Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Сравнительная оценка иммунологических изменений у пациентов, страдающих полипозным риносинуситом в процессе местного лечения мометазона фуроатом и фуросемидом, с учетом количества Т-регуляторных клето

На правах рукописи 005052184

Семенов Максим Валентинович

Сравнительная оценка иммунологических изменений у пациентов, страдающих полннозным риносинуситом в нроцессе местного лечения мометазона фуроатом и фуросемидом, с учетом количества Т-регуляторных клеток

14.03.09 — Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 АПР ¿013

Челябинск - 2013

005052184

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Зурочка Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ НИИКИ СО РАМН, Тюменский филиал, директор Суховей Юрий Геннадьевич

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздрава России, кафедра оперативной хирургии и топографической анатомии,

заведующий Чукичев Александр Викторович

Ведущая организация:

ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук» г. Пермь.

Защита диссертации состоится «18» апреля 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Автореферат разослан « 15» марта 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

Л.С. Латюшина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Изучение состояния иммунной системы и механизмов регуляции воспаления при различных видах патологии является важным разделом медицинской науки. Оценка взаимосвязей количественных и качественных показателей иммунитета позволяет более детально взглянуть на патофизиологию заболеваний, в том числе и полипозного риносинусита, склонного к частому рецидивирова-нию, и потому представляющего серьезную проблему для медицины (Мокро-носова М.А., 2011).

Полипозный риносинусит - системное иммунозависимое заболевание, проявляющееся в инфекционно-аллергическом воспалении слизистой оболочки носа и околоносовых пазух, приводящее к развитию гиперплазии слизистой оболочки с образованием полипов, характеризующееся непрерывным рецидивирующим течением, значительно снижающим качество жизни (Crampette L., et al. 2005; Мокроносова М.А., 2011).

Инфекционно-аллергическое воспаление слизистой оболочки носа и околоносовых пазух имеет весомую долю в структуре патологии. По данным Пор-тенко Г.М. с соавт. (1989) полипозный риносинусит был выявлен у 1,3% населения (Портенко Г.М., 1989). В последние годы отечественные оториноларингологи отмечают рост данного заболевания (Ланцов A.A., 1999; Лопатин A.C., 2003; Трофименко С.Л., 2010). Об увеличении распространенности полипозного риносинусита среди европейского населения свидетельствуют и исследования французских ученых (Crampette L., et al. 2005). По их данным частота встречаемости полипозного риносинусита составила 2,11%.

Несмотря на пристальный интерес к проблеме полипозного риносинусита, патогенез данного заболевания окончательно не раскрыт (Мокроносова М.А., 2011). До сих пор не ясны все механизмы иммунных реакций при развитии рецидивирующего течения воспаления тканей, в том числе слизистой оболочки носа и околоносовых пазух. Роль регуляторных Т-лимфоцитов в патоге-

незе полипозного риносинусита практически не изучалась. Между тем, эти клетки являются одним из наиболее чувствительных маркеров оценки регуляции различных видов воспаления, в том числе и хронического рецидивирующего (Seddon В., et al., 2000; Sakaguchi S., 2004; Wing К., et al., 2005). Показана весомая роль данных клеток в предотвращении различных воспалений при ревматоидном артрите, оофорите, гастрите, аутоиммунном тиреоидите, энцефаломиелите и т.д. (Sakaguchi S., 2004; Wang Z., 2006). Главным препятствием к их изучению в практической медицине является относительно высокая стоимость и сложность лабораторного исследования данного пула Т-лимфоцитов (Fritzsching В., et al., 2005; Lee S.H., et al., 2005).

В последние годы для более точной оценки уровня регуляторных Т-лимфоцитов предложено использовать удобный и экономичный метод многоцветного анализа и многоэтапное «гейтирование» в проточной цитометрии с использованием следующего набора моноклональных антител CD45/CD4/CD25/CD127 (Хайдуков C.B., Зурочка. А.В., 2008). Применение данного метода идентификации Т-регуляторных клеток позволило существенно расширить представление об их роли в патогенезе иммунного воспаления при различных патологических состояниях: бронхиальная астма и аллергический ринит, онкозаболевания и ВИЧ (Хайдуков C.B., Зурочка. А.В., 2011). Несмотря на довольно активное использование данной технологии в диагностике им-мунодефицитных состояний, необходимо отметить, что изучение уровня Т-регуляторных лимфоцитов при инфекционно-аллергическом воспалении слизистой оболочки носа и околоносовых пазух не проводилось. Между тем, внедрение этого малозатратного и менее трудоемкого способа определения уровня Т-регуляторных клеток позволило бы не только изучить их иммунопатогенетиче-скую роль в развитии рецидивирующего течения полипозного риносинусита, но и оценить возможность использования данного критерия для оценки эффективности лечения данной патологии, что и стало целью настоящего исследования.

Цель исследования

Определить значение исследования иммунной системы, в том числе уровня Т-регуляторных клеток, для оценки иммунного статуса пациентов, страдающих полипозным риносинуситом и контроля эффективности противо-рецидивной терапии.

Задачи исследования

1) Провести клинико- лабораторную оценку состояния иммунной системы у больных полипозным риносинуситом.

2) Изучить уровень Т-регуляторных лимфоцитов у больных с полипозным риносинуситом и у пациентов, страдающих затруднениями носового дыхания невоспалительного генеза.

3) Определить значение исследования уровня Т-регуляторных клеток по мембранным рецепторам для диагностики активности воспаления и оценки эффективности противорецидивной терапии полипозного риносинусита.

4) Провести сравнительную оценку клинико-иммунологической эффективности интраназальных инстилляций фуросемида и топических глюко-кортикостероидов в комплексном лечении полипозного риносинусита.

Научная новизна

Впервые при оценке иммунного статуса пациентов, страдающих полипозным риносинуситом проведено исследование уровня регуляторных Т-лимфоцитов путем многоцветного анализа и многоэтапное «гейтирование» в проточной цитометрии по мембранным рецепторам. Проведена комплексная оценка системного иммунитета у больных полипозным риносинуситом на разных этапах применения различных противорецидивных схем. При этом показано, что развитие полипозного риносинусита сопровождается не только снижением уровня Т-лимфоцитов и активированных Т- хелперов, Т-регуляторных клеток, но и увеличением числа ЫК клеток и Т-цитотоксических лимфоцитов. При этом уровень Т-регуляторных клеток отражает активность тканевого вое-

паления в слизистой оболочке носа и околоносовых пазух. Полученные результаты расширяют представления о роли иммунной системы, в частности Т-регуляторных лимфоцитов, в патогенезе полипозного риносинусита.

При изучении влияния топических методов терапии на иммунный статус пациентов с полипозным риносинуситом было впервые выявлено системное модулирующее действие интраназальных инстилляций фуросемида, характеризующееся повышением уровня Т-лимфоцитов, активированных Т- хелперов, Т-регуляторных лимфоцитов,плазменного и снижением №С- и Т-]ЧК-

лимфоцитов, а также среднего корпускулярного объёма гемоглобина.

Проанализировано системное иммуномодулирующее влияние топических глюкокортикостероидов, в результате чего выявлено что интраназальное применение данных препаратов оказывают модулирующее воздействие на системный иммунитет, выражающееся в повышении спонтанного НСТ-теста, уровня Т-лимфоцитов, Т-регуляторных клеток, активированных Т-лимфоцитов и активированных Т-хелперов и снижении уровней КГК- и Т-ЫК-лимфоцитов.

Теоретическая и практическая значимость

Применение многоцветного анализа и многоэтапного «гейтирования» с использованием набора моноклональных антител - С045/С04/С025/С0127 позволяет достаточно точно оценить состояние клеточного пула Т-регуляторных лимфоцитов. Низкий уровень этих клеток свидетельствует о высокой активности воспаления слизистой оболочки носа и околоносовых пазух. По мере стихания воспаления, количество Т-регуляторных лимфоцитов повышается.

Изучение уровня Т- регуляторных лимфоцитов с помощью многоцветного анализа и многоэтапного «гейтирования» в проточной цитометрии может быть использовано как в фундаментальных исследованиях, так и в практической медицине в качестве лабораторного критерия эффективности терапии при полипозном риносинусите. Выявлено системное иммуномодулирующее действие интраназальных инстилляций фуросемида, выражающееся в повышении уровня Т-лимфоцитов, активированных Т-хелперов, Т-регуляторных лимфоци-

тов, иммуноглобулина класса А и снижении NK- и T-NK-лимфоцитов, а также среднего корпускулярного объёма гемоглобина. Также, выявлено системное иммуномодулирующее влияние топической терапии интраназальными глюко-кортикостероидами, проявляющееся повышением спонтанного НСТ-теста, уровня Т- лимфоцитов, Т-регуляторных клеток, активированных Т-лимфоцитов и активированных Т- хелперов, и снижением уровней NK- и T-NK- лимфоцитов.

Метод интраназальных инсталляций фуросемида по своей клинико-иммунологической эффективности сопоставим с топической глюкокортикосте-роидной терапией. При этом его безопасность и экономичность позволяет считать данный метод предпочтительным.

Определение уровня Т-регуляторных лимфоцитов по набору мембранных рецепторов CD4+CD25+CD127dlm"to"neg может служить не только лабораторным критерием активности полипозного риносинусита, оценки эффективности противовоспалительной терапии, но и средством мониторирования состояния больного с целью профилактики рецидивов. Выявление у пациента сниженного уровня Т-регуляторных лимфоцитов в динамике заболевания позволяет отнести его к группе риска рецидива.

Положения, выносимые на защиту

1) Иммунологические изменения у пациентов, страдающих полипо-зным риносинуситом, характеризуются снижением уровня активированных Т-лимфоцитов и Т- хелперов, Т- регуляторных клеток, а также увеличением числа NK-клеток и Т-цитотоксических лимфоцитов.

2) Уровень Т-регуляторных клеток является высокочувствительным лабораторным критерием активности тканевого воспаления слизистой оболочки носа и околоносовых пазух и контроля эффективности терапии.

3) Интраназальное применение глюкокортикостероидов у больных полипозным риносинуситом оказывает модулирующее воздействие на системный иммунитет , вызывая, с одной стороны повышение спонтанного HCT-

теста, уровня Т-лимфоцитов, Т-регуляторных клеток, активированных Т-лимфоцитов и активированных Т-хелперов, а с другой - снижение 1ЧК- и Т-МС-лимфоцитов.

4) Интраназальные инсталляции фуросемида у больных полипозным риносинуситом оказывают модулирующее воздействие на системный иммунитет, вызывая повышение уровня Т-лимфоцитов, активированных Т-хелперов, Т-регуляторных лимфоцитов, иммуноглобулина класса А и снижение ЫК- и Т-МС-лимфоцитов, а также среднего корпускулярного объёма гемоглобина.

5) Применение интраназальных инсталляций фуросемида в комплексном лечении полипозного риносинусита является безопасной и экономически более целесообразной альтернативой топической глюкокортикостероидной терапии, сопоставимой по клинико-иммунологической эффективности при коррекции воспаления слизистой оболочки носа и околоносовых пазух.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику работы отделения оториноларингологии ГБУЗ ЧОКБ, в учебный процесс кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики и кафедры оториноларингологии ГБОУ ВПО Чел ГМА Минздрава России.

Апробация работы

Основные положения работы были доложены на IX Съезде иммунологов Урала (Челябинск, 2011), XV Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт - Петербурге» (Санкт - Петербург, 2011). Апробация состоялась на совместном заседании НИИ иммунологии, кафедры биологии, кафедры микробиологии вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ЧелГМАпротокол №6/1 от 08 ноября 2012г.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографии. Работа иллюстрирована 10 рисунками, 15 таблицами. Список литературы включает 174 литературных источника, в том числе 21 на русском и 153 на иностранных языках.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 7 в журналах, включенных в перечень ведущих научных рецензируемых журналов и изданий, утвержденный ВАК РФ.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Базой для проведения настоящего исследования явилось отделение оториноларингологии Челябинской областной клинической больницы, иммунологические исследования произведены в лаборатории иммунологии воспаления ФБГУН РАН Институт иммунологии и физиологии УРО РАН.

Объектом исследования были выбраны 37 пациентов, находившиеся на стационарном лечении в отделении оториноларингологии Челябинской областной клинической больницы, госпитализированные с диагнозом полипозный риносинусит (ПР) для хирургического лечения. Группу контроля составили 18 добровольцев с затруднениями носового дыхания вследствие невоспалительных причин (анатомических препятствий). Были определены критерии включения и критерии исключения:

Критерии включения:

1) двусторонний ПР с преимущественным поражением решетчатого лабиринта;

2) возраст пациентов от 18 до 60 лет;

3) информированное добровольное согласие пациента на участие в исследовании.

Критерии исключения:

1) наличие генетической патологии (муковисцидоз, синдром Кар-тагенера и др.);

2) наличие подтвержденного Синдрома Чарга — Стосса;

3) прием салицилатов, гормонов системно, антибиотиков в течение 6 месяцев до начала исследования;

4) возраст младше 18 и старше 60 лет;

5) наличие онкозаболеваний;

6) односторонние или преимущественно односторонние процессы, антрохоанальные солитарные полипы, преимущественное поражение верхнечелюстных пазух.

Все пациенты подлежали оперативному лечению методом функциональной эндоскопической операции на околоносовых пазухах. Произведена рандо-минизация пациентов методом генерации случайных чисел на 2 группы. В первой группе через 3 недели после операции пациенты в качестве противореци-дивной терапии получали мометазона фуроат 400 мкгр. в сутки в 2 приема ин-траназально в течение 6 месяцев. Пациенты 2 группы, начиная с 3 недели после операции получали интраназальные инсталляции фуросемида 500 мкгр в каждую половину носа 2 раза в день в течение 6 месяцев.

Материалы исследования включали: карты обследования иммунологических больных, клиническое наблюдение за пациентами, показатели иммуно-граммы, уровень Т-регуляторных лимфоцитов.

Периодом исследования выбраны пять лет: 2006 - 2011 гг.

Общее количество лейкоцитов и соотношения субпопуляций проводили методом проточной цитометрии с использованием одноплатформенной технологии с помощью гетерогенного гейтирования по панлейкоцитарному маркеру СБ45+. Производили ежедневный внутрилабораторный контроль качества посредством аттестованных контрольных материалов с известными значениями.

Исследование внутриклеточного кислородзависимого метаболизма проводили при помощи НСТ-теста. Метод основан на учете интенсивности восстановления клетками нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму - ди-формазан, происходящую в результате респираторного взрыва (Маянский А.Н. Виксман М.Е.1979). Исследование производили в 2 этапа: определение спонтанного НСТ-теста и индуцированного НСТ-теста, т.е. способность нейтрофи-лов крови отвечать повышением метаболической активности на стимуляцию частицами латекса. Изучение способности нейтрофилов крови к захвату частиц проводили на модели поглощения частиц латекса.

Изучение иммуноглобулинов класса A, M и G, С1-ингибитора (СЗа, С5а компонентам) в сыворотке крови производили с использованием «сэндвич» — варианта твердофазного иммуноферментного анализа с помощью мышиных моноклональных антител к общему Ig G (Ig A, Ig M) с пероксидазой хрена.

Т- reg клетки определялись по рецепторам CD 4; CD25; CD 127. Фенотип T-reg лимфоцита был определен как CD3+CD4+CD25+CD127dim"to neg FOXP3+. Исходя из этого, детекцию регуляторных Т-лимфоцитов мы осуществляли по данному фенотипу без выявления FOXP3. Для более точной локализации T-reg клеток был использован многоцветный анализ и многоэтапное «гейтирование» (рис.1) с использованием следующего набора моноклональных антител -CD45/CD4/CD25/CD127. (Хайдуков, C.B. с соавт. 2011).

Результаты обработаны общепринятыми методами дескриптивной статистики и выражены в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (m), М±ш. Статистически значимые различия определялись с использованием критериев непараметрической статистики: Манна-Уитни (U), непараметрического критерия Wilcoxon для связанных выборок. Применялись двусторонние критерии, различия считали значимыми при Р <0,05. Статистические взаимосвязи изучались при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (rs) и Кен-деллу (rk). Для обработки результатов исследования использован пакет прикладных программ Statistica 6.0 for Windows.

1<P-i1

104 _

104

>л :

о

а.

■л 104

сч О О

10°-

С4

10° 10' 10г 10® CD127-PE

10° 10' 102 10' CD4-PC7

Рис. 1. Многоэтапное гейтирование при анализе T-reg клеток в периферической крови. А - гистограмма распределения CD127 и CD25 после одновременного гейтирования по CD4 и CD45. В зоне Е находятся регуляторные клетки. Б - гистограмма распределения CD4 и CD25 после гейтирования только по CD45. Черные точки - T-reg клетки.

Результаты исследования и их обсуждение

Исходя из проведенных наблюдений и литературных данных, наиболее часто у пациентов страдающих полипозным риносинуситом выявлен бронхооб-структивный синдром, непереносимость нестероидных противовоспалительных средств. В наблюдаемых группах пациентов были выявлены: бронхообструк-тивные явления у 55% пациентов, непереносимость нестероидных противовоспалительных средств у 32%. Также были выявлены полипозный риносинусит у близких родственников в 30% случаев, бронхообструктивные заболевания у 12% при отсутствии соответствующих жалоб у пациента, различные виды аллергии у родственников 38%, что указывает на наличие в патогенезе данного заболевания наследственной предрасположенности.

В результате исследования выявлен ряд иммунологических отличий пациентов, страдающих ПР в сравнении с условно здоровыми людьми.

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1

Иммунологические особенности пациентов, страдающих полипозным риносину-

ситом

Показатель Статистический показатель Контроль (п=18) Больные ПР (п=37) Р

Эозинофилы (%) М±ш 2,83±3,90 5,87+6,10 >0,05

Т-цитотоксические, х10б/л. М±ш 475,60±37,10 643,00±61,40 <0,025

>ПС-лимфоциты, х106/л. М±ш 268,70±31,50 420,00±62,10 <0,05

Т-лимфоциты (поздняя активация) (%) М±ш 11,94±3,02 4,36±0,42 <0,025

Т-лимфоциты (поздняя активация) х106/л. М±ш 224,5 0±52,40 98,80±10,20 <0,05

Активированные Т-хелперы (%) М±ш 3,24±0,61 1,63±0,18 <0,025

Активированные Т-хелперы х106/л. М±ш 56,00±12,17 28,70±4,21 <0,05

Т-регуляторные клетки (%) М±ш 10,00±3,11 2,19±0,27 <0,05

Т-регуляторные клетки х106/л. М±т 154,50±50,70 46,20±7,29 <0,05

Подписи к таблице: М - средняя арифметическая, т - стандартная ошибка средней,

р - вероятность ошибки (отмечено при р менее 0,05 - статистически значимые отличия между группами больных ПР и условно здоровых лиц ).

Таким образом, полученные в ходе исследования иммунного статуса больных с полипозным риносинуситом, позволяют сделать ряд суждений:

1. В реализации иммуновоспалительной реакции, развивающейся при ПР, ведущая роль принадлежит эозинофилам, регуляторным и эффекторным Т-лимфоцитам.

2. Высокий уровень в крови эозинофилов, наблюдаемый у больных с ПР, вероятнее всего связан с включением этих клеток в процесс элиминации внутриклеточно расположенного возбудителя. Учитывая, что у 96% больных хроническим риносинуситом в содержимом ОНП выявляются эозинофилы, мигрирующие сюда из слизистой оболочки и образующие кластеры вокруг

грибковых элементов, то рост этих клеток крови в определенной мере подтверждает микотическую теорию происхождения данной патологии. Наблюдаемая эозинофилия может считаться одним из основных диагностических лабораторных критериев ПР.

3. Снижение уровня Т-ге§ клеток, определяемый с помощью набора мембранных маркеров С04+С025+сш2711|т'">г":8, у больных с ПР указывает на неконтролируемое воспаление, сопровождающееся активизацией аутоагрессив-ных механизмов. Это позволяет выдвинуть гипотезу о сходности механизма иммунопатогенеза ПР и аутоиммунных заболеваний. И в том и в другом случае имеет место снижение аутотолерантности, реализуемой посредством Т-ге§ лимфоцитов.

4. Рост уровня Т-цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров при развитии ПР обусловлен нарушением контроля силы и продолжительности иммунного ответа со стороны Т-регуляторных лимфоцитов. Появление большого количества Т-киллеров усиливает киллинг, что вызывает повреждение не только зараженных клеток, но и ведет к повреждению собственных тканей.

5. Длительно текущее воспаление при ПР приводит к снижению уровня активированных Т-лимфоцитов (СБЗ+НЬА О Я) и активированных хелперных Т-клеток (С04+С025+С0127+), что указывает на истощение Т-лимфоцитарного пула и прогрессирование иммунной недостаточности.

6. В целом, рассматривая общий иммунологический профиль патологии, полипозный риносинусит можно охарактеризовать как неконтролируемое воспаление слизистых оболочек носа с выраженной киллинговой активностью Т-лимфоцитарного звена клеточного иммунитета и значительным истощением активированных Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-регуляторных клеток, возникающих на фоне длительного вялотекущего воспалительного процесса.

Получены данные о состоянии иммунной системы пациентов, получающих различные виды противорецидивной терапии.

Изучено состояние иммунной системы у пациентов, получающих в качестве противорецидивного лечения интраназальные глюкокортикостероиды

(ИНГКС) - мометазона фуроат, 400 мкгр в сутки в 2 приема в течение 6 месяцев. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2

Иммунологические изменения у пациентов на фоне противорецидивной терапии

ИНГКС

Показатель Статистический показатель Иммунологические показатели пациентов Р

до лечения (п=18) пролеченные мометазона фуроатом (п=18)

Эозинофилы (%) М±ш 5,87+6,10 4,27±5,20 >0,05

Т-лимфоциты (%) М±ш 69,30+1,71 81,70+2,00 <0,025

Т-Ж-лимфоциты х106/л М±ш 137,00+19,00 71,00±21,78 <0,05

ЫК-лимфоциты (%) М±ш 16,90±1,70 8,35±1,52 <0,025

Т-лимфоциты (поздняя активация) х106/л М±ш 4,36±0,42 8,30+1,73 <0,025

Т-регуляторные клетки (%) М±т 2,19±0,27 9,72+3,80 <0,05

Т-регуляторные клетки х106/л М±т 46,20+7,29 81,49+14,30 <0,05

Подписи к таблице: М - средняя арифметическая, т - стандартная ошибка средней,

р - вероятность ошибки (отмечено при р менее 0,05 - статистически значимые отличия между группами больных до лечения и после лечения мометазона фуроатом 400мкгр в сутки в течение 6 месяцев).

Анализируя характер изменений в иммунном статусе пациентов с ПР после применения топического глюкокортикостероида - мометазона фуроата, необходимо отметить следующее:

1. Интраназальное орошение полости носа мометазона фуроатом оказывают не только местное, но и общее воздействие на организм, в том числе и на иммунную систему пациентов с ПР.

2. Препарат обладает иммуномодулирующим действием: с одной стороны он увеличивает количество Т-лимфоцитов, активированных Т-лимфоцитов (поздняя активация) и Т-регуляторных клеток, а с другой - снижает уровень Т-цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров. Благодаря уменьшению нагрузки на Т-звено иммунитета и уменьшается его киллинговая актив-

ность. Такой иммунокорригирующей эффект, вероятнее всего, связан со способностью мометазона фуроата замедлять процесс образования и освобождения воспалительных медиаторов (интерлейкин-1, интерлейкин-6, фактор некроза опухоли и др.).

3. Высокая степень отклика Т-ге§ лимфоцитов при топическом воздействии на слизистую носа позволяет использовать этот показатель как критерий иммунотерапевтической эффективности мометазона фуроата.

Были исследованы иммунологические особенности пациентов, страдающих полипозным риносинуситом, получающих в качестве противорецидивного лечения фуросемид интраназально в виде спрея 500 мкгр 2 раза в день, в течение 6 месяцев. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Таблица 3

Иммунологические изменения у пациентов, страдающих полипозным риносину-

ситом на фоне лечения фуросемидом

Показатель Статистический показатель Иммунологические показатели пациентов Р

до лечения (п=19) Пролеченные фуросемидом (п=19)

Средний корпускулярный объем НЬ(пг) М±ш 29,00+0,85 26,44+0,61 <0,01

Средняя концентрация корпускулярного НЬ(г/л) М±ш 337,90+2,96 307,00+4,20 <0,001

Т-лимфоциты (%) М±ш 69,30+1,71 76,67+1,66 <0,01

Т-МС-лимфоциты х106/л М±ш 137,00+19,00 42,35+9,36 <0,01

^НС-лимфоциты (%) М±т 16,90+1,70 11,45+0,99 <0,25

Активированные Т-хелперы х106/л М+т 28,70+4,21 90,92+27,07 <0,025

Т-регулятторные клетки (%) М±т 2,19+0,27 7,08+2,28 <0,05

Т-регуляторные клетки х10б/л. М±т 46,20+7,29 154,00+50,10 <0,05

^А общий (г/л) М±т 2,45+0,21 3,95+0,29 <0,001

Подписи к таблице: М — средняя арифметическая, ш - стандартная ошибка средней,

р - вероятность ошибки (отмечено при р менее 0,05 - статистически значимые отличия между группами больных до лечения и после лечения фуросемидом 500 мкгр. 2 раза в сутки, интраназально в течение 6 месяцев).

Таким образом, как и в случае с топическими стероидными гормонами, местная терапия фуросемидом оказывает иммуномодулирующее действие, в первую очередь, на Т-иммунитет пациентов с полипозным риносинуситом, которое характеризуется следующим:

1. Нормализацией уровней Т-лимфоцитов (активированных Т-хелперных лимфоцитов (С04+СБ25+СВ127+) и Т-регуляторных клеток);

2. Снижением киллерной активности за счет падения числа Т-1ЧК лимфоцитов и натуральных киллеров;

3. Повышением уровня сывороточных иммуноглобулинов класса А.

4. Наблюдаемые иммунотропные эффекты могут быть связаны как с местным противоотечным механизмом действия фуросемида, так и с его общим диуретическим воздействием на водно-электролитный обмен, о чем свидетельствовало достоверное снижение показателей корпускулярного гемоглобина.

5. Наиболее оптимальным и точным критерием оценки иммунотерапев-тической активности местного применения фуросемида является определение уровня Т-ге§ лимфоцитов крови.

При анализе клинической эффективности изучаемых схем противореци-дивного лечения критериями были выбраны: количество дней до рецидива, рецидивом считали повторную операцию и оценку качества дыхания по визуально-аналоговой шкале Вгаппап М.О., (1996). Статистически значимых отличий в клинической эффективности препаратов не получено (таб. 4; рис. 2). На фоне топической терапии ПР мометазона фуроатом и фуросемидом отмечается четкая тенденция к увеличению продолжительность ремиссии, которая независимо от вида препарата возрастала почти в 2 раза.

Качество носового дыхания по визуально-аналоговой шкале

До лечения фуросемид ИНГКС

Рисунок 2. Качество носового дыхания пациентов до лечения и спустя 6 месяцев после начала терапии фуросемидом либо мометазона фуроатом.

Таблица 4

Сравнительная характеристика клинической эффективности противорецидивных схем

Показатель Стати-стичекие показатели Контроль* п=74 Больные ПР, получившие Р

ИНГКС (п=18) Фуросемид (п=19)

Количество дней до рецидива М±т 485±161 892±262 878±243 Р[>0,05 Р2>0,05 Р3>0,05

Примечание: * Контрольная группа по данным литературы Б. 1апШ-А1апко е1 а1. (1995).

Поскольку все больные с ПР, поступающие в клинику, получали проти-ворецидивную топическую терапию, то в качестве контроля мы использовали данные, полученные Б. 1апШ-А1апко с соавт. (1995), которые изучили продолжительность ремиссии у пациентов с ПР, леченных без применения интрана-зальных инстилляций мометазона фуроатом и фуросемидом.

Уровень Т-регуляторных лимфоцитов, исходно сниженный у больных ПР, увеличивался после лечения, как при лечении ИНГКС, так и при применении фуросемида. Увеличение происходило до уровня статистически не отличи-

мого от группы пациентов, страдающих затруднением носового дыхания, в следствие невоспалительных причин (рис. 3).

Уровень Т-регуляторных клеток

9,70

контроль больные фуросемид ИНГКС

Рисунок 3. Сравнительные уровени Т - reg лимфоцитов у больных ПР

р^ - вероятность ошибки (отмечено при р менее 0,05 - статистически значимые отличия между группами больных ПР и условно здоровых лиц ).

p2j3 - тоже при сравнении групп больных ПР до лечения и пролеченных фуросемидом; Р2.4 - тоже при сравнении групп больных ПР до лечения и пролеченных мометазона фуроа-

Таким образом пациенты, страдающие ПР, в иммунологическом отношении демонстрируют признаки длительной истощающей нагрузки на систему иммунитета, приводящей к «раздражению» иммунитета, проявляющуюся в увеличении числа киллерных клеток. Из всех исследованных нами признаков заболевания наиболее показательным является уровень T-reg лимфоцитов (рис 3.), измеренный по мембранным маркерам CD4+ CD25f CD 127d"7Mo"ne8. Применение различных схем противорецидивной терапии показало идентичные иммунологические изменения как при использовании ИНГКС, так и фуросемида: увеличивается уровень Т- лимфоцитов, снижается количество Т- цитотоксиче-ских, натуральных киллеров, нормализуется уровень активированных Т-лимфоцитов хелперов. При этом, все вышеуказанные показатели изменяются разнонаправлено при различных схемах, только уровень Т - регуляторных клеток реагирует однонаправлено и статистически значимо. Указанные изменения говорят об уменьшении напряженности механизмов воспаления на фоне лечения локального очага воспаления. Нормализация показателей при топическом

лечении указывает на патогенетический приоритет локального очага, в развитии системных иммунологических нарушений, а не наоборот. Данные сведения могут быть использованы для подтверждения стафилококковой, вирусной или микотической теорий, как имеющих центральным звеном патогенеза инвазию патогена в слизистые оболочки дыхательных путей, а не нарушения системного иммунного статуса пациентов.

В процессе исследования было выяснено, что у пациентов, страдающих ПР происходит истощение пула активированных Т-лимфоцитов(СБЗ+ НЬА ОЯ+), активированных Т- лимфоцитов хелперов(С04+ СБ25+ СБ127+), и увеличении кшшерных сил (Т-лимфоцитов киллеров и МК-клеток).

Снижение уровня активированных Т-лимфоцитов указывает на проявление иммунодефицитного состояния. Статистически значимые различия получены в определении количества регуляторных Т-лимфоцитов.

Уровень Т-ге§ лимфоцитов достоверно снижен у больных ПР, при этом, данное повышение связано не с нарушениями носового дыхания, как можно заключить, исходя из нормального уровня данных клеток у лиц контрольной группы, имеющих затруднения носового дыхания ввиду невоспалительных причин. В соответствии с вышесказанным, выявляется взаимосвязь уровня Т-ге§ клеток у пациентов страдающих ПР именно с выраженностью воспалительной реакции. Назначение противорецидивной терапии изменяет уровень регуляторных Т-лимфоцитов, соответственно последний может выступать достоверным лабораторным критерием её эффективности.

Выводы

1. Иммунологические изменения у пациентов, страдающих полипозным риносинуситом, характеризуются снижением уровня активированных Т-лимфоцитов и Т - хелперов, Т-регуляторных клеток, а также увеличением числа ]чГК клеток и Т-цитотоксических лимфоцитов.

2. Выявление уровня Т-регуляторных лимфоцитов по мембранным рецепторам СБ4+С025 +С 0127ётИо",1С8 является более чувствительным методом в сравнении с определением количества эозинофильных гранулоцитов периферической крови для контроля выраженности воспаления и эффективности проводимой терапии.

3. Комбинированная терапия, включающая интраназальные глюкокорти-костероиды обладает иммуномодулирующим действием, приводя с одной стороны к повышению спонтанного НСТ-теста, уровня Т-лимфоцитов, Т- регуля-торных клеток, активированных Т- лимфоцитов и активированных Т- хелперов, а с другой - к снижению КК- и Т-ЫК-лимфоцитов.

4. Комбинированная терапия, включающая интраназальные инсталляции фуросемида, демонстрирует иммуномодулирующую активность в виде повышения уровня Т -лимфоцитов, активированных Т-хелперов, Т-регуляторных лимфоцитов, иммуноглобулина класса А и снижения ТМК- и Т-ЫК-лимфоцитов, а также среднего корпускулярного объёма гемоглобина, показывая высокую противовоспалительную активность такого способа применения фуросемида.

5. Клинико-иммунологическая эффективность интраназальных инсталляций фуросемида не имеет статистически значимых отличий от топического применения мометазона фуроата.

Практические рекомендации

1) При диагностике ПР необходимо исследование уровня Т-регуляторных лимфоцитов по набору мембранных рецепторов С04+С025+С0127с||т"">п':в с целью выявления интенсивности воспаления и контроля эффективности противорецидивной терапии.

2) Применение мометазона фуроата оказывает системное иммуномо-дулирующее действие и может быть рекомендовано у больных полипозным ри-носинуситом в объеме 400 мкгр в сутки в 2 приема на протяжении 6 месяцев.

3) Применение интраназальных инстилляций фуросемида оказывает иммуномодулирующее действие, и может быть рекомендовано у больных полипозным риносинуситом в объеме 500 мкгр 2 раза в сутки на протяжении 6 месяцев.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Зурочка, А. В. Изучение параметров иммунной системы и уровней Т-регуляторных клеток у пациентов, страдающих полипозным риносинуситом / А. В. Зурочка, М. В. Семенов, В. А. Зурочка, С. В. Хайдуков // Российский иммунологический журнал. — 2011. — Т. 5 (14), № 3—4. — С. 280285.

2) Семенов, М. В. Изменение количества Т-регуляторных клеток у больных полипозным риносинуситом, получающих противорециднвное лечение ннтраназальными инсталляциями фуросемида / М. В. Семенов, А. В. Зурочка, В. А. Зурочка // Вестник Уральск, мед. академ. науки. - 2011. -№ 2/2, (35). - С. 63.

3) Семенов, М. В. Исследование активности Т-регуляторных клеток у больных полипозным риносинуситом, получающих противорециднвное лечение топическими назальными стероидами / М. В. Семенов, А.

B. Зурочка, В. А. Зурочка, С. В. Хайдуков // Мед. иммунология. - 2011. - Т. 13, №4-5.-С. 532.

4) Семенов, М. В. Определение уровня Т-рег клеток у больных полипозным риносинуситом / М. В. Семенов, А. В. Зурочка, В. А. Зурочка // Мед. иммунология. - 2011. - Т. 13, № 4-5. - С. 489.

5) Семенов, М. В. Состояние иммунной системы и регуляторных Т-клеток у пациентов с полипозным риносинуситом до и после лечения назальными кортикостероидами и фуросемидом / М. В. Семенов // Вестник Уральск, мед. академ. науки. - 2011. - № 4/1 (38). - С. 150.

6) Семенов, М. В. Изучение влияния топических стероидов и фуросемида на состояние иммунной системы больных полипозным риносинуситом / М. В. Семенов // Вестник уральской мед. академ. науки. - 2012. -№ 2 (39). - С. 30.

7) Семенов, М. В. Регуляция аутоагрессии у больных полипозным риносинуситом, сопровождающимся гиперэозинофилией на фоне противо-рецидивного лечения ннтраназальными инсталляциями топических стероидов / М. В. Семенов // Российская оториноларингология. - 2012. - № 1. -

C. 152.

Список сокращений

ИНГКС - интраназапьные глюкокортикостероиды НСТ - нитро-синий тетеразоль ОНП - околоносовые пазухи ПР - полипозный риносинусит

CD - (Cluster of Differentiation) кластер дифференцировки

Hb - (Hemoglobin) гемоглобин

NK - (Natural killer) натуральные киллеры

T-reg клетки (лимфоциты) -{Regulatory) регуляторные Т-лимфоциты.

На правах рукописи

Семенов Максим Валентинович

Сравнительная оценка иммунологических изменений у пациентов, страдающих полипозным риносинуситом в процессе местного лечения мометазона фуроатом и фуросемидом, с учетом количества Т-регуляторных клеток

14.03.09 — Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2013

Отпечатано в ООО «Типография ВК». 454048, г. Челябинск, ул. Красная, 42; тел.: 727-74-50 Подписано к печати 14.03.2013г. Объем 1 п.л. Формат 64x90/16. Гарнитура «Times New Roman суг». Бумага для офисной техники, 80 мг/м2. Тираж 100 экз.