Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Синтез, структурные особенности и биологическая активность производных бетуленола

На правах рукописи

ІІГУЕІІ ВЛІІХЛЙ

СИНТЕЗ, СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ II БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОИЗВОДИЬІХ БЕТУЛЕНОЛА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

5 ДЕК 2013

Санкт-Петербург - 2013

005543138

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации на кафедре фармацевтической химии.

Научный руководитель: Абышев Азад Зиядович

доктор химических наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор

Официальные оппоненты: Белоусов Михаил Валерьевич

доктор фармацевтических наук, профессор, зав. кафедрой фармации ФПК и ППС ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России

Ивановская Елена Алексеевна

доктор фармацевтических наук, профессор, зав. кафедрой фармацевтической химии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2).

Защита диссертации состоится «26» декабря 2013 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 14, лит. А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197277, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей 14).

Автореферат разослан « 2-2- » ноября 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, Д 208.088.01,

кандидат фармацевтических наук,

доцент Марченко Наталья Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Одной из актуальных задач современной фармацевтической науки является поиск новых высокоэффективных лекарственных средств (ЛС), имеющих как природное, так и синтетическое происхождение. Тритерпены или тритерпеноиды составляют большую группу, включающую более 20 ООО широко распространенных в природе соединений. На основе природных и синтетических тритерпеноидов создан ряд современных ЛС, которые с успехом применяются в России и за рубежом для лечения различных заболеваний, например, фузидовая кислота, глицирризиновая кислота и ее различные производные. Более того, установлено, что многие вещества тритерпеновой природы обладают широким спектром биологического действия, сравнительно низкой токсичностью, многофункциональным механизмом действия п высокой доступностью получения.

Среди биологически активных тритерпеноидов, имеющих доступность в глобальном промышленном масштабе, следует указать производные бетуленола (бетулин, бетулинол), который является основным компонентом коры берёзы разных видов. Содержание бетуленола во внешней коре составляет до 35% от сухой массы, а в рафинированной отходной коре берёзы при деревообработке - до 24%. Данные литературы показывают, что бетуленол является уникальным родоначальником для получения биологически активных тритерпеноидов лупанового и олеананового ряда путем химической модификации. Среди синтезированных производных бетуленола обнаружены некоторые закономерности взаимосвязи «структура-активность», а именно, ацилирование бетуленола, бетуленоловой кислоты повышает биологическую активность и расширяет спектр действия (например, создание анти-ВИЧ препарата «Бевиримат»), конъюгирование их с другими биологически активными веществами даёт синергетический эффект.

В связи с этим, химическая модификация бетуленола является актуальным направлением в области создания новых высокоэффективных лекарственных средств (иммуномодуляторов, анти-ВИЧ препаратов), особенно, создание конъюгированных (гибридных) молекул, содержащих тритерпеноидные и кумариновые фрагменты, которые могут не только повысить биологический эффект, но и решить многие вопросы в фармацевтическом анализе ЛС группы тритерпеноидов. Кроме того, решающее значение для внедрения любого нового препарата в практику имеет нормативная документация, регламентирующая качество ЛС, в том числе, фармакопейная статья (ФС), фармакопейная статья предприятия (ФСП) для стандартизации новой разрабатываемой субстанции.

Цель исследования. Целью данной работы является синтез некоторых производных бетуленола, в том числе его конъюгатов с другими биологически активными соединениями,

изучение их физико-химических свойств, фармакологической активности, обоснование методик анализа исследуемых веществ и их валидации, а также стандартизации состава отобранных наиболее активных соединений. Задачи исследования

•> Осуществить синтез и анализ по структурным особенностям некоторых известных производных бетуленола, а также модифицировать технологию их получения.

♦♦♦ Осуществить синтез некоторых ранее неописанных производных бетуленола и его конъюгатов, установить их строение современными спектральными методами: ИК-, ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия, изучить их физические и физико-химические свойства.

Определить иммуномодулирующие и противовирусные свойства некоторых синтезированных производных бетуленола с целью выявления взаимосвязи «структура-активность».

❖ Разработать методики (ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ-МС) определения подлинности, посторонних примесей и количественного содержания в З-О-пропионате аллобетуленола (АН-12) и 3,28-ди-0-(7-метоксикумарин-4-ил)ацетате бетуленола (АН-32).

❖ Разработать стандартный образец (СО) на АН-12 и определить его показатели контроля качества, подготовить проекты фармакопейных статей на СО и субстанцию АН-12.

Научная новизна

❖ Впервые:

- синтезированы 4 неописанных в литературе производных бетуленола (АН-12, АН-13, АН-30 и АН-32), из которых АН-30 и АН-32 являются конъюгатами нового класса (тритерпеноид - кумарин). Изучены их физические, спектральные (ИК-, 'Н-, 13С-ЯМР-спектроскопические, масс-спектрометрические), и хроматографические (ТСХ, хромато-масс-спектрометрические, ВЭЖХ) свойства.

описаны электроспрей-масс-спектромегрические (ЭСИ-МС) особенности 12 тритерпеноидов - производных бетуленола, а также проведено полное отнесение сигналов спектров 13С-ЯМР в структуре 11 тритерпеноидов и определены пути фрагментации двух тритерпеноидов (АН-5 и АН-12).

- разработаны 6 новых методик синтеза для 4 известных производных бетуленола (АН-2, АН-5, АН-9, АН-20).

- разработан способ получения СО АН-12. Проведена стандартизация АН-12 по разделам подлинности, посторонних примесей и количественного определения спектральными и хроматографическими методами.

- установлены условия ВЭЖХ-анализа конъюгата АН-32, доказана линейность методики его определения.

•I* Впервые изучена иммуномодулирующая активность 5 производных бетуленола (АН-11, АН-12, АН-13, АН-30 и АП-32), из которых наиболее активными оказались АН-12 и АН-32.

Практическая значимость работы. Установлены способы определения подлинности всех синтезированных соединений и количественного определения содержания АН-12 и АН-32 методами ИК-, 'Н и С ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии и ВЭЖХ.

В итоге валидационной оценки установлена пригодность разработанных методик, которые отличаются высокой чувствительностью, отсутствием систематической погрешности и позволяют достаточно достоверно определять качество предлагаемых наиболее активных производных бетуленола.

По материалам исследования наиболее активных соединений АН-12 и АН-32 подана заявка в «Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам» о выдаче патента Российской Федерации на изобретение «Иммуномодулирующее средство на основе 3-0-пропионата аллобетуленола (19р,28-эпокси-18а-олеанан-ЗР-ил пропионат)» (Входящий № 044360, регистрационный № 2013129829 от 01.07.2013), в настоящее время получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы от 05.09.2013.

Разработаны проекты фармакопейных статей (ФС и ФСП) и пояснительные записки к ним на СО и субстанции АН-12.

Внедрение результатов в практику. Данные, полученные в процессе выполнения диссертационной работы по синтезу и анализу тритерпеноидов - производных бетуленола, используются в лекциях по фармацевтической химии по теме: «Природные и синтетические терпеноиды».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты эксперментальных исследований по синтезу и установлению структуры 19 соединений ряда бетуленола современными физико-химическими методами, в частности впервые синтезированных 4 производных бетуленола (АН-12, АН-13, АН-30, АН-32).

2. Результаты фармакологических исследований синтезированных соединений.

3. Результаты доказательства подлинности, посторонних примесей и количественного содержания синтезированных соединений АН-12 и АН-32 физико-химическими методами анализа и сравнительной оценки разработанных методик (ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ-МС).

4. Рекомендуемые нормы качества и проекты нормативных документов на АН-12.

Связь задач исследования с планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России в рамках одного из основных научных

направлений «Получение и изучение фармакологического действия биологически активных веществ (БАВ) с целью создания инновационных лекарственных средств» (номер государственной регистрации НИР: 01201252027).

Публикации

Основное содержание диссертации представлено в 13 публикациях, в том числе 1 заявка о выдаче патента РФ , 4 статьи в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованный ВАК РФ.

Апробация работы

Результаты работы представлены на Межвузовской научной конференции, посвященной 300-летию со дня рождения М.В. Ломоносова и 150-летию создания A.M. Бутлеровым теории химического строения органических соединений (Санкт-Петербург, 2011); Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации» (Пермь, 2011); Н-ой Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2012).

Личный вклад автора. Автору принадлежит основная роль в проведении эксперимента, аналитической и статистической обработке полученных результатов, их научном обосновании и обобщении. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до публикации результатов в научных изданиях и докладах. При проведении фармакологических исследований в сторонних организациях автор непосредственно формулировал цель и структуру проводимых экспериментов, принимал участие в постановке эксперимента, обсуждении и формулировке результатов экспериментов. В целом, степень участия автора в получении научных результатов работы составляет более 85%.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 2 и 3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 175 страницах машинописного текста, включает 60 таблиц, иллюстрирована 88 рисунками и состоит из введения, обзора литературы по теме исследования, главы «Материалы и методы

исследования», 3 глав собственных исследований, заключения, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы, списка таблиц и рисунков, приложений. Список литературы включает 192 источника, в том числе 144 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Синтез и изучение структуры тритерпеноидов-производных бетуленола В работе представлены результаты синтеза и анализа 19 производных бетуленола (табл. 1), Из них АН-12, АН-13, АН-30 и АН-32 являются неописанными в литературе соединениями. Кроме того, АН-30 и АН-32 представляют собой гибридные молекулы нового класса соединений «кумариновые тритерпеноиды» (или «трнтерпеновые кумарины»). Остальные 15 соединений являются известными тритерпеноидами, которые были синтезированы для сравнительного анализа их физико-химических и фармакологических свойств.

Таблица 1. Структура бетуленола и синтезированных производных

24 25 луненовый ряд КЧ У 2.3 ::4 і 8 Н а-олея я а к о» ы и ряд 30 » 23 А~яе<г-18Н«-олеаиеііовьш ряд

Название Я К' Название К Название

АН-! (бетуленол) ОН СН2-ОН АН-9 (аллобегуленол) ОН АН-20 (а-аі юалл обету ленол)

АН-) 0 он СН2-Яв АН-12 Кб

АII-И он СН2-Яб АН-17 Яв

АИ-15 он ПІ к.| АН-13 Яг

\H-19 Ка СНз-Иа АН-18 Ке

АН-5 Кб СН2-Кб АН-30 Кж

АН-7 Яв СН2-Яв Где: СН- ««- ос вб:т0-с-сн2-сн3 ноос IV -|-о-с-сн2-сн2-соон Кж._і.0.с.сн2 рг: -і-0-с-сн=сн-с00н ? ^ цис- |5 Т^ и о 4-/ снз

АII-4 Яг СН2-Яг

Ш-К Яе СН2-Яе

АН-32 Яж СН2-Яж

АН-2 =о СООН

АН-3 он СООН

АН-16 Яд СООН

1.1 Синтез известных производных бетуленола, их идентификация и изучение структурных особенностей

Синтезированные известные вещества полностью идентифицированы по температуре плавления, характеристике ТСХ, ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Были разработаны новые методики синтеза веществ АН-2, АН-5 (3 методики), АН-9 и АН-20. АН-2 (бетуленоновая кислота), в отличие от известных методов, была получена путем окисления бетуленола (АН-1) хрома (VI) оксидом в смеси этилацетата и уксусной кислоты. Синтез АН-5 (3,28-ди-О-пропионата бетуленола) был осуществлен из бетуленола при разных условиях: при кипячении (165-167°С) с пропионовым ангидридом без катализатора; при комнатной температуре в хлороформе и пиридине; при комнатной температуре в хлороформе с йодом. АН-9 (аллобетуленол) был получен реакцией изомеризации АН-1 при кипячении (61°С) в минимальном количестве хлороформа. Синтез АН-20 (а-апоаллобетуленола) был осуществлен одностадийно из АН-1 в кипящем хлороформе с использованием бензола в качестве азеотропно водоотнимающего реагента.

В процессе исследований по структурным особенностям показано, что введение ацильных групп в ЗР-ОН бетуленола приводит к сильному смещению химического сдвига (хим.сдвиг) На-3 (дд) от 3,19 до 4,49-4,76 м.д. Необходимо отметить, что Н|3-3 (в эпи-бетуленоле) имеет 8 = 3,47 м.д. в виде уширенного синглета (Sung T.V. et al., Phytochem., 1991, 30 (8), 2717-2720). При этом в зависимости от структуры и характера ацильной группы сигнал протонов На-3 сдвигается в более слабое поле с разной степенью. 13С хим.сдвиг С-3 бетуленола также заметно смещается в слабое поле после ацилирования. Аналогичная картина наблюдается и в случае производных олеананового ряда. Следует заметить, что сигналы С-3 и На-3 с одноименной З-О-ацильной группой в лупановом и олеанановом скелетах в соответствующих спектрах ЯМР имеют совершенно одинаковый хим.сдвиг (табл. 2).

Таблица 2. Влияние ацильных групп па сигналы ЯМР С-3 и На-3 тритерпеноидов

Заместитель Соединение L,C 5 (м.д.) Н сигнал Тип скелета тритерпеноидов

8 (м.д.) тип cm нала, КССВ (Гц)

-ОН Vil-l 78,95 3,19 дд, 7-11,29, 5,27 луп-

АН-9 78,89 3,20 дд, J= \ 1.04. 5,27 оле-

-ОСОСН2СН2СООН АН-7 81,56 4,49 дд, ./-8,53,7,53 луп-

АН-17 81,32 4,49 дд, ./=9,03, 7,28 оле-

-ОСОС6Н4-л-СООН VI1-8 82,98 4,76 дд, J=11,29, 4,27 луп-

АН-18 82,75 4,77 дд, /=11,54,4,77 оле-

Примечание: КССВ - константа спин-спинового взаимодействия, лун-: лупановый, оле-: 18На-олеанановый.

-СНг-группы исследуемых соединений представляют собой АБ-систему СС'В, т.е. протоны метиленовой группы являются магнитно неэквивалентными: На-28 (pro К) имеет хим.сдвиг при 3,33 м.д., а Нб-28 (pro S) - 3,80 м.д. в случае -CHi-OH. Замена в последней ОН-группы на

ацильную приводит к заметному смещению хим.сдвигов С-28 и 11-28 в более слабое поле, причем данное изменение зависит от природы ацильной группы (табл. 3).

Таблица 3. Влияние ацильных групп на сигналы ЯМР С-28 и Н-28 лупанового скелета

Заместитель Соединение <3С 5 (м.д.) 'Н й (м.д.), тип сигнала, КСС'В (Гц)

На-28 (рго Л) Нб-28 (рго Ї)

-ОН АН-1 60,47 "3,33 (д,./-10,79) 3,80 (д, У 10,79)

-ОСОСНз VI 1-І 9 62,8 3,86 (д,/ 11,04) 4,26 (д,./-10.79)

-ОСОСНзСН, \11-11 62,53 3,84 (д,./-10,79) 4,25 (д. ./-10,79)

АН-5 62,5 13,84 (д,,/ 10,79) 4,27 (д, У 10,79)

-ОСОСН2СН2СООН Л11-10 63,11 13,90 (л, >11,04) 4,31 (д../ 11,04)

АН-7 63.18 3,88 (д. і 11,04) 4,29 (д, >11,04)

-ОСОСН-СНСООН (/,¡«--форма) Л11-4 64,87 4,01 (д, 7=11,29) 4.44 (д, ,А= 1 1,04)

-ОСОС6Н4-и-СООН АН-8 64.54 4.12 (д. ./-11,04) 4,54 (д, >1 1.04)

Результаты анализа спектров ЯМР диацильных производных бетуленола показали, что

13С-сигналы одноименных ацильных групп в положениях 3 и 28 луп- скелета отличаются, а их 'Н-сигналы различаются только в отдельных случаях. При сравнении набора сигналов в спектрах |3С-ЯМР АН-7 (луп- ряда) и АІІ-17 (оле- ряда) показано, что 3-0-гемисукцинильные группы в двух скелетах дают совершенно одинаковый набор хим.сдвигов. Аналогичная картина наблюдается и для АН-8 и АН-18. Следовательно, в данном случае луп- и оле- скелеты на сигналы 3-0-гемисукцинильной (или 3-0-гемифтал ильной) группы влияют в одинаковой степени (табл. 4).

Таблица 4. Сравнение 13С-сигналов 3-0-ацильной группы у луп- и олеананового скелетов

А щільная группа Соединение Набор сигналов ацильной группы в спектрах С-ЯМР, 8 (м.д.)

З-О- гемисукцинил АН-7 (луп-) 29,08 29,36 171,96 177,88

АН-17 (оле-) 29,08 29,52 171,98 176,16

З-О- гемифталил АН-8 (луп-) 128,82 129,63 130,73 130,61 131,76 133,54 167,73 172,1

\ii-18 (оде-) 128,67 129,66 130.61 131,12 131,42 133,53 167,96 170,32

В процессе проведенного анализа электроспрей-масс-спектров (образование ионов при

распылении раствора анализируемого соединения в электрическом поле) установлено, что во всех случаях кроме АН-32 (с большой молекулярной массой, 875,1 Да) наблюдается пик иона «бис-молекулы» [2М+Н]+ наряду с пиком иона «л/оно-молекулы» [М+Н]+ ( габл. 5).

Таблица 5. Молекулярные пики некоторых производных в ЭСИ-масс-спектре

Соединение Брутто-формула М [М+нГ [2М+НГ

Получено Рассч. Получено Рассч.

АН-1 С30Н50О2 442,72 443,403 443,389 885,786 885,770

АН-5 С36І І^Оц 554,84 555.514 555,441 1110,016 1109,875

ЧН-9 С30Н50О2 442,72 443.467 443,389 885,914 885,770

АН-20 СзоН^нО 424,70 425,409 425,378 849,802 849,749

АН-32 СяН(,(,0|о 875,10 875.459 875,473 - 1749,939

Примечание: Рассч. - теоретически рассчитанные значения; масс-спекгры сняты в 1,5% метанольном растворе грифторуксусной кислоты, М - молекулярная масса (Да).

Это дает основание предположить, что данные нековалентные димеры тритерпеноидов формируются через межмолекулярную водородную связь, где Н' играет роль «мостика».

9

1.2 Синтез и установление строения новых производных бетуленола Синтез и установление строения З-О-пропионитч аллобетуленола (АН-]2) Синтез АН-12 из бетуленола осуществлялся двумя способами: с выделением промежуточного аллобетуленола (АН-9) и без его выделения. Схема синтеза представлена на

рисунке 1.

Рисунок 1. Схема синтеза АН-12 Молекулярная масса и брутто-формула полученного соединения А11-12 была определена методом масс-спектрометрии. В ЭСИ-масс-спектре АН-12 (рис. 2), снятом в 1,5% метанольном растворе трифторуксусной кислоты, были обнаружены 2 пика: [М+Н]' с массой 499,428 и [2М+Н]+ с массой 997,842.

100 200 500 ,00 SM 600 700 ЗОО ООО ІХО 1100 13» 1300 1400 IS»

Рисунок 2. ЭСИ-маес-спектр АН-12 (в 1,5% метанольном растворе CF3COOH) А при ионизации с помощью аммония хлорида и натрия хлорида в спирте были получены следующие пики в ЭСИ-масс-спектрах АН-12: 516,455 ([M+NH4]+), 1014,857 ([2M+NH4]+); 521,417 ([M+Na]+), 1019,895 ([2M+Na]+). На основании данных результатов однозначно установлено, что АН-12 имеет молекулярную массу 498,8 с брутто-формулой С33Н54О3, Полученные данные полностью согласуются с результатами анализа ЭИ-масс-спектра (m/z 498, М+) (рис. 3).

U ">Г 1 - L......

......................................................................... ' ' i ■ ■ 1 1 ) ' 1 1 1 i 1 ' 1 • I ' ' '

50 1 00 150 200 250 ЗОО 350 100 450 500

Рисунок 3. ЭИ-масс-спектр АН-12 (70 еВ)

При этом наблюдаются все характерные фрагменты для олеананового скелета, например, m/z 424, 409, 381, 355, 203, 189, 109. Пропионильная группа дает пик с m/z 57 (СН3СН200+).

Анализ спектров |3С-ЯМР позволяют однозначно установить углеродный скелет АН-12. Спектр |3С-ЯМР АН-12 показывает, что в молекуле исследуемого соединения присутствует пропионильная группа: С=0 (8 174,24 м.д.), CHi (23,71 м.д.) и СН3 (9,34 м.д.), и количество углеродных атомов в молекуле равно 33. Разница в хим.сдвигах сигналов каждого углерода между АН-12 и другими З-О-ацильными производными аллобетуленола (АН-17, АН-18) меньше 0,2 м.д. за исключением положений С-2 и С-3, которые подвергаются непосредственному влиянию введенной ацильной группы. Полное отнесение сигналов в спектре |3С-ЯМР AH-J2 представлено в диссертации.

В спектре ПМР AII-Í2 наблюдается квадруплет-сигнал протонов СНг пропионильной группы при 2,32 м.д., при этом сохраняются сигналы протонов скелета аллобетуленола. Под влиянием пропионильной группы сигнал протона у 3-его положения АН-12 имеет хим.сдвиг в более слабом поле (4,49 м.д., дублет дублетов) по сравнению с таковыми исходного аллобетуленола (3,20 м.д.), что типично для алифатических ЗР-О-ацильных производных (табл. 2).

В ИК-спектре в вазелиновом масле АН-12 отсутствуют полосы поглощения в области 3387-3424 см"1, характерные для вторичной спиртовой гидроксильной группы исходного аллобетуленола, при этом присутствует полоса поглощения при 1730 см ', характерная для С=0 сложноэфирной группировки.

Таким образом, исходя из выше изложенных данных, структура исследуемого соединения АН-12 установлена как 19(3,28-эпокси-18а-олеанан-3р-ил-пропионат или З-О-пропионат аллобетуленола.

П

Синтез и установление строения З-О-гемималеата аллобетуленола (АН-13)

Синтез АН-13 из бетуленола был осуществлен по аналогичной методике синтеза АН-12 -без выделения АН-9. Схема синтеза представлена на рисунке 4.

Установление строения АН-13 проведено аналогично для АН-12. Следует отметить, что сигналы двух протонов гемималеильного фрагмента в спектре ПМР АН-13 проявляются в виде двух дублетов с КССВ 3=3'= 12,30 Гц (8 6,23 и 6.29 м.д.), характерных для реконфигурации ацильной группы. Результаты анализа ИК-спектров полностью согласуются с гумс-алкеновой дизамещенной конфигурацией (v 1647 см"1, СН=СН).

Синтез и установление строения 3-0-(7-метоксикумарин-4-ил)ацетата аллобетуленола (АН-30)

Схема синтеза данного соединения представлена на рисунке 5.

а, / за О

■■ X

. [ і Т н Т: Х^Ті ДЦГК/ДГИАП X X

ь Т ^ Т= /\н сн3 СН2С1г ком. тем. 24 ч [ Ан 78% лЛ О ~ О" 'О + ДЦГМ

СзоНэдОг М = 442,72 аллобе гуленой. С12Н10О5 М= 234.20 (7-меток.ожу>лар/!Н-4-ут)уксусмая кисл іа, АН-ЭОК СН3 СлгНздОб М = 658,91 3-0-{7-метоксикумарин-4-ия ¡ацета г аллобетуленола

АН-9 ; ДЦГК - дициклогекенпкарбодиимид ( ОСС) : ДМАЛ - /\/,л/-Диметиламинопиридин ( ОМАР) : ДЦГМ - дициклогексилмочевииа ( оси) АН-30

Рисунок 5. Схема синтеза АН-30

Результаты анализа структуры АН-30 методами ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии полностью согласуются с предложенной структурой (рис. 5).

Синтез и установление строения 3,28-ди-0-(7-метоксикумарин-4-ил)ацетата бетуленола (АН-32)

Синтез АН-32 проведен но схеме, представленной на рисунке 6. Отнесение сигналов |3С-ЯМР двух одинаковых кумариновых фрагментов в АН-32 (у С-3 и С-28) было выполнено при сравнении с АН-30 (таб. 6).

Рисунок 6. Схема синтеза АН-32 Таблица 6. Отнесение сигналов ,3С-ЯМР кумариновых фрагментов в АН-32 и АН-30

Но /30 13'СНз ' АН"32 23 и 13'СНз ' АН-30

Положение С-8 (м.д.) Положение пС-б (м.д.) Положение ,3С8 (м.д.)

С-11" 38,58 С-11' 38,8 С-11' 38,79

С-13" 55,78 С-13' 55,78 С-13' 55,77

С-8" 101,13 С-8' 101,09 С-8' 101,07

С-6" 112,5 С-6' 112,5 С-6' 112.48

С-10" 112,5 С-10' 1,5 С-10' 112,48

С-3" 113,75 С-3' 113,61 С-3' 113,61

С-5" 125,51 С-5' 125,66 С-5' 125,67

С-4" 148,21 С-4' 148,48 С-4' 148,49

С-9" 155,58 С-9' 155,58 С-9' 155,56

С-2" 160,77 С-2' 160,83 С-2' 160,82

С-7" 162,86 С-7' 162,86 С-7' 162,84

С-12" 169,13 С-12' 168,41 С-12' 168.41

В спектре ПМР АН-32 кроме набора сигналов, протонов лупенового скелета бетуленола, наблюдаются все сигналы протонов двух кумариновых фрагментов: 3,73 (с, 2 Н, 2 Н-1Г (-СН2СОО)), 3,76 (с, 2 Н, 2 Н-11" (-СН2СОО)), 3,88 (с, 6 Н, З Н-13' и З Н-13" (-ОСН3)), 6,24 (уш. с, 2 Н, Н-3', Н-3"), 6,79 - 6,91 (м, 4 Н, Н-8', Н-8", Н-6', Н-6"), 7,51 (2 дублета, ,/=./'=8,53 Гц, 2 Н, Н-5', Н-5"). В ИК-спектре АН-32 полосы поглощения кумариновых фрагментов наблюдаются при (см"1): 3068 (=С-Н), 1728, 1724, (С=0 а-пиронов), 1612 (СН=СН а-пиронов), 1556, 1514 (СН=СН в бензольных циклах).

2. Стандартизация 3-0-пронионата аллобетуленола (АН-12)

2.1 Разработка стандартного образца (СО) АН-12

Была разработана методика получения СО АН-12 путем двухкратной перекристаллизации из этилового спирта (95%) или из пропан-2-ола (т. пл. СО АН-12 258-259°С). Чистота СО АН-12 доказана методом ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ-МС. При этом на хроматограммах пики

предполагаемых и неизвестных примесей практически отсутствуют. Поэтому в соответствии с общими рекомендациями по разработке и применению стандартных образцов, учитывая наличие неизвестных примесей в зависимости от условий синтеза, мы определили содержание основного вещества в данном образце 99,5% (т.е. содержание неизвестных примесей в данном СО не более 0,5%).

2.2 ВЭЖХ-анализ АН-12 и валидации используемых методик

Метод ВЭЖХ использован для определения подлинности, посторонних примесей и количественного определения. Разработана методика ВЭЖХ-анализа АН-12, условия проведения которого указаны в таблице 7.

Таблица 7. Условия проведения ВЭЖХ-анализа АН-12

Прибор Agilent 1200 Series

Колонка 15.0 см, диаметр 4.6 мм, размер частиц сорбента 5 рм

Элюирование изократическое

Температура 27-32°С

Детектирование УФ. X - 205 им

Объем инъекции 5 рл

Подвижная фаза Ацетонитрил : 0,5% водный раствор IICOOH = 95 : 5 (по объему)

Скорость подачи элюента 2 мл/мин

Приготовление пробы Растворение в хлороформе

Время удерживания (1к, мин) З-О-пропионат аллобетуленола (АН-12): 9,05±0,20 3,28-ди-О-пропионат бетуленола (АН-5): 7,79±0,20 аллобетуленол (АН-9): 4,30±0,20

В соответствии с требованиями ГФ XII (Часть 2) были определены следующие показатели валидации аналитических методик: специфичность; предел обнаружения или чувствительность; предел количественного определения; аналитическая область; линейность; правильность; прецизионность.

Доказательство специфичности методики основано на проведении анализа модельных смесей известного состава (рис. 7). Рекомендуется допустимый предел примесей: АН-5 не более 0,5%, АН-9 не более 1,5%.

GfySа АН-12 40 мг/мл в хлороформе АН-5 0,5% от АН-12 (по массе) АН-9 1,5% от АН-12 (по массе)

........!.........J.........4.........'"аГГ^"«!'""........"..........................*'"

Рисунок 7. ВЭЖХ-хроматограмма модельной смеси АН-12

Данная модельная смесь также изучена методом ГЖХ-МС.

Зависимость площади пика от концентрации АН-12 в нормализованных координатах является прямолинейный и описывается следующим уравнением: у = 0,6555х - 0,9433 (рис. 8), где у - площадь пика, х - концентрация (мг/мл). Коэффициент корреляции равен 0,9996. Предел количественного определения методики ВЭЖХ на АН-12 составляет 10-60 мг/мл.

Площадь 50 l: ----р- —-—- ——

пика 4о И 2 ::. $ Ж Щ : Щ.....#

„ : Я у = 0,6555х - 0,9433 і і И- "д^ШЖ::Ш

30 Ii-і-2--U

20 - - ,---,„,.,^ с ^,.,,». у

ю ^ щ.....

0

0 20 40 60 80

С, мг/мл

Рисунок 8. Линейная зависимость площади пика от концентрации модельных растворов АН-12

Также изучены некоторые реакции на АН-12: гидролиз, алкоголиз, цветные реакции с конц. H2SO4 (желто-оранжевое окрашивание), гидроксамовая проба (темно-вишневое окрашивание). Разработана методика количественного определения АН-12 - обратная ацидиметрия (0,1н HCl, индикатор - фенолфталеин): титрование проводится после гидролиза (30 мин) 0,5 М спиртовым раствором едкого калия, параллельно проводится контрольный опыт. Содержание С33Н54О3 в препарате должно быть не менее 98,0% и не более 102,0%.

2.3 Нормы качества СО З-О-пропионата аллобетуленола (АН-12) (табл. 8)

Таблица 8. Рекомендуемые нормы качества СО АН-12

Показатели Методы Нормы

Описание Органо] оптический Белый кристаллический порошок, без запаха

Растворимость ГФ XII, Часть 1, стр. 92 (ОФС 42-0049-07) Практически не растворим в воде, очень мало растворим в 95% спирте, мало растворим в изопропаноле

Подлинность ИК-, ЯМР-спекгроскопии Соответствует ФСП

Температура плавления ГФ XII, Часть 1, стр. 29 (ОФС 42-0034-07) 258-259°С

Посторонние примеси тех. ВЭЖХ, ГЖХ-МС Суммарное содержание примесей не более 0,5%

Количественное определение ВЭЖХ Не менее 99,5 % вещества С33Н54О3 в пересчете на сухое вещество

Хранение В соответствии с ФСП В сухом месте

2.4 Нормы качества вещества (субстанции) З-О-пропионата аллобетуленола (АН-12) (табл. 9)

Таблица 9. Рекомендуемые нормы качества субстанции АН-12

Показатели Методы Нормы

Описание Органолептический Белый кристаллический порошок, без запаха

Растворимость ГФ XII, Часть 1, стр. 92 (ОФС 42-0049-07) Практически не растворим в воде, очень мало растворим в 95% спирте, мало растворим в изопропаноле

Подлинность ИК-, ЯМР-спектроскопии Соответствует ФСП

Температура плавления ГФ XII, Часть 1, стр. 29 (ОФС 42-0034-07) 255-259°С

Посторонние примеси тех, ВЭЖХ, ГЖХ-МС Суммарное содержание примесей не более 2%

Количественное определение ВЭЖХ Не менее 98% вещества С33Н54О3 в пересчете на сухое вещество

Хранение В соответствии с ФСП В сухом месте

3. ВЭЖХ-анализ коиъюгата АН-32

Разработана методика ВЭЖХ-анализа АН-32. Условия проведения данного анализа указаны в таблице 10.

Таблица 10. Условия проведения ВЭЖХ-анализа АИ-32

Прибор Agilent 1200 Series

Колонка 15,0 см, диаметр 4,6 мм, размер частиц сорбента 5 дм

Элюирование изократическое

Температура 27-32°С

Детектирование УФ к = 325 нм

Объем инъекции 5 цл

Подвижная фаза Ацетонитрил : 0,5% водный раствор 1ICOOH = 85 : 15 (по объему)

Скорость подачи элюента 1 мл/мин

Приготовление пробы Растворение в ацетонитриле

Время удерживания (1я, мин) 3,28-ди-0-(7-метоксикумарин-4-ил)ацетат бетуленола (АН-32): 11,02±0,20 28-0-(7-метоксикумарин-4-ил)ацетат бетуленола (АН-31): 7,20±0,20 7-метоксикумарин-4-ил)уксусная кислота (АН-30К): 1,51±0,20

Линейная зависимость площади пика АН-32 от концентрации наблюдалась в интервале 0,001 до 5 мг/мл и описывается уравнением: у = 131,45х - 0,6364 (рис. 9), где у - площадь пика, х - концентрация (мг/мл). Коэффициент корреляции равен 0,9998.

Площадь 800 пика

600 400 200 0 -200

у = 131,45х - 0,63641

С, мг/мл I

Рисунок 9. Линейная зависимость площади пика от концентрации модельных растворов АН-32

По данной методике в отличие от АН-12, были использованы флуоресцентные свойства АН-32, обусловленные наличием кумариновых фрагментов (Хмакс = 325 нм). Чувствительность определения АН-32 составляет 0,001 мг/мл, в то время как данный показатель у немеченного АН-12 составляет 10 мг/мл.

4. Иммуномодулнрующая и противовирусная активность синтезированных соединении

Исследования иммуномодулирующей активности 6 известных веществ (АН-1, АН-3, АН-10, АН-15, АН-16, АН-19) были выполнены в Санкт-Петербургском НИИ вакцин и сывороток (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России), а изучение противовирусной активности АН-1, АН-3 было выполнено в НИИ гриппа РАМН (ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ). Эти данные ранее были получены профессором А. 3. Абышевым с соавторами. Затем нами были модифицированы некоторые методы синтеза ранее исследованных соединений и результаты анализа фармакологических свойств опубликованы в России и за рубежом.

Фармакологические исследования новых соединений (АН-12, АН-13, АН-30, АН-32), АН-9 и АН-11 выполнены в ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации», под руководством проф. В. Г. Макарова. При этом в нашу задачу входила постановка исследования исходя из литературных данных по фармакокинетике аналогов исследуемых соединений, а именно, программы определения иммуномодулирующей активности на соответствующих тестах и установления дозовой зависимости. Кроме того, исходя из полученных результатов, нами определена взаимосвязь «структура-активность» синтезированных соединений с учетом литературных данных.

При изучении иммуиомодулирующей активности исследуемых соединений определяли влияние на активность В-клеток по числу антитело-образующих клеток (АОК) методом локального гемолиза в жидкой фазе, а Т-лимфоцитов в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), фагоцитарную активность макрофагов определяли по поглощению

ими полистиролового латекса с диаметром частиц 1,8-2 нм. В опытах использовали здоровых половозрелых мышей-гибридов (СВЛхС57ВЬ'6)Р| весом 16-18 г. Гуморальный иммунный ответ оценивали у подопытных животных на 5-е сутки после однократного внутрибрюшинного введения им эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 2х107 ЭБ/мышь (на 1 день исследования). Вещества вводили мышам подкожно в дозах 0,1 и 10 мг/кг. На каждое соединение использовали 10 опытных (на 1 дозу) и 10 контрольных мышей.

При этом установлено, что среди изученных веществ некоторые соединения АН-1, АН-3, АН-19 и ЛН-16 оказывают достоверное стимулирующее действие на антителообразование, причем их влияние на продукцию АОК носит дозозависимый характер. Наибольшее увеличение числа АОК наблюдается при использовании АН-3 в дозе 0,1 мг/кг (табл. 11).

Таблица 11. Влияние соединений на число антителообразующпх клеток в селезенках мышей

н «Г> Г Т" Т*^' Число антителообразующпх клеток (на 106 спленоцитов)

Опытная группа (п=10) Контроль (п=10)

[ А Т „Дн н | = 0,1 мг/кг 10,0 мг/кг

И К'

АН-1 ОН СН2ОН 71,1 ± 14,11 171,1 ±28,25* 98,0 ± 12,28

АН-3 ОН СООН 242,2± 24,52* 117,8 ±24,23 98,0 ± 12,28

АН-19 ОСОСНз сн ососн. 153.1 ± 10,1 290,2 ± 24,40* 172,7 ± 15,4

АН-10 ОН СН2ОСО(СН2)2СООН 115,8 ±9,77 193,6 ± 16,0 138,4 ±9,11

АII-15 ОН СН2ОСОС6Н5 141,0 ± 11,8 225,3 ± 24,3* 151,9 ±7,4

АН-16 ОСОСбН5 СООН 250,1 ±32,0 366,4 ±21,9* 220,7 ± 10,7

Примечание: * - р < 0, 05 по сравнению с контролем, п - количество животных на 1 дозу в каждой группе.

Как видно из данных, представленных в таблице 12, соединение АН-3 подавляет развитие реакции ГЗТ. Другие исследуемые соединения не оказывали существенного влияния на эту иммунную реакцию.

Таблица 12. Влияние соединений на интенсивность реакции ГЗТ

^/ Интенсивность реакции ГЗТ (%)

Н 1 у. Опытная группа (п=10) Контроль (п=10)

Г А Т J--.fi Г . I Н рй' 0,1 мг/кг 10,0 мг/кг

к Я'

АН-1 ОН СН2ОН П.1 1,50 17,7 ± 1,36 13,6 ± 1,35

АІ1-3 ОН СООН 12,7 ± 1,96* 16,0 ±2,61 20,7 ± 2,63

АН-19 ОСОСНз СН2ОСОСН3 20,4 ± 3,03 16,33 ±2,54 24,63 ± 4,25

А11-10 ОН СН2ОСО(СН2)2СООН 2(1.0 : 3,54 13,43 ± 1,04 19,0 ±3,30

АН-15 он СН2ОСОС6Н5 17,0 ± 1,71 18,8 ± 1,99 16,4± 2,19

АН-16 ОСОС6Н5 СООН 15,6 ±2,17 22,4 ±3,24 9,4 ± 1,44

Примечание: * - р < 0, 05 по сравнению с контролем.

Результаты экспериментов, представленные в таблице 13, показывают, что соединения АН-3 и АН-19 не влияют на фагоцитарную активность макрофагов иеритонеального экссудата.

Таблица 13. Влияние соединений на фагоцитарную активность макрофагов

Соединение Доза Опыт (п=10) Контроль (п=10)

АН-3 (бетуленоловая кислота) 0,1 мг/кг 28,2 ± 1,02 26,8 ±0,86

А11-19 (диацетат бетуленола) 0,1 мг/кг 33,4 ± 1,69 26,8 ± 0,86

Иммуномодулиругощая активность новых производных бетуленола также определена в следующих условиях: выраженность гуморального иммунитета оценивалась методом определения в сыворотке крови титра антител, вырабатываемых в ответ на однократное внутрибрюшинное введение ЭБ мышам в дозе 5* 107 ЭБ/мышь на 1 день исследования. Вещества вводили мышам с 1-7 сутки подкожно в дозе 10 мг/кг (табл. 14).

Таблица 14. Оценка гуморального иммунного ответа (титр антител к ЭБ (^2М)), N=10

Доза, мг/кг Л'« животного (п-5) /Титр антител М±т Ме (01 ДО)

Я 1 2 3 4 5

АН-9 ОН 10,0 6 6 6 7 7 6,4 ± 0,2 6(6-1)

АН-12 ОСОСІЬСН, 10,0 8 7 8 7 8 7,6 ± 0,2* 8 (7;8)*

АН-13 ОСОСН=СНСООН 10,0 5 7 7 6 7 6.4 ± 0,4 6 (6;7)

АН-30 -о-с-сн2 10,0 6 6 6 7 7 6,4 ± 0,2 6 (6;7)

А1І-11 (28-О-пропионат бетуленола) 10,0 7 6 6 7 6 6,4 ± 0,2 6 (6;7)

АІІ-32 (3,28-ди-0-(7-метоксикумарин-4-ил)ацетат бетуленола) 10,0 7 6 7 7 6 6,6 ± 0,2* 7 (6;7)*

Контроль (растворитель ДМСО) - 6 6 6 6 6 6,0 ±0 6(6;6)

Примечание: * - отличия статистически значимы в сравнении с контрольной группой по непараметрическому и-критерию Манна-Уитни, при р<0,05

Проведенные исследования показали, что вещества АН-9, АН-11, АН-13 и АН-30 в дозе 10 мг/кг не оказывают существенного влияния на гуморальный иммунный ответ. При постановке реакции выявлены два эффективных соединения АН-12 и АН-32. При этом вещество АІІ-12 в дозе 10 мг/кг повышает титр антител на 26%, АН-32 - на 10%.

Таким образом, проведенное исследование позволяет предположить наличие у соединений АН-12 и АН-32 иммуномодулирующего действия, в частности направленного на активацию гуморального ответа. При этом оценивали влияние на гуморальный иммунный ответ (Титр антител к ЭБ) и клеточный иммунный ответ (ГЗТ) АН-12 при введении подкожно мышам в дозах 0,1; 1,0; 10,0 и 50,0 мг/кг.

Полученные результаты позволяют заключить, что ЛН-12 оказывает существенное влияние на гуморальный иммунный ответ (табл. 15).

Курсовое подкожное введение мышам ЛН-12 в дозах 0,1; 1,0; 10,0 и 50,0 мг/кг также приводило к дозозависимому снижению реакции ГЗТ (табл. 16). В дозе 50 мг/кг отек пораженной конечности был в 2,5 раза ниже, чем в контрольной группе.

Таблица 15. Оценка гуморального иммунного ответа ЛН-12 (титр антител к ЭБ (^214)),

№ 10 в зависимости от дозы

Группа Доза, мг/кг № животного (п=5) /Титр антител Ме ((21;<32)

1 2 3 4 5

Контрольная группа (ДМСО) - 6 6 6 6 6 6 (6;6)

АН-12 (З-О-пропионат аллобетуленола) 0,1 6 6 6 6 7 6(6:6)

ЛН-12 1,0 6 6 7 6 7 6(6;7)

ЛН-12 10,0 7 8 7 8 8 8(7;8) *

ЛН-12 50,0 9 7 8 9 8 8(8;9)*

Примечание: * - отличия статистически значимы в сравнении с контрольной группой по непараметрическому и-критерию Манна-Уитни, при р<0,05

Таблица 16. Реакция гиперчувствительности замедленного типа у инбредных мышей при

внутримышечном введении (М±т, п=10)

Препарат Доза, мг/кг Индекс реакции, %

Контроль - 33,4±2,5

АН-12 (З-О-пропионат аллобетуленола) 0,1 36,8±2,9*

АН-12 1,0 23,3±2,2*

АН-12 10,0 18,4±1,3*

АН-12 50,0 14,5±1,1*

Примечание: *- статистически значимо отличается от контроля по I критерию Стьюдента при р<0,05

Анализируя полученные данные, можно заключить, что в дозах 0,1; 1,0; 10,0 н 50,0 мг/кг ЛН-12 оказывает иммуномодулирующее действие: стимулирует гуморальный иммунный ответ, в 8 раз увеличивая концентрацию антител в крови. При развитии Т-клеточного иммунного ответа в реакции гиперчувствительности замедленного типа исследуемое вещество обеспечивает снижение отека. Полученные данные могут служить основанием для изучения ЛН-12 в качестве перспективного иммуномодулирующего средства.

Противогерпетическую активность изучали на белых мышах линии Ва1Ь массой 16-20 г, которых заражали интрацеребрально вирусом простого герпеса первого типа ЕС/385 (ВПГ-1 ЕС/385), инъекциями по 0,03 мл. Вирус брался в титре 10"3'5, что составляло 100 доз от ЯД5о. Соединения вводили животным перорально 1 раз в сутки из расчета в дозе 4,0 мг/кг, начиная со дня заражения по лечебной схеме: +1ч, +24ч, +48ч, +72ч в течение 10 дней. На десятый день учитывалось количество павших мышей и рассчитывался процент летальности и индекс защиты (ИЗ) в сравнении с таковой для ацикловира (субстанция). Из числа рассматриваемых соединений вещества АН-1 и АН-3 проявляли статистически достоверную (р<0,01-0,05) противогерпетическую активность против ВПГ-1 ЕС/385 (табл. 17), при этом АН-3 (ИЗ -75,0%) по эффективности превосходит ацикловир, имеющий ИЗ 62,5%.

Таблица 17. Противогерпетическая активность соединений на белых мышах (ВПГ-1 ЕС/385)

Соединение ! ^ , 1 мг/кг Показатели активности

Всего пало % летальности Индекс защиты, %

АП-1 (бетуленол) 14,0 3/8 37,7 62,2

АН-3 (бетуленоловая кислота) (4,0 Ацикловир 14,0 Плацебо I 2/8 I 25,0 1 75,0 3/8........... 7,5............................................. і 62,5 8/8.................................... 100.0................................................

* Указанные соединения также проявили активность в клеточных культурах, но значительно слабее (из-за плохой растворимости веществ в водной среде). Поэтому в настоящее время разрабатывается другая методика испытания соединений в клеточных культурах.

При анализе литературных данных по взаимосвязи между фармакологическими свойствами и структурой синтезированных производных бетуленола установлены следующие важные закономерности по взаимосвязи «структура- активность»:

1. Нативное кольцо А скелета бетуленола (циклогексан с Зр-гидрокснльной группой) является необходимым для проявления фармакологической активности, т.е. модификация этого кольца А (За-гидрокси-, 3-кето-, З-алкиламидо-З-дезокси-, 3-амино-, 2,3-ен-, 2,3-дикето, 2-гидрокси-) не выгодна для получения высокоактивных соединений. При этом С-3 сложноэфирные боковые цепи, содержащие 4-5 каркасных атома с З'-метильной группой, значительно повышают активность.

2. Нативная изоиропенильная группа, соединенная к пятичленному кольцу Е бетуленола и бетуленоловой кислоты, также является оптимальной для проявления фармакологической активности. Ее дигидрирование приводит к повышению токсичности. Присоединение к С-30 разных групп не повышает активности.

3. Высокоактивные соединения имеют в своей структуре, как минимум, одну свободную терминальную карбоксильную группу.

Как следует из анализа результатов наших исследований из числа синтезированных соединений, которые содержат нативное кольцо А и изопропенильную группу, наиболее высокую иммуномодулирующую активность проявила бетуленоловая кислота (АН-3), которая в дозе 0,1 мг/кг повышает титр антител на 147%, в то время как исходный бетуленол (АН-1) в дозе 10 мг/кг - 75% по сравнению с контролем. Эти же соединения проявили противовирусные свойства, в частности противогерпетическую активность, где ИЗ АН-3 (75,0%) несколько больше чем бетуленола (62,2%) и известного противогерпетического препарата ацикловира (62,5%). Следовательно, фармакологическая активность этих соединений, а именно, тритерпеноидов лупенового ряда, обусловлена наличием свободной карбоксильной группы в положении 28. Замена двух гидроксильиых групп бетуленола на кумариновые фрагменты (образование сложных эфиров) приводит к получению нового класса гибридных соединений (например, АН-32), которые проявляют выраженную иммуномодулирующую активность, что очевидно обусловлено присутствием сложноэфирной группировки. При этом следует заметить, что из числа испытанных соединений лупенового ряда сложные эфиры с алифатической природы (например, АН-10,

АН-19, табл. 11-13) обладают значительно слабой фармакологической активностью. Этот факт полностью согласуется с вышеизложенными литературными данными.

При анализе иммуномодулирующей активности некоторых новых производных аллобетуленола (тритерпеноидов олеананового ряда), испытанных на других тестах, показано, что соединения с З-О-гидроксильной (А11-9), 3-0-малеильной (АН-13) и 3-СЦ7-метоксикумарин-4-ил)-ацетильной (АН-30) группами в дозах 10 мг/кг не проявляют иммуномодулирующую активность. Тогда как соединение АН-12 (З-О-пропионил-аллобетуленол) из этого же ряда в дозе 10 мг/кг повышает титр антител на 26% по сравнению с контролем, что очевидно обусловлено наличием в структуре АН-12 пропионилыюй группы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1 .Синтезированы и идентифицированы 15 известных производных бетуленола (бетуленоновая кислота, бетуленоловая кислота, З-О-бензоат бетуленоловой кислоты, 3,28-ди-О-гемималеат бетуленола, 3,28-ди-О-пропионат бетуленола, 3,28-ди-О-гемисукцинат бетуленола, 3,28-ди-О-гемифталат бетуленола, 3,28-ди-О-ацетат бетуленола, 28-О-пропионат бетуленола, 28-О-гемисукцинат бетуленола, 28-0-бензоат бетуленола, аллобетуленол, 3-О-гемисукцинат аллобетуленола, З-О-гемифталат аллобетуленола, а-апоаллобетуленол). Анализ широкого ряда производных бетуленола позволил установить закономерности спектральных свойств в зависимости от структурной модификации молекулы основного скелета.

2. Синтезированы и установлены строения 4 ранее неописанных производных бетуленола: З-О-пропионат аллобетуленола (АН-12 состава С33Н54О3, т. пл. 257-259°С), З-О-гемималеат аллобетуленола (АН-13, С34Н52О5, т. пл. 238,5-240°С), 3-<Э-(7-метоксикумарин-4-ил)ацетат аллобетуленола (АН-30, С42Н58О6, т. пл. 242-244°С), 3,28-ди-0-(7-метоксикумарин-4-ил)ацетат бетуленола (АН-32, С54Н66О10, т. пл. 136-138°С). Из них АН-30 и АН-32 являются гибридными молекулами нового класса (тритерпеноид-кумарин).

3. Выявлено отличие в сигналах 13С-ЯМР одноименных ашшьных групп в положениях 3 и 28 лупанового скелета. Показано, что одноименные 3-0-ацильные группы в лупановом и олеанановом скелетах дают совершенно одинаковый набор хим.сдвигов. На ЭСИ-масс-спектрах исследуемых тритерпеноидов во всех случаях кроме АН-32 (с большой молекулярной массой, 875,1 Да) наблюдается пик иона «бг/с-молекулы» (нековалентный димер) [2М+Н]+ наряду с пиком [М+Н]+. Это дает основание предположить, что данные нековалентные димеры тритерпеноидов формируются через межмолекулярную водородную связь, где Н' играет роль «мостика».

4. Среди синтезированных производных бетуленола выявлены 3 наиболее активных соединения: АН-З, АН-12 и АН-32. АН-3 в дозе 0,1 мг/кг повышает титр антител на 147% по сравнению с контролем. ИЗ АН-3 против герпеса составляет 75,0%. На других тестах АН-12 в дозе 10 мг/кг повышает титр антител на 26%, АН-32 - на 10%. В дозах 0,1; 1,0; 10,0 и 50,0 мг/кг АН-12 оказывает иммуномодулирующее действие: стимулирует гуморальный

иммунный ответ, в 8 раз увеличивая концентрацию антител в крови. Выявлены некоторые зависимости между химической структурой и активностью испытанных соединений. Показано, что фармакологическая активность тритерпеноидов лупенового ряда обусловлена наличием свободной карбоксильной группы в положении 28. Введение сложноэфирной группировки в большинстве случаев повышает их фармакологическую активность, причем сложные эфиры с ароматической и гетероциклической природой в большей степени, чем алифатические.

5. Разработана методика ВЭЖХ-анализа:

- на ЛН-12: Хмакс = 205 им, подвижная фаза: ацетонитрил : 0,5% водный раствор НСООН = 95 : 5 (по объему), температура определения 27-32°С, объем инъекции 5 цл, скорость подачи элюента 2 мл/мин. Определено время удерживания основного вещества и примесей. Проведена валидация методик по требованиям ГФ XII. Уравнение линейной зависимости: у = 0,6555х - 0,9433 в интервате 10 мг/мл - 60 мг/мл.

- lia AI1-32: ^макс = 325 нм, подвижная фаза: ацетонитрил : 0,5% водный раствор НСООН = 85 : 5 (по объему), температура определения 27-32°С, объем инъекции 5 цл, скорость подачи элюента 1 мл/мин. Определено время удерживания основного вещества и примесей. Уравнение линейной зависимости: у = 131,45х - 0,6364 в интервале 0,001- 5 мг/мл.

6. Разработан стандартный образец (СО) на АН-12 с т. пл. 258-259°С путем двухкратной перекристаллизации из спирта или изопропанола, содержание примесей в СО АН-12 не более 0,5% . Определены нормы качества на СО и субстанцию АН-12.

Таким образом, нз числа синтезированных соединений отобраны наиболее перспективные соединения: АН-3, АН-12 и AII-32 для более глубокого доклинического изучения в качестве нммуномодулирующих средств. Кроме того, необходимо расширить синтез и изучение физико-химических свойств аналогов АН-32, как биологически активных флуоресцирующих гибридных структур (тритерпеноид-кумарин) и чрезвычайно важных для решения многих сложных задач фармацевтического анализа, а также для создания меченых диагностических препаратов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Абышев, А.З. Синтез н биологическая активность комбинированных кумаринов и тритерпеноидов / А.З. Абышев, C.B. Гадзиковский, В.Х. Нгуен, Э.А. Солодская // "Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации". Материалы научно-практпческой конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии (7 - 9 декабря 2011 года). - Пермь: изд-во ПГФА, 2011. - С. 25-28.

2. Нгуен, В.Х. Синтез, структурные особенности и биологическая активность тритерпеноидов / В.Х. Нгуен // Тезисы докладов межвузовской научной конференции, посвященной 300-летию со дня рождения М.В. Ломоносова и 150-летию создания A.M. Бутлеровым теории химического строения органических соединений 29 ноября 2011г. - Спб: изд-во СПХФА, 2011. - С. 37-39.

3. Нгуен, В.Х. К вопросу исследования коры берёзы в России и за рубежом / В.Х. Нгуен // Тезисы докладов П-ой всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего», Санкт-Петербург, 18-19 апреля 2012 г. Ч. 1. - Спб: изд-во СПХФА, 2012. - С. 88-89.

4. Abyshev, A.Z. Synthesis and antiviral activity of coumarin derivatives / A.Z. Abyshev, E.M. Agaev, S.V. Gadzikovskiy, D.L. Nguyen, V.H. Nguyen // Vietnam Journal of Chemistry. - 2012. -Vol. 50. -№4A. -P. 1-4.

5. Abyshev, A.Z. Synthesis of betulin derivatives / A.Z. Abyshev, E.M. Agaev, S.V. Gadzikovskiy, D.L. Nguyen, V.H. Nguyen // Vietnam Journal of Chemistry. - 2012. - Vol. 50. - № 4A. - P. 5-7.

6. Abyshev, A.Z. Immunological activity of betulin and its semisynthetic derivatives / A.Z. Abyshev, E.M. Agaev, S.V. Gadzikovskiy, D.L. Nguyen, V.H. Nguyen // Vietnam Journal of Chemistry. - 2012. - Vol. 50. - JSfe 5A. - P. 381-383.

7. Abyshev, A.Z. Synthesis and investigation of physical and chemical properties of diagnostic drugs labeled with fluorescent label of the 2//-l-benzopyran-2-one type / A.Z. Abyshev, E.M. Agaev, S.V. Gadzikovskiy, V.A. Morozova, L.D. Nguyen, H.V. Nguyen // Science and Education: Materials of the II international research and practice conference (Vol. 1). - Munich (Germany): Vela-Verlag, 2012. - P. 44-52.

8. Abyshev, A.Z. Synthesis and investigation of physical and chemical properties of diagnostic drugs labeled with fluorescent label of the 2//-l-benzopyran-2-one type (review) / A.Z. Abyshev, E.M. Agaev, E.A. Solodskaya, S.V. Gadzikovskiy, L.D. Nguyen, H.V. Nguyen // Azerbaijan Pharmaceutical and Pharmacotherapy Journal. - 2012. - Vol. 12. - № 2. - P. 11-19.

9. Абышев, А.З. Противовирусная активность соединений кумаринового ряда (Обзор, Часть 1) / А.З. Абышев, Р.А. Абышев, С.В. Гадзиковский, В.Х. Нгуен, В.А. Морозова // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. - 2013. - Т. 5. - № 1. - С. 34-41.

10. Абышев, А.З. Противовирусная активность соединений кумаринового ряда (Обзор, Часть 2) / А.З. Абышев, Р.А. Абышев, С.В. Гадзиковский, В.Х. Нгуен, В.А. Морозова // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. - 2013. - Т. 5. - № 2. - С. 25-34.

11. Абышев, А.З. Производные бетуленола как перспективные анти-ВИЧ агенты / А.З. Абышев, Р.А. Абышев, В.Х. Нгуен, В.А. Морозова // Медицинский академический журнал. -2013.-Т. 13. -№2. -С. 15-32.

12. Абышев, А.З. Современное состояние синтеза и исследования анти-ВИЧ активности соединений ряда 2//-1-бензопиран-2-она / А.З. Абышев, Р.А. Абышев, С.В. Гадзиковский, В.Х. Нгуен, В.А. Морозова // Бутлеровские сообщения. - 2013. - Т. 33. - № 1. - С. 1-21.

13. Абышев, А.З. Иммуномодулирующее средство на основе З-О-пропионата аллобетуленола (19р,28-эпокси-18а-олеанан-3|3-ил пропионат) / А.З. Абышев, В.Г. Макаров, М.Н. Макарова, К.Л. Крышень, В.Х. Нгуен // Заявка № 2013129829/15(044360), дата выдачи заявки 01.07.2013, уведомление о положительном результате формальной экспертизы от 05.09.2013.

Подписано в печать 05.11.2013г. Формат 60x84/16 У.п.л. 1,5 Уч.-изд.л 1,5 . Тир. ЮОэкз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. toroussel@mail.ru Зак. № 13506 от 05.11.2013г.