН по классификации. В

послеоперационном периоде у большинства пациентов (68%) отмечается переход в более благоприятный функциональный класс сердечной недостаточности классификации NYHA. После операции улучшение в функциональном классе сердечной недостаточности наблюдается как у пациентов с ИБС, так и у больных с ДКМП. Средний ФК исходно составил: в группе ИБС - 3,4±0,5, в группе ДКМП - 3,75±0,45; после операции достоверно уменьшился и составил при обследовании в отдаленном периоде (к 1 году): в группе ИБС - 2,0±0,6, в группе ДКМП - 2,0±0,4. У больных ИБС достоверно снизился функциональный класс стенокардии по классификации CCS. Толерантность к нагрузке возросла у пациентов обеих трупп, что было подтверждено при проведении гредмил-теста. При проведении ЭхоКГ также было выявлено достоверное улучшение сократимости миокарда ЛЖ в группах пациентов, страдающих ИБС и ДКМП.

При оценке индекса региональной сократимости было получено достоверное уменьшение значения WMSI в группе ИБС, в группе ДКМП небольшая положительная динамика оказалась недостоверной. Данные отличия в динамике сократимости между больными ИБС и ДКМП предположительно связаны с более благоприятным исходным состоянием миокарда ЛЖ у больных ИБС.

При сравнении до- и послеоперационных объемных показателей ЛЖ выявлено достоверное уменьшение КДО и КСО ЛЖ в обеих группах. В группе пациентов с ИБС до операции КДО составил 262,0 ± 53,2 (122-335) мл/м2, КСО - 173±69,5 (55-279) мл/м2, а к 1 году после операции 207,4 ± 40,5 (97-253) мл/м2 и 114,2 ± 43,5 (47-222) мл/м2 соответственно. У больных ДКМП КДО и КСО в различные сроки после вмешательства так же достоверно уменьшались по сравнению с исходными значениями: КДО 296,3 ± 56,2 (186-394) мл/м2 против 222,7 ± 49,1 (187-257) мл/м2; КСО 214,8 ± 51,4 (116-289) мл/м2 против 143,7 ± 38,2 (99-170) мл/м2. Тенденция к уменьшению объемных показателей ЛЖ у больных с ДКМП менее выражена, что объясняется более тяжелым исходным состоянием миокарда в данной группе больных.

Анализ посегментарной сократимости по данным ЭхоКГ показал, что и у больных ИБС, и ДКМП отмечается положительная динамика к I году после клеточной кардиомиопластики (ККМП). У больных ИБС количество нормокинетичных сегментов увеличилось на 14%. У пациентов с ДКМП через 1 год после процедуры ККМП отмечали уменьшение количества сегментов со значительным гипокинезом, акинетичных сегментов не наблюдали, нормокинетичные сегменты составили 6%.

При оценке перфузии миокарда ЛЖ с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) с "Тс-тетрофосминок все сегменты в обеих группах пациентов были подразделены на 2 подгруппы: леченные (согласно зонам

миокарда, в которые были введены аутологичные клетки-предшественники СОШ4") и нелеченные. Сначала были проанализированы средние показатели накопления РФП (%) в каждой группе без разделения их по степени исходного нарушения перфузии. При этом в леченных сегментах у пациентов ИБС отмечалось достоверное увеличение накопления РФП (прирост от 10% и более) на нагрузке в поздние сроки после операции (к 1 году). В покое не наблюдалось достоверных изменений перфузии миокарда в этих зонах. У пациентов ДКМП на нагрузке также наблюдался достоверный прирост перфузии в отдаленном постоперационном периоде (прирост накопления РФП в сроки к 1 году). Изменений перфузии в покое не отмечали. Результаты исследования нелеченных сегментов показали, что для них характерно отсутствие каких-либо существенных изменений в динамике.

Чтобы оценить эффективность методики, дополнительно была проанализирована динамика количества нормально перфузируемых и с различной степенью нарушения перфузии сегментов до операции и через 1 год после вмешательства. Оказалось, что количество нормально перфузируемых сегментов увеличилось только в группе леченных сегментов у больных ИБС и ДКМП, при этом количество сегментов с различной степенью нарушения перфузии уменьшилось. В нелеченных сегментах, аналогичных изменений выявлено не было. При анализе показателей систолического утолщения, в леченных сегментах исходно и в различные сроки после операции также отмечается достоверно положительная динамика. В нелеченных сегментах не было обнаружено достоверного изменения показателя систолического утолщения.

На рисунках 3 и 4 представлена динамика величины дефектов перфузии (ДП) на нагрузке и в покое у больных ДКМП и ИБС. Как видно из рисунков, у пациентов обеих групп отмечается существенное уменьшение площади ДП (%) как на нагрузке, так и в покое к 1 году после операции в сравнении с дооперационными показателями. Помимо этого, отмечается незначительное уменьшение разницы площади дефекта перфузии на нагрузке и в покое.

Рисунок 3. Динамика величины дефектов перфузии (ДП) исходно и в различные сроки после операции на нагрузке и > покое у больных ИБС.

^t- t

W

»сходно Эи«с бм*с 12 нес

Рисунок 4. Динамика величины дефектов перфузии (ДП) исходно и в различные сроки после операции на нагрузке и в покое больных ДКМП.

Для оценки клинической эффективности клеточной кардиомиопластики в зависимости от способа введения аутологичных клеток-предшественников CD133+ проводилась оценка перфузии миокарда в динамике после операции у 6 больных с изолированным итракоронарным способом введения CD1334 (группа 1) и у 4 пациентов при изолированном интрамиокардиальном транскатетерном способе доставки клеточного материала (группа 2). Всего у данной группы пациентов было проанализировано 200 миокардиальных сегментов, из которых леченных - 104, иелеченных - 96. Для анализа эффективности способа введения клеток использовали интегральный показатель прироста накопления РФП к году после операции относительно исходного уровня. В леченных сегментах, при интрамиокардиальном способе введения накопление РФП достоверно увеличивалось на нагрузке в сегментах с умеренным, значительным и выраженным снижением перфузии в среднем на 20% относительно исходного уровня. В сегментах с выраженным нарушением перфузии накопление РФП, хотя достоверно и увеличивалось, но ни в одном сегменте в послеоперационных исследованиях уровень накопления РФП не превышал 50% от максимального. В сегментах с исходно нормальной перфузией достоверных изменений выявлено не было. При интракоронарном способе введения накопление РФП также увеличивалось, но ни в одном сегменте не было выявлено достоверной разницы изменения перфузии ни на нагрузке, ни в покое. Прирост накопления РФП не превышал в среднем 10%. В нелеченных сегментах достоверной и выраженной разницы в показателях накопления РФП, в исходно нормально перфузируемых сегментах и в сегментах с различными типами нарушения перфузии до операции и в зависимости от способа введения CD133+ выявлено не было ни на нагрузке, ни в покое. При анализе показателей систолического утолщения в леченных сегментах исходно и в различные сроки после операции также отмечается более выраженная достоверно положительная динамика при интрамиокардиальном способе введения клеток.

В нелеченных сегментах не было обнаружено достоверного изменения показателя систолического утолщения. У пациентов обеих групп отмечается существенное уменьшение площади ДП (%) как на нагрузке так и в покое к 1 году после операции в сравнении с дооперационным. Однако при интрамиокардиальном введении клеток эта тенденция выражена более явно.

Качество жизни пациентов ИБС и ДКМП после лечения с помощью аутотрансплантации клеток-предшественников СБ133+ достоверно улучшилось по всем шкалам опросника - 36. Достоверное улучшение качества жизни наблюдается уже спустя 3 месяца после вмешательства и постепенно возрастает к 1 году в сравнении с исходными значениями.

Результаты терапевтического применения аутологичных клеток-предшественников (Л) 133+ у пациентов с ревматическим анамнезом и хронической сердечной недостаточностью.

При сравнении результатов ЭхоКГ исследования пациентов до и после введения клеток С0133+ было отмечено достоверно уменьшение размеров ЛЖ (КДО, КСО, КДР и КСР), что сопровождалось улучшением сократительной функции ЛЖ.

Результаты применения терапевтического ангногенеза при Х1ШК.

При применении терапевтического ангиогенеза при ХИНК побочных эффектов после введения стимуляторов ангиогенеза отмечено не было. Уровень мочевины в сыворотке пациентов, получивших «Ангиостимулин», в динамике значимо не отклонялся от нормальных показателей (15-50 мг/%) в течение всего периода наблюдения.

Через 1 месяц после введения стимулятора клиническое улучшение состояния нижней конечности отмечалось в 80 % случаев. Заживление трофических язв через 1,5-3 месяца наблюдалось в 3 из б случаев, положительная динамика со стороны долго незаживающих послеоперационных ран - также в 3 случаях. Отмечалось уменьшение болевого синдрома у пациентов. При раздельном анализе эффект лечения через 1 месяц более выражен у пациентов 1-ой группы (р<0,05): клиническое улучшение появилось у 90% пациентов 1-ой группы и у 73 % больных 2-ой группы. Если во 2-ой группе клиническое улучшение ограничилось минимальным (+1 по Рутерфорду), то в 1-й в 40 % случаев возникло умеренное улучшение (+2 по Рутерфорду). Через 3 месяца клинический эффект наступил у 100 % пациентов в обеих группах. В 1-й группе умеренное улучшение отмечено у 78 % пациентов, а во 2-й - у 57 %; минимальное в 1-й группе - у 22 % больных, во 2-й - у 43 %.

К б-му месяцу эффект сохраняется у всех пациентов 1-й группы и у 81 % - 2-й группы. Положительная динамика в обеих группах в лучшем случае не превысила «+2» по

Рутерфорду (умеренное улучшение), однако, и ухудшения по причинам, связанным с исследованием, отмечено не было. Возврат состояния конечности к исходному установлен в 2 случаях во 2-й группе исследования (19 %), что обусловлено атроэмболией из аорты.

В отдалённом периоде (больше 6 месяцев) обследовано 3 пациента. По причине стабильной положительной динамики со стороны нижних конечностей и отсутствия отрицательной со стороны других артериальных бассейнов им не проводилась дополнительная терапия. У двоих из них наступило клиническое выздоровление (полностью исчезли симптомы ишемии) через 9 месяцев после введения стимулятора ангиогенеза (клетки-предшественники); у одного - достигнутый к б-му месяцу эффект (умеренное улучшение) сохраняется уже в течение 2 лет.

Средний прирост напряжения кислорода через 1 месяц в 1-й группе составил 7,5 мм рт. ст., во 2-й группе - 6,5 (р<0,05 в обеих группах), через 3 месяца в 1-й группе - 14,0 мм рт.ст., во 2-й - 10,4 (р<0,05 в обеих группах по сравнению с исходными данными и данными через 1 месяц), через 6 месяцев в 1-й группе - 16,0 мм рт.ст., во 2-й - 13,0 (р<0,05 в обеих группах по сравнению с исходными данными и данными через 1 месяц и через 3 месяца для 1-й группы). Средний прирост напряжения кислорода в 1-й группе выше на всех этапах наблюдения, но статистическая достоверность получена лишь через 3 месяца (р<0,05).

При анализе результатов транскуганного напряжения кислорода в 1-й группе в зависимости от способа введения стимулятора наблюдалось достоверное увеличение показателя Тк Р02. При внутриартериальном введении клеток-предшественников в течение 3 месяцев, при внутримышечном - в течение всего периода наблюдения. Средний прирост Р 02 при внутримышечном введении клеток-предшественников выше на всех этапах наблюдения, по статистической достоверности различий между группами с разными способами введения стимулятора не получено (р>0,05).

Для оценки толерантности к физической нагрузке у пациентов с перемежающейся хромотой проводился тредмил-тест. ДББХ и МДХ достоверно увеличиваются в течение всего периода наблюдения: в меньшей степени за первый месяц, в большей - за последующие месяцы. Через 1 месяц ДББХ увеличивается на 0,5В минуты, через 3 месяца ещё на 1,88 минуты, через 6 месяцев - на 3,17 минуты (суммарно за 6 месяцев на 5,63 минуты). МДХ к 6 месяцу возросла на 5,82 минуты. В 2 случаях через 3 месяца и в 4 (44 %) - через 6 месяцев тредмил-тест прекращен через 12 минут (512 метров) по причине его полного выполнения (переход во 2А степень ХИНК).

Через 3 месяца после введения стимулятора ангиогенеза появление новых видимых коллатеральных сосудов отмечено у всех ангиографически обследованных пациентов. В

среднем увеличение коллатеральной сети в 1-й группе состаеило +2.28+/-0.75 (р>0,05, п=7), во 2-й - +2,0+/-0,45 (р<0,01, п=11). Установлена прямая достоверная связь между динамикой увеличения коллатеральной сети и изменением клинического статуса конечности (по Рутерфорду), транскутанным напряжением кислорода, средним показателем перфузии. Возраст и исходная тяжесть ишемии конечности достоверно не влияли на увеличение количества коллатеральных сосудов по данным ангиографии.

Клиническое улучшение состояния нижних конечностей оказало существенное влияние на качество жизни пациентов. Физическая активность (ФА), показатель влияния болезни на выполнение физических нагрузок, достоверно ниже принятого за норму показателя качества жизни здоровой популяции г. Санкт-Петербург исходно в обеих группах (р<0,05). В динамике наблюдается улучшение данного параметра. В 1-й группе значимо ФА возрастает к 3 месяцу, приближаясь к нормальному значению через 6 месяцев. Во 2-й группе лишь через 6 месяцев установлено значимое увеличение ФА, не достигшей нормального значения (р<0,05), что вероятно обусловлено преклонным возрастом пациентов и большим количеством сопутствующих заболеваний.

Интенсивность боли и ее влияние на повседневную деятельность, достоверно снижается и, соответственно, увеличивается показатель болевого фактора (БФ) через 3 месяца в обеих группах исследования. Значимого отличия между показателями БФ на различных этапах наблюдения у пациентов 1-й группы и нормальным значением установлено не было. Во 2-й группе значение БФ значительно ниже нормального уровня в течение первых 3 месяцев и приближается к нормальному значению к 6 месяцу.

Общее здоровье (03), на момент заполнения опросника и перспектив лечения достоверно отличалась на начальном этапе в обеих группах от нормального значения. В последующем данный показатель приближается к нормальному даже во 2-ой группе, где отсутствует значимый прирост 03, что подтверждает наличие положительной динамики в лечении.

В отличие от показателя 03 жизнеспособность (ЖС), сравнима с нормальным значением, а через 6 месяцев в 1-ой группе - превышает его (р<0,05), что объясняется значительным улучшением эмоционального настроя пациентов на фоне улучшения физического состояния. То же можно сказать и о психическом здоровье (ПЗ) пациентов. При исходно значительно сниженном ПЗ у пациентов 1-ой группы по сравнению с нормальным значением (р<0,05), уже в течении первого месяца эмоциональная картина меняется - ПЗ стремится к нормальному. Показатель РПП (влияния эмоционального состояния на жизнедеятельность) достоверно увеличивается у пациентов 2-й группы через 1 месяц, у пациентов 1-й группы - через 3 месяца. Социальная активность ожидаемо

возростает, достоверно не отличаясь от нормального значения. Часть пациентов (6 человек - 24 %) изменили планы на будущее: трое снова начали, а трое продолжили работать после длительного перерыва.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВА1ПШ.

Значительное число больных ИБС (от 5 до 21% по разным оценкам) имеют противопоказания к реваскуляризации хирургическими и интервенционными методами, либо у них таким способом не удается достичь полной реваскуляризации (de Feyter P., 1992; Mukherjee D. и соавт., 1999) и снять симптоматику стенокардии. В такой ситуации целесообразно рассматривать возможность применения терапевтического ангиогенеза, позволяющего обеспечить полноценный кровоток путем стимуляции формирования новых сосудов (Laham R. и соавт., 2000). Аналогичным образом, заметное количество больных хронической ишемией нижних конечностей (до 5%) страдают от остаточных симптомов после хирургии и традиционной терапии (Baumgartner I. и соавт., 2000). Несомненно, в этой группе больных терапевтический ангиогенез выглядит перспективным дополнением хирургического лечения. Более того, тяжелая сердечная недостаточность - прогрессирующий синдром, характеризующийся необратимой утратой миоцитов, теоретически может быть компенсирован за счет стимуляции регенерации миоцитов, т.е. миогенеза.

Первый этап нашего исследования был посвящен созданию генетической конструкции для терапевтической стимуляции ангиогенеза у нуждающихся в этом больных. В качестве преспективных генов-кандидатов были выбраны VEGF165 и bFGF. Полученные на основе pBK-CMV генетические конструкции эффективно воспроизводятся в культуре Е. coli, и с высокой степенью чистоты могут быть выделены из клеточного лизата на колонках фирмы Qiagen. Созданная таким образом конструкция позволяет относительно легко нарабатывать значительные (15 - 50 мг за один цикл выделения) количества плазмидной ДНК, пригодной для введения больным. Мы остановились на плазмидной конструкции в качестве стимулятора ангиогенеза основываясь, во-первых, на относительной дешевизне и простоте получения значительного количества препарата, во-вторых, на данных об эффективной экспрессии плазмидной ДНК в мышечной ткани (Tripathy и соавт., 1996), и, в-третьих, из-за опасения осложнений, связанных с применением у больных вирусного вектора (Marshall и соавт., 2003). Последующее исследование токсичности и переносимости препаратов подтвердили безопасность их применения в эксперименте на животных, и в перспективе - для лечения больных. Первично эффективность препарата VEGF|65 была проверена в стандартном тесте с

матригелем. Продемонстрирована экспрессия кодируемого плазмидой белка VEGFj$5 в человеческих клетках НЕК 293, а имплантация мыши помещенных в матригель трансфецированных плазмидой клеток приводила к эффективной стимуляции процессов ангиогенеза в коже.

Следующим этапом нашего исследования стала проверка эффективности сконструированных препаратов на модели хронической ишемии скелетной мышцы задней конечности крысы. Сравнительное изучение эффективности двух генетических конструкций показало, что через 30 дней после введения в зону ишемии даже минимальной из использованных нами в эксперименте доз (250 мкг/животное) VEGFi65 отмечается достоверное по сравнению с контролем увеличение плотности капиллярного русла, в то время как введение даже максимальной в рамках данного исследования дозы bFGF (750 мкг/животное) не оказывает существенного влияния на кровоток в ишемизированной конечности. Ангиогенная эффективность белковых препаратов FGF была продемонстрирована в ряде экспериментов на животных, как при локальном, так и при ишракоронарном способах введения (Lazarous D. и соавт., 2000; Rajanayagam М. и соавт., 2000). В то же время результаты клинических испытаний белковых и генетических препаратов FGF далеко не так однозначны (Ruel М. и соавт., 2002; Simons М. и соавт., 2002). На данном этапе наших исследований, мы решили сосредоточиться на клинических испытаниях содержащей VEGF165 плазмиды (препарат «Ангиостимулин»).

Поскольку ишемия органа приводит, в том числе к истощению регенеративных возможностей за счет З'.меньшения числа резидентных стволовых клеток, введения ангиогенных факторов может оказаться недостаточно дня полноценного восстановления функции органа. В этой связи привлекательной альтернативой выглядит использование стволовых плюрипотенгных клеток. Эндотелиальные клетки-предшественники (ЭКП) представляют собой гетерогенную группу клеток, характеризуемую экспрессией ряда поверхностных маркеров, таких как CD34, CD133 и VEGFR-2 (KDR или Flk-1), способностью накапливать Dil-Ac-LDL и связывать считающиеся специфичными для эндотелия лектины, такие как Ulex europaeus. Маркер стволовых клеток CD34 в меньшем количестве выявляется также на зрелых клетках эндотелия, и поиск более специфичных маркеров привел к обнаружению CD 133, с высокой плотностью экспрессируемого на незрелых стволовых клетках, и утрачиваемого в процессе дифференцировки (Handgretinger R. и соавт., 2003). Предполагается, что в популяции ЭПК наличествуют две субпопуляции: более примитивная CD 133+yCD34"/VEGFR-2* и более зрелая CD1337CD347VEGFR-2+. Нашей задачей было более подробно исследовать

субнопуляционный состав ЭПК, а также фенотипически и функционально охарактеризовать эти клетки в условиях in vitro и in vivo.

Использованный в нашей работе способ выделения позволяет с высокой эффективностью получать очищенный препарат аутологичных стволовых клеток пациента. На выходе с колонки мы получали 1-3 миллиона стволовых клеток.

Анализ поверхностного фенотипа выделяемых клеток позволил продемонстрировать наличие в костном мозге обследованных пациентов CD133+/CD34" субпопуляции стволовых клеток, которые в дальнейшем дифференцируются в субпопуляцию, экспрессирующую CD133+/CD34+, и в ходе последующей дифференцировки в соответствующих условиях in vitro приобретают фенотип зрелых эндотелиальных клеток. В то же время, эта субпопуляция CD133+/CD34" ЭКП функционально оказалась более активной, чем теоретически более зрелая субпопуляция ЭКП CD133+/CD34+. В условиях in vitro эта субпопуляция клеток-предшественников после обработки SDF-1 более активно прилипает к обработанной фибронектином поверхности и более эффективно дифференцируется в зрелые эндотелиальные клетки по сравнению с субпопуляиией CDI33+/CD34+ клеток.

Со времени первого сообщения в научной литературе (Asahara Т. и соавт., 1997) было принято считать, что фенотип ЭКП определяется экспрессией на поверхности маркеров CD34 и VEGFR-2. В дальнейшем, обнаружение маркера стволовых клеток CD133 (Peichev М. с соавт., 2000), экспрессия которого, в отличие от CD34 утрачивается по мере дифференцировки ЭКП в клетки эндотелия, позволило подразделить популяцию ЭКП на субпопуляцию CD133+/CD34+/VEGFR-2+, предположительно состоящую из более ранних клеток-предшественников, и субпопуляцию CD133"/CD34+/VEGFR-2+ клеток, предположительно далее продвинувшуюся по пути дифференцировки эндотслиального ростка. Полученные нами данные указывают на вероятность существования третьей, потенциально более примитивной субпопуляции ЭКП, определяемой экспрессией на поверхности CD133 и VEGFR-2 при отсутствии экспрессии CD34. Этот вывод подкрепляется результатами, полученными Guo Y. и соавт. В своей работе они показали, что в процессе культивирования in vitro С034-отрицательные стволовые клетки, выделенные из костного мозга мышей, приобретают способность экспрессировать CD34, т.е. CD34' стволовые клетки могут быть предшественниками CD34+ клеток. Аналогичным образом, в нашем исследовании CD133+/CD34" ЭКП из костного мозга человека дифференцировались в CD133+/CD34+ клетки при культивировании in vitro в условиях, способствующих дифференцировке в эндотелиальные клетки. Описанная нами субпопуляция CD133+/CD34" ЭКП отличается от субпопуляции ЭКП, описанной Rehman и

соавторами, поскольку последнюю характеризует высокий уровень экспрессии CD14 (95,7%) и низкий уровень экспрессии CD133 (0,16%) на поверхности клеток, в то время как исследованные нами CD133+/CD34" не экспрессируют CD14. Kuci S. и соавторы (Hangretinger R. и соавт., 2003) показали, что получаемая при культивировании in vitro мононуклеаров человеческой крови в присутствии Flt3/F!k2 лиганда и интерлейкина-6 субпопуляция стволовых CD133+ клеток не экспрессирует CD34 и обладает способностью репопулировать костный мозг мышей с двойной мутацией: тяжелым комбинированным иммунодефицитом и диабетом 1-го типа. После трансплантации эти клетки приживались на значительно более длительное время, чем свежевыделенные CD34+ клетки. Кроме того, на ограниченном контингенте больных (6 пациентов) было показано, что трансплантация CD133+ клеток ведет к улучшению функционирования миокарда в постинфарктный период (Stamm С. et al.,2003). Наблюдение за пересаженными бестимусным мышам CD133+ клетками-предшественниками из пуповинной крови человека показало, что они учасиуют в формировании капиллярной сети в ишемизированной задней конечности, стимулируют процессы неоваскуляризации и способствуют восстановлению ишемизированых тканей задней конечности. Тем не менее, конкретные механизмы, опосредующие миграцию стволовых клеток в ишемизированные ткани, а также регуляция и механизм регенеративного действия CD133+ стволовых клеток требуют дальнейшего, более углубленного экспериментального исследования.

Хотелось бы подчеркнуть, что по нашему мнению, субпопуляция CD1337CD34' /VEGFR-2+ ЭКП костномозгового происхождения играет ключевую роль в регенерации эндотелия и восстановлении поврежденных тканей. Учитывая их высокую регенеративную способность, представляется рациональной трансплантация таких клеток в терапевтических целях. По результатам наших экспериментов, мы предполагаем, что субпопуляция CD133+/CD34"/VEGFR-2+ клеток содержит предшественники CD 1337CD347VEGFR-2+ клеток и обладает более высоким по сравнению с последними потенциалом восстановления сосудистого русла. Полученные нами данные расширяют современные представления о гетерогенности популяций ЭКП и могут иметь значение для лечения ишемической болезни сердца и патологии магистральных сосудов.

При ИБС в основе всех патологических процессов лежит, как правило, постепенное прогрессирование артериальной недостаточности с нарушением периферической макрогемодинамики в результате развития стенотических и облигерирующих процессов в артериях. Прежде всего, это касается микроциркуляторных расстройств, которые развиваются вторично из-за низкого перфузионного давления (Савельев B.C. и соавт., 1997). Отмечается поражение капилляров, питающих мышечные волокна конечностей,

дегенеративные изменения эндотелия в них и агрегация форменных элементов крови. Поэтому клиника тяжелой ишемии определяется как микроциркудяторными нарушениями, так и изменениями гемореологическими. Несостоятельность капиллярного кровообращения является одним из ведущих факторов в развитии грубых трофических нарушений у пациентов с декомпенсацией каппилярного кровотока (Казаков Ю.И. и соавт., 1997). Следует отметить, что даже при идеально выполненной операции микроциркуляция в конечности не нормализуется в течение 2-3 лет после операции и ухудшается из-за продолжающегося прогрессирования основного патологического процесса. Поэтому все пациенты после операции нуждаются в продолжении консервативной терапии, независимо от исхода хирургического лечения (в том числе по причине сопутствующего поражения других артериальных бассейнов). Больным же с неоперабельным поражением дистального артериального русла нижних конечностей, слабым развитием коллатеральных путей кровотока и, соответственно, минимальным клиническим улучшением и при отсутствии динамики после операции (по результатам нашего исследования всего в 15 % случаев) помимо принятого объёма консервативной терапии требуется более интенсивное воздействие на коллатеральное русло глубокой бедренной и подколенной артерий.

При клиническом применении генных технологий (плазмидной конструкции УЕОР,65) для лечения хронической критической ишемии нижних конечностей (терапевтическая доза препарата составляет 1000 мкг (кпег .1. И соавт., 1999) различной этнологии (атеросклероз и облитерирующий тромбангиит) по данным литературы уже через 1 месяц после введения препарата получен статистически достоверный положительный результат. Максимальный терапевтический эффект отмечен к третьему месяцу. Сходная динамика установлена и нами. У большей части пациентов (до 71 %) полностью прекратились или уменьшились боли покоя (до 86 % по данным литературы), у 4 из 5 пациентов зажили или значительно уменьшились трофические язвы (57-67 % по данным литературы), на 10,4-13 мм рт.ст. увеличилось транскутанное напряжение кислорода, показатели перфузии конечности по данным лазерной допплеровской флоуметрии, в среднем на 0,1 - индекс лодыжечного давления (по данным литературы на 0,15-0,19), на 1,88 минуты - длительности безболевой ходьбы (на 1,3 минуты по данным литературы); возросло количество новообразовавшихся видимых коллатеральных сосудов на уровне колена, голени и стопы по данным ангиографического исследования - средний прирост составил +2,0+/-0,45 (по разным данным литературы в среднем +1,3+/-0,04). В той или иной степени к 3 месяцу клиническое улучшение отмечается у всех пациентов

(90% пациентов по данным литературы), при этом умеренное улучшение по шкале Рутерфорда- в 57 % случаев (50% по данным литературы (Baumgartner I. и соавт., 1998).

ВЫВОДЫ

1. Активизация восстановительных процессов в ишемизированных тканях достигается путем индукции в них процессов ангио/миогенеза, которые могут быть усилены применением ангиогенезстимулирующих факторов.

2. Созданная плазмидная конструкция ангиогенного препарата - ангиостимулин -биосовместима, нетоксична, позволяет эффективно экспрессировать ген VEGFi«, и может быть использована для индукции репаративного ангиогенеза в ишемизированных тканях.

3. Высокоочищенная популяция CD133+ стволовых клеток костного мозга состоит из двух субпопуляций: менее зрелых CD1337CD347VEGFR-2г клеток и более дифференцированных CD1337CD347VEGFR-2+ клеток, причем субпопуляция CD133+/CD347VEGFR-2+ клеток обладает более высоким потенциалом дифференцировки в направлении неоангиогенеза.

4. Клетки CD133+ обладают более выраженной ангиогенной активностью по сравнению с CD34+, и поэтому именно эти клетки должны использоваться для стимуляции ангиогенеза при лечении ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.

5. Препарат «ангиостимулин» улучшает перфузию миокарда в наиболее пораженных ишемией сегментах и этот эффект сохраняется не менее года.

6. При сравнительной оценке эффективности способов введения аутологичных костномозговых клеток-предшественников CD133+ для стимуляции регенеративных процессов в миокарде, показано что при инграмиокардиальном введении отмечается достоверное улучшение перфузии в леченных сегментах с исходно умеренным и значительным снижением перфузии. При интракоронарном способе введения достоверных изменений показателей перфузии получено не было.

7. Как при артериальном, так и при внутримышечном введении аутологичных клеток-предшественников CD133+ или гена VEGFi65 зарегистрировано образование новой сосудистой сети при лечении ХИНК.

8. После аутотрансплантации клеток-предшественников CD133+ достоверно улучшалось качество жизни больных ИБС и ХИНК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Исходя из результатов проведенных исследований представляется целесообразным применение внутримышечного введения генного препарата VEGF^s (ангиостимулина) при ишемии миокарда и хронической ишемии нижних конечностей (с учетом критериев включения и исключения пациентов).

Использование аутологичных костномозговых клеток-прсдшественников CD133+ можно рекомендовать для лечения сердечной недостаточности в сочетании с хирургическими методами, при этом наиболее эффективным является метод изолированного интрамиокардиального введения.

При лечении ХИНК можно рекомендовать как внутриартсриальное, так и внутримышечное введение аутологичных клеток-предшественников CD133+ или ангиостимулина (гена VEGFics).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 110 ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бокерия Л.А., Еремеева А/.Д.Современное состояние и перспективы использования ангиогенеза в лечении ишсмической болезни сердца Грудная и сердечнососудистая хирургия, 2000, №2,57-61.

2. Еремеева М. В., Голухова Е.З. Факторы ангиогенеза при ишемии. Стимуляция неоангиогенеза в миокарде. Лекции по кардиологии, в 3-х томах, под ред. Бокерия Л .А. и Голуховой Е.З., изд. НЦССХ им. А.Н.Бакулева, Москва, 2001, с.161-170.

3. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М В., Киселев С.Л. Стимуляция неоангиогенеза при ишемии миокарда. Первый этап доклинических испытаний плазмидной ДНК VEGF. Пятая ежегодная сессия Научного Центра сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2001, №3, стр. 136.

4. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Э.С. Полякова Разработка клинико-диагностических критериев отбора больных ИБС для применения терапевтического ангиогенеза. Седьмой всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2001, №3, стр.231.

5. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Полякова Э.С., Серов Р.А. Про- и антиангиогенные факторы при ишемической болезни сердца в зависимости от степени выраженности атеросклероза VI ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2002, №3, стр.161.

6. Eremeeva M., Golukhova E., Alshibaya M., Berishvili I, Bockeria L. Angiogenic factors production stimulated by different methods of myocardial revascularisation. 8-th International Local Drug Delivery meeting and cardiovascular course on Radiation and molecular strategies, Geneva, Switzerland, 2002, p. 18.

7. Eremeeva M. V., Golukhova E.Z., Bockeria L.A. Endogenous angiogenesis activation in ischemic heart disease patients: different methods of myocardial revascularization of strategies for therapeutic angiogenesis. In book "Angiogenesis bench to bedside", 2003, Medical and Engineering Publishers Inc., pp.275-292.

8. Бокерия Л.А., Еремеева M.B., Полякова Э.С., Какучая Т.Т., Лукашкин М.А. Прогностическая значимость определения уровня pro-ANP и pro-BNP для оценки степени сердечной недостаточности и эффективности терапевтического ангиогенеза. VII ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003, №3, сгр.161.

9. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Асланиди И.П., Еремеева М.В., Мерзляков В.Ю., Беришвшш И.И., Клюева А.Ф., Какучая Т.Т., Полякова Э.С., Лукашкин М.А. Экспериментальное и клиническое исследование препаратов на основе генов ангиогенных факторов (VEGF и bFGF человека) при ишемии. VII ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференции молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003, стр.161.

10. Eremeeva M., Bockeria L., Golukhova E., Kiselev S.L., Polyakova E., Lukashkin M. A. Different methods of revascularization combined with intramyocardial VEGF gene transfer administration in IHD patients. International Journal of Medical Implants and Devices, Vol. 1, No 1,2003 Medical and Engineering Publishers, Inc, USA, pp 100-155.

11. Eremeeva M., Bockeria L., Golukhova E., Kiselev S.L., Polyakova E., Lukashkin M. A. Intramyocardial VEGF gene administration in IHD patients during different methods of surgical revascularisation. Angiogenesis: Novel basic science insights and human therapy. Keystone symposia 2004 abstract book, p. 12.

12. Бокерия Л.А., Еремеева M.B., Полякова Э.С.. Диагностика сердечной недостаточности с помощью определения концентраций предшественников натрийуретических пептидов в плазме крови больных ИБС. Девятый всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». Москва. Ноябрь 2003, стр.326.

13. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Асланиди И.П., Еремеева М.В., Мерзляков В.Ю., Беришвили И.И., Клюева А.Ф., Какучая Т.Т., Полякова Э. С., Лукашкин М.А. Первые результаты клинического применения терапевтического ангиогенеза с использованием гена VEGFi65 человека. Девятый всероссийский съезд сердечнососудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева PAMII «Сердечнососудистые заболевания». 2003, №11, стр.326.

14. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В., Полякова Э.С. Использование предшественников натрийуретических пептидов в диагностике сердечной недостаточности ишемичсской этиологии до и после операции аортокоронарного шунтирования. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца» 2004, т. 5, № 3, стр. 156-161.

15. Бокерия Л.А., Георгиев Г.П., Голухова Е.З., Еремеева М.В., Гнучев Н.В., Киселев СЛ., Лагарькова М.А., Ким А.И., Асланиди И.П., Вахромеева М.Н., Какучая Т.Т., Полякова Э.С., Лукашкин М.А., Волковская И.В., Демидова O.A.. Возможности использования генных и клеточных технологий для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца». 2004, № 3, стр. 19-38.

16. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Дяштава Т.Г., Чеботарева, Еремеева М.В.. Некоторые особенности клинического течения, диагностики и реваскуляризации миокарда у больньи ишемической болезнью сердца, страдающих сахарным диабетом. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца». 2004, № 3, стр. 89-96.

17. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В. с соавт. Первый опыт клинического применения терапевтического ангиогенеза с использованием гена VEGFi® человека. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца». 2004, №4, стр. 134 -142.

18. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В. и соавт. Новые подходы к лечению ишемической болезни сердца: терапевтический ангиогенез в сочетании с хирургической реваскуляризацией миокарда. Терапевтический архив, 2004, т. 76, №6, с.25-30.

19. Бокерия JI.A., Георгиев Г.П., Голухова Е.З., Еремеева М.В. и соавт. Генные и клеточные технологии при лечении сердечно-сосудистых заболеваний (опыт НЦ ССХ им А. Н. Бакулева). Сердечно-сосудистые заболевания: проблемы трансплантологии. 2004, т.5, №7, стр. 70-91.

20. Bockeria L.A., Golukhova E.Z., Eremeeva М. V., I.I. Berishvili. Gene and cell therapy: alternative approach for myocardial revascularization. Proceedings of the 6th International Congress on Coronary Artery Disease 2005, Istanbul, Turkey, 29 oct.-l nov. 2005, p.383-386.

21. Бокерия Л.А., Глянцев С.П., Серов P.A., Еремеева М.В. и соавт.От открытия клетки к ее лечению (к 165-летию учения о клетке), часть 1 . Клиническая физиология кровообращения, 2005, №1, сгр.14-23.

22. Бокерия Л.А., Глянцев С.П., Серов Р.А., Еремеева М.В. и соавт. От открытия клетки к ее лечению, ч. 2, Клиническая физиология кровообращения, 2005, №2, стр.19-29.

23. Бокерия Л.А., Глянцев С.П., Серов Р.А., Еремеева М.В. с соавт. От открытия клетки к ее лечению, ч. 3, Клиническая физиология кровообращения, 2005, №3, стр.5-12.

24. Бокерия Л.А., Муратов P.M., Беридзе И.З., Асланиди И.П., Никитина Г Г.,. Еремеева М.В., Волковская И.В. Новый подход к хирургическому лечению клапанной и дилатационной кардиомиопатии. Сердечно-сосудистые заболевания: клапанная патология сердца, 2005, т.6, № 6, стр.9-13.

25. М. Eremeeva, Е. Golukhova, L. Bockeria, I. Volkovskaya, N. Chigogidze et al.Cell therapy by mesenchymal stem cells (CD 133+) in advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy: clinical experience. The J. of cardiovascular surgery, v.46, suppl. 1, №3, June 2005, p.120., 15-th Word Congress WSCTS, Vilnius, June 19-23 2005.

26. Бокерия Л.А., Голухова E.3., Еремеева М.В. и соавт. Первые результаты терапевтического ангиогенеза у пациентов с ишемической болезнью сердца с использованием reHaVEGF165 человека. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2005, №3, стр. 123-131.

27. Bockeria L., Golukhova Е., Eremeeva A/.et al. Experimental rationale and the first experience of therapeutic angiogenesis using VEGF165 gene in patients with ischemic heart disease. The J. of cardiovascular surgery, v.46, suppl. 1, №3, june 2005, p.47, 15-th Word Congress WSCTS,Vilnius June 19-23 2005.

28. Eremeeva M. V., Golukhova E.Z., Volkovskaya I.V., Chigogidze N.A., Aslanidi I.P., Vachromeeva M.N., Svobodov A.A., Bockeria L.A.. Stem cells (CD 133+) therapy in advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy: clinical experience. 12-th International Local Drug Delivery meeting and cardiovascular course on Revascularization & molecular strategics, feb. 2-4,2006, p. 102.

29. Бокерия J1.A., Спиридонов A.A., Еремеева M.B., Аракелян B.C., Демидова О.А. Первый опыт комбинированного лечения хронической ишемии нижних конечностей с использованием стимуляторов неоангиогенеза. Сердечнососудистые заболевания: ангиология и сосудистая хирургия, 2006, т. 7, №4, стр. 7380.

30. Бокерия Л.А., Демидова О.А., В. Аракелян B.C., Еремеева М.В.. Опыт лечения хронической ишемии нижних конечностей с помощью генного препарата сосудисто-эвдотелиального фактора роста VEGFi« - ангиосгамулина. Сердечнососудистые заболевания: ангиология и сосудистая хирургия, 2006, т. 7, №1, стр. 7481.

31. Golukhova E.Z., Bockeria L.A., Eremeeva М. V. et al.Clinical application of mesenchymal stem cells (CD 133*) in patients with advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy. Europace suppl., v. 8, supl.l, june 2006,15-th World Congress in Cardiac Electrophysiology and Cardiac Techniques, june 14-17,2006, Nice, France.

32. Golukhova E.Z., Bockeria L.A, Eremeeva M. V. et al.First experience of therapeutic angiogenesis using VEGFi« gene in patients with ischemic heart disease and its experimental rationale. Europacc supplements, v. 8, supl.l, june 2006,15-th World Congress in Cardiac Electrophysiology and Cardiac Techniques, june 14-17,2006, Nice, France.

33. Golukhova E.Z., Bockeria L.A., Eremeeva M. Ket al.VEGF165 gene in therapy the treatment of patients with ischemic heart disease. 16-th World Congress of cardio-thoracic surgeons, 2006, Ottawa, Canada, p.82..

34. Golukhova E.Z., Bockeria L.A.., Eremeeva M.B. et al. Mesenchymal stem cells

(CD 133*) in the treatment of patients with advanced coronary aitery disease and dilative cardiomyopathy: results of the pilot study. 16-th World Congress of cardio-thoracic surgeons, 2006, Ottawa, Canada, p.83.

35. Еремеева M.B., Голухова E.3., Чигогидзе H.A. и соавт. Генная и клеточная терапия для стимуляции ангио/миогснеза при сердечно-сосудистых заболеваниях. Поиск наиболее безопасных, но эффективных подходов. Ежегодная сессия НЦ ССХ им.

А.Н. Бакулева. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечнососудистые заболевания», 2006, №3, стр. 215

36. Еремеева М.В., Голухова Е.З., Чигогидзе H.A. и соавт.Лечение сердечнососудистых заболеваний и терапевтический ангио/миогенез. Поиск наиболее безопасных, но эффективных подходов. Всероссийский XII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2006, №5, стр.266.

37. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Голухова Е.З., Ким А.И. и соавт.Клеточные и генные технологии в кардиохирургии. Поиск наиболее безопасных, но эффективных подходов. Всероссийская научно-практическая конференция и выставочная экспозиция «Высокие медицинские технологии», 25-26 сентября 2007 года, стр.114.

38. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Серов P.A., Чудиновских Ю.А. Резидентные стволовые клетки миокарда: роль в клеточном гомеостазе миокарда и потенциально возможные направления их применения в лечении сердечной недостаточности. Всероссийский XIII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2007, №6, с. 297.

39. Бокерия Л.А., Голухова Е.З, Чигогидзе H.A., Асланиди И.П., Еремеева М.В., Никитина Т.Г., Какучая Т.Т., ШуруповаИ.В., Волковская И.В., Свободов A.B. Результаты клинических исследований с использованием клеточных технологий в лечении пациентов с застойной сердечной недостаточностью. Всероссийский XIII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечнососудистые заболевания». 2007, №6, с. 296.

40. Бокерия Л.А., Демидова O.A., Еремеева М.В., Аракелян В.С.Использование стимуляторов ангиогенеза в лечении хронической ишемии нижних конечностей. Всероссийский XIII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2007, №6, с. 296.

41. L. Bockeria., М Eremeeva, Т. Suchacheva, J. Chudinovskikh.Resident human cardiac stem cells: role in cardiac cellular homeostasis and in different heart diseases. Baltic Summer School 2008: Genetic and clinical aspects of arrhythmias. Abstract book.

42. Бокерия Л.А., Еремеева MB., Серов P.A., Чудиновских Ю.А. Резидентные стволовые клетки миокарда: роль в клеточном гомеостазе миокарда и потенциально возможные направления их применения в лечении сердечной недостаточности. Всероссийский XIV съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2008, стр.290.

43. Еремеева М.В. Возможности применения стволовых клеток и клеток-

предшесгвенников для стимуляции реваскуляризации и регенерации органов. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2010, том 12, №1, сгр.86-93.

Подписано в печать:

13.01.2010

Заказ № 3232 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

 
 

Введение диссертации по теме "Трансплантология и искусственные органы", Еремеева, Марина Викторовна, автореферат

ИНЛС - индекс нарушения локальной сократимости левого желудочка; иРНК - ингибирующая рибонуклеиновая кислота; КМК - костномозговые клетки; КМЦ - кардиомиоцит.

КП - клетки- предшественники (аутологичные); МСК - мезенхимальные стволовые клетки; ОФЭТ - однофотонная эмиссионная томография; ПИКВ(01М1) - прямое интрамиокардиальное введение; ПЭТ - позитронно-эмиссионная томография; РФП - радиофармпрепарат;

ТЛБАП - транслюминальная баллонная ангиопластика; УЗДГ - ультразвуковая допплерография сосудов; ХИНК- хроническая ишемия нижних конечностей; ЦЭК - циркулирующие эндотелиальные клетки; ЦЭП - циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники; ЭКП - эндотелиальные клетки предшественники; ЭСК - эмбриональные стволовые клетки;

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ОГЛАВЛЕНИЕ 3

ВВЕДЕНИЕ 7

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников"

Выводы

1. Активизация восстановительных процессов в ишемизированных тканях достигается путем индукции в них процессов ангио/миогенеза, которые могут быть усилены применением ангиогенезстимулирующих факторов.

2. Созданная плазмидная конструкция ангиогенного препарата - ангиостимулин -биосовместима, нетоксична, позволяет эффективно экспрессировать ген УЕСТ7165, и может быть использована для индукции репаративного ангиогенеза в ишемизированных тканях.

3. Высокоочищенная популяция СБ133+ стволовых клеток костного мозга состоит из двух субпопуляций: менее зрелых СВ133"7СВ347УЕОП1-2+ клеток и более дифференцированных СЭ1337СВ34+/УЕОР11-2+ клеток, причем субпопуляция С0133+/СВ347УЕ0РК-2+ клеток обладает более высоким потенциалом дифференцировки в направлении неоангиогенеза.

4. Клетки СВ133+ обладают более выраженной ангиогенной активностью по сравнению с СБ34+, и поэтому именно эти клетки должны использоваться для стимуляции ангиогенеза при лечении ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.

5. Препарат «ангиостимулин» улучшает перфузию миокарда в наиболее пораженных ишемией сегментах и этот эффект сохраняется не менее года.

6. При сравнительной оценке эффективности способов введения аутологичных костномозговых клеток-предшественников С0133+ для стимуляции регенеративных процессов в миокарде, показано что при интрамиокардиальном введении отмечается достоверное улучшение перфузии в леченных сегментах с исходно умеренным и значительным снижением перфузии. При интракоронарном способе введения достоверных изменений показателей перфузии получено не было.

7. Как при артериальном, так и при внутримышечном введении аутологичных клеток-предшественников СБ133+ или гена УЕОРк,5 зарегистрировано образование новой сосудистой сети при лечении ХИНК.

8. После аутотрансплантации клеток-предшественников С1Э133+ достоверно улучшалось качество жизни больных ИБС и ХИНК.

Практические рекомендации

Исходя из результатов проведенных исследований представляется целесообразным применение внутримышечного введения УЕОР (ангиостимулина) при ишемии миокарда и хронической ишемии нижних конечностей (с учетом критериев включения и исключения пациентов).

Использование аутологичных костномозговых клеток-предшественников СБ133+ можно рекомендовать для лечения сердечной недостаточности в сочетании с хирургическими методами, при этом наиболее эффективным является метод изолированного интрамиокардиалыюго введения.

При лечении ХИНК можно рекомендовать как внутриартериальное, так и в/мышечное введение аутологичных клеток-предшественников СБ133+ или ангиостимулина (гена УЕОР^)

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Еремеева, Марина Викторовна

1. Бокерия Л.А., Еремеева М. В. Современное состояние и перспективы использования ангиогенеза в лечении ишемической болезни сердца. Грудная и сердечно-сосудистая хирургия №2, 57-61(2000).

2. Еремеева М. В., Голухова Е.З.Факторы ангиогенеза при ишемии. Стимуляция неоангиогенеза в миокарде. Лекции по кардиологии, в 3-х томах, под ред. Бокерия Л.А. и Голуховой Е.З., изд. НЦССХ им. А.Н.Бакулева, МоскваД61-170 (2001)

3. Казаков Ю.И., Бобков B.B. Изучение микроциркуляции у больных облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей. Методология флоуметрии, 55-62(1997).

4. Парфенова Е. В, Ткачук В.А. Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы. Кардологический вестник Том 02/N 2(2007).

5. Рубина К.А., Калинина Н.И., Семина Е.В., Потехина A.B., Ефименко А.Ю. Ратнер Е.И., Ткачук В.А., Парфенова Е.В. Роль Т-кадгерина в регуляции роста кровеносных сосудов Кардологический вестник Том 02/N 2(2007).

6. Савельев B.C., Кошкин В.М. Критическая ишемия нижних конечностей. М.: Медицина.; 160 (1997).

7. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко H.A. и соавт. Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клетоккостного мозга для восстановления сократительной функции миокарда. Российский кардиологический журнал, №5,42-50 (2003).

8. Achen, M.G. et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flkl) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 548-553 (1998).

9. Adams GB et al. Therapeutic targeting of a stem cell niche. Nat Biotechnol 25: 238243 . (2007).

10. Aicher A., Brenner W., Zuhayara M., et al. Assessment of the tissue distribution of transplanted human endothelial progenitor cells by radioactive labeling. Circulation 107,2134-2139(2003).

11. Airenne, K.J. et al. Baculovirus-mediated periadventitial gene transfer to rabbit carotid artery. Gene Ther. 7, 1499-1504 (2000).

12. Alitalo, K. & Ferrara, N. Clinical applications of angiogenic growth factors and their inhibitors. Nat. Med. 5, 1359-1364 (1999).

13. Andrews PW. From teratocarcinomas to embryonic stem cells. Philos Trans R Soc bond В Biol Sci 357,405-417(2002).

14. Angoulvant D, Fazel S, and Li RK. Neovascularization derived from cell transplantation in ischemic myocardium. Mol Cell Biochem264, 133-142 (2004).

15. Arras, M. et al. Monocyte activation in angiogenesis and collateral growth in the rabbit hindlimb. J. Clin. Invest. 101, 40-50 (1998).

16. Arras, M. et al. The delivery of angiogenic factors to the heart by microsphere therapy. Nat. Biotechnol. 15, 159-162 (1998).

17. Arsic, N. et al. Induction of functional neovascularization by combined VEGF and angiopoietin-1 gene transfer using AAV vectors. Mol. Ther. 7, 450-459 (2003).

18. Asahara Т., Bauters C., Zheng L., et al. Synergistic effect of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on angiogenesis in vivo. Circulation 92(9 Suppl), 11365-371 (1995). •

19. Asahara, T. et al. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ. Res. 85, 221-228(1999).

20. Asahara Т., Takahashi Т., Masuda H. Et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilising bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18, 3964-3972 (1999).

21. Atwood J., Myers J., Colombo A., et al. The effect of complete and incomplete revascularization on exercise variables in patients undergoing coronary angioplasty. Clin. Cardiol. 13 (2), 89-93 (1990).

22. Awad HA, Butler DL, Boivin GP, Smith FN, Malaviya P, Huibregtse B, and Caplan AI. Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon. Tissue Eng 5, 267-277(1999).

23. Baddoo M, Hill K, Wilkinson R. Gaupp D, Hughes C, Kopen GC, and Phinney DG. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem 89, 1235-1249 (2003).

24. Balsam LB, Wagers AJ, Christensen JL, Kofidis T, Weissman IL, and Robbins RC. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium. Nature 428,668-673 (2004).

25. Barbash I., Chouraqui P., Baron J., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells tj the infarcted myocardium: feasibility, cell migration and body distribution. Circulation 108 (7), 863-868 (2003).

26. Bao J., Naimark W., Palasis M., et al. Intramyocardial delivery of FGF-2 in combination with radio frequency transmyocardial revascularisation. Catheter Cardiovasc. Interv. 53(3), 429-434 (2001).

27. Ватту FP. Mesenchymal stem cells therapy in joint disease. NovartisFound Symp 249, 86-96 (2003).

28. Barton-Davis, E.R., Shoturma, D.I., Musaro, A. Rosenthal, N. & Sweeney, H.L. Viral mediated expression of insulin-like growth factor I blocks the aging-related loss of skeletal muscle function. Proc. Natl Acad. Sei. USA 95, 15603-15607 (1998).

29. Baumgartner I., Rauh G., Pieczek A., et al. Lower-extremity edema associated with gene transfer of naked DNA encoding vascular endothelial growth factor. Ann. Intern. Med. 132(11),880-884 (2000).

30. Bauters C. Growth factors as potential new treatment for ischemic heart disease. Clin. Cardiol. 20(11), 52-57 (1997).

31. Bauters C., Asahara T., Zheng L., et al. Physiological assesment of augmented vascularity induced by VEGF in ischemic rabbit hindlimb. Am. J. Physiol. 267,H1263-1271 (1994).

32. Battler A., Scheinowitz M., Bor A., et al. Intracoronary injection of basic fibroblast growth factor enchances angiogenesis in infarcted swine myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 22, 2001-2006 (1993).

33. Beddington RS and Robertson EJ. An assessment of the developmental potential of embryonic stem cells in the midgestation mouse embryo. Development 105, 733-737 (1989).

34. Behfar A, Zingman LY, Hodgson DM, Rauzier JM, Kane GC, Terzic A, and Puceat M. Stem cell differentiation requires a paracrine pathway in the heart. FASEB J 16, 1558-1566 (2002).

35. Bekeredjian R., Chen S., Frekel P., et al. Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression in the heart. Circulation 108, 1022-1026 (2003).

36. Bergelson, J.M. et aL Isolation of a common receptor for coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and 5. Science 275, 1320-1323 (1997).

37. Beeri R., Guerrero J., Supple G., et al. New efficient catheter-based system for myocardial gene delivery. Circulation 106(14), 1756-1759 (2002).

38. Bhatia M. AC133 expression in human stem cells. Leukemia 15, 1685-1688 (2001).

39. Bhattacharya, V. et al. Enhanced endothelialization and microvessel formation in polyester grafts seeded with CD34+ bone marrow cells. Blood 95, 581-585 (2000).

40. Boekstegers P., von Degenfeld G., Giehrl W., et al. Myocardial gene transfer by selective pressure-regulated retroprfusion of coronary veins. Gene Ther. 7(3),232-240 (2000).

41. Boheler KR, Czyz J, Tweedie D, Yang HT, Anisimov SV, and Wobus AM. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res 91,189-201(2002).

42. Borue X, Lee S, Grove J, Herzog EL, Harris R, Diflo T, Glusac E, Hyman K, Theise ND, and Krause DS. Bone marrow-derived cells contribute to epithelial engraftment during wound healing. Am J Pathol 165, 1767-1772 (2004).

43. Britten MB, Abolmaali ND, Assmus B, Lehmann R, Honold J, Schmitt J, VogI TJ, Martin H, Schachinger V, Dimmeier S, and Zeiher AM. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction

44. TOPCAREAMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation 108, 2212-2218 (2003).

45. Brittan M, Braun KM, Reynolds LE, Conti FJ, Reynolds AR, Poulsom R, Alison MR, Wright NA, and Hodivala-Dilke KM. Bone mairow cells engraft within the epidermis and proliferate in vivo with no evidence of cell fusion. J Pathol 205, 1-13, (2005).

46. Bryant, M. et al. Tissue repair with a therapeutic transcription factor. Hum. Gene Ther. 11,2143-2158 (2000).

47. Cao, R. et al. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2. Nat. Med. 9, 604-613 (2003).

48. Castro-Malaspina H, Ebell W, and Wang S. Human bone marrow fibroblast colony-forming units (CFU-F). Prog Clin Biol Resl54, 209-236 (1984).

49. Caplan Al and Bruder SP. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Medl, 259-267 (2001).

50. Chae, J.K. et al. Coadministration of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor enhances collateral vascularization. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 20, 2573-2578 (2000).

51. Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, and Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 113, 643-655 (2003).

52. Chambers I. and Smith A. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells. Oncogene 23, 7150-7160 (2004).

53. Chleboun J., Martins R., Mitchell C., et al. bFGF enhances the development of the collateral circulation after acute arterial occlusion. Biochem. Biophys. Res. Comm. 185,510-516 (1992).

54. Chien KR. Stem cells: lost in translation. Nature 428,607-608 (2004).

55. Colter DC, Class R, DiGirolamo CM, and Prockop DJ. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc Natl AcadSci USA 97, 3213-3218 (2000).

56. Condorelli G, Borello U, De Angelis L., et al.Cardiomyocytes induce endothelialcells to trans-differentiate into cardiac muscle: implication for myocardium regeneration. Proc Nat I Acad Sci USA 98, 10733-10738 (2001).

57. Davis, S. et al. Isolation of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, by secretion-trap expression cloning. Cell 87, 1161-1169 (1996).

58. Davani S, Deschaseaux F, Chalmers D, Tiberghien P, and Kantelip JP. Can stem cells mend a broken heart? Cardiovasc Res65, 305-316 (2005).

59. Dor, Y. et al. Conditional switching of VEGF provides new insights into adult neovascularization and pro-angiogenic therapy. EMBO J. 21, 1939-1947 (2002).

60. Doss MX, Koehler CI, Gissel C, Hescheler J, and Sachinidis A. Embryonic stem cells: a promising tool for cell replacement therapy. J Cell Mol Med 8, 465-473 (2004).

61. Draper JS, Pigott C, Thomson JA, and Andrews PW. Surface antigens of human embryonic stem cells: changes upon differentiation in culture. J Anat 200, 249-258 (2002).

62. Drukker M and Benvenisty N. The immunogenicity of human embryonic stem-derived cells. Trends Biotechnol 22,136-141 (2004).

63. Dvorak, H.F., Brown, L.F., Detmar, M. & Dvorak, A.M. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis. Am. J. Pathol 146, 1029-1039 (1995).

64. Edelberg J., Lee S., Kaur M., et al. Platelet-derived growth factor-AB limits the extent of myocardial infarction in rabbit model: feasibility of restoring impaired angiogenic capacity in the aging heart. Circulation 105(5), 608-613 (2002).

65. Eisenberg LM and Eisenberg CA. Stem cell plasticity, cell fusion, and transdifferentiation. Birth Defects Res C Embryo Today 69, 209-218 (2003).

66. Eisenberg LM and Eisenberg CA. Adult stem cells and their cardiac potential. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 276,103-112 (2004).

67. Epstein S., Fuchs S. et al. Therapeutic interventions for enhancing collateral development by administration of growth factors: basic, principles, early results and potential hazards. Cardiovasc. Res. 49(3), 532-542 (2001).

68. Epstein S., Kornowski R. et al. Angiogenesis therapy: amidst the hype, the neglected potential for serious side effects. Circulation 104,115-119 (2001).

69. Etzion S, Battler A, Barbash I., et al. Influence of embryonic cardiomyocytetransplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol 33,1321-1330 (2001).

70. Folkman J. Angiogenesis therapy of human heart. Circulation 97,628-629 (1998).76. de Feyter PJ. PTCA in patients with stable angina pectoris and multivessel disease: is incomplete revascularization acceptable ? Clin, Cardiol. 15(5), 317-322 (1992).

71. Friedenstein AJ. Osteogenetic activity of transplanted transitional epithelium. Acta Anat 45,31-59(1961).

72. Friedenstein AJ, Chailakhjan RK, and Lalykina KS. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guineapig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet 3, 393-403, (1970).

73. Fernandez-Aviles F, San Roman JA, Garcia-Frade J, Experimental and clinicalregenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ Res 95, 742-748 (2004).

74. Fukumura, M. et al. Gene transfer to skeletal muscle and motor neurons by intramuscular injection of a novel minus strand RNA vector (Sendai virus vector). J. Gen. Med. 2 (suppl.), 24 (2000).

75. Fuchs S., Baffour R., Zhou YF., et al. Transendocardial. delivery of autologous bone marrow enchances collateral perfusion and regional function in pigs with chronic experimental myocardial ischemia. J. Am. Coll. Cardiol. 37, 1726-1732 (2001).

76. Fuchs S., Baffour R., Shou M., et al. Coud plasmid mediated gene transfer into the myocardium be augmented by left ventricular guided laser myocardial injury ? Catheter Cardiovasc. Interv. 54(4), 533-538 (2001).

77. Galinanes M, Loubani M, Davies J, Chin D, Pasi J, and Bell PR. Autotransplantation of unmanipulated bone marrow into scarred myocardium is safe and enhances cardiac function in humans. Cell Transplant 13,7-13 (2004).

78. Galzie, Z., Kinsella, A.R. & Smith, J.A. Fibroblast growth factors and their receptors. Biochem. Cell Biol. 75, 669-685 (1997).

79. Gill M., Dia S., Hattori K., et al. Vascular trauma induces rapid but trnsient mobilization of VEGFR2+AC133+ endothelial precursor cells. Circ. Res. 88,167174 (2001).

80. Giordano, F.J. et al. Intracoronary gene transfer of fibroblast growth factor-5 increases blood flow and contractile function in an ischaemic region of the heart. Nat. Med. 2, 534-539 (1996).

81. Gnecchi M, He H, Liang OD, Melo LG, Morello F, Mu H, Noiscux N, Zhang L, Pratt RE, Ingwall JS, and Dzau VJ. Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modifíed mesenchymal stem cells. Nat Med 11, 367-368 (2005).

82. Grant, M.B. et al. Adult hematopoietic stem cells provide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization. Nat. Med. 8, 607-612 (2002).

83. Grines C., Watkins M., Helmer G., et al. Angiogenic gene therapy (AGENT) trial in patients with stable angina pectoris. Circulation 105, 1291-1297 (2002).

84. Giordano F., Pig P., McKiran D., et al. Intracoronary gene transfer of fibroblast growth factor -5 increases blood flow and contractile function in an ischemic region of the heart. Nat. Med. 2, 534-539 (1996).

85. Grossman P., Han Z., Palasis M., et al. Incomplete retention after direct myocardial injection. Catheter Cardiovasc. Interv. 55(3), 392-397 (2002).

86. Grove JE, Bruscia E, and Krause DS. Plasticity of bone marrow derived stem cells. Stem Cells 22, 487-500 (2004).

87. Grube E., Gerckens U., Altman PA., et al. The helical infusion catheter: first clinical evaluation for local intramyocardial therapeutics. Am. J. Cardiol. 90(Suppl 6A), 120H (2002).

88. Guo Y, Lubbert M, and Engelhardt M. CD34- hematopoietic stem cells: current concepts and controversies. Stem Cells 21,15-20 (2003).

89. Handgretinger R, Gordon PR, Leimig T, Chen X, Buhring HJ, Niethammer D, Kuci S. Biology and plasticity of CD 133+ hematopoietic stem cells. Ann N Y Acad Sei. 996,141-151 (2003).

90. Hariawala M., Florowitz J., Esakof D., et al. VEGF improves myocardial blood flow but produces EDRF- mediated hypotension in porcine hearts. J. Surg. Res. 63, 77-82 (1996).

91. Hatano SY, Tada M, Kimura H, Yamaguchi S, Kono T, Nakano T, Suemori I I, Nakatsuji N, and Tada T. Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity. MechDev 122, 67-79 (2005).

92. Hattan N., Kawaguchi H., Ando K, et al. Purified cardiomyocytes from bone marrowmesenchymal stem cells produce stable intracardiac grafts in mice. Cardiovasc Res 65, 334-344 (2005).

93. Hattori, K. et al. Placental growth factor reconstitutes hematopoiesis by recruiting VEGFR1+ stem cells from bone-marrow microenvironment. Nat. Med. 8, 841-849 (2002).

94. Hardy K, Spanos S, Becker D, Iannelli P, Winston RM, and Stark J. From cell death to embryo arrest: mathematical models of human preimplantation embryo development. Proc Natl Acad SciUSA 98, 1655-1660 (2001).

95. Hart AH, Hartley L, Ibrahim M, and Robb L. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human. DevDyn 230, 187-198 (2004).

96. He JQ, Ma Y, Lee Y, Thomson J A, and Kamp TJ. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res 93, 32-39 (2003).

97. Heil M, Ziegelhoeffer T, Mees B, and Schaper W. A different outlook on the role of bone marrow stem cells in vascular growth: bone marrow delivers software not hardware. Circ Res 94, 573-574 (2004).

98. Hendel R., Henry T., Rocha-Singh K., Isner J., et al. Effect of intracoronary recombinant human vascular endothelial growth factor on myocardial perfusion: evidence for dose-dependent effect. Circulation 101, 118-121 (2000).

99. Heng BC, Haider HK, Sim EK, Cao T, Tong GQ, and Ng SC. Comments about possible use of human embryonic stem cellderived cardiomyocytes to direct autologous adult stem cells into the cardiomyogenic lineage. Acta Cardiol 60, 7-12, (2005).

100. Henry Т., Annex В., MeKendall G., et al. (for the VIVA Investigators). Vascular endothelial growth factor in ischemia for vascular angiogenesis (the VIVA trial). Circulation 107, 1359-1365 (2003).

101. Hill JM., Dick AJ., Raham VK., et al. Serial cardiac magnetic resonance imaging of injected mesenchymal stem cells. Circulation 108, 1009-1014 (2003),

102. Hodgson DM, Behar A, Zingman LV, Kane GC, Perez-Terzic C, Alekseev AE, Puceat M, and Terzic A. Stable benefit of embryonic stem cell therapy in myocardial infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol 287, H471-H479 (2004).

103. Horwitz EM. Stem cell plasticity: the growing potential of cellular therapy. Arch Med Res 34, 600-606 (2003).

104. Isner J.M. Myocardial gene therapy. Nature 415, 234-239 (2002).

105. Isner J.M. Angiogenesis for revascularization of ischaemic tissues. Eur. Heart J. 18(1), 1-2(1997).

106. Isner J.M., Asahara T. Angiogenesis and vasculogenesis as therapeutic strategies for postnatal neovascularization. J. Clin. Invest. 103(9),1231-1236 (1999).

107. Isner JM. Therapeutic angiogenesis : a new frontier for vascular therapy. Vase. Med. 1(1), 79-87(1996).

108. Isner JM., Feldman LJ. Gene therapy for arterial disease. Lancet 344,1653-1654 (1994).

109. Isner J.M., Pieczek A., Schainfeld R., et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischaemic limb. Lancet 348, 370-374 (1996).

110. Ito W.D., et al. Monocyte chemotactic protein-1 increases collateral and peripheral conductance after femoral artery occlusion. Circ. Res. 80, 829-837 (1997).

111. Jackson K.A., et al. Regeneration of ischaemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J. Clin. Invest. 107, 1395-1402 (2001).

112. Jackson KA, Snyder DS, and Goodell MA. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells 22, 180187 (2004).

113. Javerzat, S., Auguste, P. & Bikfalvi, A. The role of fibroblast growth factors in vascular development. Trends Mol. Med. 10, 483-489 (2002).

114. Jiang Z., Padua R., Ju H., et al. Acute protection of ischemic heart by FGF-2: involvement of FGF-2 receptors and protein kinase C. Am. J. Physiol. Heart Circ Physiol. 282(3), H1071-H1080 (2002).

115. Jones E., Craver J., Guyton R., et al. Impotance of complete revascularization in perfomance of the coronary bypass operation. Am. J. Cardiol. 51(1), 7-12 (1983)

116. Joukov, V. et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).

117. Kajstura J, Rota M, Whang B, et al.Bone marrow cells differentiate in cardiac cell leneages after infarction independently of cell fusion. Circ Res 96,127-137(2005).

118. Kaushal, S. et al. Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo. Nat. Med. 7, 1035-1040 (2001).

119. Kar S., Nordlander R. Coronary veins: an alternate route to ischemic myocardium. Heart Lung 21(2), 148-157 (1992).

120. Kawada H, Fujita J, Kinjo K., et al. Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.

121. Blood 104, 3581-3587(2004).

122. Khurana, R. & Simons, M. Insights from angiogenesis trials using fibroblast growth factor for advanced arteriosclerotic disease. Trends Cardiovasc. Med. 13, 116-122 (2003).

123. Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, and Epstein SE. Bone marrow-derived cells for enhancing collateral development: mechanisms, animal data, and initial clinical experiences. Circ Res 95, 354-363 (2004).

124. Kehat I and Gepstein L. Human embryonic stem cells for myocardial regeneration. Heart Fail Rev 8, 229-236 (2003).

125. Kehat I, Khimovich L, Caspi O, Gepstein A, Shofti R, Arbel G,Huber I, Satin J, Itskovitz-Eldor J, and Gepstein L. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat Biotech 10, 1-8 (2004).

126. Kellar R., Landeen L., Shepherd B., et al. Scaffold-based three-dimensional human fibroblast culture provides a structural matrix that supports angiogenesis in infarcted heart tissue. Circulation 104, 2063-2068(2001).

127. Kleiman NS, Califf RM. Results from late-breaking clinical trials sessions at ACCIS 2000 and ACC 2000. J. Am. Coll. Cardiol. 36,310-311 (2000).

128. Ko YT, Hartner WC, A Kale A and Torchilin VP. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and

129. TAT peptide. Gene Therapy, 16, 52-59 (2009).

130. Kocher, A.A. et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat. Med. 7, 430-436 (2001).

131. Koh CJ and Atala A. Tissue engineering, stem cells, and cloning: opportunities for regenerative medicine. J Am Soc Nephrol 15, 1113-1125 (2004).

132. Kootstra, N.A. & Verma, I.M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2002).

133. Koponen, J.K. et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a noveloreverse transactivator rtTA2 -M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10,459-466 (2003).

134. Koransky M. et al. VEGF gene delivery for treatment of ischemic cardiovascular disease. Trends Cardiovasc. Med. 2(3), 108-114 (2002).

135. Korbling M and Estrov Z. Adult stem cells and tissue repair. BoneMarrow Transplant 32, S23-S24 (2003).

136. Kornowski R., Fuchs S., Tio F.,et al. Evaluation of the acute and chronic safety of the Biosence injection catheter system in porcine hearts. Catheter Cardiovasc. Interv. 48(4), 447-455(1999).

137. Kornowski R., Fuchs S., Leon M., Epstein S. Delivery strategies to achieve therapeutic myocardial angiogenesis. Circulation 101(4), 454-458 (2000).

138. Kubo, H. et al. Blockade of vascular endothelial growth factor receptor-3 signaling inhibits fibroblast growth factor-2-induced lymphangiogenesis in mouse cornea. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 8868-8873 (2002).

139. Laham R., Hug D., Simons M., et al. Therapeutic myocardial angiogenesis using percutanous intrapericardial drug delivery. Clin. Cardiol. 22(1 Suppl l),6-9 (1999).

140. Laham R., Simons M. Growth factor therapy in ischemic heart disease. In: Rubanyi G.,ed. Angiogenesis in Health and Disease. New York: Marcel Decker, 451-475 (2000).

141. Laham R. Chronos N., Pike M., et al. Intracoronary basic fibroblast growth factor (FGF-2) in patients with severe ischemic heart disease: results of a phase I open-label dose esculation study. Am. J. Coll. Cardiol. 36(7),2132-2139 (2000).

142. Laham R„ Simons M., Sellke F. Gene transfer for angiogenesis in coronary artery disease. Annu. Rev. Med. 52, 485-502 (2001).

143. Laham R., Rezaee M., et al. Intracoronary and intravenous administration of basic fibroblast factor: myocardial and tissue distribution. Drug. Metab. Dispos. 27(7), 821-826(1999).

144. Laitinen, M. et al. Adenovirus-mediated gene transfer to lower limb artery of patients with chronic critical leg ischaemia. Hum. Gene Ther. 9, 1481-1486 (1998).

145. Laitinen, M. et al. Gene transfer into the carotid artery using an adventitial collai-. Comparison of the effectiveness of plasmid-liposome complexes, retroviruses, pseudotyped retroviruses and adenoviruses. Hum. Gene Ther. 8, 1645-1650 (1997).

146. Landry DW and Zucker HA. Embryonic death and the creation of human embryonic stem cells. J Clin Invest 114, 1184-1186(2004).

147. Lars Ahrlund-Richter,l Michèle De Luca,2 Daniel R. Marsliak,3 Megan Munsie,4 Anna Veiga,5 and Mahendra Rao6. Isolation and Production of Cells Suitable for Human Therapy: Challenges Ahead. Cell Stem Cell 4, January 9, pp. 20-26 (2009).

148. Laverge H, Van der Elst J, De Sutter P, Verschraegen-Spae MR, De Paepe A; and Dhont M. Fluorescent in-situ hybridization on human embryos showing cleavage arrest after freezing and thawing. Hum Reprod 13, 425-429 (1998).

149. Lawrie A., Brisken A., Francis S., et al. Microbubble-enhanced ultrasound for vascular gene delivery to myocardium. Gene Ther. 7(23), 2023-2027 (2000).

150. Lazarous D., Shou M., Scheibowitz M. Comparative effects of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor on coronary collateral development and the arterial response to injury. Circulation 94,1074-1082(1996).

151. Lazarous D., Sheinowitz M., Shou M., et al. Effects of chronic systemic administration of basic fibroblast growth factor on collateral development in the canine heart. Circulation 91, 145-153 (1995).

152. Lazarous D., Shou M., Stiber J., et al. Pharmacodynamics of basic fibroblast growth factor: route of administration letermines myocardial systemic distribution. Cardiovasc. Res. 36(1),78-85 (1997).

153. Lazarous D., Shou M., Stiber J., et al. Adenoviral-mediated gene transfer induces sustained pericardial VEGF expression in dogs: effect on myocardial angiogenesis. Cardiovasc. Res. 44(2), 294-302 (1999).

154. Lehrman, S. Virus treatment questioned after gene therapy death. Nature 401, 517-518 (1999).

155. Leong FT and Freeman LJ. Acute renal infarction. J R Soc Med 98, 121-122 (2005).

156. Leor J, Patterson M, Quinones MJ, Kedes LH, and Kloner RA.Transplantation of fetal myocardial tissue into the infarcted myocardium of rat. A potential method for repair of infarcted myocardium? Circulation 94: II332-II336, 1996.

157. Leung D., Cachianes G., Kuang, W., Goeddel D. & Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 246, 1306-1309 (1989).

158. Levenberg S, Golub J., Amit M., Itskovitz-Eldor J. and Langer R. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 99,43914396 (2002).

159. Li TS, Hamano K, Hirata K, Kobayashi T, and Nishida M. The safety and feasibility of the local implantation of autologous bone marrow cells for ischemic heart disease. J Card Surg 18: S69-S75 (2003).

160. Lin F, Cordes K, Li L, Hood L, Couser WG, Shankland SJ, and Igarashi P. Bone marrow stem cells contribute to healing of the kidney. J Am Soc Nephrol 14, S48-S54 (2003).

161. Li RK, Jia ZQ, Weisel RD, Merante F, and Mickle DA. Smooth muscle cell transplantation into myocardial scar tissue improves heart function. J Mol Cell Cardiol 31: 513-522 (1999).

162. Losordo D., Vale P., Symes J., et al. Gene therapy for myocardial angiogenesis: initial clinical results with direct myocardial injection of phVEGF165 as sole therapy for myocardial ischemia. Circulation 98(25), 2800-2804 (1998).

163. Lopez J., Laham R., Carrozza J., et al. Hemodynamic effects of intracoronary VEGF delivery: evidence of tachyphylaxis and NO dependence of responce. Am. J. Physiol. 273, H1317-1323 (1997).

164. Lopez J., Laham R., Stamler A., et al. VEGF administration in chronic myocardial ischemia in pigs. Cardiovasc. Res. 40(2), 272-281(1998).

165. Lowe H. et al. Beyond angioplasty: novel developments in interventional cardiology. Intern. Med. J. 32, 470-474 (2002).

166. Lu Y., Shasky J., DelTatto M., et al. Recomdinant vascular endothelial growth factor secreted from tissue engineered bioartificial muscles promotes localized angiogenesis. Circulation 104, 594-599(2001).

167. Lucchese F. et al. Partial left ventriculectomy: overall and late results in 44 class IV patients with 4-year follow-up. J. Card. Surg. 15, 179-185 (2000).

168. Lum LG, Padbury JF, Davol PA, and Lee RJ. Virtual reality of stem cell transplantation to repair injured myocardium. J Cell Biochem. In press.

169. Luttun, A. et al. Revascularization of ischemic tissues by P1GF treatment, and inhibition of tumor angiogenesis, arthritis and atherosclerosis by anti-Fit 1. Nat. Med. 8, 831-840 (2002).

170. Lyden, D. et al. Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth. Nat. Med. 7, 1194-1201 (2001).

171. Maisonpierre, P.C. et al. Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 277, 55-60 (1997).

172. Majka, S.M. et al. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. J. Clin. Invest. Ill, 71-79(2003).

173. Mangi AA, Noiseux N, Kong D, He H, Rezvani M, Ingwall JS, and Dzau VJ. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med 9,1195-1201 (2003).

174. Marshall, E. Second child in French trial is found to have leukemia. Science 299, 320 (2003).

175. Martin MJ, Muotri A, Gage F, and Varki A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Medl 1, 228-232 (2005).

176. Mathur A and Martin JF. Stem cells and repair of the heart. Lancet 364,183-192 (2004).

177. McNeer JF, Conley MJ, Starmer CF, et al. Complete and incomplite revascularization at aortocoronary bypass surgery; experiance with 392 consecutive patients. Am. Heart J. 88, 176-182 (1974).

178. Mesisel E., Pfeiffer D., Engelmann L., et al. Investigation of coronary venous anatomy by retrograde venography in patients with malignant ventricular tathycardia. Circulation 104, 442-447 (2001).

179. Menasche P, Iiagege AA, Scorsin M, Pouzet B, Desnos M, Duboc D, Schwartz K, Vilquin JT, and Marolleau JP. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet 347, 279-280(2001).

180. Menasche P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357(2003).

181. Menasche P., Piwnica A. Cardioplegia by way of the coronary sinus for valvular and coronary surgery. J. Am. Coll. Cardiol. 18(2), 628-236 (1991).

182. Mesri, E.A., Federoff, H.J. & Brownlee, M. Expression of vascular endothelial growth factor from a defective herpes simplex virus type 1 amplicon vector induces angiogenesis in mice. Circ Res. 76, 161-167 (1995).

183. Mezey E. Commentary: on bone marrow stem cells and openmindedness. Stem Cells Dev 13,147-152 (2004).

184. Miller, D.L. et al. Compensation by fibroblast growth factor 1 (FGF1) does not account for the mild phenotypic defects observed in FGF2-null mice. Mol. Cell Biol. 20, 2260-2268 (2000).

185. Min JY, Yang Y, Converso KL, Liu L, Huang Q, Morgan JP, and Xiao YF. Transplantation of embryonic stem cells improves cardiac function in post-infarcted rats. JAppl Physiol 92, 288-296 (2002).

186. Min JY, Yang Y, Sullivan MF, Ke Q, Converso KL, Chen Y, Morgan JP, and Xiao YF. Long-term improvement of cardiac function in rats after infarction bytransplantation of embryonic stem cells. J Thorac Cardiovasc Surg 125,361-3692003).

187. Monahan, P.E. & Samulski, RJ. AAV vectors: is clinical success on the horizon? Gene Ther. 7, 24-30 (2000).

188. Morishita, R. et al. Therapeutic angiogenesis induced by human recombinant hepatocyte growth factor in rabbit hind limb ischemia model as cytokine supplement therapy. Hypertension 33, 1379-1384 (1999).

189. Morrison SJ, Uchida N, and Weissman IL. The biology of hematopoietic stem cells. Annu Rev Cell Dev Biol 11, 35-71(1995).

190. Morrison SJ and Weissman IL. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity 1, 661-673 (1994).

191. Mukherjee D., et al. Direct myocardial revascularization and angiogenesis how many patients might be eligibl? Am. J. Cardiol. 84, 598-600(1999).

192. Murry CE, Soonpaa MH, Reinecke H, et al. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 428, 664-6682004).

193. Murry CE, Wiseman RW, Schwartz SM, and Hauschka SD. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest 98: 2512-2523(1996).

194. Naldini, L. et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272, 263-267 (1996).

195. Naimark WA., Lepore JJ., Klugherz BD., et al. Adenovirus-catheter compatibility increases gene expression after delivery to porcine myocardium. Hum. Gene Ther 14(2),161-166 (2003).

196. Negrin RS, Atkinson K, Leemhuis T, et al. Transplantation of highly purified CD34+Thy-1+ hematopoietic stem cells in patients with metastatic breast cancer. Biol Blood Marrow Transplant 6, 262-271 (2000).

197. Neufeld, G., Cohen, T., Gengrinovitch, S. & Poltorak Z. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB J. 13, 9-22 (1999).

198. Nugent H., Edelman E. Tissue engineering therapy for cardiovascular disease. Circ. Res. 92(10),1068-1078 (2003).

199. Odorico JS, Kaufman DS, and Thomson JA. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines. Stem Cells 19, 193-204 (2001).

200. Oesterle SN., Reifart N., Hayase M., et al. Catheter-based coronary bypass: : a devalopment update. Catheter Cardiovasc. Interv. 58, 212-218 (2003).

201. Ogawa, S. et al. A novel type of vascular endothelial growth factor, VEGF-E (NZ-7 VEGF), preferentially utilizes KDR/Flk-1 receptor and carries a potent mitotic activity without heparin-binding domain. J. Biol Chem. 273, 31273-31282 (1998).

202. Okumura-Nakanishi S, Saito M, Niwa H, and Ishikawa F. Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells. J Biol Chem 280, 5307-5317 (2005).

203. Olofsson, B. et al. Vascular endothelial growth factor B, a novel growth factor for endothelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 2576-2581 (1996).

204. Orlic, D. et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 410, 701-705 (2001).

205. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Mobilized bone marrow cells repair in infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci USA 98, 10344-10349 (2001).

206. Osawa M, Nakamura K, Nishi N, Takahasi N, Tokuomoto Y, Inoue H, and Nakauchi H. In vivo self-renewal of c Kit+ Sca-l+Lin(low/-) hematopoietic stem cells. J Immunol 156, 3207-3214 (1996).

207. Otani, A. et al. Bone marrow derived stem cells target retinal astrocytes and can promote or inhibit retinal angiogenesis. Nat. Med. 8, 1004-1010 (2002).

208. Pakalska E., Kolff W. Anatomical basis for retrograde coronary vein perfusion. Venous anatomy and veno-venous anastomoses in the hearts of human and some animals. Minn.Med. 63(11), 795-801(1989).

209. Palermo AT, Labarge MA, Doyonnas R, Pomerantz J, and Blau HM. Bone marrow contribution to skeletal muscle: a physiological response to stress. Dev Biol 279, 336-344 (2005).

210. Pan GJ, Chang ZY, Scholer HR, and Pei D. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct 4. Cell Res 12, 321-329 (2002).

211. Peher P., Schumacher B. Angiogenesis in ischemic human myocardium: clinical results after 3 years. Ann. Thorac. Surg. 69, 1414-1419 (2000).

212. Pera MF, Reubinoff B, and Trounson A. Human embryonic stem cells. J Cell Sci 113,5-10 (2000).

213. Pera MF and Trounson AO. Human embryonic stem cells: prospects for development. Development 131, 5515-5525 (2004).

214. Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation 107, 2294-2302 (2003).

215. Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, et al. Improved exercise capacity and ischemia 6 and 12 mo after transendocardial injection of autologous bone marrow mononuclear cells for ischemic cardiomyopathy. Circulation 110, 213-218 (2004).

216. Petrova, T.V. et al. Lymphatic endothelial reprogramming of vascular endothelial cells by the Prox-1 homeobox transcription factor. EMBOJ. 21, 4593-4599 (2002).

217. Pittenger MF and Martin BJ. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res 95, 9-20 (2004).

218. Post M., Laham R., Sellke F., Simons M. Therapeutic angiogenesis in cardiology using protein formulations. Cardiovasc. Res. 49, 522-531 (2001).

219. Reinecke H, Zhang M, Bartosek T, and Murry CE. Survival, integration, anddifferentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.

220. Circulation 100: 193-202 (1999).

221. Rajanayagam M., Shou M., Thirumurti V., et al. Intracoronary basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral perfusion in dogs. J. Am. Coll. Cardiol. 35(2), 519-526 (2000).

222. Reubinoff BE, Pera M, Fong CY, Trounson A, and Bongso A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotech 18, 399-404 (2000).

223. Reyes, M. et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. J. Clin. Invest. 109, 337-346 (2002).

224. Rezaee M., Herity N., Lo S., et al. Therapeutic angiogenesis by selective delivery of bFGF in the anterior interventricular vein. J. Am. Coll. Cardiol. 37(2), 47A(abstr.) (2001).

225. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature 386, 671-674 (1997).

226. Rissanen, T.T. et al. Expression of VEGF and VEGFR-2 (KDR/Flk-1) in ischemic skeletal muscle and its regeneration. Am. J. Pathol. 160, 1-11 (2002).

227. Rissanen, T.T. et al. Fibroblast growth factor-4 induces vascular permeability, angiogenesis and arteriogenesis in a rabbit hindlimb ischemia model. FASEB J. 17, 100-102(2003).

228. Rissanen, T.T., Vajanto, I. & Yla-Herttuala, S. Gene therapy for therapeutic angiogenesis in critically ischaemic lower limb on the way to the clinic. Eur. J. Clin. Invest. 31, 651-666 (2001).

229. Rezaee M., Yeung AC., Altman P., et al. Evalution of the percutanous intramyocardial injection for local myocardial treatment. Catheter Cardiovasc. Interv. 53(2), 271-276 (2001).

230. Ruel M., Laham R., Parker J., et al. Long-term effects of surgical angiogenic therapy with FGF-2 protein. J. Thorac Cardiovasc. Surg. 124, 28-34 (2002).

231. Ruoslahti, E. Specialization of tumour vasculature. Nat. Rev. Cancer 21, 83-90 (2002).

232. Saaristo, A., Karkkainen, M.J. & Alitalo, K. Insights into the molecular pathogenesis and targeted treatment of lymphedema. Ann. NY Acad. Sci. 979, 94-110 (2002).

233. Saegusa M, Takano Y, and Okudaira M. Human hepatic infarction: histopathological and postmortem angiological studies. Liver\3. 239-245 (1993).

234. Sakakibara Y., et al. Toward surgical angiogenesis using slow-released basic fibroblast growth factor. Eur. J. Cardiovasc. Surg. 24(1),105-112 (2003).

235. Sata, M. et al. Hematopoietic stem cells differentiate into vascular cells that participate in the pathogenesis of atherosclerosis. Nat. Med. 8, 403-409 (2002).

236. Sato K., Laham R., et al. Efficacy of intracoronary or intravenous VEGF165 in pig model of chronic myocardial ischeia. J. Am. Coll. Cardiol. 37(2), 616-623 (2001).

237. Sayeed -Shah U., Mann M., Martin J., et al. Complete reversal of ischemic wall motion abnormalities by combined use of gene therapy with transmyocardial laser revascularization. J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 116,763-769 (1998).

238. Schulinder M, Yanuka O, Itskovitz-Elder J, Melton D, and Benvenisty N. Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc NatlAcadSci USA 97, 11307-11312 (2000).

239. Schumacher B., Pecher P., von Specht B., et al. Induction of neoangiogenesis in ischemic myocardium by human growth factors: first clinical results of a new treatment of coronary heart disease. Circulation 97, 645-650 (1998).

240. Seiler C, Pohl T, Wustmann K, Hutter D, et al. Promotion of collateral growth by GM-CSF in patients with coronary artery disease: a randomised double blind placebo-controlled study. Circulation\04, 2012-2015 (2001).

241. Sekiya I, Larson BL, Smith JR, Pochampally R, Cui JG, and Prockop DJ. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality. Stem Cells 20,530-541 (2002).

242. Sellke F., Ruel M. Vascular growth factors and angiogenesis in cardiac surgery. Ann. Thorac. Surg. 75(2), S685-690 (2003).

243. Shintani S., Murohara T., Ikeda H., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circulation 103, 2776-2779 (2001).

244. Strauer B.,- Kornowski R. Stem cell therapies in perspective. Circulation 107, 929934 (2003).

245. Shizuru JA, Negrin RS, and Weissman IL. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med 56, 509-538 (2005).

246. Simons M., Annex BH, Laham RJ, et al. Pharmacological ttreatment of coronary artery disease with recombinant fibroblast growth factor-2: double-blind, randomized, controlled clinical trial. Circulation 105(7), 788-793 (2002).

247. Simons, M., Bonow R., Chronos N., et al. Clinical trials in coronary angiogenesis: issues, problems, consensus. An expert panel summary. Circulation 102(11), e73-e86 (2000).

248. Smith, R.S. Jr., Lin, K-F., Agata, J., Chao, L. & Chao, J. Human endothelial nitric oxide synthase gene delivery promotes angiogenesis in a rat model of hindlimb ischemia. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 22, 1279-1285 (2002).

249. Smith JR, Pochampally R, Perry A, Hsu SC, and Prockop DJ.Isolation of a highly clonogenic and multipotential subtraction of adult stem cells from bone marrow stroma. Stem Cells 22, 823-831 (2004).

250. Szmitko P., Fedak P., Weisel R., et al. Endothelial progenitor cells: new hope for a broken heart. Circulation 107, 3093-3100 (2003).

251. Soonpaa MH, Koh GY, Klug MG, and Field LJ. Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium. Science 264: 98- 101 (1994).

252. Spangrude GJ, Heimfeld S, and Weissman IL. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science 241, 58-62 (1988).

253. Springer, M.L., Chen, A.S., Kraft, P.E., Bednarski, M. & Blau, H.M. VEGF gene delivery to muscle: potential role for vasculogenesis in adults. Mol. Cell. 2, 549-558 (1998).

254. Stamm C, Kleine HD, Westphal B, Petzsch M, Kittner C, Nienaber CA, Freund M, and Steinhoff G. CABG and bone marrow stem cell transplantation after myocardial infarction. J Thorac Cardiovasc Surg 52, 152-158 (2004).

255. Stamm C, Westphal B, Kleine HD, Petsch M, Kittner C, Klinge H, Schumichen C, Nienaber CA, Freund M, and Steinhoff G. Autologous bone marrow stem cell transplantation for myocardial regeneration. Lancet 361,45-46 (2003).

256. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Kostering M, Hernandez A, Sorg RV, Kogler G, and Wernet P. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 106, 1913— 1918(2002).

257. Strobel ES, Gay RE, and Greenberg PL. Characterization of the in vitro stromal microenvironment of human bone marrow. IntJ Cell Cloning 4, 341-356(1986).

258. Sun S, Guo Z, Xiao X, Liu B, Liu X, Tang PH, and Mao N.Isolation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a novel and reliable method. Stem Cells 21, 527-535 (2003).

259. Suzuki K., Murtuza B., Suzuki N, et al. Intracoronary infusion of skeletal myoblasts improves cardiac function in doxorubizin-induced heart failure. Circulation 104(12 Suppl 1), 1213-1217 (2001).

260. Suva D, Garavaglia G, Menetrey J, Chapuis B, Hoffmeyer P, Bemheim L, and Kindler V. Non-haematopoietic human bone marrow contains long-lasting pluripotential mesenchymal stem cells. J Cell Physiol 198, 110-118 (2004).

261. Svensson, E.C. et al. Efficient and stable transduction of cardiomyocytes after intramyocardial injection or intracoronary perfusion with recombinant adeno-associated virus vectors. Circulation 99, 201-205 (1999).

262. Symes J., Losordo D., Vale P., et al. Gene therapy with vascular endothelial growth factjr for inoperable coronary artery disease. Ann. Thorac. Surg. 68,830-837 (1999).

263. Tai MH, Chang CC, Olson LK, and Trosko JE. Oct4 expression in adult human stem cells: evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis. Carcinogenesis 26, 495-502 (2005).

264. Takada T, Suzuki Y, Kondo Y, Kadota N, Kobayashi K, Nito S, Kimura H, and Torii R. Monkey embryonic stem cell lines expressing green fluorescent protein. Cell Transplant 11, 631-635 (2002).

265. Takahashi, T. et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat. Med. 5, 434-438 (1999).

266. Takeda Y, Mori T, Imabayashi H, Kiyono T, et al. Can the life span of human marrow stromal cells be prolonged by bmi-1, E6, E7, and/or telomerase without affecting cardiomyogenic differentiation? J Gene Med 6, 833-845 (2004).

267. Tavassoli M and Takahashi K. Morphological studies on longterm culture of marrow cells: characterization of the adherent stromal cells and their interactions inmaintaining the proliferation of hemopoietic stem cells. Am J Anat 164, 91-111 (1982).

268. Taylor DA, Atkins BZ, Hungspreugs P, Jones TR, Reedy MC, Hutcheson KA, Glower DD, and Kraus WE. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat Med 4: 929-933 (1998).

269. Thirumirti V., Shou M„ et al. Lack of efficacy of intravenous basic fibroblast growth factor in promoting myocardial angiognesis. J. Am. Coll. Cardiol. 31(Suppl 1), 54 (1998).

270. Theise ND, Nimmakayalu M, Gardner R, Illei PB, Morgan G, Teperman L, Henegariu O, and Krause DS. Liver from bone marrow in humans. Hepatology 32, 11-16(2000).

271. Thompson C., Nasseri B., Makower J., et al. Percutaneus transvenous cellular cardiomyoplasty. A novel nonsurgical approach for myocardial cell transplantation. J. Am. Coll. Cardiol. 41(11), 1964-1971 (2003).

272. Toma C., Pittenger M., Cahill K., et al. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocytes phenotype in the adult murine heart. Circulation 105, 93-98 (2002).

273. Thomson JA, Eldor JI, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, and Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147(1998).

274. Tripathy, S.K. et al. Long-term expression of erythropoietin in the systemic circulation of mice after intramuscular injection of a plasmid DNA vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10876-10880 (1996).

275. Trono, D. Lentiviral vectors: turning a deadly foe into a therapeutic agent. Gene Ther. 1, 20-23 (2000).

276. Uchida N and Weissman IL. Searching for hematopoietic stem cells: evidence that Thy-l.llo Lin-Sca-1 cells are the only stem cells in C57BL/Ka-Thy-11 bone marrow. J Exp Med 175, 175-184 (1992).

277. Unger E., Banai S., Shou M. et al. Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model. Am. J. Physiol. 266, H1588-1595 (1994).

278. Vasa M., Fichtcherer S., Adler K., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by ststin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation 103,2885-2890 (2001).

279. Villanueva, F.S. et al. Microbubbles targeted to intercellular adhesion molecule-1 bind to activated coronary artery endothelial cells. Circulation 98, 1-5 (1998).

280. Vincent, K.A. et al. Angiogenesis is induced in a rabbit model of hindlimb ischemia by naked DNA encoding an HIF-1 ex/VP 16 hybrid transcription factor. Circulation 102, 2255-2261 (2000).

281. Wagers AJ and Weissman IL. Plasticity of adult stem cells. Cell 116, 639-648 (2004).

282. Walder C., Errett C., Bunting S., et al. Vascular endothelial grjwth factor augments muscle blood flow and function in rabbit model of hindlimb ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 27, 91-98 (1996).

283. Wang JF, Yang Y, Wang G, Min J, Sullivan MF, Ping P, Xiao YF, and Morgan JP. Embryonic stem cells attenuate viral myocarditis in murine models. Cell Transplant 11, 753-758 (2002).

284. Wang JS., Shum-Tim D., Chedrawy E., et al. The coronary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration: pathophysiological and therapeutic implications. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 122(4), 699-705 (2001).

285. Watanabe E., Smith D., Sun J., et al. Effect of basic fibroblast growth factor on angiogenesis in the infarcted porcine heart. Basic Res. Cardiol. 93(1), 30-37 (1998).

286. Watanabe K, Abe H, Mishima T, Ogura G, and Suzuki T. Polyangitis overlap syndrome: a fatal case combined with adult Henoch-Schonlein purpura and polyarteritis nodosa. Pathol Int 53: 569-573 (2003).

287. Wickham, T.J. et al. Integrins and otyP5 promote adenovirus internalisation but not virus attachment. Cell 73, 309-319 (1993).

288. Weissman IL, Anderson DJ, and Gage F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annu Rev Cell Dev Biol 17, 387-403 (2001).

289. Weissman IL. The road ended up at stem cells. Immunol Rev 185,159-174 (2002).

290. Wenzel F, Dittrich M, Hescheler J, and Grote J. Hypoxia influences generation and propagation of electrical activity in embryonic cardiomyocyte clusters. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 132,111-115 (2002).

291. Wobus AM, Guan K, and Pich U. In vitro differentiation of embryonic stem cells and analysis of cellular phenotypes. MethodsMol Biol 158, 263-286 (2002).

292. Wright M., Wightman L., Lilley C., et al. In vivo myocardial gene transfer: optimization, evaluation and direct comparison of gene transfer vectors. Basic Res. Cardiol. 96(3), 227-236 (2001).

293. Xu, X., Weinstein, M., Li, C. & Deng, C. Fibroblast growth factor receptors (FGFRs) and their roles in limb development. Cell Tissue Res. 296, 33-43 (1999).

294. Yamada S, Nelson TJ, Crespo-Diaz RJ, Perez-Terzic C, Liu XK, Miki T, Seino S, Behfar A, Terzic A. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. Oct; 26(10):2644-53 (2008).

295. Yamamoto N., Kohmoto T., Roethy W., et al. Histological evidence that basic fibroblast growth factor enhances the angiogenic effects of transmyocardial laser revascularization. Basic Res. Cardiol. 95,55-63 (2000).

296. Yang Y, Min JY, Rana JS, Ke Q, Cai J, Chen Y, Morgan JP, and Xiao YF. VEGF enhances functional improvement of post-infarcted hearts by transplantation of ESC-differentiated cells. JApplPhysiol 93, 1140-1151 (2002).

297. Yang R., Thomas G., Bunting S., et al. Effects of vascular endothelial growht factor on hemodynamics and cardiac performance. J. Cardiovasc. Pharmacol. 27, 838-844(1996).

298. Yang, Y. et al. Cellular immunity to viral antigens limits El-deleted adenoviruses for gene therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4407-4411 (1994).

299. Yla-Hertuala, S. & Martin, J.F. Cardiovascular gene therapy. Lancet 355, 213-222 (2000).

300. Yokoyama SI., Fukuda N., Li Y., et al. A strategy injection of bone marrow mononuclear cells into the myocardium for the treatment of ischemic heart disease. 40(1), 24-34(2006).

301. Young, P.P., Hofling, A.A. & Sands, M.S. VEGF increases engraftment of bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs) into vasculature of newborn murine recipients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11951-11956 (2002).

302. Zhou X, Quann E, and Gallicano GI. Differentiation of nonbeating embryonic stem cells into beating cardiomyocytes is dependent on downregulation of PKC beta and zeta in concert with upregulation of PKC epsilon. Dev Biol 255, 407^122 (2003).

303. Zhang S, Wang D, Estrov Z, Raj S, Willerson JT, and Yeh ETH. Both cell fusion and transdifferentiation account for the transformation of human peripheral blood CD34-positive cells into cardiomyocytes in vivo. Circulation 110, 3803-3807(2004).

304. Zhang M, Methot D, Poppa V, Fujio Y, Walsh K, and Murry CE.Cardiomyocytegrafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. JMol Cell Cardiol 33, 907-921(2001).