Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка гранулированной формы аллергена из клещей Dermatophagoides farinae для сублингвального метода иммунотерапии (экспериментальное изучение)

ДИССЕРТАЦИЯ
Разработка гранулированной формы аллергена из клещей Dermatophagoides farinae для сублингвального метода иммунотерапии (экспериментальное изучение) - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Разработка гранулированной формы аллергена из клещей Dermatophagoides farinae для сублингвального метода иммунотерапии (экспериментальное изучение) - тема автореферата по медицине
Коренева, Елена Александровна Москва 2007 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.00.36
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка гранулированной формы аллергена из клещей Dermatophagoides farinae для сублингвального метода иммунотерапии (экспериментальное изучение)

На правах рукописи

Коренева Елена Александровна

003052726

Разработка гранулированной формы аллергена из клещей Dermatophagoides/агтае для сублингвального метода иммунотерапии (экспериментальное изучение)

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2007

003052726

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Валентина Михайловна Бержец Официальные оппоненты:

1. Доктор медицинских наук, профессор Валентина Борисовна Гервазиева

2. Доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор Иван Иванович Балаболкин

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. ЛА.Тарасевича

Защита состоится 22 марта 2007 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им И.И. Мечникова РАМН (105064, Москва, Малый Казенный переулок, д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им И.И. Мечникова РАМН

5а)

Автореферат разослан « 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат биологических наук

И.В .Яковлева

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Последние десятилетия наблюдается рост уровня аллергических заболеваний во всех возрастных группах [Патгерсон Р., Грэммер Л.К., 2000]. Высокой аллергенной активностью обладает домашняя пыль, основным аллергизирующим компонентом которой являются клещи семейства Pyroglyphidae рода Dermatophagoides [Вайцекаускайте P.JL, 1983]. Наиболее распространенные виды клещей Dermatophagoides pteronyssinus (D. pteronyssinus) и Dermatophagoides farinae (D. farinae) выявляются в 60% - 80% исследуемых проб домашней пыли на территории России, Западной Европы, Ближнего Востока, Индии, Японии, Северной и Центральной Америки, Австралии и Новой Зеландии.

В настоящее время единственно возможным лечением, затрагивающим этиологические и патогенетические звенья атопического заболевания, является аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ) [Гущин И.С., 1998; Новиков Д.К., Новикова В.И., 1998]. АСИТ позволяет остановить формирование тяжелых форм заболевания, сохранить эффект ремиссии в течение длительного времени, предотвратить развитие сенсибилизации к другим видам аллергенов, снизить потребление противоаллергических препаратов. Эффективность АСИТ подтверждена клиническими исследованиями, выполненными двойным слепым методом с использованием «плацебо»-группы [Балаболкин И.И., 1998; Гургенидзе Г.В., Надарая X., 1998; WHO Position Paper, 1998; Bodtger U., 2002].

Классический метод АСИТ водно-солевыми растворами аллергенов имеет ряд серьезных недостатков, ограничивающих ее применение. Это необходимость регулярных подкожных инъекций, частые местные и общие побочные реакции, длительность курса лечения, ограниченное использование при кожных заболеваниях и в педиатрической практике. Все эти факты диктуют необходимость разработки специальных лечебных форм

аллергенов и поиск альтернативных путей введения препаратов в организм пациента.

Последнее время повышен интерес к использованию неинъекционных способов АСИТ. Выделяют интраназальный, сублингвальный, оральный, ингаляционный, а также комбинированные (инъекционный и ингаляционный, инъекционный и оральный) методы [Canónica GW., Passalacqua G., 2003; Martorell Aragonés A., 2000]. Вышеуказанные способы АСИТ в значительной степени различаются по лечебному эффекту, удобству и безопасности применения. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), несмотря на разнообразие методов, для широкой клинической практики у взрослых пациентов рекомендует только сублингвальный способ АСИТ [WHO Position Paper, 1998]. Этот способ обеспечивает быстрое всасывание аллергенного субстрата в периферическую кровь и его доставку к регионарным лимфоидным органам, минуя желудочный и печеночный барьеры [Куприянов С.Н., 1998; Мошкевич B.C., 1999; Потемкина Л.М., 1998]. К достоинствам метода можно отнести также удобный режим и безболезненность лечения, минимизацию побочных реакций, исключение возможности инфицирования. Согласно данным литературы, показана высокая эффективность сублингвального способа АСИТ для больных с пыльцевой и клещевой сенсибилизацией [Vourdas D, Syrigou Е, 1998; Passalacqua G., Guerra L., 2006].

При сублингвальном и оральном введении стандартные водно-солевые растворы аллергенов эффективны в дозах, в десятки раз превышающих дозы инъекционной АСИТ. Общая иммунологическая толерантность возникает вследствие интенсивной антигенной нагрузки [Ulrich N., Bodo N.. 1998]. Снизить аллергенное воздействие и сохранить терапевтический эффект позволяет использование специально приготовленных лечебных форм аллергенов. Согласно литературным данным, разработано достаточно много видов подобных препаратов, но большинство из них

предназначено для орального использования (инкапсулированные и липосомальные аллергены, модифицированные аллергены) [Рахман Ю.Л., 1997; Litwin A., Flanagan М., 1997; Lucas А., 1998; Matsimaga Y., 2000; Naito S., 2002]. Стандартных лечебных форм аллергенов для сублингвального приема мало и в клинике они практически не применяются. Учитывая потребность в более широком использовании сублингвального метода АСИТ, необходимо создание для него специальных аллергенных препаратов, что и послужило поводом для проведения нашего исследования. Аллерген из клещей D. farinae выбран нами как один из наиболее распространенных сенсибилизирующих агентов.

Цель исследования

Разработать технологию приготовления лечебной формы аллергена из клещей D. farinae, предназначенной для проведения аллергенспецифической иммунотерапии сублингвальным способом.

Задачи исследования

1. Разработать способ получения гранулированной формы аллергена из клещей D. farinae.

2. Изучить физико-химические свойства гранулированной формы аллергена из клещей D. farinae.

3. Оценить специфическую активность полученного препарата в тестах in vitro.

4. Исследовать безвредность, хроническую токсичность и иммуногенность препарата на лабораторных животных.

Научная новизна Впервые разработана технология изготовления и получена гранулированная лекарственная форма аллергена из клещей D. farinae для АСИТ сублингвальным способом.

Впервые в технологии приготовления лечебной формы аллергена использованы элементы процесса производства гомеопатических препаратов.

Полученный препарат сохраняет антигенную активность исходного стандартного аллергена из клещей D. farinae, проявляет иммуногенные свойства и имеет сниженную аллергенность. Показаны безвредность и нетоксичность препарата.

Практическая значимость

Разработанная технология приготовления гранулированной формы аллергена D. farinae позволяет получать оригинальный препарат для АСИТ на основе стандартного водно-солевого раствора аллергена. Предлагаемую технологию можно использовать для изготовления гранулированной формы из любого неинфекционного аллергена. На способ получения гранулированной лекарственной формы аллергена из клещей D. farinae получен патент № 2216353, зарегистрированный 20 ноября 2003 г. в Государственном реестре изобретений Российской Федерации.

Разработаны фармакопейная статья производства и инструкция по изготовлению и контролю гранулированной формы аллергена из клещей D. farinae. Составлена программа клинических испытаний экспериментального препарата на ограниченном контингенте больных.

Полученный препарат предполагается использовать для АСИТ сублингвальным способом, что позволит избежать длительного курса инъекций, уменьшить зависимость пациента от врача, улучшить переносимость АСИТ, особенно у детей. Доклиническое изучение препарата свидетельствует о необходимости дальнейших клинических испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработана технология получения гранулированной формы аллергена из клещей D. farinae с использованием элементов технологии гомеопатических препаратов.

2. Разработанный метод позволяет получать препарат с сохраненной антигенной и иммуногенной активностью при сниженной аллергенности.

3. На основании патоморфологического исследования органов лабораторных животных показана безвредность и нетоксичность гранулированной формы аллергена из клещей D.farinae.

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертации представлены на международной конференции молодых ученых по вопросам новых медицинских технологий Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (г. Москва, 2001); на конференции «Экологические проблемы в аллергологии» (г. Тула, 2001); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Тульские педиатрические чтения» (г. Тула, 2001); на XXI конгрессе EAACI (г. Неаполь, Италия, 2002); на IV и V конгрессах РААКИ (г. Москва, 2001, г. Москва, 2002); на V конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (г. Москва, 2002); на научно-практической конференции «55 лет сотрудничества Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова и здравоохранения Тульской области» (г. Москва - г. Тула, 2002); на VII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе (г. Москва, 2003); на IV Всемирном конгрессе по астме и IX Международном конгрессе по клинической патологии (г. Бангкок, Таиланд, 2004).

Основные положения диссертации изложены в 17 печатных работах.

Апробация диссертации состоялась 01.03.2006 г. на научной конференции отдела аллергологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 108 страницах машинописного текста, иллюстрированы 19 таблицами и 12 рисунками.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, результатов и их обсуждения, выводов. Список литературы включает 140 источников, из них 77 зарубежных.

Содержание работы Материалы исследования

Для изготовления препарата был использован стандартный безфенольный водно-солевой экстракт аллергена из клещей D. farinae, приготовленный по регламенту производства (РП) №2 (563-96) и разрешенный к применению в клинической практике (Приказ о внедрении ГУ лечебно-профилактической помощи №203 от 14.07.92 г). По своим свойствам водно-солевой экстракт аллергена из клещей D. farinae соответствует требованиям фармакопейной статьи ФСП 42-3926-00, содержание белкового азота в 1 мл 5000 PNU. В качестве носителя аллергеного субстрата в экспериментальном препарате использована сахарная крупка, по химическому составу сахароза, производства ОАО «Щелковский витаминный завод» (ТУ 64-5-61-88).

Для проведения лабораторных тестов использовались сыворотки 22 больных, сенсибилизированных к клещам рода D. farinae, находившихся под наблюдением в аллергологическом кабинете 9 лечебно-диагностического центра МО РФ. Больных отбирали на основе анамнеза, результатов аллергологического и лабораторного обследований. Забор крови у больных проводили с их добровольного согласия и с соблюдением правил асептики и антисептики.

Биологическая безвредность гранулированной формы аллергена из клещей D. farinae изучена на белых мышах и морских свинках. Для патоморфологического исследования использовали биоптаты внутренних органов морских свинок. Иммуногенную активность экспериментального препарата определяли с помощью сывороток крови предварительно иммунизированных морских свинок.

Методы исследования

Величину pH растворов регистрировали потенциометрическим методом при помощи иономера. Содержание белка в растворах определяли спектрофотометрическим методом с использованием 5% раствора биуретового синего при помощи спектрофотометра СФ-46 (длина волны 250 нм.).

Специфическую активность экспериментального препарата изучали в тесте непрямой дегрануляции тучных клеток (НДТК) и методом иммуноферментного анализа (ИФА). Реакцию НДТК проводили на тучных клетках перитонеальной жидкости белых крыс с использованием пула сывороток крови больных с высокой степенью сенсибилизации к D. farinae (специфический IgE 3-4 класса) [Фрадкин В.А., 1990].

Уровень общего IgE определяли методом ИФА с использованием иммуноферментных наборов фирмы «Dr. Fooke» Laboratorien GMBH (Германия). Содержание аллергенспецифических IgE-антител и IgG4-антител в сыворотках крови измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа [Гервазиева В.Б., 1986]. Исследования проводили в лаборатории аллергодиагностики ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова. Для выявления комплексов антиген/антитело использовали конъюгаты моноклональных антител анти-IgE и aHTH-IgG4 человека (ФСП 42-0190-059300, «Полигност», Санкт-Петербург) и диагностические антитела против IgG(H+L) морских свинок (ФСП 42-0180-6029-05, «Медгамал», Москва), меченные пероксидазой хрена. Результаты регистрировали на спектрофотометре «Dynatech MR-5000» (длина волны 490 нм). Содержание IgE-антител от 1 до 4 класса и IgG4-aHTHTen в мкг/мл определяли в соответствии со значением оптической плотности референс-стандарта (IRP 75/502, IRP 67/86, "Dr. Fooke", Германия).

Для выявления сорбции белка аллергена из клещей D. farinae на носителе применяли микроточечный иммуноблот (иммунодот) [Михайлов А.Т., Симирский В.Н., 1991]. В качестве конъюгатов использовали

вторичные антитела (козьи антитела против иммуноглобулинов человека, специфические к Fcy-фрагментам), меченные щелочной фосфатазой (Jackson Immunoresearch, Weat Grove, PA). Проявление мембран проводили в APDV-буфере, используя реактивы NBC (нитросиний тетразолий) и BCIP (5-Bromo-4-Chlore-3-Indolyl phosphate) по протоколу иммуноблот-анапиза. Полученные данные обрабатывали денситометрически при помощи программы "ImageQuant 5.2 ".

Безвредность препарата изучали на 20 белых мышах весом 16-18 г. Изучение хронической токсичности проводили на 15 морских свинках средним весом 400 г. Для патоморфологического исследования внутренних органов и тканей лабораторных животных отбирали биоптаты поджелудочной железы, сердца, легкого, печени, почек, селезенки. Препараты фиксировали в нейтральном формалине по Лилли, срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Патоморфологическое исследование было проведено в отделении патоморфологии городской клинической больницы №7 (г. Москва).

Экспериментальные данные статистически обработаны с помощью пакета прикладных программ «STATISTIKA 6,0» (StatSoft, США).

Результаты исследования и их обсуждение На основе стандартного водно-солевого раствора аллергена из клещей D. farinae разработана технология приготовления гранулированной лечебной формы в виде комплекта из восьми последовательных десятичных разведений Д1 - Д8, нанесенных на сахарную крупку. Способ получения включает основные этапы регламента производства стандартного водно-солевого раствора аллергена РП №2 (563-96) и положения фармакологических статей, регламентирующих производство гомеопатических препаратов (ВФС 42-2806-23 и ВФС 42-2809-96). Все технологические операции изложены в инструкции по изготовлению и контролю гранулированной формы аллергена D. farinae для сублингвального приема.

Разработанный нами способ получения гранулированной формы включает следующие этапы:

• водно-солевую экстракцию раствора аллергена из культуры клещей без использования фенола;

• центрифугирование аллергенного экстракта;

• стерилизующую фильтрацию маточного раствора аллергена из клещей D. farinae\

• последовательное десятичное разведение маточного раствора на 45% растворе этанола и получение разведений с содержанием аллергенного субстрата с 10"' по 10"8;

• нанесение полученных разведений на сахарную крупку, предварительно пропитанную этанолом;

• высушивание сахарной крупки с лекарственным субстратом до полного испарения этанола.

Стандартный водно-солевой раствор аллергена D. farinae, использованный в качестве маточного раствора для приготовления гранулированной формы, по своим физико-химическим и иммунобиологическим свойствам соответствует требованиям нормативных документов (ФСП 42-3926-00). Его специфическая активность была оценена методом кожного скарификационного тестирования. Тесты проведены больным с аллергическими заболеваниями (атопическая бронхиальная астма, сезонный и круглогодичный аллергичекий ринит и риноконъюктивит, атопический дерматит) вне обострения на фоне полной отмены антигистаминных и глюкокортикостероидных препаратов. У 90% больных, сенсибилизированных к D. farinae, были выявлены умеренные, резко положительные и гиперэргические кожные реакции.

Высокую специфическую активность стандартный аллерген из клещей D. farinae проявил в тестах in vitro: в реакции НДТК уровень дегрануляции тучных клеток составил 62,14%±3,6% (при спонтанной

п

дегрануляции не более 4%), в реакции ИФА со специфическими сыворотками больных уровень связывания аллергенспецифических IgG4-антител составил 20,1-28,8 мкг/мл, аллергенспецифических IgE-антител -2-4 класс.

Сформирован банк сывороток больных с сенсибилизацией к D. farinae. Он включает 22 сыворотки, пять из которых - сыворотки больных с моносенсибилизацией к D. farinae (специфический IgE 2-4 классов). В большинстве сывороток присутствуют антитела к домашней пыли и клещам D. pteronyssinus. Для проведения иммунологических тестов in vitro были отобраны сыворотки с уровнем общего IgE не ниже 100-150 кЕ/л, специфического IgE к D. farinae не ниже 2 класса.

Доклиническое исследование физико-химических и иммунобиологических свойств гранулированной формы аллергена D. farinae проведено согласно Методическим указаниям к первичной экспериментально-клинической апробации новых форм аллергенов, разработанных Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича. Характеризуя физико-химические свойства препарата, следует отметить, что по внешнему виду, консистенции, цвету, вкусу, запаху, растворимости в воде и биологических жидкостях он аналогичен сахарной крупке. Гранулированная форма аллергена D. farinae представляет собой набор из 8 отдельных порций однородных гранул правильной шаровидной формы белого цвета, без запаха, сладкого вкуса. Количество гранул в 1 грамме 28-32 штуки. Растворимость в слюне и в воде не более 5 минут.

Кислотность растворов в процессе изготовления препарата не изменилась и соответствует рН маточного раствора и водно-солевого аллергена D. farinae аналогичной серии. Среднее значение величины рН для всех разведений составило 6,94±0,05.

По микробиологической чистоте гранулированная форма аллергена D. farinae соответствует требованиям категории ЗБ по общей Фармакопейной Статье «Испытания на микробиологическую чистоту» [Государственная фармакопея РФ XI, 1989].

Непосредственное определение содержания белка в экспериментальном препарате затруднено из-за его низкой концентрации. Наиболее чувствительный метод Бредфорд обладает разрешающей способностью 0,01 мг/мл [Фрадкин В.А., Прядкина М.Д., 1982], а максимальная расчетная концентрация белка в 1 г. первого десятичного разведения не превышает 5 PNU (0,3125 мкг/мл). Согласно Методическим указаниям, содержание белкового азота в стандартном аллергене из клещей D. farinae определили методом Несслера (5000 PNU в 1 мл.). Определение содержания белкового азота в гранулированной форме провели расчетным путем, исходя из содержания белкового азота в водно-солевом аллергене.

Для качественного определения наличия белка в экспериментальном препарате был использован микроточечный иммуноблот (иммунодот). Высокая чувствительность данного метода сочетается с использованием небольших объемов тестируемого образца (до 0,1 мкл), что позволяет проанализировать антигены при минимальном расходе анализируемого материала и косвенно подтвердить наличие белкового компонента аллергена на носителе [Михайлов А.Т., Симирский В.Н., 1991]. Специфическая активность неинфекционных аллергенов напрямую зависит от содержания гликопротеидных комплексов с антителосвязывающей способностью. Следовательно, определяя методом иммунодота специфическую активность того или иного образца, можно оценить в нем уровень аллергенспецифичного белка и сравнить различные виды образцов по этому показателю.

Сравнительная оценка специфической активности гранулированной формы и стандартного аллергена из клещей D. farinae проведена с

использованием сывороток больных с моносенсибилизацией к D. farinae (специфический IgE 4 класса). Сыворотки больных подобраны в соответствии со скарификационными пробами. В результате отобраны сыворотки 3 больных с моносенсибилизацией к D. farinae.

Проведено 5 серий опытов, в каждой из которых было 6 образцов для исследования (рис. 1). Выделены две основные группы сравнения:

1 - раствор 20 гранул первого десятичного разведения гранулированной формы аллергена D. farinae на I мл разводящей жидкости (расчетная концентрация белка 1 мкг/мл),

2 — разведение стандартного водно-солевого раствора аллергена D. farinae до расчетной концентрации белка 1 мкг/мл.

Контролем служили:

3 - разводящая жидкость с ТВИН-80,

4- цельный аллерген кукурузы (7500PNU в 1 мл; 468,75 мкг/мл), 5 - раствор чистой сахарной крупки (20 гранул на 1 мл), 6- цельный аллерген D.farinae (5000 PNU в 1 мл; 312,5 мкг/мл).

r 1 — гранулированная форма аллергена D. farinae

(расчетная концентрация белка 1 мкг/мл); 1 2 — стандартный водно-солевой раствор аллергена

D. farinae (расчетная концентрация белка 1 мкг/мл);

3 - разводящая жидкость с ТВИН - 80;

4 - цельный аллерген кукурузы (7500 PNU в 1 мл; 468,75 мкг/мл);

5 - чистая сахарная крупка (20 гранул на 1 мл);

6 - цельный аллерген из D. farinae (5000 PNU в 1 мл; 312,5 мкг/мл),

Рис. 1 Схема микроточечного иммуноблота

Данные иммунодота обработаны денситометрически, что позволило по интенсивности окраски пятна каждого образца на нитроцеллюлозной

мембране судить о содержании в них белковых комплексов антиген-антитело (в условных единицах).

Из рисунка 1 видно, что пятна 1 и 2 (гранулированная форма и водно-солевой аллерген £>. /агтае с расчетной концентрацией белка 1 мкг/мл) по интенсивности окраски практически не отличаются. Интенсивность окраски 4-го пятна (цельный аллерген кукурузы) примерно в 1,5-2 раза ниже интенсивности 1-го и 2-го пятен, что обусловлено отсутствием специфической реакции антиген-антитело. Слабое окрашивание 5-го пятна (чистая сахарная крупка) обусловлено высоким содержанием в сахарной крупке (носителе аллергена) полисахаридов.

Можно сделать вывод, что в гранулированной форме аллергена из клещей /агтае действительно присутствуют специфически активные белковые структуры в том же количестве, что и в водно-солевом аллергене.

Методами НДТК и ИФА был проведен сравнительный анализ аллергенных свойств (специфической активности в отношении 1§Е) гранулированной формы аллергена из клещей Д /агтае и стандартного водно-солевого раствора аллергена. Тест НДТК проведен с пулом из 12 сывороток больных с сенсибилизацией к Д. /агтае и сопутствующей сенсибилизацией к домашней пыли и клещам Д р1егопу$$ти$ (специфический IgE 2-4 класса). Для осуществления реакции НДТК, тучные клетки активировали экспериментальным препаратом в разведении Д1 и стандартным водно-солевым аллергеном с одинаковым расчетным содержанием белка. В качестве контроля использован раствор чистой сахарной крупки.

Установлено, что гранулированная форма и водно-солевой раствор аллергена в концентрациях ~0,33 мкг/мл вызывали дегрануляцию тучных клеток на спонтанном уровне (соответственно 5,2% и 4,9%). При повышении концентрации белка в исследуемых препаратах до ~1 мкг/мл процент дегрануляции повысился незначительно и составил: для

гранулированной формы 8%, для водно-солевого раствора аллергена 16%. Статистически достоверных различий в показателях дегрануляции тучных клеток ни внутри групп сравнения, ни между ними не выявлено (табл. №1).

Таблица № 1

Влияние экспериментального препарата и водно-солевого аллергена И./агтае на дегрануляцию тучных клеток

Форма аллергена Содержание белка (мкг/мл) % дегрануляции

сыворотка больных, сенсибилизированных к £>. /агтае (п=10) сыворотка больных, сенсибилизированных к пыльце злаков (контроль) (п=10)

Гранулированная форма Д1 0,33 5,2±1,0 3,8±0,6

1,0 8±0,15 4,2±0,9

Водно-солевой раствор 0,33 4,9±0,8 3,1±0,5

1,0 16±0,2 3,9±1,0

Чистая сахарная крупка - 2,6±0,6 2,8±0,6

В реакции НДТК экспериментальный препарат был использован в максимальной концентрации, проявив при этом низкую аллергенную активность. Следовательно, можно ожидать еще более низкую аллергенность высоких разведений гранулированной формы (Д2 - Д8). Данное утверждение доказано методом ИФА. Во всех разведениях гранулированная форма аллергена £>. /агтае вызывает связывание специфических 1§Е-антител на уровне 0-1 класса, что не превышает показателей реакции ИФА с неспецифической сывороткой (сывороткой больных, сенсибилизированных к пыльце злаков).

Антигенные свойства экспериментального препарата были изучены методами иммунодота и ИФА. Методом иммунодота показано, что и гранулированная форма и стандартный водно-солевой аллерген О. /агтае обладают специфической активностью в отношении 1§04. Этот результат подтверждается данными ИФА.

Методом ИФЛ изучена специфическая активность гранулированной формы Д1-Д8 (по 7 гранул каждого разведения) в сравнении с десятичными разведениями стандартного водно-солевого аллергена из клещей D. farinae с 10"' до 10~8 (п=20). В качестве контроля использованы сыворотки больных с сенсибилизацией к пыльце злаков (п=20). Оценка результатов ИФА проведена с учетом того, что по содержанию белкового субстрата 1-е разведение гранулированной формы (Д1) соответствует разведению 10'J стандартного водно-солевого аллергена D. farinae (рис.2).

S 15 I *

1 10 "

2

1 а водно-солвеоА

i п, « н< сг, ч ц * че с сыворотка ' Пгрянулированная

форма/неспацифичаскал | сыворотка ■гранулированная форма/специфическая i сыворотка

Д1 - Д8 - разведения гранулированной формы аллергена D. farinae. 10'1— 10"8-разведения стандартного водно-солевого аллергена D. farinae.

Рис. 2. Уровень связывания аллергенспецифических IgG4-aHTHTen экспериментальным препаратом и стандартным водно-солевым аллергеном D. farinae.

При взаимодействии гранулированной формы аллергена В. /аппае со специфическими сыворотками уровень связывания специфических ^04-антител в 2,8-3,5 раза выше, чем в реакции с неспецифическими сыворотками (р<0,01). При равном содержании аллергенного субстрата, специфическая активность гранулированной формы не уступает водно-солевому раствору аллергена.

Поскольку экспериментальный препарат вызывает связывание специфических 1§С4-антител в сыворотках крови больных, можно предположить, что он способен стимулировать выработку иммуноглобулинов 1§С4-класса в организме человека или животных, т.е. проявлять иммуногенные свойства. В эксперименте изучение иммуногенных свойств гранулированной формы аллергена из клещей £>. /аппае провели на морских свинках. В основной и контрольной группах животные получали препарат перорально, в виде раствора, по представленной ниже схеме (табл.№ 3).

Таблица №3

Схема иммунизации морских свинок гранулированной формой аллергена из клещей £>. /аппае

Группы подопытных животных

основная контрольная

Количество животных 10 5

Вводимый препарат гранулированная форма аллергена £). /аппае чистая сахарная крупка

Доза препарата 7 гранул (0,25 г) 7 гранул (0,25 г)

Частота и продолжительность приема препарата ежедневно 1 раз в день, каждое разведение в течение 7 дней ежедневно 1 раз в день

Общая продолжительность приема 60 дней 60 дней

Уровень аллергенспецифических ^в-антител в сыворотках животных определен методом ИФА с использованием стандартного водно-солевого аллергена О. /аппае и диагностических иммуноглобулинов против 1дО(Н+Ь) морских свинок («Медгамал», Москва). Уровень ^в-антител в

сыворотках животных контрольной группы составил, в среднем, 0,5-1 мг/мл. В сыворотках животных, получавших экспериментальный препарат, отмечено статистически достоверное повышение уровня специфических ^О-антител в сравнении с контрольной группой: от 2 мг/мл до 50 мг/мл у разных особей (р<0,01). Следовательно, можно предположить, что экспериментальный препарат обладает иммуногенной активностью при введении в организм подопытных животных.

Изучение безвредности и хронической токсичности гранулированной формы аллергена из клещей Д /агтае проведено на мышах и морских свинках. Испытание на безвредность, проведенное на мышах показало, что употребление в течение 5 дней препарата в дозе, равной средней терапевтической для взрослого человека, не нанесло животным вреда и не нарушило их жизнедеятельность.

Хроническая токсичность экспериментального препарата была изучена на морских свинках в течение 2 месяцев. Внешних признаков нарастающей интоксикации (потери массы тела, адинамии, появления парезов и параличей, гибели животного) ни в группе, получающей экспериментальный препарат, ни в контрольной группе отмечено не было. По истечении времени эксперимента у подопытных животных были отобраны биоптаты внутренних органов для патоморфологического изучения. Макроскопический осмотр внутренних органов животных не выявил признаков токсического поражения (жировой дистрофии печени, диапедезных кровоизлияний и инфарктов внутренних органов, язвенных поражений желудочно-кишечного тракта и т.п.).

Микроскопическое исследование биоптатов органов лабораторных животных также не выявило признаков гипо- и дистрофии, микроинфарктов и токсического перерождения тканей. В микропрепаратах селезенки животных основной группы по сравнению с контролем отмечены лимфопролиферативные изменения белой пульпы (нарастание числа фолликулов с центрами размножения, относительное увеличение числа

лимфоидноклеточных элементов), очаговое полнокровие синусов, увеличение числа плазматических клеток в красной пульпе, связанное с интенсивным антителообразованием. Интерстиций легких, печени, почек животных основной группы отличает лимфоидно-клеточная инфильтрация с примесью плазматических клеток. Наблюдается небольшое расширение сосудов микроциркуляторного русла с миграцией клеток лимфоидного ряда в периваскулярные и перибронхиальные отделы. Это отражает процессы миграции и рециркуляции иммуноцитов, затрагивающие все органы и ткани организма. Подобные изменения в органах и тканях являются характерными признаками активации иммунной системы при проведении аллергенспецифической иммунотерапии [Йегер JL, 1990; Гущин И.С., 1998; Сепиашвили Р.И., 2003].

Результаты экспериментов на лабораторных животных свидетельствуют о биологической безвредности гранулированной формы аллергена из клещей D. farinae. При длительном неоднократном введении препарат не вызвал токсического воздействия на организм подопытных животных.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что препарат, полученный по разработанной технологии, отвечает требованиям, предъявляемым к лечебным видам аллергенов. Он стабилен, безопасен при длительном приеме, обладает специфической активностью, проявляет иммуногенные свойства и, в сравнении со стандартным аллергеном D.

farinae, имеет сниженную аллергенность (табл. №4).

Выводы

1. Разработана технология приготовления лечебной формы для проведения АСИТ сублингвальным способом. Показана возможность использования элементов технологии изготовления гомеопатических препаратов для специальной обработки аллергенов.

2. Установлено, что экспериментальный препарат практически лишен способности связывать специфические IgE-антитела в сыворотках крови

больных, сенсибилизированных к В. /аппае, что указывает на его сниженную аллергенную активность.

3. Выявлено, что гранулированная форма аллергена Б. /аппае по способности связывать специфические ^04-антитела в сыворотках крови больных, сенсибилизированных к О. /аппае, не уступает стандартному водно-солевому аллергену.

4. Гранулированная форма аллергена из клещей £>. /аппае обладает иммуногенной активностью, стимулируя выработку аллергенспецифических антител ^в-класса у лабораторных животных.

5. В опытах на лабораторных животных показаны безвредность и нетоксичность экспериментального препарата.

Таблица №4. Общая характеристика гранулированной формы аллергена из клещей И. /аг'тае

Основные характеристики

Исходные вещества, технологии и нормативные документы Препарат изготовлен из стандартного водно-солевого раствора аллергена из клещей Dermatophagoides/аппае (РП №2 (563-96), Приказ о внедрении ГУ лечебно-профилактической помощи №203 «О разрешении применения новых медицинских иммунопрепаратов» от 14.07.92 г., ФСП 42-3926-00) без использования фенола. Использованы элементы технологии изготовления гомеопатических препаратов в соответствии с ВФС 42-2806-23 и ВФС 42-280996.

Технологические этапы приготовления гранулированной формы аллергена из клещей И. /агтае ступенчатое разведение водно-солевого раствора аллергена £). /аппае 45% этанолом по стандартной схеме разведения аллергенов для АСИТ до концентрации 10"8; - нанесение полученных растворов лекарственного вещества на сахарную крупку из расчета 1 мл аллергенного субстрата на 100 г крупки; - высушивание приготовленной сахарной крупки до полного испарения этанола.

Способ применения препарата Рассасывание гранул под языком (за щекой) до полного растворения (не менее 3-5 минут).

Рекомендуемая схема приема По 7 гранул вне приема пищи. Препарат в разведениях с Д8 по Д4 ежедневно 1 раз в день, каждое по 1 неделе; разведения ДЗ, Д2 и Д1 - 1 раз в 3 дня, каждое по 2 недели.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Коренева Е.А. Характеристика новых лечебных форм аллергенов из клещей рода Dermatophagoides. // Сборник материалов международной конференции молодых ученых по вопросам новых медицинских технологий ММА им. И.М. Сеченова. - Москва, 2001. - С. 85.

2. Бержец В.М., Хлгтян C.B., Петрова Н.С., Барашкина О.В., Коренева Е.А., Петрова С.Ю., Пахомова JI.A. Использование новых форм аллергенов в клинической практике. // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Тульские педиатрические чтения». - Тула, 2001. - С. 102.

3. Бержец В.М., Хлгтян C.B., Петрова Н.С., Барашкина О.В., Коренева Е.А., Петрова С.Ю., Пахомова J1.A. Применение новых форм аллергенов для диагностики и лечения аллергических заболеваний. // Астма (научные труды европейского конгресса по астме). - 2001. - Т.2 -№1.-С.137.

4. Коренева Е.А., Бержец В.М., Петрова Н.С., Петрова С.Ю., Пахомова JI.A. Характеристика новых форм аллергенов из клещей рода Dermatophagoides. И Сборник материалов IV конгресса РААКИ «Современные проблемы аллергологии и иммунофармакологии». - М.,

2001.- С. 541.

5. Бержец В.М., Петрова С.Ю., Коренева Е.А., Петрова Н.С., Пахомова Л.А., Бержец А.И. Лечение аллергических заболеваний, вызванных сенсибилизацией к клещам домашней пыли, новыми лечебными формами аллергенов. // International Journal on Immunorehabilitation. -

2002. - V.4. - № l.-P. 50-51.

6. Коренева E.A., Бержец B.M., Петрова Н.С., Хлгатян C.B., Пахомова Л.А., Бержец А.И. Изучение физических и иммунобиологических свойств пероральной формы аллергена из клещей рода Dermatophagoides. II Сборник материалов V Конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - М., 2002.-С. 461.

7. Бержец В.М., Коренева Е.А., Петрова Н.С., Пищулина Л.А. Способ получения гранулированной лекарственной формы из аллергена клещей рода Dermatophagoides. II Патент RU 22043768, класс А 61, К 35/78. -1995.

8. Бержец В.М., Коренева Е.А., Хлгатян C.B., Петрова Н.С., Пахомова Л.А., Бержец А.И., Пищулина Л.А. Создание нового клещевого аллергена для пероральной специфической иммунотерапии. // International Journal on Immunorehabilitation. - 2002. - V.4. - № 2. - P. 257.

9. Коренева Е.А., Бержец В.М., Петрова Н.С., Мельникова М.Н. Изучение физико-химических и иммунобиологических свойств пероральной лечебной формы аллергена из клещей домашней пыли. // Сборник материалов научно-практической конференции «55 лет сотрудничества Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова и

здравоохранения Тульской области». - Москва -Тула, 2002. - С. 131132.

Ю.Коренева Е.А., Бержец В.М., Петрова Н.С., Мельникова М.Н. Специфическая иммунотерапия аллергических заболеваний как нозодотерапия. // Сборник материалов XIII Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине». - Санкт-Петербург, 2003. - С. 97-98.

11. Бержец В.М., Хлгатян C.B., Коренева Е.А., Петрова Н.С., Пищулина JI.A., Емельянова О.Ю., Пахомова JI.A. Применение пероральной формы клещевого аллергена для специфической иммунотерапии. // «Медицинская иммунология». Материалы VII Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе. -2003. - Т.5. - № 3-4. - С. 227.

12. Коренева Е.А., Бержец В.М., Хлгатян C.B., Петрова Н.С., Емельянова О.Ю., Пищулина JI.A. Экспериментальные данные изучения иммунобиологических свойств пероральной формы клещевого аллергена. // Физиология и патология иммунной системы (материалы IV Всемирного конгресса по астме и IX Международного конгресса по клинической патологии). - Бангкок, Таиланд, 2004. - Т. 6. - №1. - С. 4647.

13. Бержец В.М., Бержец А.И., Коренева Е.А., Мельникова М.Н., Петрова Н.С. Потенцированная форма аллергена для специфической аллерговакцинации больных с атопическими заболеваниями. // Вестник новых медицинских технологий. - Тула, 2005. - Т. 12. - № 3-4. - С. 6770.

14. Бержец В.М., Хлгатян C.B., Петрова Н.С., Коренева Е.А. Пероральные клещевые аллергены для специфической аллерговакцинации. // Справочник врача общей практики. - 2005. - №3. - С.26-28.

15. Коренева Е.А., Бержец В.М., Хлгатян C.B., Петрова Н.С., Бержец А.И., Жирова С.Н. Получение и экспериментальное изучение пероральной формы аллергена из клещей домашней пыли. // Российский аллергологический журнал. - 2005. - №6. - С. 42-46.

16. Бержец В.М., Коренева Е.А., Хлгатян C.B. Петрова Н.С. Бержец А.И., Жирова С.Н. Пероральный аллерген из клещей домашней пыли для специфической иммунотерапии: экспериментальное исследование. // ЖМЭИ. - 2006. - №4. - С.65-69.

17. Бержец В.М., Коренева Е.А., Хлгатян C.B., Петрова С.Ю., Петрова Н.С. Аллергенспецифическая иммунотерапия атопических заболеваний, вызванных сенсибилизацией к клещам домашней пыли. - Медицинская иммунология. - 2006. - Т.8. - № 2-3. - С. 197.

 
 

Оглавление диссертации Коренева, Елена Александровна :: 2007 :: Москва

Раздел 1. Введение. Раздел 2. Обзор литературы.

2.1. Аллергены из клещей рода Dermatophagoides.

2.2. Аллергенспецифическая иммунотерапия заболеваний атопической природы.

2.3. Современные лечебные формы аллергенов и методы проведения аллергенспецифической иммунотерапии.

2.3.1. Аллергены пролонгированного действия.

2.3.2. Модифицированные формы аллергенов

2.3.3. Неинъекционные способы АСИТ.

2.4. Морфо-функциональные особенности иммунной системы желудочно-кишечного тракта.

2.5. Клиническая эффективность и безопасность перорального способа аллергенспецифической иммунотерапии.

Раздел 3. Материалы и методы

3.1. Материалы исследования.

3.2. Методы исследования.

3.3. Статистическая обработка полученных данных. Раздел 4. Собственные исследования

4.1. Технология изготовления гранулированной формы аллергена из клещей Dermatophagoides /аппае.

4.2. Экспериментальное изучение гранулированной формы аллергена Dermatophagoides /аппае.

4.2.1 Физико-химические свойства и микробиологическая чистота.

4.2.2. Изучение антигенных и иммуногенных свойств гранулированной формы аллергена Dermatophagoides/аппае.

4.3. Контроль безвредности и хронической токсичности экспериментального препарата.

Раздел 5. Результаты и обсуждение

Раздел 6. Выводы

Раздел 7. Список литературы

Список сокращений

АР - аллергический ринит. АД - атопический дерматит. БА - бронхиальная астма.

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения.

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт.

ИФА - иммуноферментный анализ.

НДТК - непрямая дегрануляция тучных клеток.

РК - рецидивирующая крапивница.

АСИТ - аллергенспецифическая иммунотерапия.

Отр. - отрицательная.

Дом. пыль - домашняя пыль.

Плес, грибы - плесневые грибы

Библ. пыль - библиотечная пыль.

Перо под. - перо подушки.

Тарак. - тараканы.

D. pteronyssinus, D. pter. - Dermatophagoides pteronyssinus.

D. farinae - Dermatophagoides farinae.

IgE - иммуноглобулин E.

IgA - иммуноглобулин A.

IgG - иммуноглобулин G. s-IgA - секреторный иммуноглобулин A.

Th - Т-хелперы.

IL - интерлейкин.

IFN-y - гамма - интерферон.

RAST - радиоаллергосорбентный тест.

ЕСР - эозинофильный катионный белок

 
 

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Коренева, Елена Александровна, автореферат

Последние десятилетия наблюдается рост уровня аллергических заболеваний во всех возрастных группах населения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в развитых странах количество людей, страдающих аллергией, достигает 30% [39, 54]. Высокой аллергенной активностью обладают антигены домашней пыли. Основным аллергизирующим компонентом домашней пыли являются клещи семейства Pyroglyphidae рода Dermatophagoides [12, 41]. Наиболее распространенные виды Dermatophagoides pteronyssinus (D. pteronyssinus) и Dermatophagoides farinae (D. farinae) выявляются в 60% - 80% исследуемых проб домашней пыли.

В настоящее время единственно возможным лечением, затрагивающим все патогенетические звенья атопического процесса, является аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ). АСИТ позволяет остановить формирование тяжелых форм заболевания, сохранить эффект ремиссии в течение длительного времени, предотвратить развитие сенсибилизации к другим видам аллергенов, снизить потребление противоаллергических препаратов. Эффективность АСИТ подтверждена клиническими исследованиями, выполненными двойным слепым методом с использованием «плацебо»-группы [4, 19, 21, 70, 108, 137].

Инъекционный метод АСИТ водно-солевыми растворами аллергенов имеет ряд серьезных недостатков, ограничивающих ее применение. Это необходимость регулярных подкожных инъекций, частые местные и общие побочные реакции, длительность курса лечения, ограниченное использование при кожных заболеваниях и в педиатрической практике. Все эти факты диктуют необходимость разработки специальных лечебных форм аллергенов и поиск альтернативных путей введения препаратов в организм пациента.

Последнее время повышен интерес к использованию неинъекционных способов АСИТ. Выделяют интраназальный, сублингвальный, пероральный, ингаляционный, а также комбинированные (инъекционный и ингаляционный, инъекционный и пероральный) методы [68. 93]. Вышеуказанные способы АСИТ в значительной степени различаются по лечебному эффекту, удобству и безопасности применения. Несмотря на разнообразие методов, для широкой клинической практики у взрослых пациентов ВОЗ рекомендует только сублингвальный способ АСИТ [101, 137]. Согласно данным литературы, показана его высокая эффективность для больных с пыльцевой и клещевой сенсибилизацией [5, 40, 59, 71, 77, 82, 87, 88, 96, 110]. Сублингвальный способ АСИТ обеспечивает быстрое всасывание аллергенного субстрата в периферическую кровь и его доставку к регионарным лимфоидным органам, минуя желудочный и печеночный барьеры [7, 53, 65, 102]. К достоинствам метода можно отнести также удобный режим и безболезненность лечения, минимизацию побочных реакций, исключение возможности инфицирования.

При сублингвальном и оральном введении стандартные водно-солевые растворы аллергенов эффективны в дозах, в десятки раз превышающих дозы инъекционной АСИТ. Общая иммунологическая толерантность возникает вследствие интенсивной антигенной нагрузки [76, 119, 122]. Снизить аллергенное воздействие и сохранить терапевтический эффект позволяет использование специально приготовленных лечебных форм аллергенов. Согласно литературным данным, разработано достаточно много видов подобных препаратов, но большинство из них предназначено для всасывания со слизистой кишечника (инкапсулированные и липосомальные аллергены, модифицированные аллергены) [46, 87, 90, 94]. Стандартных лечебных форм аллергенов для сублингвального приема мало и в клинике они практически не применяются. Учитывая потребность в более широком использовании сублингвального метода АСИТ, необходимо создание для него специальных аллергенных препаратов, что и послужило поводом для проведения нашего исследования. Аллерген из клещей £>. /аппае выбран нами как один из наиболее распространенных сенсибилизирующих агентов.

Цель исследования Разработать технологию приготовления лечебной формы аллергена из клещей Д /аппае. предназначенной для проведения аллергенспецифической иммунотерапии сублингвальным способом.

Задачи исследования 1. Разработать способ получения гранулированной формы аллергена из клещей Д /аппае.

2. Изучить физико-химические свойства гранулированной формы аллергена из клещей D.farinae.

3. Оценить специфическую активность полученного препарата в тестах in vitro.

4. Исследовать безвредность, хроническую токсичность и иммуногенность препарата на лабораторных животных.

Научная новизна

Впервые разработана технология изготовления и получена гранулированная лекарственная форма аллергена из клещей D. farinae для АСИТ сублингвальным способом. Впервые в технологии приготовления лечебной формы аллергена использованы элементы процесса производства гомеопатических препаратов.

Полученный препарат сохраняет антигенную активность исходного стандартного аллергена из клещей D. farinae, проявляет иммуногенные свойства и имеет сниженную аллергенность. Показаны безвредность и нетоксичность препарата.

Практическая значимость

Разработанная технология приготовления гранулированной формы аллергена D. farinae позволяет получать оригинальный препарат для АСИТ на основе стандартного водно-солевого раствора аллергена. Предлагаемую технологию можно использовать для изготовления гранулированной формы из любого неинфекционного аллергена. На способ получения гранулированной лекарственной формы аллергена из клещей Э. /аппае получен патент № 2216353, зарегистрированный 20 ноября 2003 г. в Государственном реестре изобретений Российской Федерации.

Разработаны фармакопейная статья производства и инструкция по изготовлению и контролю гранулированной формы аллергена из клещей й. /аппае. Составлена программа клинических испытаний экспериментального препарата на ограниченном контингенте больных.

Полученный препарат предполагается использовать для АСИТ сублингвальным способом, что позволит избежать длительного курса инъекций, уменьшить зависимость пациента от врача, улучшить переносимость АСИТ, особенно у детей. Доклиническое изучение препарата свидетельствует о необходимости дальнейших клинических испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработана технология получения гранулированной формы аллергена из клещей Д /агтае с использованием элементов технологии гомеопатических препаратов.

2. Разработанный метод позволяет получать препарат с сохраненной антигенной и иммуногенной активностью при сниженной аллергенности.

3. На основании патоморфологического исследования внутренних органов лабораторных животных показана безвредность и нетоксичность гранулированной формы аллергена из клещей О. /аппае.