Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка методик идентификации и определения содержания иридоидов в лекарственном растительном сырье

На правах рукописи

ЖОГОВА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ИРИДОИДОВ В ЛЕКАРСТВЕННОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 9 АПР 2015

005567875

Москва - 2015

005567875

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Самылина Ирина Александровна - член-корр. РАН, доктор фармацевтических наук, профессор.

Эллер Константин Исаакович - доктор химических наук, профессор. Официальные оппоненты:

Сливкин Алексей Иванович - доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет».

Куркин Владимир Александрович - доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Ведущая организация: ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России.

Защита состоится « Л-Л&иЯ_ 2015г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49 и на сайте ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова http://www.mma.ru

Автореферат разослан «» (¿¡^гОЛЛ? 2015 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор

Демина Наталья Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Иридоиды - это вторичные метаболиты растений и некоторых животных, по структуре являющиеся циклопентапирановыми монотерпенами. Все иридоиды имеют выраженный горький вкус и относятся к горечам, веществам, имеющим многовековую историю применения в официнальной и народной медицине в качестве средств, стимулирующих аппетит и улучшающих пищеварение, желчегонных,

противовоспалительных, противомикробных, ранозаживляющих и седативных средств. Исследования фармакологических свойств иридоидов, выделенных из растений, показали, что они обладают широким спектром биологической активности, в частности, противовоспалительной, противомикробной, иммуномодуляторной, нейро-, гепатопротекторной, гипогликемической и гиполипидемической, антиоксидантной, спазмолитической, противоопухолевой, противовирусной,

противоаллергической и др.

Лекарственные растения (ЛР), содержащие иридоиды, включены в ведущие мировые Фармакопеи. Стандартизация лекарственного иридоид-содержащего сырья, включенного в отечественные Фармакопеи, производится по содержанию других, менее специфичных, групп биологически активных веществ (БАВ) - флавоноидов (листья вахты трехлистной), ксантонов (трава золототысячника), полисахаридов (листья подорожника большого) и др., тогда как доступные методы количественной оценки собственно иридоидных гликозидов в настоящее время практически отсутствуют. В приложении к Государственной фармакопее (ГФ) XI издания предложен неселективный спектрофотометрический метод определения суммарного содержания иридоидов, основанный на реакции со щелочным раствором гидроксиламина и хлоридом железа III (гидроксамовая проба), вошедший в дополнение к фармакопейной статье (ФС) «Трава пустырника сердечного». Это определяет актуальность разработки новых подходов к стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС), содержащего иридоиды, и лекарственных препаратов (ЛП) из него с применением современных физико-химических методов анализа, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым (УФ) и/или масс-детектированием.

Степень разработанности темы исследования. В отечественной литературе представлены данные по качественному обнаружению иридоидов в лекарственном растительном сырье методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), не обладающим достаточной эффективностью разделения близких по структуре компонентов. Для количественного определения в сырье пустырника и подорожника предлагается неселективный спектрофотометрический метод определения суммарного содержания иридоидов после проведения гидроксамовой пробы. Однако до настоящего времени в РФ не было проведено исследований состава и содержания индивидуальных специфических иридоидов отечественного фармакопейного

сырья с использованием современных высокоспецифичных и селективных физико-химических методов анализа, таких как ВЭЖХ с УФ- и масс-спектрометрическим (МС) детектированием.

Цель и задачи исследования. Целью работы является разработка методик идентификации, определения содержания иридоидов и изучение химического состава других БАВ растительного сырья и ЛП (листьев вахты трехлистной, травы пустырника, листьев подорожника большого, ланцетного и среднего, плодов кизила обыкновенного) с использованием метода ВЭЖХ.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ научной литературы по теме исследования.

2. Подобрать оптимальные условия пробоподготовки и ВЭЖХ анализа иридоидов.

3. Разработать и валидировать методики идентификации и определения содержания иридоидов в изучаемом сырье и препаратах из него методом ВЭЖХ.

4. С использованием разработанных методик определить состав и содержание иридоидов в сырье и препаратах вахты трехлистной, пустырника пятилопастного, пустырника сердечного, видов подорожника, кизила обыкновенного.

5. Провести сравнительный анализ состава иридоидов и выявить маркерные соединения для каждого вида ЛРС.

6. Провести сравнительное изучение состава и содержания других БАВ (флавоноидов, гидроксикоричных кислот (ГКК)) в растительном сырье.

Научная новизна результатов исследования. Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения иридоидов методом ВЭЖХ с УФ- и МС- детектированием в растительном сырье и ЛП вахты трехлистной, пустырника пятилопастного, пустырника сердечного, видов подорожника, кизила обыкновенного. Выявлены закономерности и подобраны оптимальные условия экстракции иридоидных гликозидов из растительного сырья. Получены новые данные по идентификации и определению содержания иридоидов, флавоноидов, ГКК методом ВЭЖХ при совместном присутствии в изучаемом сырье. Выявлены иридоидные маркеры растительного сырья: дигидрофолиаментин, фолиаментин, ментиафолин в листьях вахты трехлистной; гарпагид, гарпагида ацетат, галиридозид, аюгол, аюгозид в траве пустырника; аукубин, каталпол для видов подорожника; корнузид в плодах кизила обыкновенного.

Теоретическая значимость работы. Разработаны общие подходы к анализу иридоидов различных классов методом ВЭЖХ с УФ- и МС-детектированием. Представленный в работе экспериментальный материал может служить теоретической базой для дальнейшего исследования состава и содержания иридоидов ЛРС.

Практическая значимость работы. Разработанные оригинальные методики представляют практический интерес для идентификации и оценки качества иридоид-содержащего растительного сырья и продуктов его

переработки, а также оценки распространенности иридоидов в растительном сырье. Разработанные методики используются в ФГБНУ «НИИ питания» при проведении гигиенической экспертизы продукции, подлежащей государственной регистрации. Материалы исследования внедрены в учебный процесс на кафедре фармакогнозии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Методология и методы исследования. Объектами исследования являлись образцы высушенного сырья, заготовленные в различных регионах, а также ЛП листьев вахты трехлистной, травы пустырника, листьев подорожника большого, ланцетного и среднего, свежие плоды кизила обыкновенного. Методология исследования заключалась изучении и обобщении литературных данных по теме исследования, оценке степени разработанности и актуальности темы, постановке цели и задач исследования по разработке методик анализа, идентификации и определении содержания иридоидов и других БАВ ЛРС, формулировании выводов, определяющих теоретическое и практическое значение результатов работы. При выполнении работы использован метод ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием (ДМД), детектированием на времяпролетном масс-селективном детекторе с ионизацией электрораспылением (ESI-TOF-MC) и тандемном МС-детекторе типа тройной квадруполь. Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с требованиями ГФ XII изд. (ОФС 42-0111-09. Статистическая обработка результатов химического эксперимента) с использованием программы «Microsoft Excel 2010». Разработанные методики валидировали согласно ОФС ГФ XII изд. «Валидация фармакопейных методик» (ОФС 42-0113-09) и рекомендациям ICH.

Степень достоверности результатов. Научные положения и выводы основаны на достаточном количестве экспериментальных исследований. В работе использовалось современное сертифицированное оборудование, разработанные методики валидированы по следующим критериям: специфичность, линейность, предел обнаружения и предел количественного определения, правильность, прецизионность. Достоверность первичных материалов подтверждена их экспертной оценкой. Научные положения, выводы и практические рекомендации обоснованы и логически вытекают из результатов эксперимента. В исследовании использован достаточный объем литературных источников, как отечественных, так и иностранных авторов.

Личный вклад автора. При непосредственном участии автора были определены цели и задачи исследования, разработаны методологические подходы к их выполнению. Автором был проведен анализ научной литературы, отечественной и зарубежной нормативной документации. Автору принадлежит ведущая роль в разработке и валидации методик анализа, работе по идентификации и определению содержания основных БАВ в исследуемых объектах, статистической обработке и анализе полученных результатов, написании публикаций по теме исследования. Диссертация и автореферат написаны автором лично.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Научные положения диссертационной работы соответствуют формуле специальности 14.04.02 — «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 6 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований». Номер государственной регистрации 01.2.00606352.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендуемых ВАК России.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на XVI -XVIII Международном съезде «РЬуЮрЬапп» (2012 - 2014 гг.), конференции НИИ Фармации «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» (28 февраля 2013 г., г. Москва), научно-методической конференции «II Гаммермановские чтения» (3-6 февраля 2014 г., г. Санкт-Петербург); XXIII - XXV Московских международных гомеопатических конференциях «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (2013 - 2015 гг., г. Москва), XIV Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Алиментарно-зависимая патология: предиктивный подход» (3-5 декабря 2013 г., г. Москва), Международном фармацевтическом форуме молодых ученых России и Германии «Новое поколение в фармации»(11-12 ноября, 2014, г. Москва), на научных конференциях кафедры фармакогнозии ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (2012-2014 гг.).

Апробация диссертации проведена на кафедре фармакогнозии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (18 декабря 2014 г., г. Москва). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Данные по разработке методик идентификации и определения содержания иридоидов в растительном сырье и ЛП методом ВЭЖХ.

2. Результаты идентификации и количественного определения иридоидов в изучаемом растительном сырье (листья вахты трехлистной, трава пустырника, листья видов подорожника, плоды кизила обыкновенного) и ЛП.

3. Результаты идентификации и определения содержания других БАВ (флавоноидов, ГКК) в изучаемом сырье.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 168 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, пяти экспериментальных глав, выводов

и библиографического указателя, включающего 133 источника, из которых 98 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 44 таблицами, включает 3 приложения.

Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследования, охарактеризована научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы. Первая глава представлена обзором литературы, в котором даны общие сведения об иридоидах, их структуре, свойствах и распространенности. Дана характеристика объектам исследования, оценен уровень стандартизации исследуемого растительного сырья в отечественной нормативной документации (НД). Проведено сравнительное изучение методов оценки иридоидов JIPC и ЛП в отечественной и зарубежной НД. Дана характеристика современным физико-химическим методам, использующимся в анализе иридоидов растительного сырья, описаны подходы к валидации аналитических методик. Вторая глава описывает объекты и методы исследования. Третья, четвертая и пятая главы посвящены разработке и валидации методик идентификации и определения содержания иридоидов в ЛРС (листьях вахты трехлистной, траве пустырника, листьях подорожника большого, ланцетного и среднего) и препаратах из него. Подобраны оптимальные условия пробоподготовки и ВЭЖХ анализа иридоидов. С использованием разработанных методик определен состав и содержание иридоидов в ЛРС и препаратах. С использованием метода ВЭЖХ изучен состав и содержание других БАВ (флавоноидов, ГКК). Шестая глава посвящена изучению состава и определению содержания иридоидов в плодах кизила обыкновенного. В седьмой главе проведено сравнительное изучение состава и содержания иридоидов и других БАВ растительного сырья.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследования являлись образцы высушенного сырья, заготовленные в различных регионах (Московской, Владимирской, Воронежской областях, Краснодарском крае, Чувашской республике, в Болгарии), а также ЛП листьев вахты трехлистной, травы пустырника, листьев подорожника большого, ланцетного и среднего; свежие плоды кизила обыкновенного (Тамбовская область, Кавказский регион).

Хроматографическая система. В анализе БАВ нами был использован жидкостной хроматограф Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, США) с дегазатором, насосом, обеспечивающим одновременную подачу 2-х растворителей, устройством для автоматического ввода проб (автосемплером), термостатом хроматографических колонок, ДМД Agilent 1100 Series Diode Array, ESI-TOF-MC-детекторе Agilent 6200 и программным обеспечением обработки хроматографических данных Mass Hunter. Структуру отдельных иридоидов, ГКК и флавоноидов дополнительно подтверждали фрагментацией на тандемном масс-спектрометре типа тройной квадруполь Agilent G6410.

Стандартные образцы. При разработке методик и проведении аналитических исследований в качестве стандартных образцов (СО) использовались коммерчески доступные индивидуальные вещества: аукубин (>97,0%, «Sigma-Aldrich»), каталпол (>96,0%, «Sigma-Aldrich»), логанин (>97,0% «Sigma-Aldrich»),гариагид (>99,0%, «PhytoLab»), рутина тригидрат (>95,0%«Fluka»), гиперозид (>95,0% «Fluka»), цинарозид (>98,0%, «Sigma-Aldrich»), хлорогеновая кислота (>95,0%, «Sigma-Aldrich»), кофейная кислота (>98,0%, «Sigma-Aldrich»),

ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА БАВ В ЛИСТЬЯХ ВАХТЫ ТРЕХЛИСТНОЙ

Разработка методики идентификации и количественного определения иридоидов в пересчете на логанин в листьях вахты трехлистной

Листья вахты содержат десятиуглеродные (С-10) иридоидные гликозиды, секоиридоиды и их дитерпеновые производные, содержащие в структуре сопряженные двойные связи и имеющие схожие спектры поглощения в УФ-области с максимумами в диапазоне 235-245 нм. Разработана ВЭЖХ методика с УФ- и ESI-TOF-MC-детектированием для идентификации и определения содержания иридоидов в пересчете на логанин в сырье и препаратах вахты трехлистной (измельченное сырье в пачке). Подобраны оптимальные условия извлечения иридоидов из JIPC и ЛП. Изучено влияние состава экстрагента (вода, водно-этанольные растворы) и времени экстракции на полноту извлечения иридоидов. Наиболее полное извлечение было получено экстракцией 30% этанолом в течение 60 минут на кипящей водяной бане с обратным холодильником. Настои готовили из промышленных образцов измельченного сырья согласно инструкции на упаковке.

Оптимизированы условия разделения иридоидов на колонке с обращенной фазой с использованием градиентного элюирования водой с ацетонитрилом и/или метанолом с добавлением в качестве модификаторов подвижной фазы летучих кислот (муравьиной, уксусной), УФ- и ESI-TOF-МС-детектирования. Наилучшие параметры хроматографического разделения были получены при использовании градиентного элюирования водой и метанолом, содержащих 0,1% муравьиной кислоты, и расходе элюента 0,8 мл/мин. Общее время анализа составило 45 мин. Аналитическая длина волны —235 нм. Сканирование масс проводили в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне m/z 150-1000.

Относительная ошибка единичного определения с 95 % доверительной вероятностью составила от 1,2 до 4,8%. Относительная ошибка при проведении анализа в трех повторностях не превышает ±2,8%. Методика валидирована по критериям специфичности, линейности, правильности, сходимости и промежуточной прецизионности. В выбранном диапазоне применения методики (0,1 - 12,5мг/г сырья) зависимость сигнала детектора от содержания логанина линейная с коэффициентом корреляции 0,9999. Предел обнаружения составил 7,5 мкг/г, предел количественного

определения - 25 мкг/г. Правильность методики доказывалась методом добавок. Величина относительного стандартного отклонения (3,6%) свидетельствует об отсутствии систематической ошибки. Фактор отклика с 95% доверительной вероятностью составляет 95,2 - 100,7%. Сходимость результатов была показана на 6 подготовленных пробах из однородного образца (относительное стандартное отклонение - 0,40%). Для оценки промежуточной прецизионности использовался набор данных, полученных в другой день вторым сотрудником лаборатории. Для двух серий измерений рассчитывались коэффициенты Фишера (Р) и Стьюдента (0 и сравнивались с табличными значениями. Поскольку Рра(:,|ит. (2,82)< Б табл. (5,05 при Г=5 и Р=95%), а 1расчит* (0,88)5 I табл. (2,23 при 1=5 и Р=95%), то дисперсии однородны, а различия между их средними значениями не значимы. Проведенные исследования показали, что разработанная методика валидна по выбранным критериям.

С использованием разработанной методики определен состав и содержание основных иридоидов в сырье, заготовленном в различных регионах, и препаратах вахты трехлистной (измельченные листья). Хроматограмма извлечения из листьев вахты трехлистной представлена на рис. 1.

Response Units vs. Acquisition Tima (min)

Рисунок 1. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 235 нм) извлечения вахты трехлистной. 1 - логаниновая кислота, 2- секологаниновая кислота, 3 -изомер логанина, 4 - сверозид, 5 - логанин, 6,7 - ментиафолин/ фолиаментин, 8 - дигидрофолиаментин. Хл - хлорогеновая кислота.

Содержание иридоидов в ЛРС составило от 1,38 до 2,65%. Во всех образцах преобладали дигидрофолиаментин (0,37 - 1,09%), секологаниновая кислота (0,47 - 1,07%) и иридоидный гликозид-изомер логанина (0,15 -0,27%). Идентифицированы логаниновая кислота (0,02 - 0,04%), логанин (0,01 - 0,04%), сверозид (0,01 - 0,03%). Обнаружены пики по масс-спектрам соответствующие двум изомерным соединениям: фолиаментину и ментиафолину (0,14 - 0,28%). Определено содержание иридоидов в настоях из промышленных образцов измельченного сырья вахты трехлистной (37,9 мг% и 75,2 мг%), степень перехода иридоидов в водные извлечения составила 51,2 и 63,4%.

На основании полученных данных предложено включить в проект фармакопейной статьи на листья вахты трехлистной показатель содержания иридоидов и его норму - не менее 1,2%, а также методику его определения.

Определение состава и содержания гидроксикоричных кислот и флавоноидов листьев вахты трехлистной

С целью комплексного анализа изучаемого ЛРС и выявления возможных маркеров определен состав и содержание флавоноидов и ГКК методом ОФ-ВЭЖХ с УФ- и МС-детектированием. Получены извлечения 50% этанолом. Хроматограммы представлены на рис.2 и 3.

хЮ 2

2

1.5

1

0.5

Рисунок 2. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 365 нм) извлечения из листьев вахты трехлистной. 1 -рутин, 2 - гиперозид, 3 - изокверцитрин , 4 -никотифлорин.

хЮ3 1.2

10.80.60.40.2-

Рисунок З.ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 330 нм) извлечения из листьев вахты трехлистной. 1 - неохлорогеновая кислота, 2 -хлорогеновая кислота, 3 — 4-кофеоилхинная кислота, 4,5 — изомеры дикофеоилхинной кислоты.

Результаты анализа показали, что в листьях вахты трехлистной преобладает рутин (0,12 - 0,16%), содержание гиперозида составило 0,04 -0,08%, изокверцитрина - 0,02 - 0,04%, никотифлорина - 0,02 - 0,04%. Суммарное содержание флавоноидов в исследованных образцах листьев вахты трехлистной составило 0,21 - 0,31%. Суммарное содержание производных ГКК в исследованных образцах листьев вахты трехлистной

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Регпопбе итэ уб. Асаи^Шоп "Пте (гтап!

составило 0,43 - 0,86%. В сырье преобладает хлорогеновая кислота (0,28 -0,41%), содержание 4-кофеоилхинной кислоты составило 0,02 — 0,04%, неохлорогеновой кислоты - 0,01 - 0,02%, дикофеоилхинных кислот - 0,10 -0,40%.

ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА БАВ ТРАВЫ ПУСТЫРНИКА

Разработка методики идентификации и количественного определения иридоидов в пересчете на гарпагид в траве пустырника

Иридоиды пустырника относятся к девятиуглеродным (С-9) иридоидным гликозидам. У данных соединений отсутствуют хромофорные группы, что делает малоинформативным и неспецифичным УФ-детектирование. Получение достоверных результатов возможно с использованием МС-детектора. Разработана ВЭЖХ методика cESI-TOF-MC-детектированием для идентификации и определения содержания иридоидов в пересчете на гарпагид в сырье и препаратах травы пустырника (измельченное сырье в пачке, сырье в фильтр-пакетах, настойки). Чтобы исключить возможность неконтролируемых изменений абсолютных интенсивностей сигналов во времени при использовании данного типа детектора, для количественного определения был использован метод внутреннего стандарта (IS). В качестве стандарта иридоидов пустырника использовали гарпагид, в качестве IS - близкий по структуре к иридоидам пустырника С9 иридоидный гликозид - аукубин (рис. 4)._________

_Гарпагид

— Аукубин

- V

< * i i Í .,4 ¿ г. .i-, ú л н ijv'z ¿ ,!■- j tV-A.

Рисунок 4. Хроматограмма выделенных ионов [М+Ыа]+СО гарпагида и внутреннего стандарта аукубина с концентрацией 1 мкг/мл.

Подобраны оптимальные условия извлечения иридоидов из ЛРС и ЛП. Изучено влияние состава экстрагента (вода, водно-этанольные растворы) и времени экстракции на полноту извлечения иридоидов. Наиболее полное извлечение было получено экстракцией 40% этанолом в течение 60 минут на кипящей водяной бане с обратным холодильником. Настои готовили из промышленных образцов измельченного сырья и сырья в фильтр-пакетах согласно инструкции на упаковке.

Оптимизированы условия разделения иридоидов на колонке с обращенной фазой с использованием градиентного элюирования водой с ацетонитрилом и/или метанолом с добавлением в качестве модификаторов подвижной фазы летучих кислот (муравьиной, уксусной), ЕБЬТОР-МС-детектирования. Наилучшие параметры хроматографического разделения

были получены при использовании градиентного элюирования водой и метанолом, содержащих 0,1% муравьиной кислоты, и расходе элюента 0,5 мл/мин. Общее время анализа составило 35 мин. Сканирование масс проводили в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне m/z 150-1000.

Относительная ошибка единичного определения с 95 % доверительной вероятностью составляет 10,4 - 11,88%. Относительная ошибка при проведении анализа в трех повторностях не превышает ±4,85%. Методика валидирована по критериям специфичности, линейности, правильности, сходимости и промежуточной прецизионности. В выбранном диапазоне применения методики (0,05 - 3,0 мг/г сырья) зависимость сигнала детектора от содержания гарпагида линейная с коэффициентом корреляции 0,9987. Предел обнаружения составил 0,12 мкг/г, предел количественного определения - 0,40 мкг/г. Правильность методики доказывалась методом добавок. Величина относительного стандартного отклонения (2,4%) свидетельствует об отсутствии систематической ошибки. Фактор отклика с 95% доверительной вероятностью составляет 96,6 - 100,3%.Относительное стандартное отклонение при оценке сходимости составила 3,27%. При оценке промежуточной прецизионности Fpac4„T. (1,70) < FTÄ. (5,05 при f=5 и P=95%),tpac4in, (0,45) < tTa6jl. (2,23 при f=5 и Р=95%), следовательно дисперсии однородны, а различия между их средними значениями не значимы. Проведенные исследования показали, что разработанная методика валидна по выбранным критериям.

С использованием разработанной методики определен состав и содержание иридоидов в сырье и препаратах травы пустырника. ВЭЖХ профили иридоидов пустырника пятилопастного и пустырника сердечного получены впервые. Хроматограммы выделенных ионов иридоидов травы пустырника пятилопастного и сердечного представлены на рис.5, 6.

10* . J „« J ....

|> 1

0«.

06-

О».

Ol. 2

О 1 -V 1 А 4 '"л" 5

9 »O II I/ 11 14 It. 1С 1J 14 19 20 ¿I 22 i\ 2Л 2Ь 2 / I& 29 ДО JI Í2 SJ ¿4

Рисунок 5. ВЭЖХ-МС хроматограмма выделенных ионов [М+Ыа]+ иридоидов травы пустырника пятилопастного. 1 -гарпагид, 2 - изомер аюгола, 3 - галиридозид, 4 - гарпагида ацетат, 5 - изомер аюгозида.

Рисунок 6. ВЭЖХ-МС хроматограмма выделенных ионов [М+На]' иридоидов травы пустырника сердечного, заготовленной в Болгарии. 1 -гарпагид, 2 - гапиридозид, 3 - аюгол, 4 - гарпагида ацетат, 5 - аюгозид.

В качестве основных иридоидных гликозидов в образцах травы пустырника пятилопастного найдены гарпагид (0,01-0,10%), галиридозид (0,01-0,11%), гарпагида ацетат (0,01-0,10%). Суммарное содержание иридоидов в изученном сырье составило 0,05-0,33%. В траве пустырника сердечного преобладали аюгол (0,69 %), галиридозид (0,46 %) и аюгозид (0,39 %). Суммарное содержание иридоидов составило 1,57 %.

Иридоидный профиль образцов отечественных ЛП травы пустырника (измельченное сырье в пачке, порошок сырья в фильтр-пакетах, настойка) соответствовал пустырнику пятилопастному. Содержание иридоидов в промышленных образцах измельченного сырья составило 0,17 - 0,38%, сырья в фильтр-пакетах - 0,12 - 0,55%., в настойках 10,1 - 30,9 мг%. Определено содержание иридоидов в настоях из ЛРП травы пустырника (3,01 - 12,12 мг%). Степень перехода иридоидов в водные извлечения составила 68,6 -69,4% для измельченного сырья, 83,9 - 90,1% для сырья в фильтр-пакетах.

На основании полученных данных предложено включить в проект фармакопейной статьи на траву пустырника показатель содержания иридоидов и его норму - не менее 0,1%, а также методику его определения.

Определение состава и содержания флавоноидов и гидроксикоричных кислот травы пустырника

С целью комплексного анализа изучаемого ЛРС и выявления возможных маркеров определен состав и содержание флавоноидов и ГКК методом ОФ-ВЭЖХ с УФ- и МС-детектированием. Трава пустырника пятилопастного и сердечного имеет схожие ВЭЖХ-профили флавоноидов и производных ГКК.

Нами установлено, что основными флавоноидами травы пустырника являются рутин (0,04-0,29% в траве пустырника пятилопастного и 0,09% в траве пустырника сердечного), гиперозид(0,001-0,04% и 0,02% соответственно) и изокверцитрин (0,01-0,11% и 0,01% соответственно). Хроматограмма извлечения (экстрагент - 50% этанол) из травы пустырника пятилопастного представлена на рис. 7.

х10 2 1.5 1.25 1

0.75 0.50.25-

DAD1 - B:Sig=365,4 LeonurusJIavonoids. LAR_2013_04_17_1.d

1

u

Э 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1Э 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Response Units vs. Acquisition Time (min)

Рисунок 7. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 365 нм) извлечения из

травы пустырника пятилопастного. 1 -рутин, 2 - гиперозид, 3 -

изокверцитрин , 4 - апигетрин.

Суммарное содержание флавоноидов в пустырнике пятилопастном -0,06-0,46%, в пустырнике сердечном - 0,12%.

Среди ГКК преобладали хлорогеновая кислота (0,03 - 0,32% в пустырнике пятилопастном, 0,09 % в пустырнике сердечном), лавандулифолиозид (0,03-0,40 % и 0,01 % соответственно) и вербаскозид (0,02-0,45 % и 0,06 % соответственно). Хроматограмма извлечения (экстрагент - 50% этанол) из травы пустырника пятилопастного представлена на рис. 8.

DAD1 - C:Sig=330,4 LeonuiusJlavonoids_VILAR_2013_04_17_1.d

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2S 27 28 29 Response Units vs. Acquisition Time (min]

Рисунок 8. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 330 нм) извлечения из травы пустырника пятилопастного. 1 -хлорогеновая кислота, 2 лавандулифолиозид, 3 - вербаскозид.

Суммарное содержание производных ГКК в траве пустырника пятилопастного составило 0,16-1,57 %, в траве пустырника сердечного -0,29%.

ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА БАВ ЛИСТЬЕВ ПОДОРОЖНИКА

Разработка методики определения содержания аукубина в листьях подорожника большого

Разработана ВЭЖХ методика с УФ- и ESI-TOF-MC-детектированием для идентификации и определения содержания аукубина в сырье и препаратах подорожника большого (измельченное сырье в пачке, сырье в фильтр-пакетах, настойки, соки). Подобраны оптимальные условия

извлечения иридоида из растительного сырья и препаратов. Изучено влияние состава экстрагента (вода, водно-этанольные растворы) и времени экстракции на полноту извлечения иридоидов. Наиболее полное извлечение было получено экстракцией 30% этанолом в течение 60 минут на кипящей водяной бане с обратным холодильником. Настои готовили из промышленных образцов измельченного сырья и сырья в фильтр-пакетах согласно инструкции на упаковке.

Оптимизированы условия разделения на колонке с обращенной фазой с использованием градиентного элюирования водой с ацетонитрилом и/или метанолом с добавлением в качестве модификаторов подвижной фазы добавками муравьиной, уксусной, или фосфорной кислот, УФ- и ESI-TOF-МС-детектирования. Наилучшие параметры хроматографического разделения были получены при использовании градиентного элюирования водой и ацетонитрилом, содержащих 0,05% фосфорной кислоты (при использовании MC - муравьиной кислоты), и расходе элюента 1 мл/мин. Общее время анализа составило 30 мин. Аналитическая длина волны - 210 нм. Сканирование масс проводили в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне m/z 150-1000.

Относительная ошибка единичного определения с 95 % доверительной вероятностью составила ±2,2%. Относительная ошибка при проведении анализа в трех повторностях не превышает ±1,28 %. Методика валидирована по критериям специфичности, линейности, правильности, сходимости и промежуточной прецизионности. В выбранном диапазоне применения методики (0,1 - 10,0 мг/г сырья) зависимость сигнала детектора от содержания аукубина линейная с коэффициентом корреляции 0,9998. Предел обнаружения составил 0,03мг/г, предел количественного определения - 0,1 мг/г. Правильность методики доказывалась методом добавок. Величина относительного стандартного отклонения (1,7%) свидетельствует об отсутствии систематической ошибки. Фактор отклика с 95% доверительной вероятностью составляет 97,5 - 100,1%. Относительное стандартное отклонение при оценке сходимости составила 0,87%. При оценке промежуточной прецизионности Fpac4I1T. (1,10)< Fiafi;i. (5,05 при f=5 и Р=95%), tpacHHT- (1,20)S t табл- (2,23 при f=5 и Р=95%), следовательно дисперсии однородны, а различия между их средними значениями не значимы. Проведенные исследования показали, что разработанная методика валидна по выбранным критериям.

С использованием разработанной методики определено содержание аукубина в сырье и препаратах подорожника большого. Хроматограмма извлечения из листьев подорожника большого представлена на рис.9.

ОЛ01 А. £>д«210.4 (2ААЧ2014_Ов_2«ООС 12 О!

100

Аукувт

25 -

50 -

О

О

2

12

?• \

14 1Я

Рисунок 9.ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 210 нм)извлечения из листьев подорожника большого.

Содержание аукубина в образцах высушенного сырья составило от 0,12 до 0,57%, в промышленных образцах измельченного сырья - от 0,19% до 0,71%,сырья в фильтр-пакетах - 0,18 - 0,51%, в настойке - 38,0 мг%, в соках -29,8 мг% и 41,4 мг%. Определено содержание аукубина в настоях из ЛРП листьев подорожника большого (2,2 - 21,3 мг%). Степень перехода аукубина в водные извлечения составила 44,9 - 60,3% для измельченного сырья, 53,1 -61,5% для сырья в фильтр-пакетах.

На основании полученных данных предложено включить в проект фармакопейной статьи на листья подорожника большого показатель содержания аукубина и его норму - не менее 0,1%, а также методику его определения.

Исследован состав и содержание иридоидов в листьях других видов подорожника. Содержание аукубина в листьях подорожника ланцетного составило 0,59 и 2,59%, также идентифицирован иридоидный гликозид каталпол(1,37 - 1,93%). В листьях подорожника среднего обнаружено 0,19 -0,82% аукубина.

Определение состава и содержания гидроксикоричных кислот и флавоноидов листьев подорожника

С целью комплексного анализа изучаемого ЛРС и выявления возможных маркеров определен состав и содержание флавоноидов и производных ГКК методом ОФ-ВЭЖХ с УФ- и МС-детектированием, Профиль флавоноидов и производных ГКК изучаемых видов подорожника индивидуален. Хроматограммы извлечений (экстрагент - 50% этанол) из листьев подорожника большого, ланцетного и среднего представлены нарис.10, 11, 12.

8 4 Я

4 й Л й IV ¡4 Л й

Рисунок 10.ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 330 нм) извлечения из листьев подорожника большого. 1 - плантамайозид.

Рисунок 11. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 330 нм) извлечения из листьев подорожника ланцетного. 1 - хлорогеновая кислота, 2 -вербаскозид.

-с с е^ззси »^.-че«.кги'.'с^сч

Рисунок 12. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 330 нм) извлечения из листьев подорожника среднего. 1 - вербаскозид.

Нами установлено, что среди производных ГКК в листьях подорожника большого преобладает кофеоилфенилэтаноидный гликозид плантамайозид (1,08 - 1,33%). Суммарное содержание ГКК - 1,18 - 1,50%.В листьях подорожника ланцетного и среднего преобладал вербаскозид (0,63 - 0,94% и 0,56 - 0,99% соответственно). В подорожнике ланцетном обнаружена также хлорогеновая кислота (0,02 и 0,04%), отсутствовавшая в образцах двух других видов подорожника. Суммарное содержание ГКК в исследованных

образцах составило 0,99 - 1,49% в подорожнике ланцетном и 0,84-1,48% в подорожнике среднем.

Нами установлено, что листья изучаемых видов подорожника содержат гликозиды флавонов - производные апигенина, лютеолина, скутелляреина, трицетина. Хроматограммы представлены на рис. 13, 14, 15._

Л*

Рисунок 13. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 350 нм) извлечения из листьев подорожника большого. 1 -плантагинин, 2 — непетин-7-О-глюкозид, 3 - скутелляреин-7-О-малонилглюкозид, 4 - апигетрин, 5 -гомоплантагинин, 6 - гиспидулин-7-О-малонилглюкозид.

Рисунок 14. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 350 нм) извлечения из листьев подорожника среднего. 1 — лютеолин-7-О-глюкуронид, 2-апигенин-7-О-глюкуронид, 3 - трицин-7-О-глюкуронид, 4 - хризоэриол-7-О-глюкуронид.

1Ь л & л

^ ¿г ¿1 а* зЬ

Рисунок 15. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 365 нм) извлечения из листьев подорожника ланцетного. 1 -лютеолин-7-О-глюкуронид.

В образцах листьев подорожника большого суммарное содержание флавоноидов составило 0,62 - 1,11%. Идентифицированы гомоплантагинин (0,24 - 0,43%), плантагинин (0,02 - 0,10%), непетин-7-О-глюкозид (0,01 -0,13%), скутелляреин-7-О-малонилглюкозида (0,12 - 0,14%), апигетрин(0,01 -0,02%), гиспидулин-7-О-малонилглюкозид (0,21 - 0,27%). В листьях подорожника среднего суммарное содержание флавоноидов составило 0,83 -0,91%. Определено 0,37 - 0,39% лютеолин-7-О-глюкуронида, 0,12 - 0,12% апигенин-7-О-глюкуронида, 0,14 - 0,16% трицин-7-О-глюкуронида и 0,11 -0,12% хризоэриол-7-О-глюкуронида. В листьях подорожника ланцетного суммарное содержание флавоноидов составило - 0,59 - 0,75%. Определено 0,02 - 0,04% лютеолин-7-О-глюкуронида.

ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИРИДОИДОВ ПЛОДОВ КИЗИЛА ОБЫКНОВЕННОГО

Плоды кизила обыкновенного являются перспективным источником иридоидных гликозидов. Поскольку плоды кизила содержат С-10 иридоидные гликозиды логанинового типа, для их идентификации и количественного определения была использована методика, разработанная для анализа иридоидов листьев вахты трехлистной. Хроматограмма представлена на рис. 16.

6 в 7 8 9 10 11 12 13 14 16 1в 17 1» 19 20 21 22 23 24 » 2в 27 2» 2Э 30

Рисунок 16. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 235 нм) извлечения из плодов кизила обыкновенного. 1 -логаниновая кислота, 2 - сверозид, 3 -логанин, 4 - корнузид.

В качестве основного иридоидного компонента идентифицирована логаниновая кислота (0,65 - 2,11% в пересчете на сухое сырье), обнаружены логанин (0,01 - 0,03%), сверозид (0,02 - 0,08%) и корнузид (0,03 - 0,11%). Содержание иридоидов в пересчете на сухое сырье составило от 0,72 до 2,26%.

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА БАВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

С использованием разработанных ВЭЖХ-методик определен состав и содержание иридоидов в растениях, относящихся к различным семействам: вахтовых, яснотковых, подорожниковых, кизиловых. Иридоидные гликозиды

изучаемого растительного сырья принадлежат к различным классам и являются таксономическими маркерами.

Показано, что в листьях вахты трехлистной преобладаютС-10 иридоидные гликозиды логанинового типа (логаниновая кислота, логанин) и соответствующие им секоиридоиды (секологаниновая кислота, сверозид). Дитерпеновые производные данных соединений (дигидрофолиаментин, фолиаментин, ментиафолин) являются уникальными маркерами рода вахта.

Иридоиды логанинового типа также идентифицированы в плодах кизила обыкновенного. Основным иридоидом плодов кизила является логаниновая кислота, идентифицированы логанин, сверозид. В качестве маркерного компонента обнаружен корнузид.

Иридоиды травы пустырника относятся к С-9 иридоидным гликозидам. Выявлены значительные различия в составе и содержании иридоидов двух фармакопейных видов пустырника, позволяющие однозначно определить видовую принадлежность растительного сырья. В качестве основных маркерных иридоидных гликозидов травы пустырника пятилопастного идентифицированы гарпагид, галиридозид и гарпагида ацетат; травы пустырника сердечного - аюгол, галиридозид и аюгозид.

Основным иридоидным гликозидом листьев подорожника большого, ланцетного и среднего является С-9 иридоидный гликозид аукубин, являющийся маркерным соединением растений рода подорожник. Идентифицирован индикаторный иридоид подорожника ланцетного -каталпол.

Среди ГКК в сырье вахты трехлистной преобладали кофеоилхинные кислоты (хлорогеновая, неохлорогеновая, 4-кофеоилхинная, дикофеоилхинные кислоты), широко распространенные в растениях и не являющиеся индикаторными соединениями. Хлорогеновая кислота также была обнаружена в пустырнике пятилопастном и сердечном, а также в листьях подорожника ланцетного. Однако преобладающей группой производных ГКК в сырье видов пустырника и подорожника являлись кофеоилфенилэтаноидные гликозиды. Вербаскозид идентифицирован в пустырнике пятилопастном, пустырнике сердечном, подорожнике ланцетном и подорожнике среднем. В траве пустырника наряду с вербаскозидом присутствовал лавандулифолиозид. В качестве основного кофеоилфенилэтаноидного гликозида листьев подорожника большого идентифицирован плантамайозид, который может быть отнесен к маркерным соединениям для данного вида сырья.

Из флавоноидных соединений в листьях вахты трехлистной и траве пустырника преобладали флавоноловые гликозиды. Идентифицированы гликозиды кверцетина: рутин, гиперозид и изокверцитрин, во всех образцах преобладал рутин. В сырье вахты трехлистной также обнаружен рутинозид кемпферола — никотифлорин. Значительных видовых отличий в составе флавоноидов пустырника пятилопастного и сердечного отмечено не было, маркеров не выявлено. В листьях изучаемых видов подорожника

обнаружены флавоновые глнкозиды - производные апигенина, лютеолина, екутелляреина, трицетина. В листьях подорожника большого преобладали гликозиды екутелляреина и его метокси-производного (6-метоксискутелляреина), являющиеся маркерными соединениями. В листьях подорожника среднего в качестве маркеров обнаружены глюкурониды флавонов. В качестве основного соединения идентифицирован лютеолин-7-О-глюкуронид. В листьях подорожника ланцетного также обнаруженлютеолин-7-О-глюкуронид.

ВЫВОДЫ

1. Анализ литературы показал актуальность разработки новых подходов к стандартизации иридоид-содержащего ЛРС, направленных на идентификацию и определение содержания маркерных для каждого вида сырья иридоидов с использованием современных физико-химических методов анализа, таких как ВЭЖХ с УФ- и МС- детектированием.

2. Подобраны оптимальные условия извлечения иридоидов из сырья и препаратов вахты трехлистной, пустырника пятилопастного и пустырника сердечного, подорожника большого, ланцетного и среднего. Наиболее полное извлечение иридоидных гликозидов получено экстракцией 30-40% этанолом в течение 60 минут.

3. Разработаны методики идентификации и определения содержания иридоидов в изучаемом сырье и препаратах из него методом ВЭЖХ с УФ- и Е81-ТОР-МС-детектированием. Методики валидированы по основным валидационным критериям: специфичности, линейности, пределу обнаружения и количественного определения, правильности, прецизионности (сходимости и промежуточной прецизионности), что показывает возможность их применения для качественной и количественной оценки иридоидов.

4. С использованием разработанных методик определен состав и содержание иридоидов в сырье и препаратах вахты трехлистной, пустырника пятилопастного, пустырника сердечного, видов подорожника, кизила обыкновенного.

- В высушенных листьях вахты трехлистной идентифицированы и количественно определены дигидрофолиаментин (0,37 - 1,09%), секологаниновая кислота (0,47 - 1,07%), иридоидный гликозид-изомер логанина (0,15 - 0,27%), логаниновая кислота (0,02 - 0,04%), логанин (0,01 -0,04%), сверозид (0,01 - 0,03%). Обнаружены пики по УФ- имасс-спектрам соответствующие двум изомерным соединениям: фолиаментину и ментиафолину (0,14 - 0,28%).

- В качестве основных иридоидных гликозидов в образцах высушенной травы пустырника пятилопастного идентифицированы и количественно определены гарпагид (0,01-0,10%), гапиридозид (0,01-0,11%), гарпагида ацетат (0,01-0,10%). В траве пустырника сердечного преобладали аюгол (0,69%), галиридозид (0,46%) и аюгозид (0,39%). Содержание иридоидов в

исследованных образах ЛРП травы пустырника составило 0,12 - 0,55%, в настойках - 10,1 - 30,9 мг%.

- В высушенных листьях подорожника большого идентифицирован аукубин (0,12 до 0,57%>), в ЛРП определено от 0,18% до 0,71% аукубина, в настойке -38,0 мг%, в соках подорожника - 29,8 мг% и 41,4 мг%. В листьях подорожника ланцетного определены аукубин (0,59 - 2,59%) и каталпол (1,37

- 1,93%). В листьях подорожника среднего обнаружено 0,19 - 0,82% аукубина.

В свежих плодах кизила обыкновенного идентифицированы и количественно определены логаниновая кислота (0,65 — 2,11% в пересчете на сухое сырье), логанин (0,01 - 0,03%), сверозид (0,02 - 0,08%) и корнузид (0,03-0,11%).

- Определено содержание иридоидов в настоях из ЛРП. Степень перехода иридоидов в водные извлечения составила 44,9 - 69,4% для измельченного сырья, 53,1 - 90,1% для сырья в фильтр-пакетах.

5. Сравнительный анализ иридоидов ЛРС вывил маркерные иридоиды для каждого вида ЛРС: дигидрофолиаментин, фолиаментин и ментиафолин для листьев вахты трехлистной; гарпагид, гарпагида ацетат, галиридозид, аюгол, аюгозид для травы пустырника; аукубин, каталпол для видов подорожника; корнузид для плодов кизила обыкновенного.

6. Проведено сравнительное изучение состава и содержания производных ГКК и флавоноидов в растительном сырье методом ВЭЖХ.

- Среди производных ГКК в листьях вахты трехлистной идентифицированы кофеоилхинные кислоты (хлорогеновая, неохлорогеновая, 4-кофеоилхинная, дикофеоилхинные кислоты). В сырье видов пустырника и подорожника преобладали кофеоилфенилэтаноидные гликозиды. В траве пустырника пятилопастного и сердечного идентифицированы вербаскозид, лавандулифолиозид и хлорогеновая кислота. В листьях подорожника большого преобладал плантамайозид - маркерное соединением для данного вида. В листьях подорожника ланцетного и среднего в качестве основного компонента идентифицирован вербаскозид. В подорожнике ланцетном обнаружена также хлорогеновая кислота. Содержание производных ГКК убывает в ряду: трава пустырника пятилопастного > листья подорожника большого > листья подорожника ланцетного > листья подорожника среднего > листья вахты трехлистной > трава пустырника сердечного.

- Среди флавоноидов в листьях вахты трехлистной и траве пустырника обнаружены флавоноловые гликозиды - производные кверцетина. Идентифицированы рутин, гиперозид, изокверцитрин. Выявлены различия в соотношении компонентов и их содержании в сумме флавоноидов. В сырье вахты трехлистной также обнаружен рутинозид кемпферола — никотифлорин. В листьях изучаемых видов подорожника обнаружены флавоновые гликозиды - производные апигенина, лютеолина, скутелляреина, трицетина. Основные флавоноиды подорожника большого (гликозиды скутелляреина и 6-метокси-скутелляреина) и глюкурониды флавонов подорожника среднего

могут являться маркерными соединениями для данных видов сырья. В образцах листьев подорожника большого идентифицированы гомоплантагинин, плантагинин, непетин-7-О-глюкозид, скутелляреин-7-O-малонилглюкозид, апигетрин, гиспидулин-7-О-малонилглюкозид. В листьях подорожника среднего идентифицированы лютеолин-7-О-глюкуронид, апигенин-7-О-глюкуронид, трицин-7-О-глюкуронид и хризоэриол-7-O-глюкуронид. В листьях подорожника ланцетного идентифицирован лютеолин-7-О-глюкуронид. Содержание флавоноидов убывает в ряду: листья подорожника большого > листья подорожника среднего > листья подорожника ланцетного > трава пустырника пятилопастного > листья вахты трехлистной > трава пустырника сердечного.

Основное содержание диссертационной работы отражено в следующих публикациях:

1. Жогова, A.A. ВЭЖХ-масс-спектрометрия в анализе индикаторных иридоидов растительного сырья / A.A. Жогова, К.И. Эллер, И.А. Самылина // Фармация. - М., 2012. - №7. - С. 14-17.

2. Zhogova, A.A. The methodological approach to the iridoid analysis in herbal raw material / A.A. Zhogova, K.I. Eller // The 16th international congress "Phytopharm 2012". Abstracts book. Obzory po kliniceskoj farmacologii I lekarstvennoj terapii.-2012. -Vol.10. - №2. - Pp. 48 - 49.

3. Жогова, A.A. Биологически активные вещества плодов кизила обыкновенного / A.A. Жогова, И.Б. Перова // Материалы XIV Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов с международным участием «Алиментарно-зависимая патология: предиктивный подход». Приложение к журналу «Вопросы диетологии». - М., 2012. - Т. 2. -Приложение №1. - С. 30 - 31

4. Жогова, A.A. Идентификация иридоидов вахты трехлистной / A.A. Жогова, К.И. Эллер, И.А. Самылина // Сборник материалов XXIII Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине». - М., 2013. - С. 173.

5. Жогова, A.A. Изучение состава и определение содержания иридоидов в листьях вахты трехлистной / A.A. Жогова, И.А. Самылина, К.И. Эллер // Фармация. - М., 2013. - №. 6. - С.17-20.

6. Жогова, A.A. Изучение состава иридоидов вахты трехлистной / A.A. Жогова, К.И. Эллер, И.А. Самылина // Сеченовский вестник. - М., 2013. - №1 (11).-С. 73-74.

7. Zhogova, A.A. Minor biologically active compounds of Motherwort herb / A.A. Zhogova, I.B. Perova, A.V. Cherkashin et al // The 17lh international congress "Phytopharm 2013". Abstracts book. Obzory po kliniceskoj farmacologii I lekarstvennoj terapii. - 2013. - Vol. 11. - P. 32.

8. Жогова, A.A. Идентификация и количественное определение основных биологически активных веществ травы пустырника с помощью ВЭЖХ-масс-спектрометрии / A.A. Жогова, И.Б. Перова, И.А. Самылина и др. // Химико-фармацевтический журнал. - М., 2014. - Т. 48. - № 7. - С. 54 - 59.

9. Жогова, А.А. Разработка оптимальных условий определения иридоидов в листьях вахты трехлистной / А.А. Жогова, И.А. Самылина, К.И. Эллер // Сборник научных трудов научно-методической конференции «II Гаммермановские чтения». - С-Пб., 2014. - С. 56-57.

10. Жогова, А.А. Сравнительное изучение состава биологически активных веществ лекарственного растительного сырья для приготовления матричных настоек пустырника / А.А. Жогова, И.А. Самылина, К.И. Эллер // Сборник материалов XXIV Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине».

- М., 2014. - С. 152.

11. Zhogova, А.А. Investigation of biologically active compounds of the leaves of plantain species / A.A. Zhogova, I.A. Samylina, K.I. Eller // The 18thinternational congress "Phytopharm 2014". Abstracts book. Obzory po kliniceskoj farmacologii I lekarstvennoj terapii. - 2014. - Vol. 12. - Pp. 15-16.

12. Samylina, I.A. Iridoids in medicinal plants: recent approaches to standardization of raw materials and herbal medicines / I.A. Samylina, K.I. Eller, A.A. Zhogova // The 18th international congress "Phytopharm 2014". Abstracts book. Obzory po kliniceskoj farmacologii I lekarstvennoj terapii. - 2014. - Vol. 12.

- P. 54.

13. Перова, И.Б. Биологически активные вещества плодов кизила (Cornus mas L.) / И.Б. Перова, А.А. Жогова, А.В. Полякова, К.И. Эллер, Г.В. Раменская, И.А. Самылина // Вопросы питания. — 2014. - Т. 83. - №5. — С. 86 -93.

14. Жогова, А.А. Определение аукубина в сырье и препаратах подорожника большого/ А.А. Жогова, И.А. Самылина, К.И. Эллер // Фармация.- М„ 2015. - №. 2. - С.15-18.

15. Жогова, А.А. Изучение хромато графических характеристик биологически активных веществ подорожника / А.А. Жогова, И.А. Самылина, К.И. Эллер // Сборник материалов XXV Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине». - М., 2015. -С 186-187.

Заказ № 61-А/03/2015 Подписано в печать 23.03.2015 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:zak@cfr.ru