Автореферат и диссертация по медицине (14.03.08) на тему:Секреторные и адегезивные свойства эндотелиальных клеток человека при моделировании эффектов микрогравитации in vitro

На правах рукописи

РУДИМОВ ЕВГЕШШ ГЕННАДЬЕВИЧ

СЕКРЕТОРНЫЕ И АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЭФФЕКТОВ МИКРОГРАВИТАЦИИ IN VITRO

14.03.08 - авиационная, космическая и морская медицина 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН Z015

005562659

Москва - 2015

005562659

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБГТ РАН)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАН Буравкова Людмила Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории клеточной

адгезии ФГБУ РКНПК МЗ и СР РФ Мазуров Алексей Владимирович

доктор биологических наук, руководитель лаборатории проблем

регенерации ФГБУН ИБР РАН Григоряп Элеонора Порайровна

диссертационного совета Д 002.111.01 в Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке (г. Москва, Хорошевское шоссе, Д.76А), на сайте Института http://www.imbp.ru и сайте Высшей аттестационной комиссии при Минобрнауки РФ http://vak.ed.gov.ru.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Защита диссертации состоится

часов на заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

'М.А. Левинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Аетуальность проблемы

Хорошо известно, что микро гравитация, как один из основных факторов космического полета, приводит к дисрегуляции сердечно-сосудистой системы (Газенко, Григорьев, Егоров, 1990; Charles, Lathers, 1994; Богомолов, Самарин, 2007; Котовская, Фомина, 2010). Важным функциональным элементом, вовлекаемым в эти процессы, является эндотелий, изменения которого регистрируются после космических полетов и при проведении наземных модельных экспериментов (Григорьев, Котовская, Фомина, 2009; Moore, Thornton, 1987; Sofronova, Tarasova, Gaynullina et al., 2015).

Хорошей моделью для изучения структурно-функциональных и молекулярно-клеточных изменений при действии микрогравитации являются эндотелиальные клетки (ЭК), которые в условиях культивирования in vitro образуют монослой клеток, идентичный тому, что выстилает внутреннюю поверхность сосудов в живом организме. Эндотелиапьный монослой является основным барьером между кровью и подлежащими тканями и функционирует как механически чувствительный интерфейс передачи сигнала (давление, растяжение, сокращение, воздействие напряжения сдвига (shear stress) жидкости (Michiels, 2003; Tzima, Irani-Tehrani, Kiosses et al., 2005). Исследования показали, что ЭК очень чувствительны к изменению гравитационного стимула, демонстрируя как ранние, так и отсроченные ответы (Sangha, Han, Purdy, 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005; Infanger, Ulbrich, Baatout et al., 2007). Было показано, что ранний ответ ЭК на длительное воздействие постоянно изменяющегося направления вектора гравитации проявлялся в ремоделировании акшнового цитоскелета и усилении миграционной активности (Романов, Кабаева, Буравкова, 2001). Длительное экспонирование ЭК в условиях измененной гравитации увеличивало уровень белков внеклеточного матрикса, молекул клеточной адгезии и индуцировало высвобождение цитокинов (Grimm, Infanger, Westphal et al., 2009). Эти наблюдения подтвердили ранее выдвинутое предположение, что некоторые из мембранных белков, являются механическими сенсорами клетки. Возможными регуляторными сенсорами могут быть механочувствительные кальциевые каналы, сайты фокальной адгезии, цитоскелет, а также известные рецепторы факторов роста и цитокинов. Вторичные сигналы от сенсоров могут индуцировать различные внутриклеточные сигнальные каскады, в которых участвуют митоген-активируемые протеинкиназы (МАРК), такие как ERK, Р38 и JNK (Hughes-Fulford, 2002). Однако, не стоит забывать, что появление провоспалительных стимулов в корне меняет фенотип, функциональное состояние ЭК и вызывает активацию сигнальных каскадов, опосредуемых МАРК (Schiffrin, 1994). Точные молекулярные механизмы

гравичувствительностн ЭК остаются не выясненными в силу наличия у них многоуровневой системы регуляции провоспалительной активности и механочувствительности. В связи с этим, изучение секреторных и адгезивных свойств интакгного и активированного эндотелия в условиях моделирования эффектов микрогравитации in vitro (экспозиции на Random Positioning МасЫпе/ЯРМ/ЗО-клиностате) позволит приблизиться к пониманию процессов, происходящих в условиях реального космического полета.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование влияния моделирования эффектов микрогравитации (3D клиностатирования) на архитектонику цитоскелета, синтез молекул адгезии, белков адгезионных межклеточных контактов и растворимых медиаторов воспаления в интактных и TNF-a-активированных эндотелиальных клетках пупочной вены человека.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Исследовать воздействие 3D клиностатирования на организацию и экспрессию генов основных белков актинового и тубулинового цитоскелета ЭК, находящихся в различных функциональных состояниях (в норме и при провоспалительной активации);

2) Сравнить эффект провоспалительной активации, 3D клиностатирования и их совместного действия на жизнеспособность первичных эндотелиальных клеток из пупочной вены человека;

3) Провести анализ экспрессии молекул клеточной адгезии (Е-селектин, РЕСАМ-1, ICAM-1, VCAM-1) и основного белка клеточных контактов (VE-кадгерин) на поверхности интактных и TNF-a-активированных ЭК в условиях моделирования эффектов микрогравитации;

4) Изучить влияние 3D клиностатирования на секреторную активность интактных и TNF-a-активированных ЭК;

5) Оценить уровень экспрессии генов основного белка адгезионных контактов, молекул клеточной адгезии и цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в условиях провоспалительной активации, экспозиции на RPM и их совместного действия.

Научная новизна

• Впервые проанализировано влияние моделирования эффектов

микрогравитации, с помощью уникального устройства для рандомизации положения

объекта относительно вектора гравитации (RPM), на основные характеристики интактных и TNF-a-активированных первичных ЭК.

• Впервые показаны различия в функциональной активности первичных культивируемых эндотелиальных клеток человека, характеризующие не только продукцию поверхностных маркеров, но и транскрипцию генов, ответственных за синтез данных маркеров в норме и при провоспалительной активации.

• Впервые установлено, что моделирование эффектов микрогравитации вызывает реорганизацию актинового и тубулинового цитоскелета первичных ЭК уже после 1 часа воздействия, а 24-часовая экспозиция на RPM приводит к нарушению сборки микротрубочек и появлению двуядерных клеток в первичной культуре ЭК. Получены новые данные, свидетельствующие о сопутствующем ремоделированию актинового цитоскелета увеличении экспрессии гена АСТВ после 24-часов экспозиции на RPM.

• Впервые выявлено потенцирование эффектов провоспалительной активации на транскрипцию генов ¡САМ! и 1L8 в условиях 3D клиностатирования, что в совокупности с увеличением экспрессии рецептора Е-селектина на поверхности ЭК, может способствовать увеличению адгезионных свойств этих клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования подтверждают возможность использования эндотелиальных клеток человека в качестве адекватной экспериментальной модели для изучения механизмов гравичувствительности и трансдукции гравитационного стимула во внутриклеточные биохимические сигналы.

Обнаруженные в работе взаимосвязанные изменения архитектоники цитоскелета, экспрессии поверхностных маркеров, белка межклеточных контактов и секреции цитокинов подтверждают существование и значительно дополняют имеющиеся теоретические представления о гравитационно-зависимых внутриклеточных механизмах.

Продемонстрированные в работе функциональные различия между эндотелиальными клетками, полученными от разных доноров, позволяют предполагать необходимость более тщательного подхода к оценке результатов, с учетом индивидуальных особенностей первичных культур.

Полученные в работе результаты могут являться основанием для разработки проекта технического задания на проведение космического эксперимента в Российском сегменте МКС с целью дальнейшего изучения барьерных, адгезивных и секреторных свойств эндотелиальных клеток в условиях реальной микрогравитации.

Положения, выносимые на защиту

1. Реорганизация актиновых микрофиламентов в местах клеточных контактов и нарушение сборки микротрубочек наблюдается уже на ранних этапах культивирования ЭК на RPM (1 час) и сохраняется на протяжении 24 часов, приводя к трехкратному увеличению экспрессии гена АСТВ, а также нарушению пролиферации и накоплению двуядерных клеток.

2. Рандомизации положения культивируемых ЭК относительно вектора гравитации не является сильным воспалительным стимулом, так как не стимулирует транскрипцию генов и экспрессию кодируемых ими индуцибельных молекул Е-селектина и VCAM-1 на поверхности клеток, однако, достаточна для того, чтобы способствовать увеличению экспрессии ICAM-1 интактных и TNF-a-активированных ЭК.

3. 3D клиностатирование не влияет на экспрессию генов и секрецию молекул ИЛ-6 и ИЛ-8 в интактных эндотелиальных клетках. Экспозиция на RPM не отменяет TNF-a-индуцированное увеличение экспрессии и секреции данных цитокинов, а в случае с ИЛ-8 даже потенцирует транскрипцию гена этого цитокина.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на: 10-й, 11 -й Конференциях молодых ученых, специалистов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2011, 2012); 12-й Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию ГНЦ РФ - ИМБП РАН (Москва, 2013); 13-й Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию полета первого в мире врача-космонавта Егорова Б.Б. (Москва, 2014); 35-х и 37-х Академических чтениях по космонавтике, посвященных памяти академика С.П.Королева «Актуальные проблемы Российской космонавтики» (Москва, 2011, 2013); 14-ой Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием, посвященной 50-летию создания ИМБП (Москва, 2013); 22-ом Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013); 12-й Объединенной конференции Европейского космического агентства и Международного общества гравитационной физиологии «Life in Space for Life on Earth» (Великобритания, Абердин, 2012); 40-й Научной ассамблее Международного комитета по исследованию космического пространства (COSPAR) «COSMOS» (Москва, 2014); 6-ом Международном конгрессе «Медицина в космосе и экстремальных условиях» (ICMS) (Германия, Берлин, 2014).

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.

Работа выполнена в рамках Плана фундаментальных исследований ГНЦ РФ -ИМБП РАН при частичной поддержке РФФИ (грант № 12-04-31763 мол_а) и грантов «Ведущие научные школы» НШ-1207.2012.4 и НШ-371.2014.4.

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН "Космическая физиология и биология" 19 мая 2015 г., протокол №5.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 166 страницах машинописного текста, сопровождается 24 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 464 источника, из них 37 на русском и 427 на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Получение и культивирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Выделение ЭК из вены пуповины, полученной во время нормальных своевременных родов, использовали метод Gimbrone et al., (Gimbrone, Cotran, Folkman, 1974) в модификации Щегловитовой и соавторов (Scheglovitova, Romanov, Maksianina et al., 2002). Культивирование клеток осуществляли в среде 199 (Gibco, Великобритания), содержащую L-глутамин и соли Эрла, с добавлением 25 мМ HEPES ("MP Biomedicals"), 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина в 0,85% солевом буфере (ПанЭко, Россия), 1 мМ пирувата натрия (Gibco, Великобритания), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, США), 5 ЕД/мл гепарина (Московский эндокринный завод, Россия) и 100 мкг/мл фактора роста эндотелиальных клеток (ECGS) (BTI, США). Замену культуральной среды проводили каждые 2 дня. Культивирование в стандартных условиях проводили при 37°С в СОг-инкубаторе (Sanyo, Япония).

Моделирование эффектов микрогравитации. Моделирование эффектов микрогравитации осуществляли в течение 24 часов с помощью специального устройства для рандомизации положения объекта относительно вектора гравитации - Random Positioning Machine (RPM, Dutch Space, Leiden, Нидерланды). Постоянное изменение положения объекта относительно вектора гравитации на RPM происходит за счет разнонаправленного вращения двух взаимоперпендикулярных рамок (100 рад/мин и 80 рад/мин), к которым крепится платформа с экспериментальными образцами, что имитирует эффект снижения влияния силы тяжести на культуру клеток (van Loon, 2007; Гершовнч, Гершович, Буравкова, 2009).

Провоспалительнан активация ЭК. Провоспалительную активацию эндотелия проводили путем добавления в среду культивирования TNF-a (2 нг/мл) на 24 часа (Toborek, Barger, Mattson et al., 1996). В качестве контроля использовали интактные клетки, культивируемые в статических условиях.

Иммунофенотип ЭК оценивали по экспрессии ряда поверхностных маркеров с помощью FITC- и РЕ-меченых моноклональных антител к CD31, CD54, CD105, CD144, CD106, CD62L, CD62E (Immunotec, Франция) на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). В качестве контроля использовали FITC- и РЕ-меченые

моноклональные антитела того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера (Immunotec, Франция).

Жизнеспособность ЭК оценивали по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии с помощью набора ANNEXIN V-FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя.

Иммуноцитохимический анализ. Для иммуноцитохимического выявления белков цитоскелета ЭК культивировали в специальных культуральных флаконах 9см2 предназначенных для микроскопии (Slide Flask, NUNC, Дания). После различной длительности экспозиции на RPM (1 час, 24 часа) ЭК отмывали средой ДМЕМ без сыворотки, затем фиксировали в течение 15 минут 4% раствором параформальдегида. После чего отмывали средой ДМЕМ и инкубировали в течение 15 минут в 0,1% растворе Triton Х-100 для солюбилизации мембранных белков. Для предотвращения неспецифического связывания антител, перед окрашиванием клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в 1% растворе БСА. Для визуализации микротрубочек и молекул адгезии использовали моноклональные антитела специфичные к бета-тубулину (Santa Cruz Biotechnology, США), ICAM-1 и VCAM-1 (Sigma, США) в разведении 1:50 и инкубировали в течение ночи при 4°С. После инкубации ЭК отмывали, наносили вторые антитела, конъюгированные с флуоресцентным красителем FITC (Dako, США), специфичные к IgG первых антител, в разведении 1:20 и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Для визуализации фибриллярных структур актинового цитоскелета ЭК инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с флуоресцентным красителем TRITC-фаллоидин (Sigma, США) в концентрации 50 мкг/мл). Для заключения препаратов использовали специальную среду Fluoroshield, содержащую флуоресцентный краситель ядерной ДНК, DAPI (Sigma, США). Препараты изучали на флуоресцентном фазово-контрастном Nikon Eclipse TiU (Nikon, Япония) и конфокальном LSM 780 (Zeiss, Германия) (совместно с дм.н., проф. C.B. Буравковым) микроскопах, оснащенных программами для анализа изображения.

Анализ уровня цитокинов в среде культивирования. Скрининг цитокинов проводили в кондиционированной среде с помощью набора FlowCytomix human Thl/Th2 11 Plex (Bender MedSystems, Австрия), который позволяет измерить концентрацию 11 цитокинов (IL-lß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-I2p70, IFN-y, TNF-a, TNF-ß) одновременно. Метод основан на «сэндвич»-методе твердофазного иммуноферментного анализа. В данном случае в роли твердой фазы выступают полистироловые гранулы, конъюгированные с соответствующими анти-цитокиновыми антителами. Образцы анализировали на цитофлуориметре FACS Calibur (BD biosciences, США). Для более подробной оценки концентрации IL-6 и IL-8 в кондиционированной среде были использованы наборы для иммуноферментного анализа Human IL-6 ELISA Set и Human IL-8 ELISA Set (BD biosciences, США). Результаты количественного содержания данных цитокинов оценивали, измеряя оптическую плотность при длине волны 450 нм на планшетном спектрофотометре PR 2100 (Bio-Rad, США).

Анализ уровня экспрессии генов.

Выделение тотальной РНК производили с помощью набора RNeasy PLUS mini kit (Qiagen, США). После культивирования, ЭК снимали с подложки, отмывали, центрифугировали и консервировали при -35 °С в стабилизирующем реагенте RNAIater (Qiagen, США). Согласно инструкции производителя, клетки (500 - 750 тыс) после удаления RNAIater центрифугированием (5 минут при 1000 об/мин) инкубировали на шейкере в лизирующем буфере в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее клеточный лизат переносили на колонки Qiashredder (Qiagen, США) и подвергали центрифугированию при 14000 об/мин в течение 2 минут, после чего в колонки добавляли 70% этанол. Полученный раствор переносили на сорбционные колонки и центрифугировали 30 сек при 10000 об/мин, супернатант удаляли. Далее производилась

последовательная отмывка буферами, согласно инструкции производителя, с последующим центрифугированием 30 сек при 10000 об/мин. РНК смывали с колонок 50 мкл деионизированной воды. Полученные образцы РНК замораживали и хранили при -35 °С. Реакцию обратной транскрипции и получение кДНК на основе ранее выделенной РНК производили с помощью набора QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, США), согласно инструкции производителя.

ПЦР в реальном времени проводили с помощью прибора МХ3000Р (Stratagene, США) используя набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green 1, содержащий рекомбинантную ДНК-полимеразу HotStarTaq, смесь дезоксирибонуклеотидов и флуоресцентный краситель SYBR Green (Сиптол, Россия). Количество кДНК на одну реакцию составляло 0,5 мкг. Конечный объем реакции составлял 25 мкл. Для определения уровня экспрессии исследуемых генов применялись оптимизированные для этого метода пары праймеров QuantiTect Primer Assay (Qiagen, США) для следующих исследуемых генов: ICAM-l, VCAM-1, IL-8,IL-6,CDH5, АСТВ. В качестве референсного гена для определения относительного значения изменения уровня экспрессии изучаемых генов, был использован ген гипоксантингуанинфосфорибозил-трансферазы (HPRT) (Chen, Zhao, Feng et al., 2013). Специфичность проводимой реакции определялась с помощью анализа кривой плавления продуктов амплификации в диапазоне от 55 °С до 95 °С с шагом 1 градус. Для оценки относительного уровня экспрессии исследуемых генов использовали метод 2"AI,Ct(Livak, Schmittgen, 2001).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов вариационной статистики программы "Excel" и однофакторного дисперсионного анализа в программе "Statistica 7.0" для Windows ХР. Статистическая обработка данных ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени осуществлялась с помощью программы REST 2009 v. 2.0.12. Межгрупповые отличия считали достоверными при р < 0,05.

Результаты исследования н их обсуждение Влияние моделирования эффектов микрогравитации на морфологию и структуры цитоскелета эндотелиальных клеток человека

При исследовании морфологических особенностей ЭК было показано отсутствие серьезных изменений формы клеток при 24 часовой инкубации с TNF-a (2 нг/мл) по сравнению с контрольными образцами. Лишь отдельные клетки начинали втягиваться, образуя небольшие межклеточные «разрывы» (рис. 1 б). Экспозиция ЭК на RPM в течение 24 часов приводила к нарушению целостности эндотелиального монослоя, клетки становились менее распластанными, уменьшалась их площадь, появлялись отростки -«ламеллы» (рис. 1 в). TNF-a-активированные ЭК в условиях 3D клиностатирования приобретали различную форму (часть клеток приобретала веретеновидную форму, часть сильно распластывалась по подложке), у большинства из них наблюдались «ламеллы», при этом целостность монослоя значительно нарушалась (рис. 1 г). Изменения происходили и в цитозоли - появлялась четко выраженпая зернистость цитоплазмы в перинуклеарной области, а также визуализировались структуры, напоминающие вакуоли. Подобные изменения в цитоплазме могли свидетельствовать об увеличении синтетической активности шучаемых ЭК.

Рис. 1. Морфологические особенности эндотелиального монослоя in vitro при различных условиях культивирования (24 ч): а - статический контроль; б - активация эндотелия TNF-a (2 нг/мл). в - экспозиция на RPM; г - экспозиция на RPM и TNF-а-активация. Масштабный отрезок 100 мкм.

Окрашивание фибриллярных волокон актина показало, что в контрольных образцах ЭК сохраняли свою полигональную форму, волокна F-актина были сосредоточены по периферии клетки и в виде тонких фибрилл пересекали центр клетки (рис. 2 а). Спустя час после добавления TNF-a в некоторых клетках наблюдались утолщение актиновых фибрилл и формирование стресс-волокон. Это сопровождалось клеточным сжатием и формированием ламеллоподий и филоподий, расположенных, главным образом, в местах межклеточных контактов (рис. 2 б). Экспонирование ЭК на RPM в течение 1 часа приводило к накоплению фибрилл актина в центральной части клеток. Стресс-волокна объединялись в пучки, число их возрастало, по сравнению с TNF-a-активированными клетками. В большинстве клеток стресс-волокна F-актина располагались параллельно основной (длинной) оси клетки. Кроме того, в области межклеточных контактов появлялись отдельные «звездоподобные» стуктуры, по-видимому, представляющие собой участки связывания стресс-волокон соседних клеток (рис. 2 в). Экспозиция TNF-a-активированных ЭК на RPM той же длительности вызывало более выраженные изменения в организации F-актина, чем при клиностатировании интактных клеток или инкубации с TNF-a. При этом, большее количество стресс-волокон актина объединялось в пучки, увеличивалась частота появления <ввездоподобных» структур. Некоторые клетки в области клеточных контактов формировали гак называемый «волнистый край» (раффлы) (рис. 2 г).

Изменения архитектоники актинового цитоскелета, наблюдаемые в ЭК на коротких сроках инкубации с TNF-a, многократно усиливались после 24-часового воздействия

этого шггокина. Практически все клетки в местах клеточных контактов имели «звездчатые структуры», стресс-волокна были собраны в толстые пучки, по периферии сжатых клеток образовывались «микрошипы» актина При этом в перинукпеарном пространстве выявлялись шарообразные глыбки Р-актина (рис. 3 а). Данные наблюдения сопровождались значительным увеличением интенсивности флуоресценции Р-актина в активированных клетках (рис. 3 г), что свидетельствует о переходе большей части С-актина клеток в фибриллярное состояние.

Под действием 24-часового ЗО клиностатирования наблюдалось нарушение целостности монослоя ЭК из-за сокращения фибрилл актина в местах клеточных контактов и уменьшения объема соседних клеток. Характерным отличием ЭК, культивируемых в этих условиях, являлось отсутствие филоподий и освобождение перинуклеарного пространства от стресс-волокон (рис. 3 б). Стоит отметить, что экспозиция на ЯРМ значительно снижала интенсивность флуоресцентного окрашивания филаментов по сравнению с ЮТ-а-активированными клетками, однако оставляла этот показатель на уровне выше контрольных значений (рис. 3 г).

Суточное экспонирование ТЫР-а-активированных ЭК на КРМ характеризовалось более выраженной деполимеризацией актиновых фибрилл, о чем свидетельствует появление шарообразных «глыбок» из разрушенных актиновых волокон (рис. 3 в). Кроме того, интенсивность флуоресценции Р-актина, при сочетанном действии изучаемых факторов, снижалась до контрольных значений (рис. 3 г).

Обнаруженные изменения интенсивности флуоресценции актиновых филаментов ЭК коррелировали с изменением уровня экспрессии гена АСТВ, кодирующего этот белок. Так, в результате 24 часовой инкубации с ТЫР-а, экспрессия исследуемого гена увеличивалась в 1,8 раза, по сравнению с контролем (рис. 4). Клиностатирование ТОТ-а-активированных клеток, за это же время, вызывало двукратное увеличение экспрессии АСТВ. Однако наиболее выраженное увеличение экспрессии гена р-актина (в 3 раза) вызывала 24 часовая экспозиция на ИРМ (рис. 4), что указывает на увеличение локомоторной активности ЭК.

За счет своей механической нестабильности микротрубочки (МТ) также могут быть потенциальными участниками механотрансдукции. Спустя 1 час после начала эксперимента, МТ контрольных клеток образовывали густую решетчатую сеть, которая охватывала всю цитоплазму, распространяясь от центра клетки к ее периферии (рис. 5 а). На переднем крае клетки микротрубочки были четко окрашены (рис. 5 д). В это же время инкубация с ТЫР-а вызывала деполимеризацию периферической сети микротрубочек (рис. 5 б). Интенсивность флуоресценции р-тубулина снижалась на периферии клеток, МТ

истончались и иногда теряли свою направленность, извивались и образовывали петли (рис. 5 е). При экспозиции ЭК на ЯРМ в течение часа вместо длинных яркоокрашенных МТ, тянущихся по всей цитоплазме, наблюдалось только несколько нитей, доходящих до края клетки. Остальные МТ объединялись в крупные пучки и концентрировались вокруг клеточного ядра, оставляя периферию свободной (рис. 5 в). Цитоплазма ЭК имела диффузную окраску, что могло быть вызвано меченными свободными тубулиновыми субъединицами (рис. 5 ж). На переднем крае клеток также обнаруживались короткие МТ, являющиеся остатками от некогда развтвленной мощной сети МТ и свидетельствующие о деполимеризации тубулинового цитоскелета (рис. 5 ж). Экспонирование ТЫР-а-активированных ЭК на ЯРМ в течение 1 часа приводило к усилению изменений тубулинового цитоскелета, наблюдаемых при клиностатировании интактных ЭК: увеличение деполимеризации МТ вокруг ядра (рис. 5 г); появление агрегирующих тубулиновых субъединиц в перинуклеарной области; увеличение количества коротких МТ с хаотичной ориентацией на периферии клеток (рис. 5 з).

Изменения организации тубулинового цитоскелета, индуцированные ТЫР-а, сохранялись на протяжении 24 часов инкубации. На данном сроке инкубации большая часть р-тубулина ЭК находилась в виде деполимеризованных тубулиновых единиц, сконцентрированных, главным образом, вокруг ядра. Однако, МТ, обнаруживаемые на периферии клетки, хотя и оставались все еще укороченными, но приобретали правильную ориентацию (от центра к краю клетки) и не образовывали петель. Возможно, с этого момента начиналось восстановление нормальной организации МТ (рис. 6 б).

Диффузная окраска Р-тубулина вокруг ядра наблюдалась и в ЭК, подвергавшихся 24 часовому экспериментальному воздействию. На периферии клетки обнаруживались МТ, которых не наблюдалось в ЭК, экспонировавшихся на ЯРМ в течение часа. Однако, эти МТ не имели четкой направленности, образовывали хаотичную сеть по краям клеток (рис. 6 в). Наряду с этим, отмечалось резкое увеличение числа двуядерных клеток, которые образовывали кластеры и находились рядом друг с другом в общей массе одноядерных клеток.

Совместное действие изучаемых факторов приводило, с одной стороны, к образованию большого количества ламеллоподий в которых МТ ассоциированы в толстые ярко флуоресцирующие пучки, с другой стороны, в клетках, не образующих ламеллоподий, МТ концентрировались вокруг ядра и располагались в виде тонких нитей по периферии (рис. 6 д). Кроме того, наблюдаемые МТ были либо фрагментированы (указано стрелками), либо полностью потеряли свою нормальную ориентацию, вплоть до образования спиралей (рис. 6 д).

Рис. 2. Динамика изменения строения актинового цитоскелета ЭК через час после начала эксперимента: а - статический контроль; б - активация ТЫР-а (2 нг/мл), стрелками показано образование ламелло- и филоподий; в - экспозиция на ЯРМ, стрелками показано образование ламелло- и филоподий; г - экспозиция на ЯРМ активированных ТЫИ-а ЭК, стрелками показано образование волнистого края «раффл» и пучков Р-актина. Конфокальная микроскопия, масштабный отрезок 20 мкм.

Таблица 1. Жизнеспособность ЭК после 24 ч культивирования с добавлением ТЫ Р-а, экспозиции на !1РМ и их совместном действии, где среднее количество живых (РГ/АппУ), апоптотических (АгшУ+), некротических (РГ^) и на поздней стадии апоптоза (РГ/АппУ+), ЭК.

Статический контроль (2 нг/мл) КРМ ЯРМ+ ТКР-а

Р1+-клетки,% 0,4 ± 0,09 0,9 ± 0,34 0,4 ±0,13 0,5 ±0,10

Р1+/Апп\/+-кле1кн,% 2,1 ±0,81 6,4 ±3,12 1,3 ±0,35 1,5 ±0,70

Дп п У*-кл етк и, % 6,8 ± 2,20 3,4 ± 1,60 3,4 ± 0,72 3,7 ±1,10

РГ/АппУ"-клегки,% 90,8 ± 2,97 89,3 ±5,11 94,9 ± 0,93 94,2 ± 1,90

Статический ТМ О КРМ К■ IМ (!

^ контроль

Рис. 3. Динамика изменения строения актинового цитоскелета (24 ч): а - активация ТЫР-а (2 нг/мл), стрелками показаны «звездчатые структуры» и «микрошипы»; б - экспозиция на ЯРМ, стрелками показано образование вогнутого края и утрата клеточных контактов; в -экспозиция на ЯРМ активированных Т№-а ЭК, стрелками показано образование «глыб» Р-актина; г - средняя интенсивность флуоресценции Р-актина в ЭК, при различных воздействиях; М±5Е, *- р<0,05, различия достоверны по сравнению с контролем, # - р<0,05 различия достоверны по сравнению с ЯРМ+ТЫР-сс, ** - р<0,05 достоверные различия между группами.

Масштабный отрезок 20 мкм.

Рис. 4. Изменение относительного уровня экспрессии гена Р-актина в

ЭК после 24 часовой инкубации с ТОТ-а, экспозиции на ЯРМ и совместном воздействии. М±ЭЕ,*р<0,05- по сравнению со статическим контролем, #р<0,05- по сравнению с ТЫР-а-активированными ЭК,**р<0,05.

[-; 1ВИ и I сямкдм

Статический IЛТ > ИРМ RP.VI.TNf-а

контроль

Рис. 5. Динамика изменения строения тубулинового цитоскелета ЭК через час после начала эксперимента: а, д - статический контроль, строение МТ; б, е -активация ТОТ-а (2 нг/мл), строение МТ; в, ж - экспозиция на ИРМ, строение МТ; г, з экспозиция на ЯРМ активированных ТОТ-а ЭК, строение МТ. Конфокальная микроскопия. Масштабный отрезок 20 мкм.

I

Рис. 6. Динамика изменения строения тубулинового цитоскелета ЭК, спустя 24 ч от начала эксперимента: а - статический контроль, б - активация ТЫР-а (2 нг/мл); в -экспозиция на ЯРМ; г, д - экспозиция на РРМ активированных ТЫР-а ЭК, детальное строение МТ. Конфокальная микроскопия. Масштабный отрезок 20 мкм.

Жизнеспособность культивируемых эндотелиальных клеток при моделировании эффектов микрогравитации

Проведенный анализ жизнеспособности показал, что ТЫР-а в малых дозах не вызывает снижения доли живых клеток, по отношению к контрольным образцам (89,3% против 90,8%). Экспозиця на ЯРМ интактных и ТОТ-а-активированных (94,9% и 94,2%) не приводила к возникновению достоверных отличий от контрольных образцов (табл. 1).

Влияние моделирования эффестов микрогравитации на экспрессию поверхностных молекул эндотелиальных клеток.

Основные функции ЭК обеспечиваются межклеточными взаимодействиями: ваимодействие ЭК между собой лежит в основе ангиогенной и барьерной функций, а взаимодействие с клетками крови - иммунной функции. Регуляция межклеточного взаимодействия осуществляются за счет определенных поверхностных мембранных белков, экспрессирующихся конститутивно (антивоспалительный фенотип) или после индукции медиаторами воспаления (провоспалительный фенотип).

Профиль экспрессии молекул адгезии 1САМ-1 (СЭ54), УСАМ-1 (СОЮ6) и Е-селектина (С062Е) на поверхности ЭК после 24-часовой экспозиции интактных и ТЫР-а-активированных клеток на ЯРМ показал, что в нормальных условиях доля С062Е-положительных клеток составляла около 24% от всей популяции интактных ЭК (рис. 7 а). Изучаемые в работе воздействия вызывали постепенное увеличение экспрессии Е-селектина, однако, статистически значимое увеличение (в 3 раза по сравнению с контролем) наблюдалось при экспозиции на ЯРМ ТОТ-а-активированных клеток (рис. 7 а) (р = 0,0409). В связи с этим, можно предположить, что экспозиция на ЯРМ не способствует увеличению базальной экспрессии Е-селектина, однако потенцирует индуцированную экспрессию данного рецептора.

Используемая в работе культура ЭК характеризовалась отсутствием экспрессии молекулы сосудистого эндотелия 1-го типа (УСАМ-1) (рис. 7 б). Добавление ЮТ-а приводило к достоверному тридцатикратному увеличению доли СОЮ6+-клеток (р = 0,0431) после 24 часов культивирования в статических условиях (рис. 7 б). Экспозиция на ЯРМ той же длительности не вызывала появления данной молекулы на поверхности интактных ЭК и не изменяла долю СО 106+ ТХР-а-активированных клеток (р = 0,5001) (рис. 7 б).

Таким образом, все используемые в работе культуры ЭК адекватно реагировали на добавление ТЫР-а увеличением экспрессии 1САМ-1. Однако, базальный уровень экспрессии данного рецептора сильно варьировал в зависимости от донора. В связи с этим, положив в основу исходный уровень и степень увеличения экспрессии 1САМ-1 в ответ на добавление "ШР-сс, были выделены два типа клеточных линий: высокоэкспрессирующие (1 группа) и низкоэкспрессирующие (2 группа). Так, популяция интактных клеток 1-ой группы характеризовалась достоверно большей долей С054+- ЭК, чем во 2-ой группе (р = 0,0034) (рис. 8 а). 24-часовая инкубация с ТЫР-а способствовала тому, что практически вся популяция ЭК несла на своей поверхности 1САМ-1 в обеих группах (рис. 8 б). Однако степень выраженности провоспапительного эффекта была

разной: для 1 группы доля СЭ54+ - ЭК выросла в 1,6 раза (98,7%), а для 2 группы - в 9,6 раза (94,9%). Кроме этого, относительная интенсивность флуоресценции 2 группы клеток была выше, чем у 1-ой группы (рис. 8 в). Таким образом, активация ТЫИ-а приводила к увеличению экспрессии 1САМ-1 в обеих группах, однако во 2-ой группе этот эффект был более выраженный.

Рис. 7. Экспрессия Е-селектина (а)

культивирования с добавлением ТОТ-а (2 действии. Данные представлены М±8Е,*-контроля.

Статический контроль

и УСАМ-1 (б) на поверхности ЭК после 24 ч нг/мл), экспозиции на ЯРМ и их совместном <0,05 достоверные отличия от статического

ИРМ

Рис. 8. Экспрессия 1САМ-1 на поверхности различных групп ЭК после 24 ч культивирования в условиях статического контроля и 30 клиностатирования (а), при добавлении ТОТ-а (б), а также средняя интенсивность флуоресценции этой молекулы (в); \4iSE,*- р<0,05 - от статического контроля внутри 1-ой группы, **- р<0,05 - от статического контроля внутри 2-ой группы, # - р<0,05 - между группами.

Обнаруженные различия в исходном уровне экспрессии 1САМ-1 между ЭК разных типов, сохранялись и оставались достоверно отличимыми (р = 0,0192) после 24 ч экспериментального воздействия (рис. 8 а). Экспозиция на ЯРМ способствовала

увеличению доли С054+-клеток 2-ой группы (в 2 раза по сравнению с контролем, р = 0,0117) (рис. 8 б). В то же время ЗО клиностатирование достоверно снижало долю С054+-ЭК 1-ой группы (р = 0,0431). В отличие от интактных клеток, для ТКР-и-актшшрованных ЭК, экспонированных на ЯРМ, подобных изменений отмечено не было (рис. 8 б) и доля С054+-клеток была близка к 100%. Причем различий между группами также не наблюдалось. Однако результаты анализа средней флуоресценции на клетку говорят о том, что во 2-ой группе величина этого показателя была значительно выше, чем в 1-ой (рис 8 в). Эти данные подтверждают обоснованность разделения полученных первичных клеточных линий на две группы. Так, тенденция к более выраженному ответу клеток 2-ой группы на индукцию ТМГ-а сопровождалась достоверными изменениями (р = 0,0186) при моделировании эффектов микрогравитации на ЯРМ.

Исследование воздействия ЗО клиностатирования на экспрессию генов 1САМ1 и УСАМ! показало, что 24-часовая экспозиция на КРМ достоверно не изменяет экспрессию гена УСАМ! в интактных ЭК. 24-часовая инкубация с цитокином ТОТ-а приводила к наиболее выраженному увеличению уровня экспрессии УСАМ!, особенно в 1-ой группе клеток. Уровень экспрессии в этой группе в 600 раз превышал контрольные значения и был достоверно выше значений относительного уровня экспрессии для 2-ой группы (рис. 9 а). Экспозиция на ИРМ тон же длительности ТЫР-а-активированных ЭК отменяла характерную для статических условий разницу в уровнях экспрессии УСАМ! между высоко- и низкоэкспрессирующими клетками (рис. 9 а).

Моделирование эффектов микрогравнтации одновременно потенцировало эффект индуцированный ПМР-а во 2-ой группе и снижало в 1-ой группе клеток (рис. 9 а). Очевидно, что наблюдаемое увеличение уровня экспрессии гена УСАМ! во 2-й группе клеток согласуется с отмеченным ранее увеличением уровня поверхностной экспрессии, кодируемой этим геном молекулы УСАМ-1, в данной группе клеток (рис. 7 б).

Выявленная направленность изменения экспрессии гена УСАМ! сохранялась и для другой молекулы адгезии - 1САМ1. Так, 24-часовая экспозиция на ИРМ вызывала достоверные различия уровня экспрессии гена 1САМ1 между высоко- и низкопродуцирующнми клетками (рис. 9 б), что подтверждает наблюдаемые при ЗО клиностатировании различия доли С054+-ЭК между 1-ой и 2-ой группой (рис. 8 а). Кроме того, провоспалительная активация вызывала достоверно большее увеличение уровня экспрессии 1САМ1 в клетках 2-ой группы (рис. 9 б). Экспозиция на ЯРМ ТЫР-а-активированных ЭК не изменяла эффектов провоспалительной активации на экспрессию 1САМ! в 1 -ой группе клеток и потенцировала их во 2-ой (рис. 9).

■

Таким образом, экспериментальное моделирование эффектов микрогравитации in

vitro не является для эндотелиальных клеток сильным воспалительным стимулом, так как

не влияет на транскрипцию генов и экспрессию кодируемых ими молекул Е-селектина и

VCAM-1 на поверхности ЭК, однако, достаточно для того, чтобы способствовать

увеличению экспрессии 1САМ-1 интактных и TNF-a-активированных ЭК.

Рис. 9. Относительный уровень экспрессии генов УСАМЦа) и /САМ 1(f)) в ЭК после 24-часовой экспозиции на RPM, активации TNF-a и их совместном действии. Данные представлены как M±SE, в относительных единицах по отношению к контролю, принятому за 1 (черная линия). Достоверные отличия:

* - р<0,05 - внутри одной группы;

# - р<0,05 - между группами; ** - р<0,01 - между группами.

Уромиь экспрассим VCAM1

IlilL

• Группа 2

I-1 .

I

|Групп»2

Влияние моделирования эффектов микрогравитации на экспрессию VE-кадгерина

Главным регулятором свойств адгезивных контактов ЭК являются молекулы VE-кадгерина (Lampugnani, Resnati, Raiten et al., 1992). Анализ поверхностной экспрессии VE-кадгерина показал, что в 1-ой группе интактных ЭК доля CD144+ - клеток составляла около 78,8% (рис. 10). Контрольные образцы 2-ой группы напротив характеризовались достоверно более низким содержанием CD144+-3K (р = 0,0223) (рис. 10). После 24 часов инкубации с провоспалительным цитокином TNF-a не было выявлено изменения доли С0144+-клеток в обеих группах (р = 0,0202) (рис. 10). Экспозиция ЭК 1-ой группы на RPM в течение 24 часов не вызывала изменения доли С0144+-клеток (рис. 10). Во 2-ой группе первичных ЭК 24-часовая экспозиция на RPM, напротив, приводила к достоверному увеличению интактных и TNF-a-активированных С0144+-клеток (р = 0,0202) по сравнению с контрольными образцами (рис. 10).

Исследование экспрессии гена CDH5, кодирующего VE-кадгерин показало, что ЭК 1-ой группы характеризовались достоверно более высоким уровнем экспрессии CDH5 (р = 0,0001). При этом, изучаемые воздействия не вызывали значительных изменений экспрессии гена CDH5 в клетках 1-ой группы (рис. 11 а, б), что подтверждает отсутствие изменений доли CD144+-3K (рис. 10). Во 2-ой группе клеток 24-часовая экспозиция на

Г1РМ вызывала более чем двукратное увеличение экспрессии СВН5 (р = 0,0345) (рис. 11

а). При этом инкубация ЭК с ТОТ-сс длительностью 24 ч также вызывала достоверное

увеличение экспрессии гена (р = 0,015), кодирующего УЕ-кадгерин (рис. 11 б).

Рис. 10. Экспрессия УЕ-кадгерина на поверхности ЭК после 24 ч культивирования в условиях провоспалительной активации ТЫ К-а (2 нг/мл), экспозиции на ИРМ и их совместном действии; данные представлены М±5Е, достоверные отличия: # - р < 0,05 - между группами; * - р < 0,05 - от статического контроля.

к. АРМ а Ш , $ 4 § - 1'

0,92 _1 ■ Групп* 2 1 ' * Групп*

и * X 1, ■ .1

а Групп* 1 ГИ г!

0 12 14 Уромнк >хспр«сеии СОН5 ТМР-о ЯРМ+ТНР-О

Рис. 11. Экспрессия гена УЕ-кадгерина (СОН5) в ЭК после 24-часовой экспозиции на ИРМ (а), активации ТЫГ-а и их совместном действии (б). Данные представлены как М±5Е, в относительных единицах по отношению к контролю, принятому за 1 (черная линия). Достоверные отличия: * - р < 0,05 - относительно статического контроля; # - р < 0,05 - между группами ЭК.

При экспозиции на ЯРМ ТЫГ-а-активированных клеток 2-ой группы не удалось обнаружить отличий экспрессии СйН5 как относительно ТЫР-а-активированных клеток, находящихся в статических условиях, так и относительно 30 клнностатируемых интактных ЭК. В связи с этим, можно предположить, что клетки 1-ой группы находились в предактивированном состоянии и слабо реагировали на действие изучаемых в нашей работе факторов, в то время как клетки 2-ой группы адекватно отвечали на воздействие моделируемой микрогравитации и провоспалительной активации.

Влияние моделирования эффектов микрогравнтации на секрецию цитокннов эндотелиальными клетками Для оценки уровня цитокинов, участвующих и регулирующих процесс воспаления, был проведен мультиплексный иммуноферментный анализ кондиционированной среды ЭК. Скрининг показал, что уровни секреции большинства цитокинов были очень низкими или совсем не детектировались. Провоспалительная активация ЭК при 24-часовой

шМ

Статм*мский ТТ^-а РРН ирм«тар-а

инкубации с ТОР-а увеличивала секрецию 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-8. Наибольший интерес представляли 1Ь-6,11,-8, в связи с чем, их уровень в среде культивирования в дальнейшем измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.

Провоспалительная активация ЭК ТЫР-а приводила к повышению секреции 1Ь-8 в 1-ой группе в 3,2 раза выше контроля (р = 0,0001), тогда как для 2-ой группы - в 12,6 раза (р = 0,0001) (рис. 12 а). Моделирование эффектов микрогравитации в течение 24 часов практически не влияло на синтез 1Ь-8 в обеих группах. В клетках 1-ой группы ЗИ клиностатирование не отменяло действия провоспалительной активации ЮТ-а, оставляя уровень секреции 11,-8 выше контрольных значений (р = 0,0001). Во 2-ой группе наблюдалась лишь тенденция к увеличению секреции 1Ь-8 активированными клетками, экспонированными на ЯРМ. Стоит отметить, что 30 клиностатирование не изменяло уровень секреции 1Ь-8: наблюдаемая разница между двумя группами после индукции ТОТ-а сохранялась (р = 0,0001) (рис. 12 а).

Рис. 12. Уровень секреции ИЛ-8 (а) и ИЛ-6 (б) в ЭК после 24 часов культивирования в стандартных условиях, при добавлении Т^-а (2 нг/мл), моделировании эффектов микрогравитации и их сочетанием действии. Данные представлены в условных единицах по отношению к контрольным значениям, принятым за 1, М±БЕ. Достоверные отличия: * -р < 0,01 от статического контроля; # - р < 0,01 - между группами.

Схожие закономерности наблюдались и для секреции 1Ь-6. В кондиционированной

среде ТОТ-а-активированных клеток отмечалось увеличение содержания 11,-6 в 2,9 раза (р = 0,0001) в 1-ой группе и в 7,1 раза (р = 0,0005) во 2-ой группе, относительно контроля (рис. 12 б). Интересно, что ЭК 2-ой группы отвечали на провоспалительную активацию значительно сильнее (р = 0,0007), хотя базальный уровень секреции 11,-6 был практически не различим. Моделирование эффектов микрогравитация не изменяло уровень секреции данного цитокина в обеих группах, сохраняя контрольные значения. 24 часовая экспозиция на ИРМ совместно с провоспалительной активацией приводила к увеличению секреции 1Ь-6 по отношению к интактным клеткам (р = 0,0001; р = 0,0001 для 1-ой и 2-ой группы соответственно), но не отличалась от уровня, детектируемого в ТОТ-а-активированных клетках обеих групп (рис. 12 б).

Исследование влияния провоепалительной активации и моделирования эффектов

микрогравитации на экспрессию генов IL8 и IL6 в тех же первичных клеточных группах

показало, что 24-часовая инкубация с TNF-a вызывала резкое увеличение экспрессии

генов IL8 и IL6, причем изменения были однонаправленны для обеих групп (рис 13).

Рис. 13. Относительный уровень экспрессии генов IL8 (а) и IL6 (в) в ЭК после 24-часовой экспозиции на RPM, активации TNF-a и их совместном действии. Данные представлены как M±SE, в относительных единицах по отношению к контролю, принятому за 1 (черная линия). Достоверные отличия: * - р < 0,05 - по отношению к статическому контролю; # - р< 0,05 - между группами; ** - р< 0,01 - внутри одной группы.

Под действием провоепалительной активации экспрессия гена 1L8 в 1-ой группе увеличилась в 12,8 раза (р = 0,0001), тогда как во 2-ой - в 59,6 раза (р = 0,0001). Отмеченный провоспалительный эффект TNF-a на экспрессию гена IL6 был менее выражен, чем для IL8. В 1-ой группе наблюдалось лишь незначительное достоверное увеличение уровня мРНК IL6 (1,5 раза, р = 0,0001), тогда как во 2-ой группе наблюдалось пятикратное увеличение данного показателя (р = 0,0453) по сравнению с интактными клетками (рис. 13 б). Эти данные согласуются с наблюдаемым нами увеличением содержания IL-6 и IL-8 в кондиционированной среде ЭК в условиях провоепалительной активации (рис. 12).

24-часовая экспозиция на RPM достоверно не изменяла экспрессию гена 1L8 и незначительно снижала экспрессию гена IL6 (р = 0,0013) во 2-ой группе ЭК (рис. 13). Экспозиция на RPM той же длительности TNF-a-активированных ЭК не отменяла эффектов провоепалительной активации на транскрипцию изучаемых генов, а экспрессия IL8 в 1-ой группе оставалась на уровне (р = 0,292) TNF-a-индуцированных клеток, находящихся в условиях статического контроля (рис. 13 а). В то же время совместное действие 3D клиностатирования и провоепалительной активации вызывало трехкратное увеличение уровня мРНК 1L8 во 2-ой группе клеток (р = 0,0004) по отношению к TNF-a-индуцированным образцам (рис. 13 а). При анализе экспрессии 1L6 в TNF-a-индуцированных ЭК обеих групп, находящихся в условиях экспозиции на RPM,

h RPM 0.8 ■ Групп«} 0 1 . г 1 ■ 1 | а Групп* 1 ■ Групп» 2 гЛ гЛ TNF-а ftPM+TNF-e

В Групп* 1 1.4

Уро в*нь экспрессж Lt

■ RPM 3.62 _J ■Групп» 2 О Групп* 1 0.83 1 г • : » » ' 1 1' " . б 1... ri ri

Уровень экспресс им И TNF-a RPM+THF-0

подобного эффекта отметить не удалось. Транскрипция гена IL6 в таких клетках не отличалась в TNF-a-активированных ЭК в статических условиях (рис. 13 б). Интересно отметить, что значения исходного уровня экспрессии генов рассматриваемых цитокинов в разных первичных клеточных линиях были близкими, следовательно, паракринная активность активированных ЭК зависит от индивидуальных особенностей первичных культур.

Таким образом, мы показали, что моделирование эффектов микрогравитации не влияет на экспрессию генов и секрецию молекул IL-6 и IL-8 в интактных эндотелиапьных клетках. Экспозиция на RPM не отменяет TNF-a-индуцированное увеличение экспрессии и секреции данных цитокинов, а в случае с IL-8 способствует увеличению транскрипции гена этого цитокина.

Проведенные исследования позволили установить, что моделирование эффектов микрогравитации изменяет адгезионные свойства ЭК, что сопровождается увеличением экспрессии некоторых поверхностных маркеров экспрессией, необходимых как для осуществления межклеточных взаимодействий, так и обеспечения барьерной функции (ICAM-1, VE-кадгерин). При этом, на ранних этапах экспозиции на RPM происходит реорганизация актинового и тубулинового цитоскелета, которая сохраняется на протяжении 24 часов и сопровождается изменением экспрессии гена структурного белка АСТВ, разрушением периферической сети «быстрых» МТ и появлением двуядерных клеток. Эти изменения указывают на увеличение подвижности ЭК, нарушение пролиферации и целостности монослоя, что ведет к барьерной дисфункции.

В нашей работе впервые использована модель активации ЭК цитокином TNF-a при экспозиции на RPM, что отражает условия возможного провоспалительного микроокружения в ходе реального космического полета (Crucian, Zwart, Mehta et. al., 2014). Нами было показано, что моделирование эффектов микрогравитация потенцирует TNF-a-индуцированное увеличение экспрессии генов молекул межклеточной адгезии и провоспалительного цитокина IL-8. Суммируя полученные данные, можно предположить, что микрогравитация на фоне воспалительной реакции может приводить к барьерной дисфункции ЭК и усиленной инфильтрации подлежащих тканей.

Выводы

1) Рандомизация положения культивируемых ЭК относительно вектора гравитации (24 часа) приводит к изменению морфологии и нарушению целостности монослоя интактных эндотелиапьных клеток вследствие ремоделирования тубулинового и актинового цитоскелета, которое характеризуется деполимеризацией и изменением ориентации микротрубочек, образованием «звездоподобных» пучков стресс-фибрилл в

области межклеточных контактов и увеличением экспрессии гена АСТВ. В TNF-a-активированных и экспонированных на RPM ЭК наблюдаются более выраженные изменения исследуемых компонентов цитоскелета.

2) Применяемая в работе модель провоспалительной активации эндотелиальных клеток in vitro, моделирование эффектов микрогравитации и совместное действие данных факторов в течение 24 ч не снижает жизнеспособность первичных эндотелиальных клеток из пупочной вены человека.

3) Культивируемые эндотелиальные клетки не отличаются по исходному уровню экспрессии молекул РЕСАМ-1 и Е-селектина. Экспозиция на RPM не изменяет экспрессию молекулы РЕСАМ-1 на поверхности интактных и TNF-a-активированных клеток. В то же время, после экспериментального воздействия наблюдается тенденция к увеличению экспрессии Е-селектина на поверхности интактных клеток, а доля TNF-a-активированных клеток, несущих данный маркер, достоверно увеличивается.

4) Сосудистые эндотелиальные клетки в первичной культуре могут быть «предактивированными» («высокоэкспрессирующая» группа) и «неактивированными» («низкоэкспрессирующая» группа), отличающимися по базальному и TNF-a-индуцированному уровню экспрессии молекул 1САМ-1, VCAM-1 и VE-кадгерина.

5) Моделирование эффектов микрогравитация вызывает увеличение адгезивных свойств эндотелиальных клеток «низкоэкспрессирующей» группы, что сопровождается увеличением транскрипции гена и экспрессии молекул ICAM-1 и VE-кадгерина на поверхности интактных клеток. При этом происходит потенцирование TNF-a-индуцированной экспрессии генов молекул межклеточной адгезии и молекулы адгезивных контактов.

6) Экспозиция на RPM не вызывает синтеза провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в культивируемых эндотелиальных клетках, не отменяет TNF-a-индуцированную экспрессию генов и секрецию данных цитокинов, однако, в TNF-a-активированных клетках «низкоэкспрессирующей» группы вызывает достоверное увеличение транскрипции гена IL8.

7) Краткосрочное моделирование эффектов микрогравитации само по себе не является для ЭК провоспалительным стимулом, в отличие от TNF-a.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Рудимов Е.Г., Погодина М.В., Буравкова Л.Б. Влияние моделируемой микрогравитации на секреторную активность культивируемых эндотелиапьных клеток человека. // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2014. - Т. 48. - №3. - С. 30-35.

2. Руднмов Е.Г., Буравков СВ., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Влияние провоспалительной активации на распределение F-актина культивируемых эндотелиапьных клеток человека в условиях моделируемой микрогравитации. // Клеточные технологи в биологии и медицине. - 2014. - №4. - С. 260-267.

Тезисы:

1. Rudimov E.G., Andreeva E.R., Buravkova L.B. Adhesion molecule expression in human endothelial cells under simulated microgravity conditions. // Proceedings "Life in space for life on Earth", Aberdeen, United Kingdom. - 2013. - Vol. 706. - № El 1690/706.

2. Рудимов Е.Г., Гальчук С.В. Использование микроспектрофлуориметрии для исследования функционального состояния клетки в условиях микрогравитации. // Материалы X конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию со дня первого полета человека в космос, г. Москва, 2011. С. 58-59.

3. Гальчук С В., Григорьева О.В., Рудимов Е.Г., Буравкова Л.Б. Наземная подготовка полетного эксперимента «Биосигнал». // Актуальные проблемы Российской космонавтики. Труды XXXV академических чтений по космонавтике, г. Москва, 2011. С. 600-603.

4. Гальчук С В., Григорьева О.В., Рудимов Е.Г., Буравкова Л.Б. Экспериментальные подходы и аппаратура для динамического анализа состояния внутриклеточных систем в условиях космического полета. // Сборник материалов Космического форума 2011, посвященного 50-летию полета в космос Ю.А.Гагарина, г. Москва, 2011. С. 151.

5. Рудимов Е.Г. Культивирование эндотелиальных клеток в искусственных кровеносных сосудах на основе полидиметилсилоксана. // Материалы XI Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики, г. Москва, 2012. С. 40-41.

6. Рудимов Е.Г., Андрианова И.В., Буравкова Л.Б. Использование метода 3D клиностатирования для исследования синтеза молекул адгезии культивируемыми эндотелиальными клетками человека. // Актуальные проблемы российской космонавтики. Материалы XXXVII академичских чтений по космонавтике. Москва, 2013. С. 619-620.

7. Рудимов Е.Г. Изменение экспрессии молекул адгезии и актинового цитоскелета в эндотелиальных клетках человека при моделировании условий микрогравитации in vitro. // Материалы XII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН. г. Москва, 2013. С. 42-43.

8. Рудимов Е.Г., Ударцева О.О., Григорьева О.В. Влияние моделируемой микрогравитации на строение цитоскелета, миграцию и синтез молекул адгезии эндотелиальными клетками человека. // Материалы XIV Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием, г. Москва, 2013. С. 129.

9. Рудимов Е.Г., Ударцева О.О., Григорьева О.В., Буравкова Л.Б. Эффекты переменного вектора силы тяжести на экспрессию молекул адгезии и миграцию культивируемых эндотелиальных клеток. // Материалы XXII съезд физиологического общества им.И.П.Павлова. г. Волгоград, 2013. С.450-451.

10. Рудимов Е.Г. Секреторная активность культивируемых эндотелиальных клеток человека в условиях моделируемой микрогравитации. // Материалы XIII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию полета первого в мире врача-космонавта Б.Б.Егорова, г. Москва, 2014. С.42-43.

11. Rudimov E.G., Pogodina M.V., Andrianova I.V., Buravkova L.B. Impact of simulated microgravity on the secretory and adhesive activity of cultured human vascular endothelial cells. II Abstract book 40th Scientific Assembly COSPAR "COSMOS". Moscow, 2014. F5.5-6-14

12. Rudimov E., Buravkov S., Pogodina M., Buravkova L. Effects of simulated microgravity on endothelial inflammatory response. // Abstract book 6th International Congress of Medicine in Space and Extreme Environments (¡CMS). Berlin, Germany, 2014. P3.5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭК - эндотелиалъныс клетки

IL-6 - интерлейкин-6

IL-8 - интерлейкин-8

CD - кластер дифферекцировки

FITC - флуоресцеина изотиоцианат (Fluorescein Isothyocyanatc) РЕ - фикоэретрин

РЕСАМ-1 - тромбоцитарно-эндотелиальными молекулами клеточной адгезии 1-го типа

ICAM-1 - молекула межклеточной адгезии 1-го типа

VCAM-1 - молекула адгезии сосудистого эндотелия 1-го типа

TNF-a - фактор некроза опухоли-альфа (tumor necrosis factor alpha)

ERK - киназа регулируемая внеклеточными сигналами

Р38 - группа стресс-актив ируемых протеинкиназ (семейство МАРК)

JNK - c-Jun N-концевая киназа (семейство МАРК)

МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы

RPM - Random positioning machine

Подписано в печать:

01.09.2015

Заказ № 10914 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru